PT2173767E - Processo otimizado de purificação da proteína do fator de crescimento recombinante - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO OTIMIZADO DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA DO FATOR DE CRESCIMENTO RECOMBINANTE"

Esta invenção relaciona-se com um método avançado para a produção procariótica e purificação eficientes de proteínas recombinantes do fator de crescimento. Mais particularmente, diz respeito a modificações processuais resultando num melhor rendimento da proteína, maior pureza do produto e uma aplicabilidade industrial melhorada do referido processo.

Os Fatores de Crescimento e Diferenciação (GDF's - do inglês Growth and Diferentiation Factors) são citoquinas homodiméricas que promovem a proliferação/diferenciação celular e a regeneração de tecidos. Um GDF útil numa vasta extensão de aplicações médicas é o Fator de

Crescimento/Diferenciação 5 (GDF-5). Em especial, as propriedades osteogénicas do GDF-5 foram aplicadas com êxito no passado, isto é, para ajudar na cicatrização de fraturas ósseas locais. Parentes muito próximos do GDF-5 com funções biológicas sobreponíveis e homologias de aminoácidos extremamente elevadas são o GDF-6 e o GDF-7. 0 grupo GDF-5/-6/-7 é conservado entre os mamíferos mas não possui ortólogos conhecidos nos invertebrados (Ducy e Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214).

In vivo, os membros desta família de proteínas são inicialmente sintetizados como proteínas precursoras longas que subsequentemente sofrem clivagem proteolítica num agregado de resíduos básicos a aproximadamente 110-140 aminoácidos do C-terminal, libertando deste modo as partes 2 da proteína madura do C-terminal bioativo, do predomínio N-terminal. Todos os polipéptidos maduros estão estruturalmente relacionados e contêm um domínio bioativo conservado que compreende seis ou sete cisteínas canónicas. Pontes de dissulfureto entre esses resíduos contribuem para o motivo tridimensional de "nó de cistina" característico desta família de proteínas. A expressão do GDF-5 maduro em hospedeiros procarióticos já foi conseguida no passado (ver por exemplo Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, p. 646-652, 1994). No entanto, estas proteínas não se conseguem preparar facilmente numa forma pura. Quando expressas em larga escala em E. coli, a proteína desejada tende geralmente a formar uma proteína monomérica e inativa com um tamanho de 14 kDa que é acumulada em corpos de inclusão. Para se obter o fator de crescimento dimérico bioativo (28 kDa), a proteína monomérica de corpo de inclusão tem que ser solubilizada, purificada e renaturada na forma de um homodímero com a estrutura típica de nó de cistina. Este procedimento é geralmente chamado refolding.

Devido a uma solubilidade extremamente baixa em soluções aquosas de valores de pH entre pH 4 e pH 9, bem como a outras características invulgares das proteínas, a purificação e refolding das proteínas relacionadas com o GDF-5 que são produzidas nos procariontes envolvem necessariamente vários passos processuais especificamente adaptados. Por exemplo, dado que as proteínas refolded relacionadas com o GDF-5 tendem a adsorver-se a uma resina cromatográfica, tornou-se aparente que a purificação da proteína desejada na produção em larga escala não pode ser realizada de acordo com protocolos padrão de purificação e 3 3 da proteína purificação (tais como componentes cromatográficos aquosos. Depois estar refolfed, são aplicados métodos de primários que utilizam solventes orgânicos cromatografia de fase reversa).

Um processo recentemente desenvolvido de produção e purificação de proteínas relacionadas com o GDF-5 produzidas de forma recombinantemente é divulgado na patente WO 96/33215 e EP1449848. 0 método baseia-se na purificação da proteína monomérica antes do procedimento de refolding e compreende os seguintes passos principais: 1. cultura bacteriana, rutura das células e recuperação de corpos de inclusão, 2. tratamento com um agente desnaturante para obter o monómero solubilizado, 3. separação por cromatografia de permuta iónica, 4. sulfonação (o passo de sulfonação é opcional), 5. separação por cromatografia de filtração em gel, 6. refolding, 7. recuperação por precipitação isoelétrica, e 8. separação por cromatografia de fase reversa.

Embora o procedimento tal como descrito acima seja basicamente aplicável, foram encontradas algumas dificuldades no método nos dois primeiros passos processuais, que afetam tanto o rendimento como a pureza da proteína alvo. 0 rendimento obtenível da proteína relacionada com o GDF-5 é significativamente mais baixo do que o esperado teoricamente, principalmente devido a acontecimentos de degradação parcial relacionados com uma solução invulgarmente turva/viscosa durante a solubilização da proteína do corpo de inclusão. Deste modo, é óbvio que 4 os parâmetros e condições do processo divulgados devem ser melhorados.

Os objetivos desta invenção são ultrapassar os problemas acima mencionados e otimizar o rendimento e a pureza das proteínas relacionadas com o GDF-5 recombinante.

Estes objetivos resolvem-se pelo desenvolvimento de métodos avançados divulgados a seguir para a produção de proteínas relacionadas com o GDF-5 recombinante em E. coli.

Antes da descrição detalhada da invenção devem-se definir e exemplificar alguns termos frequentemente utilizados, tal como se segue: 0 termo "dominio de nó de cistina", tal como é utilizado aqui, significa a região de aminoácidos rica em cisterna bem conhecida e conservada, que está presente nas partes maduras das proteínas da superfamilia de TGF-beta tais como, isto é, GDF-5 humano e que forma uma estrutura proteica tridimensional conhecida como nó de cistina. Neste dominio, é importante a localização respetiva dos residuos de cisterna uns relativamente aos outros, e permite-se apenas que ela varie ligeiramente para não se perder a atividade biológica. Foi demonstrado que o dominio de nó de cistina por si só é suficiente para a função biológica da proteina (Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). As sequências de consenso para dominios de nó de cistina são bem conhecidas no estado da técnica. De acordo com a definição aqui definida, o dominio de nó de cistina de uma proteina começa com o primeiro residuo de cisterna que participa no nó de cistina da respetiva proteina, e termina com o residuo que se segue à 5 última cisteína que participa no nó de cistina da respetiva proteína. Por exemplo, o domínio de nó de cistina da proteína precursora do GDF-5 humano (ID SEQ NO: 1) consiste nos aminoácidos 400-501 (ver também a FIG.l). O termo "proteína relacionada com o GDF-5" tal como aqui utilizado significa qualquer proteína de origem natural ou criada artificialmente, que compreende um domínio de nó de cistina com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 60% com o domínio de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano (aminoácidos 400-501 da ID SEQ NO: 1). Este termo inclui proteínas com propriedades biofísicas semelhantes que pertencem ao grupo das proteínas do GDF-5, GDF-6 e GDF-7 de espécies de vertebrados ou mamíferos bem como variantes recombinantes das mesmas, desde que estas proteínas apresentem as percentagens de identidade com o domínio de nó de cistina do GDF-5 humano acima mencionadas. O valor limitante de 60% é bem adequado para separar membros do grupo de proteínas dos GDF-5/-6/-7 bem como respetivas variantes de outras proteínas tais como outros GDFs e BMPs. Uma comparação dos domínios de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano, GDF-6 humano e GDF-7 humano (ver a FIG.2) revela o elevado grau de identidade de aminoácidos entre estas proteínas. O GDF-6 humano partilha 87 (85%) e o GDF-7 humano partilha 83 (81%) resíduos idênticos com o domínio de nó de cistina do GDF-5 humano. Os respetivos domínios das moléculas GDF-5/-6/-7 de outras espécies de vertebrados e mamíferos que foram identificados até agora também apresentam percentagens de identidade muito elevadas de pelo menos 75% (entre 79% e 99%), quando comparadas com o GDF-5 humano. Em contraste, os GDFs e BMPs que não pertencem ao subgrupo do GDF-5/-6/-7 mostram valores de identidade muito mais baixos, abaixo de 60% (ver a FIG.3). 6 A determinação das correspondentes posições dos aminoácidos em sequências de aminoácidos relacionadas, bem como o cálculo de percentagens de identidade entre eles podem ser facilmente levados a cabo com a ajuda de algoritmos de alinhamento bem conhecidos e, opcionalmente, de programas computacionais que utilizam estes algoritmos. Por exemplo, as identidades de aminoácidos neste pedido de patente (isto é, FIG. 2) foram calculadas por meio do alinhamento de sequências com o programa gratuito ClustalX (Versão 1,81) com parâmetros padrão e posterior contagem manual de residuos idênticos. As configurações padrão para alinhamento aos pares (baixa precisão) são: parâmetro de abertura de hiato: 10,00; parâmetro de extensão de hiato 0,10; matriz de peso da proteina: Gonnet 250. O programa ClustalX é descrito em detalhe em

Thompson, J.D, Gibson, T.J., Plewhiak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. (1997):

The ClustalX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.

