PT2081937E - Moduladores de proteína-cinase de triazolo-piridazina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MODULADORES DE PROTEÍNA—CINASE DE TRIAZOLO-PIRIDAZINA"

As cinases de proteínas de mamíferos são importantes reguladores das funções celulares. Porque as disfunções na atividade de proteína-cinase têm sido associadas a várias doenças e distúrbios, as proteína-cinases são alvos para o desenvolvimento de fármacos. A familia de tirosina-cinase e particularmente o subconjunto de tirosina-cinases recetoras, é enriquecida com alvos de cancro comprovados e putativos. As tirosina-cinases recetoras (RTKs) tais como EGFR, HER2, KIT e KDR são proteínas bem caraterizadas com um papel claramente estabelecido no cancro. Fármacos visando estas RTKs, tais como Gleevec, Iressa e Tarceva, foram aprovados para o tratamento de certos tipos de cancro. Outras RTKs são menos bem caraterizadas, mas também têm sido implicadas no cancro. Por exemplo, dados emergentes sugerem que os inibidores de TRKC, ROS, CSF1R/FMS e ALK podem ser úteis no tratamento do cancro. MET e RON são dois alvos de RTK particularmente atrativos para o desenvolvimento de novos agentes para tratar o cancro. 0 fator de crescimento de hepatócito (HGF), também conhecido como fator de dispersão, é um fator de crescimento multi-funcional que acentua a transformação e 2 ΡΕ2081937 desenvolvimento do tumor, induzindo a mitogénese e a motilidade da célula. Além disso, o HGF promove a metástase por estimulação da motilidade da célula e invasão através de vários caminhos de sinalização. A fim de produzir efeitos celulares, o HGF deve ligar-se ao seu recetor, c-Met, uma tirosina-cinase recetora. c-Met, uma proteína heterodimérica amplamente expressa compreendendo uma subunidade α de 50 quilodalton (kDa) e uma subunidade β de 145 kDa (Maggiora et al., J. Cell. Physiol., 173 (1997) 183-186), é sobre-expressa numa percentagem significativa dos cancros humanos e é amplificada durante a transição entre os tumores primários e metástases. Os vários cancros em que a sobre-expressão de c-Met está implicada incluem, mas sem constituir limitação, adenocarcinoma gástrico, cancro renal, carcinoma de pulmão de pequenas células, cancro colorretal, cancro de próstata, cancro do cérebro, cancro de fígado, cancro do pâncreas e cancro da mama. c-Met também está implicada na aterosclerose e fibrose do pulmão. MET foi primeiro identificado como um rearranjo de DNA transformador (TPR-MET) numa linha de celular de osteossarcoma humano que tinha sido tratada com N-metil-N'--nitro-nitrosoguanidina (Cooper et al., 1984). A tirosina--cinase recetora MET (também conhecida como recetor do fator de crescimento do hepatócito, HGFR, MET ou c-Met) e seu fator de crescimento de hepatócitos ("HGF") de ligando têm numerosas atividades biológicas, incluindo a estimu- 3 ΡΕ2081937 lação, proliferação, sobrevivência, diferenciação e morfo-génese, tubulogénese de ramificação, motilidade celular e crescimento invasivo. Patologicamente, MET tem sido implicado no crescimento, invasão e metástase de muitas formas diferentes de cancro, incluindo cancro do rim, cancro gástrico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do fígado e cancro da mama. Foram encontradas mutações de ativação somáticas no MET em metástases de carcinoma humano e em cancros esporádicos tais como o carcinoma da célula renal papilar. Há também evidência de que a via de sinalização do MET pode desempenhar um papel importante na resistência a terapias do cancro. Por exemplo, o gene MET verificou-se ser amplificado em pacientes de cancro de pulmão que recaíram após resposta inicial a inibidores do EGFR tais como gefitinib e erlotinib. Além do cancro, há evidência de que a inibição de MET pode ter valor no tratamento de várias indicações incluindo: invasão de Listeria, osteólise associada com mieloma múltiplo, infecção de malária, retinopatias diabéticas, psoríase e artrite. Mutações na sequência de codificação do MET são relativamente raras em cancros humanos. No entanto, com base no precedente seleção de mutações BCR-ABL em pacientes de leucemia mielóide crónica tratados com imatinibe e mutações do EGFR em cancro, pacientes tratados com erlotinib e gefitinib, estas e/ou talvez mutações adicionais do MET que podem conferir resistência a fármacos são previstas tornarem-se cada vez mais predominantes se os inibidores de 4 ΡΕ2081937 MET se tornarem amplamente utilizados no cancro. Por conseguinte, fármacos que efetivamente inibem algumas destas mutações de MET poderiam tornar-se ferramentas muito importantes em futuras terapias de cancro. MET está intimamente relacionado com um grupo de cinco tirosina-cinases recetoras que não foram tão bem estudadas como o próprio MET. Estas incluem Tyro3/Sky, MER, AXL, RYK e RON. A tirosina-cinase RON é o recetor para a proteína de estimulação de macrófago e é o parente mais próximo do MET, pertencente à família MET de tirosina-cinases recetoras. Tal como MET, RON está implicado no crescimento, invasão e metástase de várias formas diferentes de cancro, incluindo cancro colorretal e cancro de bexiga. Há também evidências de que AXL e MER desregulados podem desempenhar papéis importantes no cancro. MER tem muitas propriedades consistentes com a atividade como um oncogénio. Ratos transgénicos expressando MER na linhagem hematopoiética desenvolvem sintomas semelhantes a leuce-mia/linfoma linfoblástica da célula T e ela é expressa na maioria dos pacientes de leucemia linfoblástica aguda da célula T (T-ALL). Estudos em modelos de rato sugeriram que AXL é importante para o crescimento do cancro da mama, onde AXL apareceu a regular processos não só angiogénicos mas também tumorgénicos. Estudos adicionais com linhas de células de cancro humano sugerem que AXL está envolvido na metástase de NSCLC e resistência a fármaco. Embora muito pouco seja conhecido sobre os papéis normal e patológico de 5 ΡΕ2081937

