PT2179035E - Bacteriófago modificado incluindo um gene da proteína pequena do esporo solúvel em ácido alfa/beta (sasp) - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "BACTERIÓFAGO MODIFICADO INCLUINDO UM GENE DA PROTEÍNA PEQUENA DO ESPORO SOLÚVEL EM ÁCIDO ALFA/BETA (SASP)" A presente invenção refere-se a um bacteriófago modificado e a um processo para a produção do bacteriófago modificado.

Antecedentes da Invenção

Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções contraídas durante estadas num hospital (infecções nosocomiais) (Noskin et al., 2005) . Causa frequentemente infecções nos pulmões, em feridas, na pele e no sangue e, devido ao número de toxinas que a bactéria pode produzir, estas infecções podem colocar a vida em risco.

Quase todas as estirpes de S. aureus são actualmente resistentes à penicilina devido à sua capacidade para produzir uma enzima (penicilinase) que degrada o fármaco; e 45 anos após a introdução da meticilina em 1959, uma penicilina resistente à penicilinase, estirpes de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) são endémicas em muitos hospitais. Mais recentemente, as estirpes de MRSA também se tornaram um problema na comunidade. Muitas estirpes de MRSA são agora resistentes a múltiplos antibióticos. 1

Os níveis de MRSA aumentaram dramaticamente nos hospitais tanto nos EUA como no R.U. e, além disso, novas estirpes MRSA Adquiridas na Comunidade (CA-MRSA) disseminaram-se rapidamente pelo globo desde que foram relatadas pela primeira vez no final da década de 1990. Estas estirpes CA-MRSA demonstraram ser altamente transmissíveis e frequentemente comportam um conjunto de genes que codificam a Leucocidina de Panton Valentine que é uma toxina que pode tornar essas estirpes altamente virulentas. Existem preocupações de que estas estirpes de CA-MRSA possam ainda aumentar as dificuldades de controlar infecções de MRSA em hospitais (Donegan, 2006).

De facto, a MRSA é agora um problema tão grave (e letal) nos hospitais que está a ser realizado um esforço significativo na implementação de medidas de controlo da infecção como um meio de minimizar a disseminação da MRSA em hospitais e desse modo reduzir o número de infecções. Em relação à MRSA em particular, as medidas de controlo da infecção incluem, variadamente, a utilização de higienizadores de mãos pelos trabalhadores de saúde; o rastreio, isolamento e confinamento de enfermaria de doentes infectados e portadores; e descontaminação dos doentes e trabalhadores de saúde que são portadores de MRSA. O transporte de bactérias é definido como a presença de bactérias, normalmente a um nível baixo, sem qualquer patologia associada, tal como inflamação. Todavia, os transportadores de MRSA constituem um risco significativo para a disseminação de MRSA a uma comunidade hospitalar mais vasta e a eliminação de MRSA dos portadores, particularmente antes ou durante a admissão, é uma parte muito importante do processo de controlo da infecção. O transporte de S. aureus (e consequentemente de MRSA) ocorre no nariz, sovacos, virilha e períneo, e em redor destes, 2 assim como em lesões superficiais na pele. Vários estudos relatam que a S. aureus é transportada no nariz por 25 a 30% da população geral, sendo a MRSA transportada em cerca de 1%. Entre os doentes hospitalares, a taxa de transporte é significativamente superior. Nos EUA foi estimado que 89 milhões de pessoas transportam S. aureus no seu nariz, e 2,3 milhões destes transportam MRSA (Mainous et al., 2006). A eliminação intranasal de MRSA é por isso fundamental para controlar a disseminação deste organismo potencialmente letal em hospitais.

Como uma alternativa aos antibióticos convencionais, uma família de proteínas que demonstra que actividade antibacteriana de vasto espectro dentro da bactéria compreende as proteínas pequenas de esporo solúveis em ácido de tipo α/β (conhecidas doravante como SASP). Dentro das bactérias, a SASP liga-se ao ADN bacteriano: a visualização deste processo, utilizando microscopia crioelectrónica, demonstrou que a SspC, a SASP mais estudada, reveste o ADN e forma domínios salientes e modifica a estrutura de ADN (Francesconi et al., 1988; Frenkiel-Krispin et al., 2004) de tipo B (passo 3,4 nm) para tipo A (3,18 nm; o ADN tipo A possui um passo de 2,8 nm) . Os motivos salientes da SspC interagem com filamentos adjacentes ADN-SspC que empacotam os filamentos num conjunto mais apertado de hélices de núcleo-proteína. Deste modo, a replicação do ADN é interrompida e, quando ligada, a SASP previne a transcrição de ADN. A SASP liga-se ao ADN de um modo não especifico para a sequência (Nicholson et al, 1990) de modo a que as mutações no ADN bacteriano não afectam a ligação de SASP. O documento W002/40678 descreve a utilização como um agente antimicrobiano de bacteriófagos modificados para incorporar um gene de SASP. De modo a proporcionar a produção eficaz do 3 bacteriófago modificado num hospedeiro bacteriano, o documento W002/40678 é dirigido ao evitar da expressão do gene SASP durante a proliferação do hospedeiro de produção. Com esta finalidade, o gene SASP foi inserido, de um modo preferido, nos genes de lise do bacteriófago, de modo a colocar o gene SASP sob o controlo de um promotor do gene litico que é activo apenas no final do ciclo de vida do bacteriófago. Pensou-se que a proliferação do hospedeiro da produção bacteriana seria, de outra forma, prevenida devido à presença do produto do gene SASP, particularmente, se o gene SASP estava sob o controlo de um promotor constitutivo. Numa disposição menos preferida, o gene SASP pode estar localizado noutro local no cromossoma do bacteriófago e colocado sob o controlo de um bacteriófago ou promotor bacteriano através do qual o ciclo litico pode ser deixado a prosseguir o seu curso. Nesta disposição, o promotor bacteriano seria não constitutivo e poderia ser regulado positivamente por sugestões ambientais. 0 documento WO2004/13375 descreve uma combinação de um tal agente antimicrobiano com um antibiótico para o tratamento de infecção bacteriana.