Nucleic Acids Research 24:4876-4882. O ClustalX é uma interface do Windows para o programa de alinhamento de sequências múltiplo ClustalW e está, isto é, disponível a partir de várias fontes, isto é, mediante ftp anónimo de ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk ou através de download da seguinte página web: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/. O programa

ClustalW e o algoritmo também se descrevem em pormenor em

Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994): 7 CLUSTAIW: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680. O termo "variante" tal como é utilizado aqui significa qualquer um dos seguintes polipéptidos: a) fragmentos biologicamente ativos de uma proteina b) constructos de proteínas biologicamente ativas que contêm sequências adicionais em excesso relativamente à sequência original da proteína c) qualquer combinação de a) e b)

Os termos "tampão de dissolução" ou "tampão de solubilização" de corpos de inclusão significam soluções que são usadas para a solubilização de corpos de inclusão e para a desnaturação da proteína incorporada nos referidos corpos de inclusão. O termo "atividade biológica" indica a atividade de compostos terapêuticos, incluindo, por exemplo, uma proteína relacionada com o GDF-5 tal como medida através dos ensaios comuns de fosfatase alcalina in vitro (ALP - do inglês ALkaline Phosphatase), por exemplo tal como descrito no exemplo 5 ou em Takuwa et al. (1989), Am. J. Physiol. 257, E797-E803) . Linhas celulares adequadas que podem ser utilizadas no tal ensaio ALP são por exemplo as células ATDC-5 ou MCHT 1/26.

Em seguida é feita uma descrição mais detalhada da invenção: 0 método de fabrico de proteínas relacionadas com o GDF-5 recombinante, e em particular do GDF-5 recombinante humano, compreende os passos iniciais de fermentação em E. coli, recolha da biomassa, rutura da célula, recolha/lavagem do corpo de inclusão e dissolução do corpo de inclusão sob condições desnaturantes. Posteriormente, a proteína desnaturada é sujeita a passos de purificação downstream e a um procedimento de refolding como por exemplo descrito na patente WO 96/33215. 0 passo de rutura das células mencionado é efetuado rotineiramente usando um homogeneizador de alta pressão. Depois, os corpos de inclusão (IBs - do inglês Inclusion Bodies) são normalmente recolhidos por centrifugação e (opcionalmente) lavados repetidamente. A dissolução completa (solubilização) da proteína de corpo de inclusão antes dos passos posteriores de purificação é conseguida por suspensão num tampão de solubilização que compreende grandes quantidades de ureia desnaturante.

Notavelmente, a solução de solubilização contendo agora a proteína de corpo de inclusão monomérica e desnaturada parece estar extremamente turva e viscosa, mesmo depois de filtração prévia ou centrifugação. Ao mesmo tempo, ocorre uma fragmentação dependente do tempo do GDF-5 monomérico (ver a FIG. 5), um processo que em último caso conduz a uma destruição/redução do tamanho de uma parte significativa do monómero do GDF-5. Em menos de 1,5 horas, o tamanho da proteína monomérica madura é consideravelmente reduzido dos 14 kD originais para aproximadamente 10 kD na solução de dissolução. Esta ocorrência de degradação indesejada e rápida parece estar relacionada com a sequência/conformação e está restringida ao passo de solubilização do corpo de 9 inclusão. 0 processo de degradação dependente do tempo interfere especialmente com a produção da proteina em grandes escalas/escalas industriais, dado que os tempos de processamento sofrem normalmente um acréscimo como resultado do aumento da escala. Em consequência, o rendimento e a pureza da proteina relacionada com o GDF-5 finalmente obtida após o procedimento global de purificação são significativamente reduzidos.

Para ultrapassar os problemas divulgados os inventores fizeram investigações consideráveis e seguiram uma variedade de diferentes aproximações que resultaram finalmente num processo de purificação modificado. Estas tentativas incluíram variações no procedimento de rutura das células, experiências de inativação da protease a fim de combater uma potencial contaminação enzimática/proteolitica, alterações à concentração de solubilização critica e/ou componentes do tampão de lavagem, e adição de diferentes compostos químicos ao tampão de solubilização.

Enquanto que todos os diferentes esforços com o intuito de verificar e inativar uma suposta atividade proteolítica que contribua para a degradação observada da proteína falharam (ver exemplo 3: Inibição química e inativação pelo calor), os inventores descobriram que mesmo assim se pode obter uma redução da fragmentação da proteína e um rendimento/pureza da proteína mais elevados pela implementação de duas modificações importantes relacionadas com o processo, isoladamente ou (preferencialmente) em combinação. Estas modificações são formas de realização específicas da invenção divulgada e relacionam-se com 1) a adaptação do procedimento de rutura das células e 2) a otimização da 10 composição do tampão de solubilização. Elas são exemplificadas doravante mais em detalhe: 1) Modificação da rutura das células por homogeneização a alta pressão

Determinou-se que a turbidez e viscosidade invulgarmente elevadas da solução de solubilização (que compreende os corpos de inclusão solubilizados) são prejudiciais para o processo de purificação downstream das proteínas relacionadas com o GDF-5 e têm que ser evitadas. Enquanto que nem os passos adicionais de filtração nem de centrifugação anteriores à solubilização do corpo de inclusão puderam resolver o problema, esta questão verificou-se inesperadamente ser endereçável por meio de uma modificação muito seletiva da pressão de rutura das células aplicada. Enquanto que esta pressão é normalmente variável num intervalo largo (por exemplo de 100 a 2000 bar) sem impactos dramáticos na solubilização do corpo de inclusão, é imperativo limitar esta pressão a um intervalo estreito se se purificarem as proteínas relacionadas com o GDF-5. Mais precisamente, se se aplicar uma pressão de rutura entre os 800 - 900 bar, é detetável uma solução significativamente mais límpida dos corpos de inclusão solubilizados e um aumento no rendimento do produto durante a primeira parte do processo de purificação das proteínas relacionadas com o GDF-5. Suplementarmente, a razão (rhGDF-5/proteína total) é consideravelmente melhorada à pressão de rutura mais elevada. Por causa da melhor filterabilidade, o tempo de processamento global é mais curto e assim a fragmentação da proteína dependente do tempo é reduzida. Em contraste, pressões de rutura acima ou abaixo deste intervalo são prejudiciais e conduzem a 11 reduções significativas no rendimento (ver por exemplo a FIG 6). 2) Modificações na composição do tampão de solubilização

As seguintes modificações nos componentes do tampão de solubilização são cobertas por esta invenção:

Ureia/suplementação com L-arginina

Embora não se descreva no estado da técnica um efeito prejudicial da ureia na estabilidade da estrutura primária de Fatores de Crescimento e Diferenciação (GDF's), os inventores descobriram que a fragmentação das proteínas relacionadas com o GDF-5 não ocorre se a ureia for completamente removida de todas as soluções (por exemplo dos tampões de lavagem e solubilização) que estão em contacto com os corpos de inclusão. No entanto, não é possivel a eliminação de um agente desnaturante dos tampões de solubilização a fim de manter o efeito desnaturante desejado. Infelizmente, a substituição da ureia por cloridrato de guanidina (GuHCl) como um desnaturante alternativo também não é recomendável em plantas de produção industrial devido ao favorecimento da corrosão pelos sais de guanidina (que em certos casos podem levar a um reduzido tempo de vida útil das tubagens e tanques) . Suplementarmente o GuHCl é muito caro e pode aumentar os custos relacionados com o processo.

Os inventores procuraram por conseguinte um modo alternativo para eliminar o decaimento supracitado do GDF-5 relacionado com a protease. Como resultado de experiências detalhadas, descobriu-se que a referida fragmentação das 12 proteínas relacionadas com o GDF-5 pode ser eliminada em tampões de solubilização contendo ureia, se as referidas soluções forem suplementadas com concentrações definidas de L-arginina como um aditivo protetor.

