PT2094728E - Métodos de adaptação de anticorpos monoclonais ao ser humano - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS DE ADAPTAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS AO SER

HUMANO

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a métodos para a seleção de estruturas da região variável humana para utilização na adaptação humana de anticorpos monoclonais não humanos, tais como anticorpos de roedores.

Antecedentes da Invenção

Adaptação de anticorpo humano é um termo genérico que descreve a manipulação de anticorpos monoclonais xenogénicos (mAbs) contra alvos humanos terapêuticos para substituir maximamente as sequências xenogénicas com sequências de anticorpos humanos, preservando as suas especificidades de ligação ao antigénio. 0 objectivo é o de reduzir a imunogenicidade destes anticorpos para melhorar as suas propriedades e valores terapêuticos. Os anticorpos manipulados também são conhecidos na técnica como anticorpos humanizados ou enxertados com CDR. A Patente US 2005/148001 descreve a construção baseada na estrutura de bibliotecas de anticorpos humanos. Morea et al. (Biophysical Chemistry, 1997, Volume 68, páginas 9-16) refere-se à estrutura do anticorpo, predição e redesenho.

Atualmente, a técnica mais utilizada para a adaptação do anticorpo humano é conhecida como "enxerto de CDR". A base cientifica desta tecnologia é que a especificidade de 1 ligação de um anticorpo reside essencialmente nos três laçadas hiper-variáveis conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das suas regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada (regiões V) , enquanto as regiões de estrutura mais conservada (estrutura, FW; região de estrutura, FR) fornecem a função de apoio da estrutura. Por enxerto, as CDRs para uma FW adequadamente selecionada, alguma ou a totalidade da atividade do anticorpo de ligação pode ser transferida para o anticorpo recombinante resultante. A primeira demonstração da transferência de especificidade por enxerto de CDR foi para um hapteno nitrofenol (NP) (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)).

Uma vez que a metodologia para a definição de CDR tem sido bem estabelecida, a chave para o enxerto de CDR é a seleção de um aceitador de anticorpo humano mais apropriado para o enxerto. Várias estratégias foram desenvolvidas para selecionar anticorpos aceitadores humanos com as maiores semelhanças com as sequências de aminoácidos das CDRs dadoras ou FW, ou para as estruturas dos doadores. Todas essas estratégias de "melhor ajuste", embora pareçam muito racionais, são, na verdade baseadas numa suposição, i.e., um anticorpo recombinante resultante que é mais semelhante (em sequência de aminoácidos ou na estrutura) com o anticorpo original preservará melhor preservar a atividade de ligação ao antigénio original. Embora estas estratégias tenham sido aplicadas com sucesso para gerar anticorpos terapêuticos (por exemplo, Tempest et al., Biotechnology 9:266-71 (1991), Gorman et al., Proc Natl Acad Sei USA 88:4181-4185 (1991), Co et al., J. Immunol. 152:2968-76 (1994)), a hipótese subjacente nunca foi seriamente testada. 2

Um problema potencial das estratégias de melhor ajuste é que os critérios de melhor ajuste são matemáticas, mas não necessariamente biológicas. A aptidão medida pelo grau de homologia, por exemplo, é a soma de valores numéricos designados para residuos de aminoácidos idênticos, homólogos e diferentes ou sequências de ácidos nucleicos. Embora estes valores atribuídos sejam amplamente validados em muitos outros sistemas de avaliação de homologia, as diferenças finas que podem não ser significativas para outros sistemas podem ser importantes para o cálculo do melhor ajuste na adaptação do anticorpo humano.

Um problema relacionado é, dados dois receptores com um grau de aptidão total ou muito próxima para o doador, a sua aptidão local nas diferentes FRs podem ser diferentes. Uma região pode ser mais importante que a outra? Como vai isso ser determinado? Em suma, um modelo matemático ainda não foi validado para satisfazer a exigência de cálculo do melhor ajuste na relação doador-receptor na manipulação de anticorpos.

Uma complicação adicional relaciona-se com as interações entre as duas cadeias de um anticorpo: um receptor de cadeia pesada de melhor ajuste e um receptor de cadeia leve de melhor ajuste podem não se encaixar uma com a outra para melhor conservar a atividade de ligação do doador. Nenhuma ferramenta está disponivel para avaliar a aptidão intercadeia. Os investigadores emparelharam cadeias pesadas e leves de vários anticorpos contra um mesmo epitopo para tentar encontrar um melhor emparelhamento. No entanto, isso não foi tentado em adaptação do anticorpo humano. 3

Em teoria, todas as sequências da linha germinativa humana foram sequenciadas e estão disponiveis para a pesquisa de anticorpos FW. Na prática, no entanto, a maioria das regiões humanas V que têm sido utilizados até agora na humanização de anticorpos são a partir de genes de anticorpos maduros, frequentemente aqueles de proteinas do mieloma. Eles são susceptiveis de conter mutações somáticas. Estas mutações são únicas para o individuo a partir do qual os genes rearranjados foram derivados, e, consequentemente, irão ser vistas como estranho por outros indivíduos. Sequências do banco de dados germinativos são mais adequadas para a humanização de anticorpos a partir dessa perspectiva. No entanto, não há sequências do banco de dados da linha germinativa que codificam todo o FW que estejam prontamente disponíveis para a humanização de anticorpos, e elas só podem ser geradas pela combinação de sequências cruas de genes V e J.