Tyro3/Sky esta tirosina-cinase recetora compartilha certas propriedades e funções com seus parentes melhor estudados e também pode eventualmente provar ter um papel importante no cancro. RYK é também expressa em certos tipos de cancro, mas é uma tirosina-cinase recetora órfã atipica que não tem a atividade de cinase detectável e por conseguinte a sua rastreabilidade como um alvo para terapias de cancro de pequena molécula é atualmente incerta.

Porque têm sido implicadas cinases em numerosas doenças e condições, tais como cancro, é necessário desenvolver novos e potentes inibidores de proteina-cinase que podem ser usados para o tratamento. A presente invenção cumpre estas e outras necessidades na técnica. Embora certas proteínas-cinases sejam especificamente nomeadas aqui, a presente invenção não está limitada a inibidores destas cinases e inclui, dentro do seu âmbito e alcance, inibidores de proteinas-cinases relacionadas e inibidores de proteínas homólogas.

Foi descoberto que os compostos de triazolo-piridazina da presente revelação podem ser utilizados para modular a atividade da cinase e para tratar doenças mediadas pela atividade de cinase. Em particular, os compostos da presente revelação podem ser usados para modular e/ou inibir tirosina-cinases, incluindo MET. Além disso, os compostos da presente revelação podem ser usados para reduzir ou inibir a atividade de cinase do MET numa 6 ΡΕ2081937 célula ou indivíduo, e para modular a expressão de MET numa célula ou indivíduo. Os compostos revelados também são úteis para a prevenção ou tratamento num indivíduo de uma desordem proliferativa celular e/ou distúrbios relacionados com MET. Os moduladores de cinase de triazolopiridazina revelados são descritos em detalhe abaixo. Além disso, as atividades inibidoras dos compostos selecionados são aqui reveladas. Compostos estruturalmente semelhantes que são também adequados como inibidores de cinase são descritos em WO 02/083139 e WO 02/083675.