Sumário da Invenção

Descobriu-se agora surpreendentemente que a produção eficaz do bacteriófago pode ser alcançada quando o bacteriófago foi modificado para transportar um gene que codifica uma SASP sob o controlo de um promotor que é controlado independentemente do bacteriófago e que é constitutivo sem regulação exógena ou in trans necessária ou proporcionada. Quando presente em cópias 4 múltiplas, por exemplo, após infecçao das células alvo, o promotor conduz a níveis tóxicos da expressão de SASP.

Consequentemente, num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um bacteriófago modificado capaz de infectar uma bactéria alvo, cujo bacteriófago inclui um gene da proteína pequena do esporo solúvel em água α/β (SASP) que codifica uma SASP que é tóxica para a bactéria alvo, em que o gene de SASP está sob o controlo de um promotor constitutivo que é estranho para o bacteriófago e o gene SASP, cujo promotor é suficientemente forte para conduzir a produção de níveis tóxicos de SASP quando o bacteriófago modificado está presente em múltiplas cópias na bactéria alvo e em que o bacteriófago é capaz de formar um lisogénio contendo uma única cópia do gene SASP numa estirpe de produção de hospedeiro bacteriano.

Num segundo aspecto, é proporcionado um processo para a produção de um bacteriófago modificado capaz de infectar a bactéria alvo, cujo processo compreende cultivar um hospedeiro bacteriano compreendendo o material genético que codifica o bacteriófago num meio de crescimento; provocando a replicação do bacteriófago no hospedeiro bacteriano; e recolher o bacteriófago. A utilização de um bacteriófago modificado no qual o gene SASP está sob o controlo de um promotor constitutivo possui várias vantagens. 0 controlo da expressão do gene SASP é removido do bacteriófago por meio do qual a produção da SASP torna-se independente da expressão do gene fágico. Isto permite que a SASP seja produzida mesmo quando o bacteriófago não pode realizar o seu ciclo de vida completo; que pode acontecer no caso de super-infecção (quando o bacteriófago infecta um 5 hospedeiro bacteriano que já contém um pró-fago) e restrição ao hospedeiro do ADN do bacteriófago. Como descrito abaixo, esta estratégia permite desse modo que um tipo de fago iniba muitas estirpes diferentes de uma espécie bacteriana.

Embora o bacteriófago tenda geralmente a possuir intervalos de hospedeiros estreitos, colocando um gene SASP sob o controlo de um promotor constitutivo pode alargar o intervalo de hospedeiros do bacteriófago modificado. Isto é devido ao facto de um dos modos chave pelos quais a bactéria limita o seu intervalo de hospedeiros ser através da degradação do ADN do bacteriófago na entrada para uma célula bacteriana. A utilização do bacteriófago para distribuir um gene SASP, cuja produção é independente do bacteriófago, significa que o destino do ADN do bacteriófago pode não ter impacto na eficácia da SASP. Deste modo, o bacteriófago actua como um vector de distribuição através da distribuição do gene que codifica a SASP a uma célula bacteriana alvo. A produção de um bacteriófago modificado de acordo com a invenção requer um hospedeiro bacteriano que possa ser lisogenizado pelo bacteriófago. Este lisogénio deve permitir a proliferação do bacteriófago após indução, de modo a que possa ser obtido um titulo de bacteriófago adequado para a recolha. De acordo com a invenção, a SASP não evita a produção de títulos de fagos adequados na escala de tempo necessário por um processo de fabrico, i. e. antes da morte celular do hospedeiro. A abordagem de acordo com a presente invenção é a utilização de um promotor constitutivo para controlar o gene SASP, de modo a que o promotor não promova a expressão de SASP suficiente para matar a estirpe de produção do hospedeiro a partir da qual o 6 bacteriófago modificado deve ser recolhido. 0 promotor pode ser um promotor bacteriano, tal como a partir de S. aureus. Promotores preferidos incluem os promotores pdhA de S. aureus para a componente da subunidade alfa da desidrogenase de piruvato El, rpsB para a proteína S2 ribossómica 30S, pgi para a glucose-6-fosfato isomerase. As sequências que possuem de identidade >90% com estas sequências podem também ser utilizadas nos promotores de acordo com a invenção. Um promotor particularmente preferido é o promotor para o gene da aldolase de bisfosfato da frutose, fbaA, de S. aureus N315 (n° de acesso BAB43211) ou uma sequência apresentando homologia >90% com esta sequência. Uma vantagem de utilizar o promotor fbaA para expressar o gene SASP é que este promotor é expresso constitutivamente em células bacterianas e não parece ser regulado por qualquer mecanismo nas células de S. aureus. Além disso, uma única cópia do elemento fbaA::SASP-C não produz SASP-C suficiente para ser letal para uma célula hospedeira, permitindo a manutenção e a produção do bacteriófago PTSA 1.2/A, como descrito em maior detalhe abaixo. Após infecção de bactérias alvo, contudo, múltiplas cópias do promotor fbaA (por múltiplos eventos de infecção ou replicação de fagos na célula alvo) conduzem uma expressão suficiente de SASP-C de modo a provocar a perda da viabilidade do alvo.