Um outro problema na utilização de genes de anticorpos maduros para aceitador FW é que nem todas as combinações possíveis de V-J da cadeia leve ou combinações V-D-J para a cadeia pesada estão representadas nos genes maduros. Assim, podem surgir situações em que um gene estreitamente correspondente V é ligado a um segmento de J de correspondência fraca. A humanização do anticorpo monoclonal de ratinho anti-Tac descrita por Queen et al., (Proc Natl Acad Sei USA 86:10029-10033 (1989)) é um

exemplo. A comparação da região anti-Tac VH para a base de dados NBRF-PIR (http://www.psc.edu/general/software/packages/nbrf-pir/nbrf .html) indica que a região VH da proteína do mieloma humano Eu tinha o mais alto grau de homologia (57% idêntico em relação a VDJH) . No entanto, a estrutura 4 da 4 região Eu VH tem vários aminoácidos, presumivelmente codificados pelo segmento Eu JH, que são atípicos dos segmentos humanos JH. Isso resulta numa correspondência fraca entre a estrutura 4 da Eu e do anti-Tac (Fig. 1). A comparação independente da região JH do anti-Tac (estrutura 4 e estrutura 4 - extremidade proximal do CDR3) com as sequências de aminoácidos dos segmentos humanos funcionais JH conhecidos (dos quais há seis. Ver Fig. 2), indica que JH 4 humana é muito melhor correspondência do que a Eu JH. Este exemplo sugere que as comparações separadas dos elementos V e J são mais vantajosas do que a comparação das regiões variáveis completas das sequências de anticorpos entre roedores e humanos. Atualmente, uma ferramenta para este tipo de comparação separada não está prontamente disponível.

Nem todos os aminoácidos nas CDRs estão envolvidos na ligação ao antigénio. Assim, foi proposto que o enxerto de apenas os resíduos que são críticos na interação antigénio-anticorpo - a chamada especificidade de determinação de resíduos de enxerto (enxerto SDR) - vá aumentar ainda mais o teor das sequências de anticorpos humanos no anticorpo recombinante resultante (Kashmiri et al., Methods. 36:25-34 (2005)/ Gonzales et al. Mol. Immunol. 40:337-49 (2004)). A aplicação desta estratégia requer informação sobre a estrutura dos anticorpos, bem como dos resíduos de contacto anticorpo-antigénio, que estão muito frequentemente indisponíveis. Mesmo quando essa informação está disponível, não existe um método sistemático para identificar com segurança as SDRs e o enxerto SDR permanece até agora principalmente a nivel da pesquisa básica. 5

Recentemente, foi desenvolvida uma nova estratégia chamada "mistura da estrutura humana" (Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005). Essa técnica funciona por ligação de fragmentos de ADN que codificam as CDRs para os fragmentos de ADN que codificam FR1, FR2, FR3 e FR4 humano, gerando, assim, uma biblioteca de todas as combinações entre as CDRs dadoras e as FRs humanas. Embora esta estratégia tenha sido aplicada com sucesso, existem dois problemas potenciais. Em primeiro lugar, as FRs do anticorpo resultante, enquanto todas as fontes humanas, são susceptiveis de ser de FWs não contíguas, e, portanto, não naturais. Permanece para ser avaliado se estas FWs antinaturais serão imunogénicas em humanos. Em segundo lugar, a biblioteca, em teoria, pode ser proibitivamente grande, e levar à necessidade de elevados recursos de pesquisa e ensaio.

Assim, existe uma necessidade de métodos melhorados para a produção de anticorpos humanos adequados.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 mostra comparações da região anti-Tac JH. A Fig. 2 mostra as sequências de aminoácidos do segmento JH humano. A Fig. 3 mostra o fluxograma do algoritmo da estrutura da biblioteca. A Fig. 4 mostra os fragmentos dos genes V, D, J para a variável FR/CDR. 6 A Fig. 5 mostra a sequência de aminoácidos para a região variável da cadeia pesada e a correspondente FRs/CDRs de murino anti-TLR3 mAb 1068. A Fig. 6 mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve 1068 e a correspondente FRs/CDRs de murino anti-TLR3 mAb 1068. A Fig. 7 mostra um alinhamento de sequências da biblioteca de cadeia pesada FW. A Fig. 8 mostra um alinhamento de sequências da biblioteca de cadeia leve FW.

As Figs. 9A, B, C e D mostram a ligação de anti-TLR3 mAbs humano adaptado para hTLR3 em ensaios ELISA.