Como se mostra no exemplo 3/Fig. 7 e 8, a adição de L-arginina a soluções contendo ureia reduz ou elimina a degradação do GDF-5 de forma dependente da concentração. A degradação pôde ser reduzida em aproximadamente 50 por cento com tampões contendo pelo menos L-arginina 100 mM, e termina completamente com o uso de tampões de dissolução contendo L-arginina 500 mM ou mais. Mesmo concentrações menores de L-arginina (tais como L-Arginina 1 mM no tampão A4 do exemplo 3) exibem um efeito detetável de inibição de fragmentação. O uso de L-arginina como um ingrediente suplementar para tampões de solubilização contendo ureia, de corpos de inclusão contendo proteínas relacionadas com o GDF-5, tem várias vantagens. Em primeiro lugar, dado que a L-arginina é um produto químico de preço comparativamente baixo, o custo-eficácia do processo de purificação da proteína é mantido não obstante a adição desta substância. Em segundo lugar, uma combinação de ureia e L-arginina é muito menos corrosiva que uma solução desnaturante compreendendo cloridrato de guanidina. Em terceiro lugar, a L-arginina é mais amiga do ambiente comparativamente aos sais de guanidínio que requerem eliminação especial. Esta vantagem torna a invenção especialmente útil para plantas industriais com equipamentos ricos em metais. Suplementarmente a L-arginina pode ser facilmente removida do processo de purificação por aplicação de um simples passo de diafiltracão, por exemplo diretamente depois da 13 solubilização dos corpos de inclusão. Isto é especialmente importante dado que a adição proposta de L-arginina ao tampão de solubilização interfere com a ligação subsequente das proteínas relacionadas com o GDF-5 à coluna de cromatografia de permuta iónica (IEC - do inglês Ion Exchange Chromatography) (ver o exemplo 4). A diafiltração e a IEC são facilitadas se forem aplicados (opcionalmente) passos adicionais de purificação (por exemplo centrifugação, filtração em profundidade e/ou filtração estéril) após a solubilização do corpo de inclusão a fim de remover contaminantes de elevado peso molecular tais como detritos celulares. Parâmetros possíveis de tamanho do poro para a filtração em profundidade são por exemplo 0,1 - 0,7 ym, para a filtração estéril são por exemplo 0,22 ym.

Assim, de acordo com uma forma de realização preferida da invenção e com o objetivo de evitar a fragmentação/degradação da proteína, um tampão de solubilização para o tratamento de corpos de inclusão de proteínas relacionadas com o GDF-5 deve conter L-arginina. A concentração preferida deste aditivo varia entre L-arginina 100 e 1000 mM nos tampões de solubilização da invenção. A concentração mais preferida de L-arginina é de 400 a 500 mM. No entanto, também é possível usar uma concentração de L-arginina mais elevada (por exemplo até 2000 mM) que pode ser útil no caso de períodos de incubação/processamento extremamente longos.

Os tampões de solubilização da invenção são ainda caracterizados por conter ureia entre 4 e 8 M como agente desnaturante. O mais preferido é um tampão de solubilização contendo ureia 6 M. 14

Outras partes da invenção relacionam-se com modificações suplementares dos referidos tampões de solubilização que possuem efeitos menos dramáticos mas mesmo assim significativos na produtividade do processo. PH;

De acordo com o processo de purificação do rhGDF-5 divulgado na patente WO1996/033215, descreve-se um pH de 8,3 como sendo adequado para um tampão de solubilização das proteínas relacionadas com o GDF-5. No entanto, foi agora descoberto (ver também o exemplo 3/FIG.7) que o uso de tampões de solubilização com valores de pH mais elevados, entre 9,0 e 11,0 ajuda a reduzir a degradação e melhora a quantidade de proteína total obtida no processo de purificação. Esta descoberta pode ser explicada pelo perfil de solubilidade dependente do pH do GDF-5, que é apresentado na FIG.9. A solubilidade é baixa a pH 8,3 mas aumenta significativamente a pH mais alto. Assim, um pH entre 9,0 e 11,0 também é considerado útil para os tampões de solubilização da invenção.

Agentes quelantes: A concentração de agentes quelantes nos tampões de solubilização pode também ser adaptada. Os agentes quelantes são empregues para se ligarem de forma segura a agentes metálicos tais como mercúrio, arsénio, ou chumbo. Um agente quelante sintético comumente usado é o EDTA que é usado nos tampões de solubilização da invenção (por exemplo na forma de Na2EDTA ou NasEDTA) . De acordo com as experiências descritas no exemplo 3, é vantajoso aumentar as concentrações de agentes quelantes do valor originalmente descrita de 1 mmol/L (ver a patente WO/ 15 1996/033215) para 5-100 mmol/L, preferivelmente para 5-50 mmol/L. O tampão de solubilização mais preferido compreende os seguintes componentes:

Tris-HCl 20 mM Ureia 6 M DTT 64 mM L-arginina 500 mM NasEDTA 5 mM

De acordo com a invenção, as principais modificações do processo estão sumariadas na FIG. 10. Deve notar-se por precaução que o esquema de purificação proposto representa uma forma de realização preferida da invenção, mas que a invenção não está de modo algum limitada a esta ordem ou número de passos processuais (especialmente no respeitante aos passos 5 a 9 da FIG. 10). Podem-se omitir, substituir ou suplementar passos individuais com outros métodos de purificação, desde que o procedimento global de purificação compreenda os passos iniciais de 1. cultura de células bacterianas (o hospedeiro bacteriano preferido é E. coli, as estirpes hospedeiras especialmente preferidas são W3110 e D1210), 2. rutura das células, 3. recuperação de corpos de inclusão e 4. solubilização de corpos de inclusão. A invenção divulgada foi exemplificada com o GDF-5 humano recombinante como substância teste. Porém, devido a uma homologia de sequências extraordinariamente elevada (ver a FIG. 2) os métodos de purificação também podem ser aplicados à purificação de outras proteínas relacionadas com o GDF-5. O termo "proteínas relacionadas com o GDF-5" inclui proteínas funcionalmente semelhantes pertencentes ao 16 grupo das proteínas GDF-5, GDF-6 e GDF-7 de vertebrados, bem como respetivas variantes recombinantes. Uma propriedade comum a todas as proteínas relacionadas com o GDF-5 é a ocorrência de um domínio de nó de cistina bioativo com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 60% com o domínio de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano que é suficiente para a função biológica da proteína. Tal como se pode ver pela FIG. 3, o valor limitador preferido de 60% separa membros do grupo GDF-5/-6/-7 de GDFs e BMPs mais distantemente relacionados. Proteínas especialmente preferidas apresentam identidades de aminoácidos de pelo menos 75%, 80% ou 90% com o domínio de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano.

Exemplos não limitantes para proteínas relacionadas com o GDF-5 de vertebrados e mamíferos são proteínas precursoras e maduras do GDF-5 humano (divulgadas como MP52 na patente WO95/04819 e como GDF-5 humano em Hõtten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), GDF-5/MP52 recombinante humano (patente W096/33215), Arg MP52 (patente WO97/06254), MP52s humana de HMW (patente W097/04095), CDMP-1 (patente W096/14335), GDF-5 de ratinho (Mus musculus) (patente US 5.801.014), GDF-5 de coelho (Oryctolagus cuniculus) (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), GDF-5 de galinha (Gallus gallus) (n° de acesso de NCBI NP_989669), GDF-5 de sapo com garras africano (Xenopus laevis) (n° de acesso de NCBI AAT99303), GDF-5 monomérico (patente WO 01/11041 e patente WO 99/61611), GDF-6/BMP-13 humanos (patente US 5.658.882), GDF-6 de ratinho (n° de acesso de NCBI NP_038554) , GDF-6/CDMP-2 (patente W096/14335), GDF-7/BMP-12 humanos (patente US 5.658.882), GDF-7 de ratinho (n° de acesso de NCBI AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (patente W096/143335) . Também 17 estão cobertas pela invenção as proteínas relacionadas com o GDF-5 que tenham mutações adicionais tais como substituições, adições e eliminações, desde que estas mutações adicionais não anulem completamente a atividade biológica da proteína. Algumas variantes preferidas são mutantes das proteínas relacionadas com o GDF-5 com atividade biológica melhorada. Por exemplo, um ou mais resíduos que estão normalmente presentes na proteína precursora do GDF-5 humano (ver a FIG. 1) são substituídos nestes mutantes por outros aminoácidos: a arginina na posição 438 do precursor do GDF-5 humano é substituído por glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina ou asparagina; e/ou a serina 439 é substituída por ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, leucina, ou isoleucina; e/ou a asparagina 445 é substituída por serina ou treonina. Num outro mutante de elevada atividade, a metionina 453 e/ou a metionina 456 são substituídas por alanina, valina, ou isoleucina. Também de interesse especial são os mutantes em que a leucina 441 é substituída por prolina.