Esses promotores que são adequados para serem utilizados a montante da SASP em construções de bacterióf agos, tal como o promotor fbaA, possuem duas propriedades definidoras; não são suficientemente fortes para matar o hospedeiro do bacteriófago durante o crescimento da bactéria hospedeira; não evitam a produção de títulos de fagos adequados na escala de tempo necessária para o processo de fabrico, i. e. antes da morte celular do hospedeiro. Todavia, são suficientemente fortes para 7 levar à produção de níveis tóxicos de SASP quando presente em múltiplas cópias, i. e. após a distribuição de múltiplas cópias do gene SASP a uma célula alvo ou devido à replicação do fago numa célula alvo. A selecção dos promotores com essas actividades pode ser realizada analisando construções de bacteriófagos para estas características. 0 promotor que controla a transcrição e consequentemente a expressão do gene SASP é estranho para o bacteriófago e para o gene SASP no sentido que não tem origem no bacteriófago e não é o promotor nativo do gene SASP. Deste modo, o controlo de expressão do gene SASP é afastado do fago. 0 hospedeiro bacteriano pode ser qualquer hospedeiro adequado para um dado bacteriófago. 0 hospedeiro deve suportar o bacteriófago através da proliferação de partículas de bacteriófago no hospedeiro, quando induzido para o fazer. 0 documento W002/40678 apresenta no apêndice 4 uma lista de agentes patogénicos comuns e alguns dos seus fagos. Este apêndice é reproduzido no presente pedido como o apêndice 1. Os hospedeiros de Staphylococcus e Clostridium, de um modo preferido, Staphylococcus aureus e Clostridium difficile, são hospedeiros particularmente úteis. 0 Bacteriófago oll é capaz de infectar Staphylococcus aureus e é descrito em maior detalhe abaixo. Este bacteriófago pode ser modificado de acordo com a presente invenção.

As sequências de SASP de tipo α/β podem ser encontradas no apêndice 1 do documento WO02/40678 incluindo SASP-C de Bacillus megaterium que é a SASO de tipo α/β preferida.

Os vectores de bacteriófagos modificados de modo a conter um gene de SASP foram denominados de um modo genérico vectores SASPject. 0 vector SASPject PTSA1.2/A é descrito em maior detalhe abaixo para distribuição do gene SASP a S. aureus, incluindo MRSA. Assim que o gene SASP foi distribuído à bactéria alvo, a SASP é produzida dentro das bactérias onde se liga ao ADN bacteriano e altera a conformação do ADN de tipo B para tipo A. A produção de SASP suficiente dentro das células bacterianas alvo provoca uma quebra na viabilidade das células afectadas; assim, a toxicidade provocada pela SASP é dependente da dose, que por sua vez está dependente da actividade do promotor e do número de cópias de promotor::SASP presentes.

Em geral, o gene da SASP e o seu promotor podem ser colocados em qualquer lugar dentro do genoma do bacteriófago. Todavia, é preferido que, para direccionar as bactérias patogénicas, o bacteriófago modificado seja não lítico e isto possa ser alcançado através da remoção ou inactivação de um ou mais genes requeridos pelo fago para lisar as bactérias infectadas, de um modo muto preferido, através da inactivação de, pelo menos, um dos genes de lise. Numa forma de realização preferida, o gene SASP é inserido num dos genes de lise ou o gene de lise é substituído pelo gene da toxina. Os genes para lisar bactérias infectadas incluem o gene da holina do bacteriófago e/ou um gene da amidase. Um ou mais destes genes pode ser interrompido ou substituído pelo gene SASP. Prevenir o bacteriófago modificado de lisar o seu hospedeiro bacteriano alvo permite a expressão e acumulação continuada da SASP, possivelmente para além do tempo no qual o bacteriófago iria normalmente provocar a lise do hospedeiro bacteriano. 9

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para inibir ou prevenir o crescimento da célula bacteriana, que compreende um bacteriófago modificado como aqui definido e um seu veiculo. Essa composição pode possuir uma vasta gama de utilizações e deve por isso ser formulada de acordo com a utilização pretendida. A composição pode ser formulada como um medicamento, especialmente para o tratamento humano e pode tratar vários estados, incluindo infecções bacterianas. Entre estas infecções tratáveis de acordo com a presente invenção estão infecções tópicas, cáries dentárias, infecções respiratórias, infecções dos olhos e infecções localizadas nos tecidos e órgãos. 0 veiculo pode ser um recipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. A natureza exacta e as quantidades dos componentes dessas composições podem ser determinadas empiricamente e irão depender, em parte, das vias de administração da composição.