Sumário da Invenção

Um aspecto da invenção é um método para selecionar estruturas de anticorpos humanos para uso na produção de um anticorpo humano adaptado compreendendo os passos de: a. obtenção de uma sequência de péptido para uma região variável de um anticorpo não humano; b. delineamento das sequências de péptidos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e das regiões de estrutura da região variável não humana; c. construção de uma biblioteca de sequências de péptidos para a estrutura 1, 2, 3 e 4 do anticorpo humano codificadas por genes da linha germinativa humana; d. seleção de um subconjunto de membros das sequências de péptidos humanos da biblioteca com um comprimento idêntico para as regiões estruturais do anticorpo não humano maduro; 7 e. comparação da similaridade da estrutura da região de sequência das sequências de peptídeos humanos selecionadas para as sequências de péptidos das regiões de estrutura não-humanas; f. comparação da compatibilidade do comprimento de CDR1 e CDR2 comprimento entre as sequências de péptidos humanos selecionadas e as sequências de péptidos das regiões de estrutura não-humanas; g. seleção de um segundo subconjunto das sequências de péptidos humanos selecionados, em que as sequências de péptidos selecionadas têm uma estrutura de região de semelhança maior do que um valor de limiar de identidade e a soma da diferença de comprimento de CDR1 e CDR2 é menor do que ou igual a um valor de limiar de compatibilidade do comprimento de CDR12; e h. seleção de estruturas representativas do segundo subconjunto do passo g) com base num valor de tamanho da biblioteca e um valor da redundância da estrutura da região.

Outro aspecto da invenção é um método de produção de um anticorpo humano adaptado compreendendo os passos de: a. obtenção de uma sequência de péptido de uma região variável de um anticorpo não humano; b. delineamento das sequências de péptidos de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de estrutura da região variável não humana; c. construção de uma biblioteca de seguências de péptidos para a estrutura das regiões 1, 2, 3 e 4 do anticorpo humano codificada por genes da linha germinativa humana; 8 d. seleção de um subconjunto de membros de sequências de péptidos humanos da biblioteca com um comprimento idêntico ao das regiões estruturais do anticorpo não humano maduro; e. comparação da similaridade da estrutura da região de sequência das sequências de peptídeos humanos selecionados para as sequências de peptideos das regiões de estrutura não-humanas; f. comparação da compatibilidade do comprimento de CDR1 e CDR2 entre as sequências de peptideos humanos selecionados e as sequências de péptidos das regiões de estrutura não-humanas ; g. seleção de um segundo subconjunto das sequências de péptidos humanos selecionadas, em que as sequências de peptídeos selecionadas têm uma similaridade de estrutura de região maior do que um valor limite de identidade e a soma da diferença de comprimento de CDR1 e CDR2 é menor do que ou igual a um valor do limiar de compatibilidade do comprimento de CDR12; h. seleção de estruturas representativas do segundo subconjunto do passo g) com base num valor de tamanho da biblioteca e um valor da redundância da estrutura da região; e i. construção de uma molécula quiméric, que inclui cada uma das regiões CDR da região variável não humana e regiões de estrutura de, pelo menos, um membro das estruturas representativas da cadeia pesada e da cadeia leve humanas selecionadas no passo h), em que a molécula quimérica é um anticorpo adaptado humano ou um fragmento de anticorpo que se liga ao mesmo antigénio a que está ligado pelo anticorpo não-humano. 9

Descrição Detalhada da Invenção

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações, as formas singulares "um", "e" e "o" incluem referência plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma cadeia de péptido" é uma referência a uma ou mais cadeias de peptideos, e inclui os seus equivalentes conhecidos dos peritos na técnica. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e cientificos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual pertence esta invenção. Embora métodos semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no ensaio da invenção, os métodos aqui descritos são exemplificativos. 0 termo "anticorpo" significa moléculas de imunoglobulina ou de anticorpo e fragmentos de anticorpos. Em geral, os anticorpos são proteínas ou polipeptídeos que exibem especificidade de ligação a um antigénio específico. Anticorpos intactos são glicoproteínas heterotetraméricas, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, enquanto o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e cadeia leve também têm pontes de dissulfureto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro 10 domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a saber, kappa (k) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

As imunoglobulinas podem ser atribuídas a cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de aminoácido de domínio constante de cadeia pesada. As IgA e IgG, podem ainda sub-classifiçadas como os isotipos IgAi, lgA2, IgGi, IgG2, lgG3 e IgG4.

Os anticorpos são proteínas segregadas constitutivamente expressas e segregadas pelas células do plasma. Os anticorpos também podem ser produzidos utilizando células imortalizadas de plasma por meio de métodos convencionais, tais como a produção do hibridoma ou através de transfecção genes de anticorpo cadeia pesada/leve numa célula B imortalizada, como uma célula de mieloma ou outros tipos de células, tais como as células de ovário de hamster chinês (CHO), células de plantas e células de insectos. 0 termo "fragmentos de anticorpos" designa uma porção de um anticorpo intacto, geralmente a região de ligação de antigénio ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F (ab')2 e Fv, diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples, tais como as moléculas de scFv em que as variáveis de cadeias pesadas e as variáveis de cadeias leves estão ligadas como uma única cadeia polipeptídica por um ligante 11 e anticorpos multiespecíficos formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos.