As atividades biológicas das proteínas relacionadas com o GDF-5 podem ser facilmente determinadas com a ajuda de sistemas teste estabelecidos. 0 mais útil e preferido é um teste vulgar in vitro, conhecido como ensaio da fosfatase alcalina (ALP) (Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803), que também está descrito no exemplo 5. Demonstrou-se que as proteínas relacionadas com o GDF-5 aumentam a atividade da fosfatase alcalina, isto é, em células ROB-C26 (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) tal como descrito na patente W095/04819, em células ATDC5 embrionárias (Riken Gene Bank, ROB 0565), em células MCHT-1/26 estromais de ratinho, e em células HPDL 18 tal como apresentado em Nakamura et al. 2003, J.

Periodontal Res. 38, 597-605.

Os seguintes exemplos não limitantes, conjuntamente com as figuras e protocolos de sequências pretendem ilustrar suplementarmente a invenção.

SEQUÊNCIAS ID SEQ NO: 1 apresenta a sequência da proteina do precursor do GDF-5 humano. ID SEQ NO: 2 apresenta a sequência do DNA do precursor do GDF-5 humano. ID SEQ NO: 3 apresenta a sequência da proteina de 120 aa do GDF-5 humano maduro. Se for produzida recombinantemente, a proteina pode alternativamente consistir em 119 aa, começando assim com o segundo aa (prolina) da ID SEQ NO: 3. ID SEQ NO: 4 apresenta a sequência da proteina de 120 aa do GDF-5 monomérico humano maduro. A proteina pode alternativamente consistir em 119 aa, começando assim com o segundo aa (prolina) da ID SEQ NO: 4. FIGURAS: A FIG. 1 apresenta caracteristicas adicionais da proteina precursora do GDF-5 humano de acordo com a ID SEQ NO: 1: 19 aa 001-381 pre-predomínio (letras a negrito) aa 001-027 péptido de sinal (a negrito e sublinhado) aa 382-501 parte da proteína madura aa 400-501 domínio de nó de cistina (sublinhado) A FIG. 2 apresenta uma comparação dos domínios de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano (ID SEQ NO: 1), GDF-6 humano (sequência 2 da patente US 5.658.882) e GDF-7 humano (sequência 26 da patente US 5.658.882). Os resíduos de aminoácidos que são idênticos nas três moléculas encontram-se realçados. A FIG. 3 apresenta uma tabela com as identidades das sequências dos domínios de nó de cistina de vários BMPs e GDFs conhecidos com o domínio de nó de cistina do GDF-5 humano. A FIG. 4 apresenta um mapa plasmídeo para a expressão do GDF-5 humano recombinante maduro tal como descrito no exemplo 1 e (mais em detalhe) na patente WO 1996/033215. A FIG. 5 apresenta uma Página-SDS que mostra a fragmentação dependente do tempo do GDF-5 recombinante maduro durante a solubilização do corpo de inclusão num tampão de solubilização (ureia 8 M, Tris 20 mM, DTT 10 mM, Na2EDTA lmM, pH 8,3) . O GDF-5 monomérico é reduzido de 14kDa para 10 kDa (fragmento). A fragmentação está praticamente completa após 3 horas de solubilização. A FIG. 6 apresenta uma Página SDS que mostra o efeito da modificação da pressão de rutura celular na fragmentação, rendimento e pureza das proteínas, de acordo com o exemplo 20 2. Neste subconjunto da experiência, compara-se uma pressão de rutura de 560 bar (figura de acima) com uma pressão de rutura de 850 bar (figura de baixo). A pressão mais elevada de 860 bar conduz a um decréscimo significativo da fragmentação da proteína e a um rendimento/pureza mais elevados da proteína.

As FIG. 7 e 8 apresentam uma Página SDS que mostra os efeitos de diferentes tampões de solubilização na fragmentação do GDF-5 monomérico dissolvido no tampão de solubilização. As composições dos tampões encontram-se listadas no exemplo 3. A FIG. 9 apresenta um perfil de solubilidade dependente do pH, do GDF-5 maduro. A FIG. 10 mostra modificações do processo de produção do GDF-5 de acordo com a invenção. EXEMPLOS:

Exemplo 1: Produção e purificação do rhGDF-5 (1) Construção de um vetor de expressão e transformação de E. coli A construção de um sistema de vetores plasmídeo para a produção do GDF-5 humano recombinante maduro (aminoácidos 1 a 119 da ID SEQ NO: 3) e transformação da estirpe de hospedeiros E. coli W3110 (W3110M) foi efetuada tal como descrito no exemplo 1 da patente WO 1996/033215. 21 (2) Cultivo em E. coli A E. coli que expressa a proteína da invenção foi pré-cultivada no meio SOC modificado (Bacto triptona 20 g/L, extrato de fermento Bacto 5 g/L, NaCl 0,5 g/L, MgCl2.6H20 2,03 g/L, Glicose 3,6 g/L). Usaram-se 100 mL da suspensão de bactérias para inocular 5 L do meio de produção (Bacto triptona 5 g/L, Ácido cítrico 4,3 g/L, K2HP04 4,675 g/L, KH2P04 1,275 g/L, NaCl 0, 865 g/L, FeS04'7H20 100 mg/L,

CuS04'5H20 1 mg/L, MnS04’nH20 0,5 mg/L, CaCl2'2H20 2 mg/L,

Na2B407'10H2O 0,225 mg/L, (NH4) 6Mo7024'4H20 0, 1 mg/L, ZnS04'7H20 2,25 mg/L, CoC12'6H20 6 mg/L, MgS04'7H20 2,2 g/L, Tiamina'HCl 5,0 mg/L, Glicose 3 g/L), que foi cultivado num fermentador de 10 litros com arejamento-agitação, e depois, ao atingir o estágio inicial de fase de crescimento logarítmico (OD55o=5,0) adicionou-se isopropil^-D-tiogalactopiranosídeo numa concentração final de 1 mM e continuou-se o cultivo até se atingir um OD55o=150. Durante o cultivo, manteve-se a temperatura a 32° C, e ajustou-se o valor de pH a 7,15 por adição de amónia. Para prevenir o abaixamento da concentração de oxigénio dissolvido, acelerou-se a agitação para manter a concentração de oxigénio dissolvido a 50% de saturação do ar. Continuou-se o cultivo adicionando uma solução de glicose a 50% em concentrações de 0,2% para obter uma densidade celular elevada, usando como indicação um aumento abrupto da concentração de oxigénio dissolvido. (3) Preparação de corpos de inclusão de E. coli O caldo da cultura obtido pelo método acima descrito foi centrifugado para recolher as células, que depois se suspenderam num tampão Tris-HCl 25 mM contendo ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (pH 7,3). As células foram rompidas por passagem através de um homogeneizador de alta 22 pressão e novamente centrifugadas para recolher o precipitado contendo os corpos de inclusão. (4) Lavagem e solubilização dos corpos de inclusão de E. coli

Após três lavagens (por exemplo com 1% de Triton X-100), os corpos de inclusão de E. coli foram centrifugados a 3.000 x g durante 30 minutos a 4o C, e depois o precipitado resultante foi solubilizado mediante sonicação num tampão de solubilização (tampão Tris-HCl 20 mM, ureia 8 M, DTT 10 mM, e Na2EDTA 1 mM, pH 8,3) .