Num aspeto, a presente invenção proporciona compostos que têm a fórmula:

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Noutras formas de realização, a presente revelação diz respeito a compostos para utilização no tratamento de cancro e composições farmacêuticas usando um composto da presente invenção. A Figura 4 ilustra os efeitos na fosforilação de MET do tumor através da administração do composto 124 na forma duma dose oralmente aguda (PO). 9 ΡΕ2081937 A Figura 6 ilustra os efeitos sobre o volume médio do tumor pela administração do composto 124 oralmente (PO) duas vezes por dia (Q12H) durante 14,5 dias consecutivos . A Figura 7 ilustra os efeitos sobre a inibição do crescimento do tumor (TGI) em 16 tumores GTL em ratos nus pela administração do composto 124 por via oral.

Os compostos da presente revelação podem existir na forma de sais. A presente revelação inclui tais sais. Exemplos de formas de sal aplicáveis incluem hidrocloretos, hidrobro-metos, sulfatos, metanossulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartaratos (por exemplo, ( + )-tartaratos, (-)-tartaratos ou suas misturas incluindo misturas racémicas, succinatos, benzoatos e sais com aminoácidos tais como ácido glutâmico. Estes sais podem ser preparados por métodos conhecidos dos peritos na técnica. Também estão incluidos sais de adição de base tais como sais de sódio, potássio, cálcio, amónio, amino orgânico ou magnésio, ou um sal similar. Quando os compostos de presente revelação contêm funcionalidades relativamente básicas, os sais de adição de ácido podem ser obtidos pelo contacto da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente do ácido desejado, quer puro quer num solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição de ácido aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como os ácidos cloridrico, bromidrico, nitrico, carbónico, mono-hidrogenocarbónico, fosfórico, mono--hidrogenofosfórico, di-hidrogenofosfórico, sulfúrico, mono- 10 ΡΕ2081937 hidrogenossulfúrico, iodídrico ou fosforoso e semelhantes, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos como os ácidos acético, propiónico, isobutirico, maleico, malónico, benzóico, succinico, subérico, fumárico, lático, mandélico, ftálico, benzenossulfónico, p-tolilsulfónico, citrico, tartárico, meta-nossulfónico e semelhantes. Também estão incluidos os sais de aminoácidos tais como arginato e semelhantes, e sais de ácidos orgânicos como ácidos glucurónico ou galacturónico e semelhantes. Certos compostos específicos da presente revelação contêm funcionalidades não só básicas mas também acidicas que permitem que os compostos sejam convertidos nos seus sais de adição ou de ácido ou de base.

As formas neutras dos compostos são de preferência regeneradas pelo contacto do sal com uma base ou ácido e isolando o composto progenitor da maneira convencional. A forma progenitora do composto difere das várias formas de sal em certas propriedades fisicas, tais como a solubilidade em solventes polares.

Certos compostos da presente revelação podem existir em formas não solvatadas, bem como formas solva-tadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, as formas solvatadas são equivalentes a formas não solvatadas e estão abrangidas pelo âmbito e alcance da presente revelação. Certos compostos de presente revelação podem existir em múltiplas formas cristalinas ou amorfas. Em geral, todas as formas fisicas são equivalentes para as utilizações contempladas pela presente revelação e têm a intenção de estar dentro do âmbito e alcance da presente revelação. 11 ΡΕ2081937

Certos compostos da presente revelação possuem átomos de carbono assimétricos (centros óticos) ou ligações duplas; os enantiómeros, racematos, diastereómeros, tautó-meros, isómeros geométricos, formas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquimica absoluta, como (R)- ou (5)-, ou como (D)- ou (L)- para aminoácidos, e isómeros individuais são abrangidos pelo âmbito e alcance da presente revelação. Os compostos da presente revelação não incluem aqueles que são conhecidos na técnica por serem demasiado instáveis para sintetizar e/ou isolar. A presente revelação tem a intenção de incluir compostos em formas racémicas e oticamente puras. Isómeros (R)- e (S)-, ou (D) -e (L)-, oticamente ativos podem ser preparados utilizando sintões quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando técnicas convencionais. Quando os compostos aqui descritos contêm ligações olefinicas ou outros centros de assimetria geométrica, e a menos que especificado de maneira diferente, é pretendido que os compostos incluem ambos os isómeros geométricos E e Z. 0 termo "tautómero," conforme aqui usado, refere-se a um dos dois ou mais isómeros estruturais que existem em equilíbrio e que são prontamente convertidos de uma forma isomérica para outra.