Anticorpos humanizados, humanos adaptados e enxertados com CDR são anticorpos monoclonais quiméricos que contêm CDR de uma espécie não-humana e regiões de estrutura da região variável e das regiões constantes de um anticorpo humano. A presente invenção proporciona um novo método de adaptação do anticorpo humano. 0 método utiliza genes V e J germinais humanos como uma fonte das sequências aceitadoras FW, classificando todas as aceitadoras FWS baseadas na similaridade FW e em outros critérios entre anticorpo não humano e as sequências da linha germinativa humana, e gerando uma biblioteca de anticorpos humanos adaptados representativos (ver fluxograma da Fig. 3) . Os algoritmos usados no processo da invenção são descritos abaixo. 1. Criação de banco de dados FW humanas virtuais

Sequências germinativas de genes V e J foram descarregadas baixados do banco de dados Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Vbase é uma lista completa de todas as sequências da região variável germinativas humanas compiladas a partir de mais de mil sequências publicadas, inclusive nas versões atuais do Genbank e bibliotecas de dados EMBL. 0 banco de dados foi desenvolvido ao longo de vários anos no MRC Centre for Protein Engineering como uma extensão do trabalho no sequenciamento e mapeamento de genes de anticorpos humanos. A FW é composta por quatro regiões de estrutura curtas (FR) . Como pode ser visto na Fig. 4, FR1, FR2 e FR3 são 12 codificadas pelo fragmento do gene V da linha germinativa, enquanto FR4 é codificada pelo fragmento do gene J da linha germinativa. No banco de dados Vbase, cada gene germinativo V foi delimitado em regiões FR e CDR. A fim de implementar a estratégia da biblioteca da invenção, uma base de dados FW virtual foi criada a partir das sequências de genes V e J. Cada registo no banco de dados FW virtual consiste em 4 campos, i.e., FR1, FR2, FR3 e FR4, e é gerado pela combinação exaustiva de V/J de FRs. Por exemplo, na cadeia pesada, existem seis fragmentos JH, mas que codificam apenas 4 fragmentos FR4 únicos (devido à JH1, JH4 e JH5 que codificam o mesmo FR4), ver a Fig. 2. Os últimos 11 residuos de cada sequência JH correspondem a FR4. 0 emparelhamento de todo o FR1 FR2, FR3 a partir de genes V da linha germinativa pesada com estes 4 FR4 únicos gera a base de dados FW para a cadeia pesada. 0 banco de dados FW para as cadeias leves kappa e lambda foi gerado de forma semelhante. Há um total de 666 registos no banco de dados FW resultante, dos quais 260 são gerados a partir de cadeias pesadas germinativas, e 190 e 216 são de cadeias leves kappa e lambda, respectivamente. Não há entradas redundantes no banco de dados FW, e cada registo FW é único. 2. Delimitação de uma sequência de anticorpo em FRs e CDRs A definição de Kabat CDR, que se baseia na variabilidade da sequência do anticorpo, é vulgarmente utilizada em delineamento de sequência. Outras regras ou padrões conhecidos (http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) são também tipicamente aplicados para encontrar os CDRs numa sequência de anticorpos, mas não é incomum que muitas CDRs 13 de anticorpos não se conformem com os padrões. Comparado com as CDRs, as FR são muito mais conservadas em termos de comprimento e de homologia. Em vez de se encontrar diretamente as CDRs, o método da invenção utiliza o algoritmo descrito abaixo para identificar asFRs e, consequentemente, as CDR correspondentes são deduzidas (ver Figura 4. para decomposição do anticorpo em FR/CDR). A base de dados FW construída como descrito acima contém sequências FRl, FR2, FR3 e FR4 para cada FW. Para uma dada sequência do anticorpo e da sua linha germinativa compatível FW, o algoritmo identifica as regiões de estrutura (i.e., sequências FRl, FR2, FR3 e FR4) como segue. Tomando FR2 como um exemplo, uma janela FR2 deduzida a partir da sequência da linha germinativa humana é movida ao longo da sequência do anticorpo a partir do primeiro resíduo, e a similaridade para as sequências na janela é calculada em cada posição do resíduo. Quando a sequência de janela FR2 corresponde à sua sequência de anticorpo homóloga, será observado um pico de alta similaridade, identificando, assim, FR2. Da mesma forma, FRl, FR3 e FR4 podem ser encontradas de uma maneira semelhante. Este algoritmo é muito eficaz na identificação de regiões da estrutura e universalmente aplicável a qualquer sequência do anticorpo. 3. Nova homologia baseada em fragmento e banco de dados de filtragem de estrutura

No enxerto CDR, um roedor anticorpo dador FW é substituído por um humano e as CDR permanecem as mesmas. No entanto, o comprimento de cada FR no anticorpo do roedor tem de ser compatível com a da FR humana. Depois de uma sequência de anticorpo do dador ser delineada em FR e regiões CDR, as 14 suas RFs são comparadas com as FW no banco de dados criado acima. Isto gera uma lista de FWs classificadas pelas suas semelhanças com o anticorpo dador. 0 algoritmo de comparação da homologia da invenção é detalhado abaixo.

Em primeiro lugar, a compatibilidade entre o comprimento do anticorpo não humano FRs e FRs humanas é verificado e é são selecionado um subconjunto de sequências humanas que têm um comprimento idêntico ao das FR não humanas. Por exemplo, na FR1, há sempre 30 resíduos na sua região de cadeia pesada, enquanto os números são sempre 22 e 23, para as cadeias kappa e lambda, respectivamente. Se um determinado anticorpo é uma cadeia leve capa, apenas aquelas FWs kappa na base de dados podem ser escolhidas; não é possível escolher um lambda FW uma vez que os comprimentos de FR1 entre o dador e o aceitador não são idênticos, mas é muito provável que o dador da sequência kappa seja muito semelhante a uma linha germinal lambda como um todo. Este novo algoritmo de comparação de homologia deverá reduzir significativamente os falsos positivos na escolha de FWs.