Devido à degradação parcial observada da proteina de corpo de inclusão do GDF-5 em tampões contendo ureia (ver a Fig. 5) , também se testou uma variedade de tampões de solubilização adicionais, que estão descritos no exemplo 3. (5) Preparação de monómeros A solução solubilizada foi centrifugada a 20.000 x g durante 30 minutos a 4o C e o sobrenadante resultante foi recolhido. O sobrenadante obtido foi submetido a SP-

Sefarose FF (Pharmacia AB) equilibrada com tampão Tris-HCl 2 0 mM a pH 8,3, ureia 6 M, e EDTA 1 mM, e depois, após lavagem com a mesma solução, foi eluido com a mesma solução contendo NaCl 0,5 M. As proteínas no eluato foram sulfonadas por adição de Na2SC>3 e Na2S4C>6 nas concentrações finais de 111 mM e 13 mM respetivamente, e por incubação a 4o C durante 15 horas. A solução sulfonada foi filtrada em gel com Sephacryl S-200 HR (Pharmacia AB) equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,3, ureia 6 M, NaCl 0,2 M, e EDTA 1 mM para obter monómeros sulfonados purificados da proteina da invenção. 23 (6) Refolding A solução dos monómeros sulfonados foi adicionada a um volume 9 vezes superior de um tampão de Na-Glicina 50 mM a pH 9,8, NaCl 0,2 M, CHAPS 16 mM, EDTA 5 mM, GSH 2 mM (glutationa de tipo reduzido) , e GSSG 1 mM (glutationa de tipo oxidado) com agitação, e depois incubada durante 24 horas a 4o C para oxidar e reenrolar a proteína da invenção. (7) Preparação de homodímeros A solução de refolding foi diluída com igual volume de água purificada e depois adicionou-se NaCl 6 N ajustando o pH a aproximadamente 7,4 e colocou-se para precipitação isoelétrica. Os precipitados recolhidos por centrifugação a 3.000 x g durante 20 minutos foram solubilizados numa solução de acetonitrilo a 30% contendo 0,1% de TFA. A solução foi diluída com igual volume de água purificada e colocada numa coluna RESOURCE RPC (Pharmacia AB) de um HPLC de fase reversa pré-equilibrada com acetonitrilo a 25% contendo 0,05% de TFA, e depois eluída com um gradiente linear de acetonitrilo a 25-45% contendo 0,05% de TFA. Monitorizou-se o eluato a uma absorvância de 280 nm. As frações da proteína homodimérica purificada foram recolhidas e liofilizadas num Concentrador SpeedVac (Servant Co.). Opcionalmente, submeteu-se a proteína purificada a um passo final de ultra-/diafiltração.

Exemplo 2: Variações I - Modificação da pressão de rutura celular

Para avaliar o efeito da rutura celular no rendimento/degradação, pureza e filterabilidade da 24 proteína, levaram-se a cabo várias experiências com diferentes pressões de rutura celular. A biomassa de cada fermentação foi ressuspensa num tampão de homogeneização (Tris 25 mM, Na2EDTA 10 mM, pH 7,3), homogeneizada e agitada durante 30 a 60 minutos com um agitador magnético. Posteriormente, a suspensão da biomassa foi rompida três vezes a diferentes pressões de rompimento num homogeneizador de alta pressão. Os corpos de inclusão recebidos foram lavados com um tampão de lavagem (Tris 20 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 8,3) e armazenados a temperaturas inferiores a -70° C. Após descongelamento durante a noite a 4°C, os IBs foram dissolvidos num tampão de solubilização pré-arrefecido contendo Ureia 6 M e L-arginina 0,5 M, homogeneizados e agitados novamente com um agitador magnético durante 30 a 60 minutos. De seguida, centrifugou-se a solução de IB durante 30 minutos a 10° C, força g de 10000 x g ( = 7500 rpm) . 0 sobrenadante foi decantado para separar os IBs dos componentes insolúveis, e filtrado através de filtros de profundidade (CUNO Zeta Plus BC0030A90ZA08A). A seguir, o filtrado foi novamente filtrado através de um filtro estéril (Filtro da Tampa da Garrafa Nalgene de poro 0,2 ym) . O filtrado estéril foi concentrado e diafiltrado no tampão CEX A (Ureia 6 M, Tris 20 mM, Na2EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, DTT 10 mM, pH 8,3) antes de ser colocado na coluna CEX. Analisaram-se amostras teste geradas nos diferentes passos com métodos de testes analíticos conhecidos tais como SDS-PAGE, corante Azul Brilhante de Coomassie e técnicas ELISA para a determinação de proteínas E. coli.

Os resultados desta investigação (ver a FIG. 6) mostram que se pode conseguir uma melhoria significativa do processo 25 primário de purificação do rhGDF-5 se a rutura celular for feita com uma pressão de rompimento entre os 800 e os 900 bar. Obtém-se uma melhor qualidade de IBs, resultando numa maior razão rhGDF-5/proteína total (por exemplo 57 % a 850 bar contra 35 % a 560 bar) e num conteúdo reduzido de proteínas E. coli no produto final (por exemplo < 30 yg/mg a 850 bar contra > 50 yg/mg a 560 bar). Estas melhorias são também vantajosas para a filterabilidade. A área de filtro necessária para a escala de produção pode ser reduzida (por exemplo dos 2,6 m2 teóricos a 560 bar para < 1 m2 a 850 bar) em grande escala. Isto conduz a tempos mais baixos de processo, a uma fragmentação reduzida da proteína e a um corte nos respetivos custos de produção do rhGDF-5.

Exemplo 3: Variações II - Solubilização do corpo de inclusão

Para prevenir a degradação do GDF-5 e proteínas relacionadas, o passo padrão de solubilização do corpo de inclusão como por exemplo descrito no exemplo 1 foi alterado em diferentes aspetos. Os esforços compreenderam experiências para identificar/inibir uma potencial atividade proteolítica bem como alterações na composição do tampão de solubilização tal como descrito no exemplo 1 (por exemplo pH, ureia, Na2EDTA e DTT, GuHCl, aminoácidos tais como a L-arginina). (3.1) Experiências de inibição da protease (3.1.1) Inibição química

Neste conjunto de experiências utilizou-se um coquetel de inibidores de protease. Num subgrupo, resuspenderam-se adicionalmente corpos de inclusão durante 20 minutos em HCl 26 a 25% (pH 2,7) para inativar proteases que estão ligadas à parede externa da célula. Após 3 passos de lavagem, dissolveram-se 8 g de corpos de inclusão do GDF-5 humano recombinante (rhGDF-5) em 50 mL de um tampão de solubilização padrão contendo ureia 8 M. Duas pastilhas contendo uma mistura de inibidores de protease (Roche Diagnostics Protease Inhibitor Cocktail Tablets Cat. No. 11 697 498 001) foram adicionadas e completamente misturadas com a solução do corpo de inclusão. Após 1,5 h e 3 h de incubação à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas e analisadas. Verificou-se que o rhGDF-5 estava em grande parte degradado em todos os grupos, indicando que a inibição quimica da degradação da proteína pelo uso de HC1 ou inibidores de protease não é eficaz. (3.1.2) Inativação pelo calor

Após 3 passos de lavagem, 15 g de corpos de inclusão do GDF-5 humano recombinante (rhGDF-5) foram dissolvidos em 100 mL de um tampão contendo Na2EDTA 10 mM, Tris 25 mM (pH 7,3). A inativação térmica foi efetuada por incubação a 65° C ao longo de diferentes períodos de tempo (20 min a 2 horas). De seguida, as amostras foram submetidas a um passo de solubilização padrão tal como descrito no exemplo 1. Resultados: Não obstante a inativação térmica das proteases, o rhGDF-5 degradou-se em todas estas amostras. (2) Alterações às composições de tampões de solubilização. Tentativas para minimizar a fragmentação de proteínas relacionadas com o GDF-5 por modificação do tampão de solubilização usado foram bem sucedidas. Alguns dos tampões de solubilização testados encontram-se listados abaixo: 27

Tampões com ureia:

Padrão: ureia 8 M, Tris 20 rrM, DTT 10 rrM, Na2EDTA 1 rrM, pH 8,3 Tampão Ul: ureia 8 M, Tris 20 rrM, DTT 64 rrM, Na2EDTA 50 rrM, . pH 8 ,3 Tampão U2 : ureia 6 M, Tris 20 rrM, DTT 64 rrM, Na2EDTA 50 rrM, . pH 8 ,3 Tampão U3 : ureia 6 M, Tris 20 rrM, DTT 64 rrM, Na2EDTA 5 rrM, pH 8 , 3 Tampão U4: ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, NaCl 50 Tampão U5: ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 9,5 pH 8,3

Tampões com L-arginina:

Tampão AI: arginina 100 mM, ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 8,3 Tampão A2 : arginina 30 : mM, ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 : mM, Na2EDTA 5 ) mM, pH 8 ,3 Tampão A3: arginina 10 : mM, ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 : mM, Na2EDTA 5 > mM, pH 8 ,3 Tampão A4 : arginina 1 mM, ureia 6 Mj , Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 8, 3 Tampão A5: arginina 200 mM, ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 8,3 Tampão A6 : arginina 100 mM, ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 9,5 Tampão A 7 : arginina 500 rrM, ureia 6 M, Tris 20 mM, DTT 64 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 9,5 Tampão A8 : arginina 500 rrM, ureia 6 M, Tris 20 rrM, DTT 64 rrM, Na2EDTA 5 mM, pH 8,3 Tampão A9 : arginina 300 rrM, ureia 6 M, Tris 20 rrM, DTT 64 rrM, Na2EDTA 5 rrM, pH 8,3 Tampão A10 : arginina 400 rrM, ureia 6 M, Tris 20 rrM, DTT 64 rrM, Na2EDTA 5 rrM, pH 8,3

Para testar a degradação, 0,1 g de corpos de inclusão do GDF-5 foram misturados com 0,9 mL do tampão de solubilização. Verificou-se a degradação após 4-5 horas de incubação dos corpos de inclusão dissolvidos no tampão de solubilização. Os resultados foram analisados por SDS-Page e posterior coloração com o Azul Brilhante de Coomassie.