Será evidente para um perito na técnica que certos compostos desta revelação podem existir em formas tautoméricas, estando todas essas formas tautoméricas dos compostos no âmbito e alcance da revelação. 12 ΡΕ2081937 A menos que indicado em contrário, as estruturas aqui delineadas têm também a intenção de incluir todas as formas estereoquimicas da estrutura; ou seja, as configurações R e S para cada centro assimétrico. Portanto, isómeros estereoquimicos isolados, bem como misturas enantioméricas e diastereoméricas dos presentes compostos estão dentro do âmbito e alcance da revelação. sulfúrico mono- 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" têm a intenção de incluir sais de compostos ativos, os quais são preparados com ácidos ou bases relativamente não tóxicos, dependendo das porções substituintes particulares sobre os compostos aqui descritos. Quando compostos da presente revelação contêm funcionalidades relativamente acidicas, sais de adição de base podem ser obtidos por contacto da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente da base desejada, quer pura quer num solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de sódio, potássio, cálcio, amónio, amino orgânico ou magnésio, ou um sal similar. Quando os compostos de presente revelação contêm funcionalidades relativamente básicas, os sais de adição de ácido podem ser obtidos por contacto da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente do ácido desejado, quer puro quer num solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem os derivados de ácidos inorgânicos como os ácidos clorídrico, bromidrico, nítrico, carbónico, mono-hidrogenocarbónico, fosfórico, mono-hidro-genofosfórico, di-hidrogenofosfórico, " 13 ΡΕ2081937 -hidrogenossulfúrico, iodídrico ou fosforoso e semelhantes, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos relativamente não tóxicos como acético, propiónico, isobutirico, maleico, malónico, benzóico, succinico, subérico, fumárico, lático, mandélico, ftálico, benzenossulfónico, p-tolilsulfónico, citrico, tartárico, metanossulfónico e semelhantes. Também estão incluídos os sais de aminoácidos tais como arginato e semelhantes e sais de ácidos orgânicos, como os ácidos glucu-rónico ou galacturónico e semelhantes (ver, por exemplo, Berge et ai., "Pharmaceutical Salts" in Journal of Pharmaceutical Science, 66 (1977) 1-19). Certos compostos específicos da presente revelação contêm ambas as funcionalidades básicas e ácidas que permitem que os compostos sejam convertidos nos sais de adição quer de ácido quer de base.

Para além das formas de sal, a presente revelação diz respeito a compostos, os quais estão numa forma de pró--fármaco. Os pró-fármacos dos compostos aqui descritos são aqueles compostos que prontamente passam por mudanças químicas sob condições fisiológicas para proporcionar os compostos da presente revelação. Além disso, os pró--fármacos podem ser convertidos aos compostos da presente revelação por métodos químicos ou bioquímicos num ambiente ex vivo. Por exemplo, os pró-fármacos podem ser convertidos lentamente aos compostos da presente revelação quando colocados num reservatório de adesivo transdérmico com uma enzima ou reagente químico adequados.

Os termos "tratando" ou "tratamento" em referência a uma doença particular inclui a prevenção da doença. ΡΕ2081937 14 0 símbolo indica o ponto de ligação duma porção ao resto da molécula.

Moduladores de Proteína-Cinase de Triazolopiridazina

Num aspeto, a revelação diz respeito a compostos que têm a fórmula: fVK γΛΛ 1 e-ή ,β N · i

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Num outro aspeto, a revelação proporciona um composto para utilização no tratamento do cancro num paciente humano.