Ainda, se um aceitador FW passa a verificação de compatibilidade de comprimento FR, o número de diferenças de resíduos entre o dador e o aceitador FWs são contadas, e, em seguida, a similaridade da sequência global entre as sequências do dador e do aceitador FW é calculada. Se a similaridade for inferior a um valor limite chamado valor limiar de identidade, a correspondente FW é ignorada/omitida. O limiar de identidade é um parâmetro especificado pelo utilizador, e os valores padrão são pelo menos 60%, tanto para a cadeia pesada como para a cadeia leve. O objectivo deste parâmetro é o de reduzir o número de candidatos FWs de modo que apenas FWs com similaridade 15 razoável ao dador possam ser selecionadas para o enxerto CDR.

Em seguida, são comparados o grau de compatibilidade de comprimento CDR1 e CDR2 entre as sequências de peptideos humanos selecionados e as sequências de péptidos de regiões de estrutura não humanos. Especificamente, o comprimento CDR1 é comparado e é gerado um valor refletindo o número de resíduos que diferem. Da mesma forma, é comparado o comprimento CDR2 e gerado um valor semelhante. Os valores de diferença do comprimento CDR1 e CDR2 são somados para gerar um valor de comprimento de compatibilidade CDR12. A estrutura tendo o seu valor de comprimento de compatibilidade CDR12 maior que um valor do limiar de comprimento de compatibilidade CDR12 é eliminado. 0 valor limiar de comprimento de compatibilidade CDR12 recomendado é 0 ou 1.

Finalmente, todos os candidatos FWS identificados a partir do comparador de comprimento, homologia de sequência e comparação de comprimento CDR12 da base de dados virtual de FW são classificados com base na identidade de sequência FW de modo a que a FW mais homóloga seja classificada em primeiro lugar. 4. Seleção de FWs representativas para rastreio

Sob certas circunstâncias, pode ser desejável rastrear uma biblioteca representativa menor de candidatos FWs, em vez de todo o conjunto de candidatos. Primeiro, algumas FWs são muito semelhantes entre si, mesmo com uma única diferença de resíduo devido à estreita semelhança intrínseca entre algumas sequências germinativas. Nessa 16 circunstância, é razoável e benéfico não incluir todas as FWs no rastreio, e, em vez disso, escolher um representante FW. Em segundo lugar, os laboratórios húmidos podem não ter capacidade de rastreio de todas as FWs combinadas, se a biblioteca resultante for muito grande. Por exemplo, se os limiares de similaridade FW forem definidos como um padrão de 60% (para a cadeia pesada) e 70% (para a cadeia leve), são obtidos 75 e 80 candidatos FWs para as cadeias pesadas e leves de um rato anti-TLR3 mAb, respectivamente (Ver Figs. 5 e 6 e Exemplo 1, infra) . O número total de combinações FW de HC/LC é de 6000, e isso representa um grande desafio para o rastreio em laboratório húmido.

Na presente invenção, foi desenvolvido um algoritmo para automatizar a escolha de FWs representativos, e gerar uma biblioteca de FW muito menor e menos redundante para o rastreio. Um utilizador pode inserir o tamanho da biblioteca FW (número de membros), e o critério redundante FW (limiar redundante), e o algoritmo compara automaticamente todas os FWs candidatos e cria a biblioteca FW em conformidade. A escolha critério redundante FW é dependente do número total de candidatos FWs após a comparação de homologia e o tamanho desejado da biblioteca FW para o rastreio. Na prática, recomenda-se a diferença de 1 a 3 resíduos. O tamanho da biblioteca FW pode ser qualquer valor inteiro, por exemplo, de 4 a 20. Os passos do algoritmo e parâmetros são detalhados abaixo.

Parâmetros do algoritmo:

Lista de candidatos FW: todos os candidatos FWS após a comparação de homologia; 17

Lista de saída FW: a lista da biblioteca de sequência FW;

Tamanho da biblioteca: o tamanho da biblioteca FW;

Limiar redundante: o critério para considerar que dois FWs são redundantes; FW ativo: o FW atual escolhido do Fluxograma da Lista de candidatos FW. a. Verifique o tamanho da Lista de Candidatos FW, vá para a etapa f) se essa lista estiver vazia; b. Escolha o primeiro FW da Lista de Candidatos FW; i. Defina este FW para FW ativo/ ii. Remova este FW da Lista de Candidatos FW/ iii. Coloque este FW na Lista de Saida FW/ c. Verifique o tamanho da Lista de Saida FW, vá para a etapa f) se o tamanho da biblioteca tiver sido atingido; d. Conte a diferença entre cada resíduo FW na Lista de CandidaTOS FW com o FW ativo, remova este FW da Lista de Candidatos FW se a diferença for inferior ao limiar redundante/ e. Vá para a etapa a); f. Enxerto CDRs de anticorpos de roedores em cada FW na Lista de Saída FW; e parar.