Resultados: Inter alia, conseguiram-se os seguintes resultados durante os testes de degradação: - Na2EDTA: o aumento da concentração de 1 para 5 - 50 mM leva a uma ligeira redução da degradação 28 - pH: uma modificação de 8,3 para valores mais elevados (entre 9,0 e 11,0) leva a uma redução da degradação bem como a um aumento da quantidade de proteína total. Por exemplo, a elevação do pH de 8,3 para 9,5 nos tampões de solubilização (ver por exemplo os tampões A7 e A8 na FIG. 7) melhoraram tanto a quantidade de proteína total como o grau de degradação. Mesmo IBs dissolvidos em tampões contendo baixas quantidades de L-arginina ainda continham rhGDF-5 após 5 horas de incubação à temperatura ambiente se se aumentasse o pH (ver por exemplo o tampão A6 na FIG. 7). - DTT: alteração sem efeito - Aminoácidos, especialmente a L-arginina: conseguiram-se os seguintes resultados iniciais com tampões de solubilização contendo L-arginina de 0 a 100 mM (pH 8,3):

Tampão usado Tempo de incubação Degradação do rhGDF-5 Tampão sem Arg (ref.) 0 h de incubação praticamente completa 4 h de incubação à temperatura ambiente praticamente completa Tampão AI 0 h de incubação cerca de 50% 4 h de incubação à temperatura ambiente cerca de 50% Tampão A3 (L-Arg 30 mM, pH 8,3) 0 h de incubação cerca de 50% 4 h de incubação à temperatura ambiente praticamente completa Tampão A2 (L-Arg 10 mM, pH 8,3) 0 h de incubação cerca de 50% 4 h de incubação à temperatura ambiente praticamente completa Tampão A4 (L-Arg 1 mM, pH 8,3) 0 h de incubação degradação inferior à da amostra de referência 4 h de incubação à praticamente completa 29 temperatura ambiente

Em experiências posteriores usou-se uma concentração superior de L-arginina. 0 tempo de incubação foi aumentado para 5 horas. 0 objetivo desta experiência foi o de testar a influência de a) uma concentração mais elevada de L-Arginina no tampão de dissolução e b) uma mudança de pH para condições mais básicas na degradação do rhGDF-5. Os resultados foram:

Tampões usados Proteína total (mg/mL) rhGDF-5 (mg/mL) razão do rhGDF-5 (rhGDF-5/ proteína total) Degradação do rhGDF-5 Tampão sem Arg (pH, 8,3) 5, 92 não foi encontrado rhGDF-5 11 não foi encontrado rhGDF-5 11 praticamente completa 2) Tampão sem Arg (pH, 9,5) 7, 79 não foi encontrado rhGDF-5 11 não foi encontrado rhGDF-5 11 praticamente completa 2) Tampão A6 com Arg 100 mM (pH 9,3) 10,03 3, 31 33 % praticamente nenhuma Tampão A5 com Arg 200 mM (pH 8,3) 7, 62 1, 64 22 % cerca de 50 $.2) o Tampão A9 com Arg 300 mM (pH 8,3) 7,59 3,34 44 % pouca degradação 2) Tampão AI0 com Arg 4 00 mM (pH 8,3) 7,29 3,57 49 % praticamente nenhuma 2) Tampão A7 com Arg 500 mM (pH 9,5) 11,12 5,17 47 % praticamente nenhuma 2) Tampão A8 com Arg 500 mM (pH 8,3) 7, 68 4,76 62 % praticamente nenhuma 2) 11 valores fora de calibração

21 Grau de degradação julgado visualmente por SDS-PAGE 30

De acordo com a avaliação quantitativa, o grau de degradação diminuiu claramente com o aumento das concentrações de arginina nos tampões de solubilização (tabela acima e FIG. 7 e 8) . No entanto, ainda existe alguma degradação do rhGDF-5 usando o tampão AIO com arginina 400 mM (tampão de dissolução) . Praticamente não se pôde encontrar nenhum rhGDF-5 (degradado) nos grânulos de corpos de inclusão, tal como julgado visualmente por SDS-PAGE e por avaliação quantitativa. Assim, a solubilidade do rhGDF-5 nos tampões de solubilização contendo arginina é boa. A razão do rhGDF-5 aumentou com concentrações mais elevadas de L-arginina nos tampões de solubilização. A melhor razão do rhGDF-5 de 62 % pôde ser alcançada usando o tampão de dissolução A8 contendo arginina (L-arginina 500 mM). Uma concentração de L-arginina de pelo menos 500 mM no tampão de solubilização do corpo de inclusão é considerada ótima para a produção do rhGDF-5 e proteinas relacionadas.

Exemplo 4: Efeito da L-arginina na cromatografia de permuta iónica O intuito desta experiência foi verificar se um tampão de solubilização de corpo de inclusão modificado compreendendo L-arginina afeta a purificação posterior da proteína por cromatografia de permuta iónica.

Diferentes amostras de corpos de inclusão de uma fermentação após solubilização foram colocadas numa coluna de permuta catiónica (CEX) cheia com resina SP Sefarose FF empacotada numa coluna XK 16/2 0 (CV = 2 8 mL) . Os tampões testados compreenderam (entre os outros componentes descritos) ureia 8 M, nenhuma L-arginina (tampão de 31 solubilização padrão) ou Ureia 6 M, L-arginina 500 mM (tampão de solubilização modificado).

Os corpos de inclusão foram produzidos por rutura do GDF-5 produzindo células E. coli com um homogeneizador de alta pressão (três ciclos, 850 bar) seguida de duas lavagens. Dissolveram-se 10,37 g dos IBs produzidos em 100 mL de tampão de solubilização modificado (tampão de ureia 6 M contendo Arginina 0,5 M) . 80 mL da solução de IB foram deixados de lado após a centrifugação, filtração dead end e filtração estéril dos IBs. Colocaram-se 40 mL da solução filtrada de IB não diluida na coluna CEX (aproximadamente 172,4 mg de proteina total). Analisou-se a proteína total e o conteúdo em rhGDF-5 no fluxo (DL), a solução de lavagem e as frações de ambas as corridas da CEX.

Resultados: Devido a uma condutividade alterada do tampão de solubilização modificado (18 mS/cm em vez de 5 mS/cm do tampão de solubilização padrão) , a ligação à coluna CEX com o tampão modificado não é completa. Com o tampão de solubilização modificado apenas é possível uma ligação reduzida à coluna CEX (rendimento da proteína de 10 % em vez dos cerca de 60 %) . Por isso é necessário um passo adicional de permuta do tampão (diafiltração, por exemplo através de uma membrana de celulose de 5 kDa) antes da CEX.

Exemplo 5: Teste da atividade biológica da fosfatase alcalina (ALP) A atividade biológica das proteínas relacionadas com o GDF-5 e respetivas formulações coloidais pode ser facilmente determinada com a ajuda de sistemas de teste 32 estabelecidos. 0 mais útil e preferido é o ensaio comum da fosfatase alcalina (ALP) (Takuwa et ai. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803). Neste sistema de teste in vitro, a atividade biológica dos fatores de crescimento relacionados com o GDF-5 é medida após cocultura de diferentes concentrações de proteinas com células osteogénicas/condrogénicas. 0 GDF-5 e proteinas relacionadas com potencial osteo/condrogénico aumentam a expressão da fosfatase alcalina (ALP) nestas células, por exemplo em células ATDC-5, ROB-C26 ou MCHT-1/26. A atividade da ALP nos lisatos destas células é determinada por meio de um ensaio colorimétrico. A reação baseia-se na hidrólise do p-Nitrofenilfosfato (PNPP) a p-Nitrofenol, que se torna visivel sob condições alcalinas como o anião p-Nitrofenol amarelo. 0 objetivo era medir a atividade das formulações LMP testadas em comparação com a atividade da ALP obtida com concentrações conhecidas do padrão de referência GDF-5.