Num outro aspeto, a revelação proporciona um composto para utilização no tratamento do cancro num paciente humano, em que o cancro é cancro da mama, cancro do pulmão, melanoma, cancro colorretal, cancro da bexiga, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro renal, cancro da célula escamosa, glioblastoma, cancro do pâncreas, leiomiossarcoma, mieloma múltiplo, carcinoma da células renais papilar, cancro gástrico, cancro de figado, cancro da cabeça e pescoço, melanoma ou leucemia (por exemplo, mielóide, mielóide crónica, linfoblástica aguda, linfo-blástica crónica, de Hodgkin, e outras leucemias e cancros hematológicos) .

Num outro aspeto, a revelação proporciona composições farmacêuticas tendo um composto da presente invenção num excipiente farmaceuticamente aceitável. 17 ΡΕ2081937 Sínteses Exemplares

Os compostos da revelação são sintetizados por uma combinação apropriada de métodos sintéticos geralmente bem conhecidos. Técnicas úteis para sintetizar os compostos da revelação são não só prontamente evidentes mas também acessíveis aos peritos na técnica relevante. A discussão abaixo é oferecida para ilustrar alguns dos diversos métodos disponíveis para uso na montagem dos compostos da revelação. No entanto, a discussão não pretende definir o âmbito e alcance de reações ou sequências de reação que são úteis na preparação de compostos de presente revelação. Os compostos desta revelação podem ser feitos pelos procedimentos e técnicas reveladas na secção Exemplos abaixo, bem como por técnicas de síntese orgânica conhecidas.

Grupos de Protecção

Os compostos da presente revelação podem ser sintetizados usando um ou mais grupos de proteção geralmente conhecidos na técnica de síntese química. 0 termo "grupo de proteção" refere-se a porções químicas que bloqueiam algumas ou todas as porções reativas de um composto e impedem que tais porções participem em reações químicas até que o grupo de proteção seja removido, por exemplo, aquelas porções listadas e descritas em Greene, et al.r Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley & Sons, 1999. Pode ser vantajoso, onde diferentes grupos de proteção são empregues, que cada grupo de 18 ΡΕ2081937 proteção (diferente) seja removível por meios diferentes. Os grupos de proteção que são clivados sob condições de reação totalmente diferentes permitem a remoção diferencial de tais grupos de proteção. Por exemplo, os grupos de proteção podem ser removidos por ácido, base e hidrogenólise. Grupos tais como tritilo, dimetoxitritilo, acetal e t-butildimetilsililo são lábeis em ácido e podem ser usados para proteger porções reativas carboxi e hidroxi na presença de grupos amino protegidos com grupos Cbz, os quais são removíveis por hidrogenólise, e grupos Fmoc, os quais são lábeis em base. Porções reativas de ácido carboxílico e hidroxi podem ser bloqueadas com grupos lábeis em base, tais como, sem limitação, metilo, etilo e acetilo na presença de aminas bloqueado com grupos lábeis em ácido tais como carbamato de t-butilo ou com carbamatos que são estáveis não só em ácido mas também em base mas removíveis hidroliticamente.

Porções reativas de ácido carboxílico e hidroxi também podem ser bloqueadas com grupos de proteção hidroliticamente removíveis tais como o grupo benzilo, enquanto grupos amina capazes de ligação de hidrogénio com ácidos podem ser bloqueados com grupos lábeis em base tais como Fmoc. As porções reativas de ácido carboxílico podem ser bloqueados com grupos de proteção removíveis oxidativamente tais como 2,4-dimetoxibenzilo, enquanto os grupos amino coexistentes podem ser bloqueados com carbamatos de sililo lábeis em fluoreto. 19 ΡΕ2081937

Os grupos que bloqueiam alilo são úteis na presença de grupos de proteção de ácido e base uma vez que os primeiros são estáveis e podem ser removidos subsequentemente por catalisadores de metal ou pi-ácido. Por exemplo, um ácido carboxilico de alilo bloqueado pode ser desprotegido com uma reação catalisada por paládio (0) na presença de carbamato de t-butilo lábil em ácido ou grupos de proteção de amina lábeis em acetato. Ainda uma outra forma de grupo de proteção é uma resina para a qual um composto ou intermediário pode ser ligado. Enquanto o residuo está ligado à resina, aquele grupo funcional está bloqueado e não pode reagir. Uma vez libertado da resina, o grupo funcional está disponível para reagir.