Saída:

Uma biblioteca de anticorpos humanizados representativos. 18 0 algoritmo definido acima pode ser modificado para alterar o tamanho da biblioteca FW de modo a coincidir com a capacidade de rastreio do laboratório húmido. Para cadeias de anticorpo pesadas e leves de roedores, as bibliotecas FW correspondentes serão geradas respectivamente, e todos as cadeias pesadas e leves humanas adaptadas serão combinadas para o rastreio. Assim, o algoritmo de estratégia global da biblioteca FW da invenção aumenta a probabilidade de encontrar pares favoráveis de cadeias pesadas e leves humanas com as interações entre cadeias óptimas que são susceptiveis importante para a retenção de afinidade.

Um perito na técnica pode automatizar as principais etapas do algoritmo através de programação de computador, tal como em linguagem Java orientada para o objecto. Funções de importação/exportação úteis incluem a capacidade de ler sequências de anticorpos de roedores numa variedade de formatos e escrever conjuntos de bibliotecas FW em arquivos Fasta planas ou exportá-los numa folha de cálculo ou arquivo HTML.

Após a seleção de pares de estruturas favoráveis da cadeia pesada e leve humana, pelos métodos da invenção, pode ser construída uma molécula quimérica que inclua cada uma das regiões CDR da região variável não humana e as regiões de estrutura de, pelo menos, um membro das estruturas representativas da cadeia pesada e leve humanas selecionadas, em que a molécula quimérica é um anticorpo humano adaptado ou fragmento de anticorpo que se liga ao mesmo antigénio a que está ligado pelo anticorpo não-humano. Técnicas de ADN recombinante bem conhecidas dos peritos na técnica podem ser utilizadas para construir as moléculas quiméricas. As moléculas quiméricas podem então 19 ser selecionadas por rastreio de cada molécula de afinidade de ligação ao antigénio e selecionando o anticorpo humano adaptado óptimo ou fragmento de anticorpo. 0 método da invenção proporciona um número de vantagens sobre as técnicas atuais de adaptação humana. Por exemplo, ao contrário de todas as outras estratégias baseadas na estrutura, tais como o enxerto SDR, o processo da invenção não requer informações de estrutura complexa detalhada do anticorpo ou antigénio-anticorpo. Outra vantagem do método da invenção é que pode fornecer vários anticorpos humanizados comparáveis, mas distintos, para a mesma CDR do dador. Isto é especialmente útil para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos, permitindo aos investigadores selecionar um candidato principal e ter um ou mais candidatos a seguir ou de reserva.

Outra vantagem relacionada com o método da invenção é que estes candidatos comparáveis, com as suas sequências distintas, podem ter diferentes propriedades farmacêuticas químicas e fisiológicas. Isto pode ser utilizado em outros aspectos de melhoria terapêutica do anticorpo. Por exemplo, as CDRs do anticorpo com baixa solubilidade podem ser montadas numa biblioteca de estrutura humana, e um bom ligante, com solubilidade melhorada pode ser selecionado a partir dos anticorpos resultantes. A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos, não limitativos específicos. 20

Exemplo 1

Adaptação humana de um anticorpo monoclonal murino

As sequências de aminoácidos de murino anti-TLR3 mAb de cadeia pesada C1068 (HC) e leve (LC) são listadas nas Figs. 5 e 6, respectivamente. A aplicação do algoritmo de estratégia de humanização da biblioteca no âmbito da invenção discutido para o mAb C1068 gera um conjunto de biblioteca FW de 8 HC e LC 12. HC 4 e 4 LC foram escolhidas para o rastreio inicial. A similaridade entre cada FW e mAb C1068 é relatada na Tabela 1. Os resultados indicam que todas as quatro HC e 4 LC são comparáveis, em termos de semelhança global de sequência. 0 alinhamento de sequência múltiplo das quatro HC mostra que estes quatro FWs são muito semelhantes entre si (Fig. 7), e isto é válido para as 4 LC FWs (ver Fig. 8 para alinhamento de sequências múltiplas FW) também.

Tabela 1: Estrutura da biblioteca de murino anti-TLR3 mAb C1068

Estrutura da biblioteca FW de cadeia pesada Estrutura da biblioteca FW de cadeia leve Abbr. FW Identidade (%) Abbr. FW Identidade (%) HV1 VB_1-03/JH1 72 LV1 VB_012/JK2 78 HV4 VB_l-02/JHl 71 LV3 VB_A3 0/JK2 77 HV5 VB_1-08/JH1 71 LV5 VB_A2 0 / JK4 76 HV7 VB_l-69/JH2 71 LV7 VB_L1/JK2 76 21

Foram expressos dezasseis mAbs que representam todas as combinações possíveis das quatro construções de cadeias variáveis pesadas e leves das quatro regiões. Todas as estruturas da região variável da cadeia pesada foram expressas com uma região constante de IgG4 de cadeia pesada humana que tem uma substituição de Ser para Pro no resíduo 108 e substituições de Phell4 e Leull5 e Ala; S228P, F234A L235A e na cadeia pesada de comprimento total. Todas as estruturas da região variável da cadeia leve foram expressas usando uma região constante humana K. Os anticorpos foram expressos transitoriamente em células de mamíferos por co-transfecção de cadeia leve e pesada contendo os plasmídeos apropriados. Os anticorpos foram purificados utilizando um padrão de purificação de proteína A e dialisados em PBS para a caracterização.