As vias de administração para os recipientes incluem oral, bucal, sublingual, intranasal, por inalação, tópica (incluindo oftálmica) , intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea e intra-articular. Para conveniência de utilização, as dosagens de acordo com a invenção irão depender do sitio e do tipo de infecção a ser tratado ou prevenido. As infecções respiratórias podem ser tratadas por administração por inalação e as infecções dos olhos podem ser tratadas utilizando gotas para os olhos. Os produtos de higiene oral que contêm o bacteriófago modificado também são fornecidos; pode ser utilizado um desinfectante bucal ou pasta de dentes que contenha o bacteriófago modificado de acordo com a invenção formulada para eliminar bactérias associadas à formação da placa dentária. 10

Pode ser utilizado um bacteriófago modificado de acordo com a invenção como um descontaminante bacteriano, por exemplo, no tratamento da contaminação da superfície bacteriana, assim como, biorremediação de terrenos ou tratamento de águas. 0 bacteriófago pode ser utilizado no tratamento do pessoal médico e/ou doentes como o agente descontaminante, por exemplo num detergente para lavar as mãos. 0 tratamento das superfícies de trabalho e o equipamento é também fornecido, especialmente aquele utilizado em processos hospitalares ou na preparação de alimentos. Uma forma de realização particular compreende uma composição formulada para utilização tópica para prevenir, eliminar ou reduzir o transporte da bactéria e a contaminação de um indivíduo para outro. Isto é importante para limitar a transmissão de infecções microbianas, particularmente num ambiente hospitalar em que as bactérias resistentes aos antibióticos convencionais são prevalentes. Para tal utilização, o bacteriófago modificado pode estar contido em solução salina tamponada com Tris contendo CaCl2 (10 mM) e MgCl2 (1 mM) ou pode ser formulado num gel ou creme. Para utilização múltipla pode ser adicionado um conservante. Alternativamente, o produto pode ser liofilizado e podem ser adicionados excipientes, por exemplo, um açúcar, tal como sacarose.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção será agora descrita em maior detalhe, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos acompanhantes e ao exemplo seguinte. 11

Breve descrição dos desenhos:

Figura 1. Região de S. aureus fago φΐΐ, apresentando os genes da holina e da amidase, e os sitios de iniciação para amplificação dos genes e do ADN dos flancos.

Figura 2. Diagrama de pSAl, apresentando a região clonada e a localização dos sitios de iniciação para PCR inversa de pSAl.

Figura 3. Diagrama de pSA4, apresentando a região clonada do promotor-saspC com o gene de resistência ao cádmio (CdR) e o ADN dos flancos de φΐΐ, juntamente com a localização dos sitios de iniciação relevantes.

Figura 4. Disposição do ADN no genoma de PTL1003, apresentando a substituição do gene da holina com genes estranhos. A disposição dos genes o genoma de φΐΐ de tipo selvagem é apresentada para comparação.

Figura 5. Um exemplo de uma curva de mortalidade apresentando a eficácia de PTSA1.2/A contra uma estirpe de S. aureus.

Figura 6. Uma curva de mortalidade comparando a capacidade de matar de PTSA1.2/A com o mesmo fago menos o gene SASP.

Figura 7. Uma curva de morte de PTSA1.2/A infectando uma estirpe de S. aureus. 12

Sumário da construção de um bacteriófago geneticamente alterado contendo SASP-C sob o controlo de um promotor do homólogo da aldolase de bisfosfato de frutose (fbaA).

Os genes podem ser removidos e adicionados ao genoma do fago utilizando recombinação homóloga. Existem vários modos através doa quais os fagos que transportam genes estranhos e promotores podem ser construídos e o seguinte é um exemplo desses métodos.

Para a construção de um derivado de φΐΐ é apresentado como, utilizando um vector vaivém para E. coli/S. aureus, apenas como um exemplo, o gene da holina do fago foi substituído com o gene para SASP-C, sob o controlo de um homólogo do promotor de bisfosfato da frutose de S. aureus (é utilizado fbaA a partir daqui para designar o promotor da aldolase de bisfosfato da frutose). Os genes para resistência ao metal pesado Cádmio (de aqui em diante referido como CdR) são utilizados como um marcador de resistência não antibiótico.

As regiões fbaA-SASP-C e CdR foram clonadas entre duas regiões do ADN de φΐΐ que flanqueiam o gene da holina de φΐΐ. Subsequentemente, este plasmídeo foi introduzido nas células e os recombinantes duplos foram seleccionados, quando a holina foi substituída com a região fbaA-SASP-C e CdR.

Procedimentos Experimentais

Todas as reacções de PCR foram realizadas utilizando o sistema de PCR de Expansão com Elevada Fidelidade e condições restringentes, dependendo das temperaturas de fusão (Tm) dos iniciadores, de acordo com as instruções dos fabricantes. Salvo 13 técnicas as indicação em contrário, as técnicas gerais de biologia molecular, tais como digestão com enzimas de restrição, electroforese em gel de agarose, ligações dependentes da ligase de ADN de T4, preparação de células competentes e transformação foram baseadas nos métodos descritos em Sambrook et al. (1989). 0 ADN foi purificado a partir das reacções enzimáticas e preparado a partir das células que utilizam kits de purificação de ADN da Qiagen. As células de S. aureus foram transformadas com ADN plasmídico por electroporação, utilizando métodos, tais como aqueles descritos por Schenck e Ladagga (1992) .

Os iniciadores foram obtidos de Sigma Genosys. Quando os iniciadores incluem sequências de reconhecimento para enzimas de restrição, foram adicionados mais 2-6 nucleótidos na extremidade 5' para assegurar a digestão de ADN amplificado por PCR.

Todas as clonagens, salvo referência em contrário, são realizadas através da ligação dos ADN de um dia para o outro com ligase de ADN de T4 e depois transformando-as em estires de clonagem de E. coli, tais como DH5a ou XLl-Blue, com isolamento em meio selectivo, como descrito noutro local (Sambrook et al., 1989) .