Grupos de proteção ou de bloqueio típicos incluem, por exemplo:

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MÉTODOS DE TRATAMENTO

Num outro aspeto, a presente revelação diz respeito a compostos para utilização no tratamento de uma doença mediada pela atividade de cinase (doença ou perturbação mediada por cinase) num organismo (por exemplo, mamíferos, como os seres humanos). Por doenças "mediadas por cinase" ou "associadas a cinase" devem entender-se doenças nas quais a doença ou sintoma pode ser aliviado por inibição da atividade da cinase (por exemplo onde a cinase está envolvida na sinalização, mediação, modulação ou regulação do processo da doença). Por "doenças" deve entender-se doenças ou sintomas de doença.

Exemplos de doenças associadas a cinase incluem cancro (por exemplo, leucemia, tumores e metástases), alergia, asma, inflamação (e.g., doença inflamatória das vias respiratórias), doença obstrutiva das vias respiratórias, doenças autoimunes, doenças metabólicas, infeção (por exemplo bacteriana, virai, por leveduras, fúngica), doenças do SNC, tumores cerebrais, doenças neurais degenerativas, doenças cardiovasculares e doenças associadas com a angiogénese, neovascularização e vasculogénese. Numa forma de realização exemplar, os compostos são úteis para o tratamento do cancro, incluindo leucemia, e outras doenças ou distúrbios envolvendo a proliferação anormal de células, desordens mieloproliferativas, desordens hematológicas, asma, doenças inflamatórias ou obesidade. 21 ΡΕ2081937

Exemplos mais específicos de cancros tratados com os compostos da presente revelação incluem cancro da mama, cancro do pulmão, melanoma, cancro colorretal, cancro da bexiga, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro renal, cancro de células escamosas, glioblastoma, cancro pancreático, leiomiossarcoma, mieloma múltiplo, carcinoma da célula renal papilar, cancro gástrico, cancro do figado, cancro da cabeça e pescoço, melanoma e leucemia (por exemplo, mielóide, mielóide crónica, linfoblástica aguda, linfoblástica crónica, de Hodgkin, e outras leucemias e cancros hematológicos).

Outros exemplos específicos de doenças ou distúrbios para os quais que o tratamento pelos compostos ou composições de revelação são úteis para tratamento ou prevenção incluem, mas sem constituir limitação, a rejeição a transplante (por exemplo, de rim, fígado, coração, pulmão, células ilhéus, pâncreas, medula óssea, córnea, intestino delgado, aloenxertos ou xenoenxertos de pele e outros transplantes), doença do enxerto vs. hospedeiro, osteoartrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, retinopatia diabética, doença inflamatória intestinal (por exemplo, Crohn doença, colite ulcerativa e outras doenças do intestino), doença renal, caquexia, choque sético, lúpus, miastenia grave, psoríase, dermatite, eczema, seborreia, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, proteção de células estaminais durante a quimioterapia, seleção ex vivo ou purga ex vivo para transplante autólogo ou alogénico de medula óssea, doença 22 ΡΕ2081937 ocular, retinopatias (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética e outras retinopatias), doença da córnea, glaucoma, infeções (por exemplo bacteriana, virai ou fúngica), doença cardíaca, incluindo, mas sem constituir limitação, restenose.

Terapia de combinação

Num outro aspeto, a revelação proporciona uma terapia de combinação para o tratamento ou inibição do aparecimento de uma desordem proliferativa celular ou de uma desordem relacionada com c-Met num indivíduo. A terapia de combinação compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um composto de Fórmula I, e uma ou mais outras terapias antiproliferação celular incluindo quimioterapia, radioterapia, terapia génica e imunoterapia.