Todos os 16 mAbs foram avaliados para a ligação ao domínio extracelular de TLR3 humana usando um formato ELISA, em comparação com o mAb murino parental C1068. Resumidamente, o domínio extracelular solúvel humano TLR3 foi revestido sobre os poços de uma placa de 96 poços e os mAbs candidatos foram incubados em várias concentrações (de 10-3 a 103 ng/ ml) e o anticorpo ligado foi detectado com isotipos de coelho anti-rato IgG-HRP para murino IgGl (Zymed, South San Francisco, CA) ou HRP marcado IgG anti-humano (Jackson 109-036-088) para isotipos IgG4 humanos. Os valores de EC50 foram determinados e os resultados de rastreio são mostrados na Fig. 9 e na Tabela 2 abaixo. 22

Tabela 2: Valores de EC5o calculados para 16 mAbs combinatórios EC50 ng/ml HV1 HV4 HV5 HV7 LV1 29,2 29, 1 15, 5 1474,0 LV3 117,7 60,2 28, 9 >5000 LV5 27,7 18,7 13, 7 1820,0 LV7 288,8 182, 9 78, 6 4258,0 o CE50 de C1068 calculado foi de 8 ng/ml; os resultados indicam que 12 dos mAbs humanos adaptados tinha menos do que uma redução de 40 vezes no CE50 calculado relativo ao progenitor murino mAb 1068. Os pares LV5/HV5, LV5/HV4 e LV1/HV5 são melhores do que o par mais homólogo LV1/HV1 em termos de afinidade.

Os dados sobre a afinidade da Tabela 2 e Fig. 9 mostram claramente que, pelo menos no caso do anticorpo anti-TLR3, a escolha do melhor ajuste não é o melhor aceitador, e que as interações entre cadeias contribuem para a afinidade do anticorpo. A nova estratégia de estrutura de biblioteca humana e algoritmo, portanto, desafia fundamentalmente a abordagem tradicional de melhor ajuste e, ao mesmo tempo, proporciona uma abordagem experimental, muito promissora, para a seleção de receptores para a humanização do anticorpo. A presente invenção agora totalmente descrita, será aparente para um perito na técnica mas muitas mudanças e 23 modificações podem ser feitas à mesma sem se sair do âmbito das reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> CENTOCOR, INC.

DE ANTICORPOS MONOCLONAIS AO

Ala Glu Leu val Gin Pro Gly Thr 10 15 ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr 25 30 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Arg ile Asn Tyr GO Asn Glu Lys Phe ASp Lys Ser w Ser Ser Thr Ala Tyr 75 val 80 Glu ASp Ser Ala Tyr Tyr Cys 90 95 Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110 <12 0> MÉTODOS DE ADAPTAÇÃO SER HUMANO 130> CEN5164PCT <140> A SER ATRIBUÍDO <141> 2007-10-25 <140> 60/863008 <141> 2006-10-26 <160> 10

Versão 4.0 <170> FastSEQ para Windows

<210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1

Gin 1 vai Gin Leu Gin 5 Gin Pro Gly Ser Vai Arg teu 20 Ser Cys Lys Ala Trp Ile Mis Trp 35 Vai Lys Gin Arg 40 Gly Glu 50 Ile Asn Pro Asn Asn 55 Gly Lys 65 Thr Lys Ala Thr Leu 70 Thr vai Met Gin Leu Ser ser 85 Leu Thr ser Thr Arg vai Gly ÍOO vai Met ile Thr Thr Leu vai 115 Thr Vai Ser Ala 24 <210> 2

<211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 61u Thr val Thr ile Thr cys Arg Ala Ser Gly Asn ile HÍS Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gl n Leu Leu val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gl y ser Tyr Tyr Cys Gin HÍS Phe Trp Ser Thr pro Phe 85 90 95 Thr phe 61 y ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia pesada adaptada humana HV1 <400> 3 25

Gin vai Gin Leu Vai Gin ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys pro Gly Ala 1 5 10 15 ser vai Lys vai Ser cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 Gin 30 Trp ile HÍS Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Arg Leu Gl u Trp Met 35 40 45 Gly Glu lie Asn Pro Asn Asn Gly Arg ile Asn Tyr Asn GlU Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg vai Thr 11 e Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu asp 90 Thr Ala vai Tyr Kr cys Ala Arg Vai Gly Vai Met lie Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Th r Leu vai Thr vai Ser Ser 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia pesada adaptada humana HV4 <4 0 0> 4

Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys val Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 Gin 30 Trp ile His Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu ser Arg 85 Leu Arg ser Asp Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Vai Gly 100 val Met ile Thr Thr 105 Phe Pro Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr val ser Ser 115 26 <210> 5

<211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Cadeia pesada adaptada humana HV5 <400> 5

Gin vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu vai lvs Lys pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser vai Lys vai ser cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Trp ile His Trp vai Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Glu ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Thr Arg vai Thr Met Thr Arg Asn Thr ser ile ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala vai Tvr Tyr cys 85 90 y 95