Foi utilizado um vector vaivém de E. coli/S. aureus, designado pSM198 para transferir os genes entre E. coli e S. aureus. 0 plasmideo pSM198 foi previamente produzido através da combinação do vector de clonagem em E. coli pUC18 e as regiões de resistência à tetraciclina e de replicação do plasmideo pTl81 de S. aureus. 0 plasmideo transporta marcadores de resistência que podem ser seleccionados em E. coli e em S. aureus. Este plasmideo retém o sítio de clonagem múltiplo de pUC18 (MCS), 14 embora nem todos os sítios permaneçam como sítios únicos. Os sítios únicos que restam no MCS de pSM198 são: Ps ti, SAI I, BamEI, Saci e EcoRI.

Construção de um plasmídeo para a substituição direccionada do gene da holina de ¢11 com £baA-SASP-C/CdR 1. 0 plasmídeo pSAl, compreendendo pBluescript SK+ contendo um fragmento de 1,8 kb de φΐΐ abrangendo os genes líticos, foi construído como se segue. A Figura 1 apresenta os sítios de iniciação para os oligonucleótidos descritos abaixo para a amplificação de regiões do genoma de φΐΐ. A amplificação por PCR de φΐΐ ADN utilizando os iniciadores B1001 e B1002, foi realizada e produziu um fragmento de 1,8 kb que foi limpo e digerido com XbaI e PstI. Após digestão, o ADN foi limpo e clonado em pBluescript SK+ digerido com XbaI e PstI, produzindo pSAl. 0 iniciador B1001 (SEQ ID N°: 1) compreende um sítio 5' PstI (sublinhado) seguido pela sequência de φΐΐ (Genbank: AF424781) desde a base 39779 até à base 39798, (ver Figura 1) . 0 iniciador B 1002 (SEQ ID N°: 2) compreende um sitio Xbal (sublinhado) seguido pelo inverso e complementar da sequência de φΐΐ desde a base 41537 até à base 41556 (ver Figura 1). B1001 (SEQ ID N°:1) 5'-AACTGCAGGTGTATTGCAACAGATTGGCTC- 3' B1002 (SEQ ID N°:2) 5'-GCTCTAGACTTTGCTCCCTGCGTCGTTG-3' 15 2. A PCR inversa foi realizada em pSAl como o molde, utilizando os iniciadores B1003 (SEQ ID N°: 3) e B1004 (SEQ ID N°: 4) (ver Figura 2). 0 iniciador B1003 compreende um sitio 5' BamEI (sublinhado) seguido pela sequência inversa e complementar de φΐΐ desde a base 40454 até à base 40469 (ver Figura 1) . O iniciador B1004 compreende um sitio 5' Spel (sublinhado), seguido pela sequência de φΐΐ desde a base 40891 até à base 40911 (ver Figura 2). BI003 (SEQ ID N°. 3) 5'-CGGGATCCGACTAAAAATTAGTCG-3' BI004 (SEQ ID N°. 4) 5'-GGAC TAGTGAATGAGTATCATCATGGAGG-3'