Num outro aspeto, os compostos da revelação podem ser administrados em combinação com a quimioterapia. Conforme aqui usado, a quimioterapia refere-se a uma terapia envolvendo um agente quimioterapêutico. Uma variedade de agentes quimioterapêuticos pode ser utilizada nos métodos de tratamento combinados aqui revelados. Os agentes quimioterapêuticos contemplados como exemplares, incluem, mas sem constituir limitação: compostos de platina (e.g., cisplatina, carboplatina, oxaliplatina); compostos de taxa-no (e.g., paclitaxcel, docetaxol); compostos de campotote-cina (irinotecano, topotecano); alcaloides vinca (e.g., 23 ΡΕ2081937 vincristina, vimblastina, vinorelbina); derivados de nucle-osídeo antitumoral (e.g., 5-fluorouracilo, leucovorina, gemcitabina, capecitabina), agentes alquilantes (e.g., ciclofosfamida, carmustina, lomustina, tiotepa); epipodo-filotoxinas/podofilotoxinas (e.g., etoposido, teniposido); inibidores de aromatase (anastrozole, letrozole, exemes-tano); compostos antiestrogénio (e.g., tamoxifeno, fulves-trant), antifolatos (e.g., premetrexado dissódico); agentes de hipometilação (e.g., azacitidina); biológicos (e.g., gemtuzamab, cetuximab, rituximab, pertuzumab, trastuzumab, bevacizumab, erlotinib); antibióticos/antracilinas (e.g., idarrubicina, actinomicina D, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, dactinomicina, carminomicina, daunomicina); antimetabolitos (e.g., clofarabina, amino-pterina, arabinoside de citosina, metotrexato) ; agentes de ligação de tubulina (e.g., combretastatina, colchicina, nocodazole); inibidores de topoisomerase (e.g., camptote-cina); agentes de diferenciação (e.g., retinoides, vitamina D e ácido retinóico); agentes de bloqueio do metabolismo do ácido retinóico (RAMBA) (e.g., acutano); inibidores da cinase (e.g., flavoperidol, mesilato de imatinibe, gefiti-nibe, erlotinibe, sunitinibe, lapatinibe, sorafinibe, tem-sirolimus, dasatinibe); inibidores de farnesiltransferase (e.g., tipifarnibe); inibidores de histona-desacetilase; inibidores da via ubiquitina-proteassoma (e.g., borte-zomibe, Yondelis).

Outras agentes úteis incluem verapamil, um antagonista de cálcio encontrado como sendo útil em - 24 - ΡΕ2081937 combinação com agentes antineoplásicos para estabelecer a quimiossensibilidade em células tumorais resistentes a aceitar agentes quimioterapêuticos e potenciar a eficácia de tais compostos em malignidades sensíveis a fármaco. Ver W. G. Simpson, "The calcium channel blocker verapamil and câncer chemotherapy" in Cell Calcium, 6(6) (dezembro de 1985) 449-67. Além disso, ainda para fazerem emergir agentes quimioterapêuticos estão contemplados como sendo úteis em combinação com o composto da presente revelação.

Num outro aspeto, a revelação proporciona compostos que podem ser administrados em combinação com radioterapia. Conforme aqui usado, "radioterapia" refere-se a uma terapia que compreende a exposição do indivíduo com necessidade dela a radiação. Tal terapia é conhecida dos peritos na técnica. 0 esquema apropriado da terapia de radiação será semelhante aos já empregues, em que a terapia de radiação é usada sozinha ou em combinação com outras quimioterapêuticas.

Num outro aspeto, a revelação proporciona compostos que podem ser administrados em combinação com uma terapia de gene ou genética. Conforme aqui usado, "terapia genética" refere-se a uma terapia de direcionamento especifico sobre genes particulares envolvidos no desenvolvimento do tumor. As estratégias de terapia genética possíveis incluem a restauração de genes defeituosos inibidores do cancro, transdução celular ou transfeção com DNA antis-sentido correspondentes a genes que codificam para fatores 25 ΡΕ2081937 de crescimento e seus recetores, estratégias baseadas em RNA como ribozimas, chamarizes de RNA, RNAs mensageiros antissentido e moléculas pequenas de RNA de interferência (siRNA) e os assim chamados 'genes suicidas'.

Noutro aspeto, a revelação proporciona compostos que podem ser administrados em combinação com uma imunoterapia. Conforme aqui usado, "imunoterapia" refere-se a uma terapia visando determinada proteína envolvida no desenvolvimento do tumor através de anticorpos específicos para tal proteína. Por exemplo, utilizaram-se anticorpos monoclonais contra o fator de crescimento endotelial vascular no tratamento de cancros.