Num ensaio de ALP estandardizado, lxlO4 células de ATDC-5 de células MCHT1/26 foram incubadas durante a noite em placas de 96 cavidades em meio de cultura celular (alfa-MEM, Penicilina/Estreptomicina, L-glutamina 2 mM, FCS a 10%) a 37°C, 5% de C02, saturado em H20. No dia seguinte, as células foram estimuladas com as proteinas relacionadas com o GDF-5 ou respetivas formulações durante 72 horas com as concentrações de ligando indicadas. As células foram posteriormente lavadas com PBS (tampão fosfato-salino). A lise das células foi levada a cabo em 100 yL do tampão de lise alcalina 1 (glicina 0,1 M, pH 9,6, NP-40 a 1%, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM) durante 1 h à temperatura ambiente. Depois adicionaram-se 100 yL do tampão de lise alcalina 2 (glicina 0,1 M, pH 9,6, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM + PNPP 2 mg/mL) . As 33 placas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2, saturadas em H20. A reação da ALP foi parada posteriormente com 100 pL de NaOH a 30 g/L e por fim mediu-se a densidade ótica com um leitor automático de microplacas a 405 nm tendo em consideração a subtração do valor em branco. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Biopharm Empresa para 0 Desenvolvimento

Biotecnológico de Produtos Farmacêuticos Lda. <120> Processo Otimizado de Purificação da Proteina do Fator de Crescimento Recombinante < 1 3 0 > 4 1 0 6 6P EP <1 60> 4 < 1 7 0 > Patentln Versão 3.3

< 2 1 0 > 1 < 2 11 > 501 < 2 1 2 > PRT <213> homo sapiens <220> 34 <221> MISC-FEATURE <223> precursor do GDF-5 <4 0 0> 1

Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp 1 5 10 15

Leu Asp Leu Glu Phe Xle Cys Thr Vai Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly 20 25 30

Gin Arg Pro Gin Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys 35 40 45

Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn vai Phe Arg Pro Gly Gly His Ser 50 55 60

Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr 65 70 75 80

Gly Gin Thr Gly Gly Leu Thr Gin Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys 85 90 95

Leu Pro Pro Arg Prò Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro 100 105 110

Glh Thr Arg Gin Ala' Thr Ala Arg Thr Vai Thr Pro Lys Gly Gin Leu 115 120 125

Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser vai pro Ser Ser phe 130 135 140

Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu 145 150 155 160 35

Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu 165 170 175

Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Vai ISO 185 190

Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys 195 200 205

Gly Gin Asp Asp Arg Gly Pro Vai Vai Arg Lys Gin Arg Tyr Vai Phe 210 215 220

Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg 225 230 235 240

Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly 245 250 255

Gly Gly Arg Ala Ala Gin Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg 260 265 270

Gin Pro Ala Ser Leu Leu Asp Vai Arg Ser Vai Pro Gly Leu Asp Gly 275 280 285

Ser Gly Trp Glu Vai Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys 290 295 300

Asn Ser Ala Gin Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg 305 310 315 320

Ala Vai Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Axg Gin Vai 325 330 335 Hís Glu Lys Ala Leu Phe Leu Vai Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp 340 345 350

Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gin Asp Asp Lys Thr 355 360 365

Vai Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gin Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu 370 375 380

Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys 385 390 395 400

Ser Arg Lys Ala Leu His Vai Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp 405 410 415

Trp lie Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala phe His Cys Glu Gly Leu 420 425 430 36

Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser Hís Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Vai 435 440 445

Xle Gin Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr 450 455 460

Cys Cys Vai Pro Thr Arg Leu Ser Pro lie Ser Xle Leu Phe lie Asp 465 470 475 480

Ser Ala Asn Asn Vai Vai Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met Vai Vai Glu 485 490 495

Ser Cys Gly Cys Arg 500 <210> 2 <211> 2703 <212> DNA <213> horoo sapiens <220> <221> CDS <222> (640),.(2142) <400» 2 ccatggcctc gaaagggeag cggtgatttt tttcacataa atatategea cttaaatgag 60 tttagacagc atgacatcag agagtaatta aattggttcg ggttggaact ccgtttccaa 120 ttcctgagtt caggtttgta áaagattttt ctgagcacct gcaggcctgt gagtgtgtgt 180 gtgtgtgcgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtga agtattttca ctggaaagga ttcaaaacta 240 gggggaaaaa aaaactggag cacacaggca gcattacgcc attcttcctt cttggaaaaa 300 tccctcagcc ttatacaagc ctccttcaag ccctcagtca gttgtgcagg agaaaggggg 360 cggttggctt tctcctttca agaacgagtt attttcagct gctgaetgga gacggtgcac 420 gtctggatac gagageattt ccactatggg actggataea aacacacacc cggcagactt 480 caagagtctc agactgagga gaaagccttt ccttctgctg ctactgctgc tgccgctgct 540 tttgaaagtc cactectttc atggtttttc ctgccaaacc agaggcacct ttgctgctgc 600 cgctgttctc tttggtgtca ttcagcggct ggccagagg atg aga ctc Met Arg Leu ccc aaa Pro Lys 654 ' 1 5 ctc ctc act ttc ttg ctt tgg tac ctg gct tgg ctg gac ctg gaâ ttc 702

Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe 10 15 20 ate tgc act gtg ttg ggt gee cct gac ttg gge cag aga ccc cag ggg 750 lie Cys Thr vai Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gin Arg Pro Gin Gly 25 30 35 acc agg cca gga ttg gee aaa gea gag gee aag gag agg ccc ccc ctg 798

Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu 37 846 40 45 50 gcc cgg aac gtc Ala Arg Asn Vai 55 acc aat gcc aat Thr Asn Ala Asn 70 ctg aca cag ccc Leu Thr Gin Pro ggc ggc cct gaa Gly Gly Pro Glu 105 aca gcc cgg act Thr Ala Arg Thr 120 ccc cca aaa gea Pro Pro Lys Ala 135 etc agg cca ggg Phe Arg Pro Gly 68 gcc agg gea aag Ala Arg Ala Lys 75 aag aag gat gaa Lys Lys Asp Glu 90 ccc aag cca gga Pro Lys Pro Gly gtg acc cca aaa Vai Thr Pro Lys 125 gga tet gtc ccc Gly Ser Vai Pro 140 ggt cac age tat Gly His Ser Tyr 65 gga ggc acc ggg Gly Gly Thr Gly SO ccc aaa aag ctg· Pro Lys Lys Leu 95 cac cct ccc caa His Pro Pro Gin 110 gga cag ctt ccc Gly Gin Leu Pro ggt ggg ggg gcc Gly Gly Gly Ala cag aca gga ggc Gin Thr Gly Gly 85 ccc ccc aga ccg Pro Pro Arg Pro 100 aca agg cag gct Thr Arg Gin Ala 115 age tcc ttc ctg Ser Ser Phe Leu 145 gga ggc aag gea Gly Gly Lys Ala 130 ctg aag aag gcc Leu Lys Lys Ala agg gag ccc ggg ccc cca cga gag Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu 150 155 ccc ate aca ccc cac gag tac atg Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met 170 gat gct gac aga aag gga ggc aac Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn 185 ctg gcc aac acc ate acc age ttt Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe 200 205 ggt ccc gtg gtc agg aag cag agg Gly Pro Vai Vai Arg Lys Gin Arg 215 220 ccc aag gag ccg ttt ege cca ccc Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro 160 165 etc teg ctg tac agg acg ctg tcc Leu Ser Leu Tyr Arg. Thr Leu Ser 175 180 age age gtg aag ttg gag gct ggc Ser Ser Vai Lys Leu Glu Ala Gly 190 195 att gac aaa ggg caa gat gac cga Ile Asp Lys Gly Gin Asp Asp Arg 210 tac gtg ttt gac att agt gcc ctg Tyr Vai Phe Asp Ile Ser Ala Leu 225 gag aag gat ggg ctg ctg ggg gcc gag ctg cgg ate ttg cgg aag aag Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys 230 235 240 245 ccc teg gac acg gcc aag cca gcg gcc ccc gga ggc ggg cgg gct gcc Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala 250 255 260 cag ctg aag ctg tcc age tgc ccc age ggc cgg cag ccg gcc tcc ttg Gin Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gin Pro Ala Ser Leu 265 270 275 ctg gat gtg ege tcc gtg cca ggc ctg gac gga tet ggc tgg gag gtg Leu Asp Vai Arg Ser Vai Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Vai 280 285 290 ttc gac ate tgg aag ctc ttc cga aac ttt aag aac teg gcc cag ctg Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gin Leu 295 300 305 894 942 990 1038 1086 1134 1182 1230 1278 1326 1374 1422 1470 1518 1566 38 tgc ctg gag ctg gag gee tgg gaa cgg ggc agg gee gtg gac ctc cgt 1614 Cys 310 Leu Glu Leu Glu Ala 315 Trp Glu Arg Gly Arg 32a Ala Val Asp Leu Arg 325. 99C ctg ggc ttc gac cgc gee gee cgg cag gtc cac gag aag gee ctg 1662 Gly Leu Gly Phe Asp 330 Arg Ala Ala Arg Gin Val 335 His Glu Lys Ala 340 Leu ttc ctg gtg ttt ggc cgc acc aag aaa cgg gac ctg ttc ttt aat gag 1710 Phe Leu Val Phe 345 Gly Arg Thr Lys Lys 350 Arg Asp Leu Phe Phe 355 Asn Glu att aag gcç cgc tet ggc cag gac gat aag acc gtg tat gag tac ctg 1758 Ile Lys Ala 360 Arg Ser Gly Gin Asp Asp 365 Lys Thr Val Tyr 370 Glu Tyr Leu ttc age cag cgg cga aaa cgg çgg gCC cca ctg gee act cgc cag ggc 1806 Phe Ser 375 Gin Arg Arg Lys Arg 380 Arg Ala Pro Leu Ala 385 Thr Arg Gin Gly aag cga ccc age aag aac ctt aag gct cgc tgc agt cgg aag gea ctg 1854 Lys 390 Arg Pr© Ser Lys Asn 395 Leu Lys Ala Arg Cys 400 Ser Arg Lys Ala Leu 405 cat gtc aac ttc aag gac atg ggc tgg gac gac tgg ate ate gea ccc 1902 His Val Asn Phe Lys 410 Asp Met Gly Trp Asp Asp 415 Trp Ile ile Ala 420 Pro ctt gag tac gag gct ttc cac tgc gag ggg ctg tgc gag ttc cca ttg 1950 Leu Glu Tyr Glu 425 Ala phe His Cys Glu 430 Gly Leu Cys Glu Phe 435 Pro Leu cgc tcc cac ctg gag ccc acg aat cat gea gtc ate cag acc ctg atg 1998 Arg Ser His 440 Leu Glu Pro Thr Asn 445 His Ala Val Ile Gin 450 Thr Leu Met aac tcc atg gac ccc gag tcc aca cca ccc acc tg.c tgt gtg ccc acg 2046 Asn Ser 45S Met Asp Pro Glu Ser 460 Thr Pro Pro Thr Cys 465 Cys Val Pro Thr cgg ctg agt ccc ate age ate ctc ttc att gac tet gee aac aac gtg 2094 Arg 470 Leu Ser Pro Ile Ser 475 Ile Leu Phe Ile Asp 480 Ser Ala Asn Asn Val 485 gtg tat aag cag tat gag gac atg gtc gtg gag teg tgt ggc tgc agg 2142 Vai Tyr Lys Gin Tyr 490 Glu Asp Met Val Val Glu 495 Ser Cys Gly Cys 500 Arg tagcagcact ggccctctgt cttcctgggt ggcacatccc -aegagcccct tcctgcactc 2202 ctggaatcac agaggggtca ggaagctgtg gcaggagcat etacacagct tgggtgaaag 2262 gggattccaa taagcttgct cgctctctga gtgtgacttg ggctaaaggc ccccttttat 2322 ccacaagttc ccctggctga ggattgctgc ccgtctgctg atgtgaccag tggcaggcac 2382 aggtccaggg agacagactc tgaatgggac tgagtcccag gaaacagtgc tttccgatga 2442 gactcagccc accatttctc ctcacctggg ccttctcagc ctctggactc tcctaagcac 2502 ctctcaggag agccacaggt gccactgcct cctcaaatca catttgtgcc tggtgacttc 2562 ctgtccctgg gacagttgag aagctgactg ggcaagagtg ggagagaaga ggagagggct 2622 tggatagagt tgaggagtgt gaggctgtta gactgttaga tttaaatgta tattgatgag 2682 39 39 3703 ataaaaagca aaactgtgcc t

<210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sequência de aa do GDF-5 humano; a proteína pode alternativamente consistir em prolina 119 aa, começando assrm com a <400> 3

Ala 1 Pro Leu Ala Thr Arg 5 Gin Gly Ala Arg Cys Ser 20 Arg Lys Ala Leu Trp Asp Asp 35 Trp Ile Ile Ala Pro 40 Glu. Gly Leu 50 Cys Glu Phe Pro 55 Leu His 65 Ala Vai Ile Gin Thr 70 Leu Met Pro Pro Thr Cys Cys 85 Vai Pro Thr Phe Ile Asp Ser 100 Ala Asn Asn Vai Vai Vai Glu 115 Ser Cys Gly Cys Arg 120

Lys Arg 10 Pro Ser Lys Asn Leu 15 Lys His 25 Vai Asn Phe Lys Asp 30 Met Gly Leu Glu Tyr Glu Ala 45 Phe His Cys Arg Ser His Leu 60 Glu Pro Thr Asn Asn Ser Met 75 Asp Pro Glu Ser Thr 80 Arg Leu 90 Ser Pro Ile Ser Ile 95 Leu Vai 105 Tyr Lys Gin Tyr Glu 110 Asp Met

<210> 4 <211> 120 <212> PRT sapiens <213> Homo 40 <22 0> <223> sequência de aa do GDF-5 humano monomérico; a proteína pode alternativamente consistir em 119 aa, começando assim com a prolina; <400> 4

Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys 15 10 15

Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Vai Asn Phe Lys Asp Met Gly 20 25. - 30

Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys 35 40 45

Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60

His Ala Vai Ile Gin Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr 65 70 75 80

Pro Pro Thr Ala Cys Vai Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu .85 .90 95

Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Vai Vai Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met X00 105 ‘ 110

Vai Vai Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120

Lisboa, 30 de Abril de 2013

Claims (3)

1 NOVAS REIVINDICAÇÕES 1-10 1. Um processo para a produção de uma proteína purificada relacionada com o GDF-5 recombinante, sendo qualquer proteína de origem natural ou criada artificialmente que compreenda um domínio de nó de cistina com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 60% com o domínio de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano (aminoácidos 400-501 da ID SEQ NO: 1), que compreenda o passo de solubilização do corpo de inclusão para obter um monómero solubilizado de uma proteína relacionada com o GDF-5, sendo o referido processo caracterizado por tratamento dos corpos de inclusão recuperados com um tampão de solubilização desnaturante contendo ureia que compreende L-arginina, em que a concentração de ureia varia de 4 a 8 M e a concentração de L-arginina varia de 100 até 1000 mM.

2. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão de solubilização contém ureia 4-8 M e arginina 400-500 mM. 3. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tampão de solubilização contém um agente quelante numa concentração que varia entre 5 e 100 mM, 4 . 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que 0 tampão de solubilização é caracterizado por um pH entre 9,0 e 11,0. 2 5. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente a remoção de contaminantes de elevado peso molecular diretamente após o passo de solubilização do corpo de inclusão por aplicação de um ou mais meios selecionados a partir do grupo que consiste em centrifugação, filtração em profundidade e filtração estéril. 6. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo suplementarmente a remoção da referida L-arginina da solução que compreende a proteina de corpo de inclusão solubilizada por meio de diafiltração. 7. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a estirpe hospedeira que expressa a proteina relacionada com o GDF-5 nos corpos de inclusão é uma estirpe E. coli. 8. 0 uso de uma solução compreendendo ureia e L-arginina para a solubilização de corpos de inclusão bacterianos, em que a concentração de ureia varia entre 4 e 8 M e a concentração de L-arginina varia desde 100 até 1000 mM, para obter um monómero solubilizado de uma proteina relacionada com o GDF-5, sendo uma proteina de origem natural ou criada artificialmente que compreenda um dominio de nó de cistina com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 60% ao dominio de nó de cistina de 102 aa do GDF-5 humano (aminoácidos 400-501 da ID SEQ NO: 1) nele contido. 3 9. 0 processo de acordo com a reivindicação tampão de solubilização contém ureia 6 M e mM.

10. O processo de acordo com a reivindicação estirpe E. coli é selecionada de E. coli coli W3110. Lisboa, 30 de Abril de 2013 2, em que o arginina 500 7, em que a D1210 e E.