Esta reacção de PCR produziu um fragmento de ~4,2 kb que constituiu: o braço esquerdo de φΐΐ, o plasmídeo pBluescript SK+ inteiro, e o braço direito de φΐΐ. Este fragmento foi digerido com BamEI e Spel, limpo, e subsequentemente, utilizado como um vector para clonar no fragmento seguinte. 3. A região de resistência ao cádmio de pl258 foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores B1005 e B1006, produzindo um fragmento de ~2,8 kb. O produto de PCR foi limpo e digerido com BamEI e XbaI. O produto de PCR digerido foi limpo e clonado em pSAl (amplificador por PCR e digerido, acima), produzindo pSA2. 16 0 iniciador Β1005 (SEQ ID N°: 5) é complementar ao ADN 308 pb a montante de ATG para o gene putativo da proteína reguladora da resposta ao cádmio cadC de pl258 (Genbank: J04551), estando a extremidade 3' mais próxima de ATG (ver Figura 3). A extremidade 5' do iniciador transporta uma cauda não complementar com um sítio Bam-Hl (sublinhado) para auxiliar a clonagem. O iniciador B1006 (SEQ ID N° : 6) é complementar ao ADN na extremidade 3' do gene cadA para a proteína de resistência ao cádmio do plasmídeo pl258, de modo a que, pelo menos, 3 nucleótidos complementares sejam complementares ao códão de terminação TAG do gene cadA (ver Figura 3). A extremidade 5' contém um sítio não complementar Xfoal (sublinhado) para auxiliar a clonagem. BI005 (SEQ ID N°: 5) 5'-CGATGGATCCTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTC- 3' B1006 (SEQ ID N°: 6) 5'-GCAGACCGCGGCTATTTATCCTTCACTCTCATC- 3' 4. O ADN que contém os braços esquerdo e direito de φΐΐ e CdR foi cortado do pSA2 utilizando PstI e Saci, e purificado do gel a partir do vector. Este fragmento foi clonado num vector vaivém pSM198 que foi também cortado com PstI e Saci. Os clones foram rastreados para o fragmento de restrição e os candidatos foram enviados para sequenciação. Foi identificada uma construção de plasmídeo correcto e designada pSA3. Este plasmídeo foi utlizado para clonagem nos fragmentos seguintes. 17 5. A amplificação por PCR do promotor de fbaA utilizando Bi007 e B1008 produziu um fragmento de aproximadamente 300 pb que foi limpo e subsequentemente, digerido com Nco I, depois re-limpo. O fragmento de PCR fbaA foi ligado à sequência que codifica SASP-C de B. megaterium. A amplificação e preparação do gene SASP-C é descrita abaixo. O iniciador B1007 (SEQ ID N°: 7) compreende uma cauda da sequência em 5' que inclui um sitio BamRI, seguido pelo complemento inverso das bases 2189404 até 2189427 do genoma de S. aureus NCTC 8325 (Genbank: CP000253) (ver Figura 3). 0 oligonucleótido B1008 (SEQ ID N°: 8) compreende uma cauda de sequência que inclui um sitio Ncol, depois a sequência de bases 2189214 até 2189232 do genoma de S. aureus NCTC 8325 (ver Figura 3). Quando o produto de PCR é produzido utilizando este iniciador, o sítio IVcol incorporado no iniciador no ATG do gene resulta na alteração da base 2 nucleótidos a montante do ATG de T>C. BI 0 0 7 (SEQ ID N°: 7) 5'-CTACGGATCCTTTATCCTCCAATCTACTTATAAA - 3' B 1008 (SEQ ID N°: 8) 5'-CATGCCATGGAAGTTCCTCCTTGAGTGCT-3' 6. O gene SASP-C da estirpe KM de B. megaterium (ATCC 13632) foi amplificado por PCR com os iniciadores B 1009 e B1010 e produziu um fragmento de -300 pb. O produto de PCR foi limpo e digerido com NcoI. O produto de PCR digerido foi limpo e 18 utilizado numa ligação com o fragmento de PCR de fbaA, como descrito abaixo. 0 oligonucleótido B1009 (SEQ ID N°: 9) compreende uma cauda 5' contendo um sítio IVcol e é complementar aos primeiros 20 nucleótidos de SASP-C (n° de acesso K01833), começando em ATG, da estirpe KM de B. megaterium (ver Figura 3). O sítio Ncol no início do oligonucleótido incorpora o ATG do gene SASP-C. B1009 (SEQ ID N°: 9) 5'-CGATCCATGGCAAATTATCAAAACGC-3' O oligonucleótido B1010 (SEQ ID N°: 10) compreende um sítio BglII (sublinhado), e um sítio EcoRI (duplo sublinhado), seguido pelo complemento inverso de ADN começando 59 bases a jusante do códão de terminação a 74 bases a jusante do códão de terminação do gene SASP-C (ver Figura 3). B1010 (SEQ ID N°: 10) 5'-AGTGAGATCTGAATTCGCTGATTAAAAGAAAC- 3' 7. Os fragmentos de PCR fbaA e SASP-C (ambos cortados com Ncol) foram ligados em conjunto utilizando uma ligase de ADN de T4. Os ADN ligados foram utilizados como um molde para PCR, para amplificar os ADN de fbaA e de SASP-C unidos. A PCR foi realizada utilizando os iniciadores B1007 e B1010. O produto principal de PCR de -500 pb foi purificado a partir do gel. O produto de PCR foi digerido com BamHI e BglII e limpo. Este fragmento foi clonado em pSA3 que foi preparado como se segue. O plasmídeo foi cortado com BamHI, e as 19 extremidades foram desfosforiladas utilizando fosfatase alcalina de intestino de vitela (CIAP). 0 ADN foi novamente limpo.

Os plasmideos foram rastreados de modo a que a extremidade do gene SASP-C fosse adjacente à região do "braço esquerdo" de φΐΐ, e de modo a que o início do promotor fbaA fosse adjacente à região de resistência ao cloreto de cádmio. 0 plasmídeo resultante, que contém íbaA-SASP-C, foi designado pSA4.

Substituição do gene da holina do fago φΐΐ de S. aureus com fbaA-SASP-C e o marcador CdR 1. 0 pSA4 foi transformado em S. aureus estirpe PTL47. 0 PTL47 é um monolisogénio de φΐΐ em RN4220.

2. As células que sofreram um duplo cruzamento, em que o ADN contido entre os braços de φΐΐ esquerdo e direito de pSA4 substituíram o ADN entre os braços esquerdo e direito de φΐΐ no genoma do fago (i. e. o gene da holina) deram origem a colónias com o seguinte fenótipo: resistente a CdCl2 (0,1 mM), sensível à tetraciclina (5 pg/mL). A resistência à tetraciclina é realizada pelo vector de vaivém pSMl98. A perda de resistência à tetraciclina é indicativa de perda do pSM 198. As colónias que tinham o fenótipo: CdCl2R, tetraciclinas foram novamente rastreadas por PCR de colónia 3. As reacções de PCR foram realizadas para verificar que o gene da holina gene já não estava presente e que o fbaA-SASP-C e o gene CdCl2R estavam presentes e correctamente colocados no genoma do pró-fago φΐΐ. Os 20 fragmentos de PCR foram sequenciados para assegurar que o isolado continha a sequência esperada, especialmente nas regiões: fbaA e SASP-C.