Ala Arg vai Gly vai Met ile Thr Thr Phe pro Tyr ΤΓ„ Gin Gly 100 105 μ

Thr Leu Vai Thr vai Ser ser 115

210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia pesada adaptada humana HV7 <400> 6 27

Gin val Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly ser 1 5 10 15 ser val Lys val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Trp ile His Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu lvs Phe 50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cvs 85 90 95

Ala Arg val Gly val Met ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Glv Ara Glv 100 105 110

Thr Leu val Thr val Ser Ser 115

210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Cadeia pesada adaptada humana LV1 <400 > 7 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 Gly 15 Asp Arg val Thr ile Thr Cys Arg Ala ser Asn ile HIS Asn Tyr 20 25 Ala 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys ΡΓΟ Gly Lys Pro Lys Leu Leu 11 e 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala ASp Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 ile 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr phe Gly Gin Gly rhr Lys Leu Glu ile Lys 100 105 28

210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia pesada adaptada humana LV3 <400> 8

Gin ser ΡΓΟ Ser ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15 Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 25 30 Gin lys Pro Gly Lys Ala pro Lys Arg Leu Ile 40 45 Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg phe Ser g! y 55 60 Glu Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Gin Pro 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 90 95 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105

Asp ile Gin Niet Thr 1 5

Asp Arg vai Thr lie 20

Leu Ala Trp Tyr Gin 35

Tyr Asn Ala lys Thr 50

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Glu Asp Phe Ala Thr 85

Thr Phe Gly Gin Gly 100

210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia pesada adaptada humana LV5 <400> 9 29

Asp He Gin Met Thr Gin Ser pro 1 5

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg 20

Leu Ala Trp ryr Gin Gin Lys Pro 35 40

Tyr Asn Ala Lys Thr leu Ala Asp 50 55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Glu Asp vai Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai 100

Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 10 15

Ala Ser Gly Asn Xle His Asn Tyr 25 30

Gly Lys Vai Pro Lys Leu Leu Ile 45

Gly Vai pro ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 90 95

Glu Ile Lys 105 210> 10 <211> 107

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia pesada adaptada humana LV7 <4 0 0> 10

Asp ile Gin Met Thr Gin ser pro ser ser teu ser Ala ser vai Gly 1 . . 5 10 15

Asp Arg vai Thr ile Thr cys Arg Ala ser Gly Asn ile His Asn Tyr 70 25 30

Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin His Phe Trp ser Thr Pro Phe , , 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu ile Lys 100 105 30

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para selecionar estruturas de anticorpos humanos para uso na fabricação de um anticorpo humano adaptado compreendendo os passos de: a. obtenção de uma sequência de péptido de uma região variável de um anticorpo não humano; b. delineamento das sequências de péptidos de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de estrutura da região variável não humana; c. construção de uma biblioteca de sequências de péptidos para a estrutura das regiões 1, 2, 3 e 4 do anticorpo humano codificada por genes da linha germinativa humana; d. seleção de um subconjunto de membros de sequências de péptidos humanos da biblioteca com um comprimento idêntico ao das regiões estruturais do anticorpo não humano maduro; e. comparação da similaridade da estrutura da região de sequência das sequências de peptideos humanos selecionados para as sequências de peptideos das regiões de estrutura não-humanas; f. comparação da compatibilidade do comprimento de CDR1 e CDR2 entre as sequências de peptideos humanos selecionados e as sequências de péptidos das regiões de estrutura não-humanas; g. seleção de um segundo subconjunto das sequências de péptidos humanos selecionadas, em que as sequências de 1 peptídeos selecionadas têm uma similaridade de estrutura de região maior do que um valor limite de identidade e a soma da diferença de comprimento de CDR1 e CDR2 é menor do que ou igual a um valor do limiar de compatibilidade do comprimento de CDR12; h. seleção de estruturas representativas do segundo subconjunto do passo g) com base num valor de tamanho da biblioteca e um valor da redundância da estrutura da região, em que o dito valor da redundância da estrutura da região é de 1 a 3.
2. 2. Método de produção de um anticorpo ou fragmento de anticorpo humano adaptado compreendendo o método da reivindicação 1 e que compreende ainda o passo de: i) construção de uma molécula quimérica, que inclui cada uma das regiões CDR da região variável não humana e regiões de estrutura de pelo menos um membro das estruturas representativas da cadeia pesada e da cadeia leve humanas selecionadas no passo h) , em que a molécula quimérica é um anticorpo humano adaptado ou fragmento de anticorpo que se liga ao mesmo antigénio a que está ligada pelo anticorpo não-humano.
3. 3. Método da reivindicação 2, que compreende ainda o passo de: j) rastrear cada combinação para ligação de afinidade ao antigénio e selecionando o anticorpo humano adaptado óptimo ou fragmento de anticorpo.
4. 4. Método da reivindicação 1 ou 2, em que o valor do limiar de identidade é, pelo menos, 60% para as estruturas da cadeia pesada e de cadeia leve. 2
5. 5. Método da reivindicação 1 ou 2, tamanho da biblioteca é de 4 a 20. em que o valor do 3