As construções de pró-fago verificadas foram então identificadas e foi escolhida uma representativa e designada PTL1001. 4. 0 fago foi induzido a partir de uma cultura da estirpe PTL1001 através de choque térmico e as células foram lisadas com lisostafina (0,25 mg/mL) e, depois, filtradas através de um filtro de 0,2 pm, produzindo um lisado fágico bruto sem células. 5. Este lisado foi utilizado para infectar a estirpe 8325-4 de S. aureus. A mistura de infecção foi plaqueada em placas de agar de φνΡΒ (caldo de vegetal e peptona contendo 10 g/L de cloreto de sódio) + CdCl2 (0,1 mM) para seleccionar lisogénios após crescimento de um dia para o outro a 37 °C. 6. Os lisogénios foram verificados por PCR das colónias como descrito acima. Foi identificado um lisogénio verificado e designado PTL1002. 7. O PTL1002 foi passado 5 vezes por φνΡΒ agar, seleccionado uma colónia isolada e re-estriado para obter colónias isoladas em cada passagem. 8. Uma única colónia foi retirada e analisada de novo por PCR e sequenciação. O isolado verificado foi denominado PTL1003. O fago transportado por esta estirpe lisogénica é denominado PTSA1.2/A (ver Figura 4). 21 0 vector SASPject PTSA1.2/A foi testado contra um painel de estirpes de S. aureus e isolados clínicos, incluindo estirpes de S. aureus sensível a meticilina (MSSA) e MRSA que pertencem a cada um dos 5 tipos scc-mec reconhecidos. Um exemplo de uma curva de mortalidade que apresenta a eficácia de PTSA1.2/A contra uma estirpe de S. aureus é dado na Figura 5.

Uma curva de mortalidade comparando a capacidade para matar de PTSA1.2/A versus o mesmo fago menos o gene SASP (fago SAO/A) é dada na Figura 6 e confirma que a taxa de mortalidade é devida à presença da SASP.

Uma curva de mortalidade de PTSA1.2/A infectante da estirpe S. aureus que é um monolisogénio de PTSA1.2/A é dada na Figura 7 e mostra que a imunidade para a superinfecção para o fago não evita que os SASP de inibir células infectadas.

REFERÊNCIAS

Donegan, N. 2006. Annual Meeting of the Soc. for Healthcare Epidemiology of America.

Francesconi, S.C., MacAlister, T.J., Setlow, B. e Setlow, P. 1988. Immunoelectron microscopic localization of small, acid-soluble spore proteins in sporulating cells of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 170: 5963-5967.

Frenkiel-Krispin, D., Sack R., Englander, J., E. Shimoni, Eisenstein, M., Bullitt, Horowitz-Scherer, E. R., Hayes, C. S.,

Setlow, P., Minsky, A. e Wolf, S.G. 2004. Structure of the 22 AND-SspC Complex: Implications for DNA Packaging, Protection, and Repair in Bacterial Spores. J. Bacteriol. 186: 3525 - 3530.

Mainous, A.G. III, Hueston, W.J., Everett, C.J. e Diaz V.A. 2006. Nasal Carriage of Staphylococcus aureus and Methicillin Resistant S. aureus in the US 2001-2002. Annals of Family Medicine 4:132-137.

Nicholson, W. L., Setlow, B. e Setlow, P. 1990 . Binding of DNA in vitro by a small, acid-soluble spore protein from Bacillus subtilis and the effect of this binding on DNA topology. J. Bacteriol. 172: 6900-6906.

Noskin, G.A., Rubin, R. J., Schentag, J. J., Kluytmans, J., Hedblom, E. C., Smulders, M., Lapetina, E. e Gemmen, E. 2005. The Burden of Staphylococcus aureus Infections on Hospitais in the United States: An Analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Arch Intern Med 165: 1756-1761

Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, 1989).

Schenk, S., and R. A. Laddaga. 1992. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett. 73 :133-138. 23 APENDICE 1 fagos.

Uma lista de patogénios comuns e alguns dos seus (Esta lista é representativa mas não exaustiva).

Colifagos: Bacteriófago lambda Bacteriófago 933W (. Bacteriófago VT2-Sa Colifago 186 Colifago Pi Colifago P2 Colifago N15 Bacteriófago T3 Bacteriófago T 4 Bacteriófago T 7 Bacteriófago KU1

Bacteriófagos de Salmonella spp

Bacteriófago Felix Bacteriófago P22 Bacteriófago L Bacteriófago 102 Bacteriófago 31 Bacteriófago F0 Bacteriófago 14 Bacteriófago 163 Bacteriófago 175 24

Bacteriófago Vir Bacteriófago ViVI Bacteriófago 8 Bacteriófago 23 Bacteriófago 25 Bacteriófago 46 Bacteriófago E15 Bacteriófago E34 Bacteriófago 9B

Bacteriófagos de Shigella dysenteriae

Bacteriófago φ80 Bacteriófago P2 Bacteriófago 2 Bacteriófago 37

Bacteriófagos de Vibrio cholerae

Bacteriófago fs-2 Bacteriófago 138 Bacteriófago 145 Bacteriófago 149 Bacteriófago 163

Bacteriófagos de Mycoplasma arthritidis

Bacteriófago MAV1 25

Bacteriófagos de Streptococci

Bacteriófago CP-1 Bacteriófago φΧζ40 Bacteriófago IA Bacteriófago 1B Bacteriófago 12/12 Bacteriófago 113 Bacteriófago 120 Bacteriófago 124

Bacteriófagos de Pseudomonas aeruginosa

Bacteriófago D3 Bacteriófago φΟΤΧ Bacteriófago PP7

Bacteriófagos de Haemophilus influenzae

Bacteriófago S2 Bacteriófago HP1 Bacteriófago flu Bacteriófago Um

Bacteriófagos de Staphylococcus aureus

Bacteriófago Twort Bacteriófago tIII-29S 26

Bacteriófago <£PVL Bacteriófago φΡν83 Bacteriófago φΐΐ Bacteriófago φ12 Bacteriófago φ13 Bacteriófago φ42 Bacteriófago φ812 Bacteriófago Κ Bacteriófago Ρ3 Bacteriófago Ρ14 Bacteriófago UC18 Bacteriófago 15 Bacteriófago 17 Bacteriófago 29 Bacteriófago 42d Bacteriófago 47 Bacteriófago 52 Bacteriófago 53 Bacteriófago 79 Bacteriófago 80 Bacteriófago 81 Bacteriófago 83 Bacteriófago 85 Bacteriófago 93 Bacteriófago 95 Bacteriófago 187 Bacteriófagos > de Chlamydia Bacteriófago φΟΡΑϊ73 9 27

Micobacteriófago

Bacteriófago L5 Bacteriófago LG Bacteriófago D29 Bacteriófago Rvl Bacteriófago Rv2 Bacteriófago DSGA

Bacteriófagos de Listeria monocytogenes

Bacteriófago A118 Bacteriófago 243 Bacteriófago A500 Bacteriófago A511 Bacteriófago 10 Bacteriófago 2685 Bacteriófago 12029 Bacteriófago 52 Bacteriófago 3274

Bacteriófagos de Klebsiella pneumoniae

Bacteriófago 60 Bacteriófago 92 28

Bacteriófagos de Yersinia pestis

Bacteriófago R Bacteriófago Y Bacteriófago PI

LISTAGEM DE SEQUENCIA <110> Phico Therapeutics Ltd <120> Bacteriófago modificado

<130> 313609/JND/CJS <150> UKO 715 416.4 <151> 2007-08-07 <160> 10

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador B1001 29 <4 Ο 0> 1 aactgcaggt gtattgcaac agattggctc 30 <210> 2 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador B1002 <400> 2 gctctagact ttgctccctg cgtcgttg 28 <210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador B1003 <400> 3 cgggatccga ctaaaaatta gtcg 24 <210> 4 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador B1004 30 <400> 4 ggactagtga atgagtatca tcatggagg 29 <210> 5 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial sequência <220> <223> Iniciador B1005 <400> 5 cgatggatcc tctcatttat aaggttaaat aattc 35 <210> 6 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador B1006 <400> 6 gcagaccgcg gctatttatc cttcactctc ate 33 <210> 7 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial sequência 31 <22 0> <223> Iniciador B1007 <400> 7 ctacggatcc tttatcctcc aatctactta taaa 34 <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial sequência <220> <223> Iniciador B1008 <400> 8 catgccatgg aagttcctcc ttgagtgct 29 <210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial sequência <220> <223> Iniciador B1009 <400> 9 cgatccatgg caaattatca aaacgc 26 <210> 10

<211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial 32 <220> <223> Iniciador Β1010 <400> 10 agtgagatct gaattcgctg attaaaagaa ac 32

Lisboa, 27 de Março de 2013 33

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Bacteriófago modificado capaz de infectar uma bactéria alvo, bacteriófago esse que inclui um gene da proteína pequena do esporo solúvel em água α/β (SASP) que codifica uma SASP que é tóxica para a bactéria alvo, em que o gene SASP está sob o controlo de um promotor constitutivo que é estranho ao bacteriófago e o gene SASP, promotor esse que é suficientemente forte para conduzir a produção de níveis tóxicos de SASP quando o bacteriófago modificado está presente em múltiplas cópias na bactéria alvo e em que o bacteriófago é capaz de formar um lisogénio contendo uma cópia única do gene SASP numa estirpe de hospedeiro bacteriano produtora.
2. 2. Bacteriófago modificado de acordo com reivindicação 2, em que a SASP compreende SASPC de B. megaterium.
3. 3. Bacteriófago modificado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, que compreende um bacteriófago modificado de S. aureus.
4. 4. Bacteriófago modificado de acordo com a reivindicação 3, em que o bacteriófago de S. aureus é um bacteriófago 0ll.
5. 5. Bacteriófago modificado de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o promotor é seleccionado de pdhA, rpsB, pgi, fbaA e sequências possuindo mais de 90% de identidade com estes. 1
6. 6. Bacteriófago modificado de acordo com reivindicação 5, em que o promotor bacteriano fbaA é de S. aureus.
7. 7. Bacteriófago modificado de acordo com qualquer reivindicação anterior, que é não litico, opcionalmente em que o gene SASP é inserido num seu gene de lise.
8. 8. Bacteriófago modificado de acordo com a reivindicação 7, que é holina.
9. 9. Bacteriófago modificado de acordo com qualquer reivindicação anterior, que compreende ainda um marcador de resistência não antibiótica, tal como um marcador de resistência a cádmio.
10. 10. Composição para inibir ou prevenir o crescimento de células bacterianas, que compreende um bacteriófago modificado de acordo com qualquer reivindicação anterior e um seu veículo.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, que é formulada para utilização tópica.
12. 12. Bacteriófago modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para utilização como um medicamento.
13. 13. Utilização de um bacteriófago modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, como um descontaminante bacteriano não terapêutico.
14. Bacteriófago modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para utilização na inibição ou prevenção de infecção bacteriana. 2 14.
15. 15. Processo para a produção de um bacteriófago modificado capaz de infectar uma bactéria alvo, processo que compreende o crescimento de um hospedeiro bacteriano compreendendo material genético que codifica o bacteriófago de qualquer reivindicação anterior num meio de crescimento; fazendo com que o bacteriófago replique no hospedeiro bacteriano; e recolhendo o bacteriófago. Lisboa, 27 de Março de 2013 3