Onde um segundo fármaco é usado juntamente com um composto de revelação, os dois medicamentos podem ser administrados simultaneamente (por exemplo, em composições unitárias ou separadas) sequencialmente em qualquer ordem, aproximadamente ao mesmo tempo, ou em horários de dosagem distintos. No último caso, os dois compostos serão administrados dentro dum prazo e numa quantidade e maneira que é suficiente para assegurar que um efeito vantajoso ou sinér-gico é alcançado. Será apreciado que o método e a ordem de administração preferidos e as quantidades e regimes de dosagem respetivos para cada componente da combinação dependerão do agente quimioterapêutico particular a ser administrado em conjunção com o composto da presente invenção, da sua via de administração, do tumor específico a ser tratado e do hospedeiro específico a ser tratado. 26 ΡΕ2081937

Como será compreendido pelos peritos vulgares na técnica, as doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos serão geralmente semelhantes ou inferiores às já empregues em terapias clinicas onde os quimioterapêuticos são administrados isoladamente ou em combinação com outros quimioterapêuticos. 0 método e a ordem da administração ótimos e as quantidades e o regime de dosagem podem ser prontamente determinados pelos peritos na técnica usando métodos convencionais e tendo em conta a informação aqui fornecida. A titulo de exemplo somente, os compostos de platina são vantajosamente administrados numa dosagem de 1 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 50 a 400 mg/m2, particularmente para cisplatina numa dosagem cerca de 75 mg/m2 e para carbo-platina em cerca de 300 mg/m2 por curso de tratamento. A cisplatina não é absorvida por via oral e deve portanto ser entregue através de injeção por via intravenosa, subcutaneamente, intratumoralmente ou intraperitonealmente. A titulo de exemplo somente, os compostos de taxano são vantajosamente administrados numa dosagem de 50 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 75 a 250 mg/m2, particularmente para paclitaxel numa dosagem de cerca de 175 a 250 mg/m2 e para docetaxel em cerca de 75 a 150 mg/m2 por curso de tratamento. 27 ΡΕ2081937 A título de exemplo somente, os compostos de camptotecina são vantajosamente administrados numa dosagem de 0,1 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 1 a 300 mg/m2, particularmente para irinotecano numa dosagem de cerca de 100 a 350 mg/m2 e para topotecano, em cerca de 1 a 2 mg/m2 por curso de tratamento. A título de exemplo somente, os alcaloides vinca podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de 2 a 30 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, particularmente para a vimblastina numa dosagem de cerca de 3 a 12 mg/m2, para vincristina numa dosagem de cerca de 1 a 2 mg/m2, e para vinorelbina numa dosagem de cerca de 10 a 30 mg/m2 por curso de tratamento. A título de exemplo somente, os derivados de nucleosídeo anti-tumoral podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de 200 a 2500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo de 700 a 1500 mg/m2. O 5-fluorouracil (5-FU) é comummente usado por meio de administração intravenosa com doses variando de 200 a 500 mg/m2 (preferivelmente de 3 a 15 mg/kg/dia). A gemcitabina é vantajosamente administrada numa dosagem de cerca de 800 a 1200 mg/m2 e a capecitabina é vantajosamente administrada em cerca de 1000 a 2500 mg/m2 por curso de tratamento. 28 ΡΕ2081937 A título de exemplo somente, os agentes alqui-lantes podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de 100 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 120 a 200 mg/m, particularmente para ciclofosfamida numa dosagem de cerca de 100 a 500 mg/m2, para clorambucil numa dosagem de cerca de 0,1 a 0,2 mg/kg de massa corporal, para carmustina numa dosagem de cerca de 150 a 200 mg/m2 e para lomustina numa dosagem de cerca de 100 a 150 mg/m2 por curso de tratamento. A título de exemplo apenas, os derivados de podofilotoxina podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de 30 a 300 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo de 50 a 250 mg/m2, particularmente para etoposido numa dosagem de cerca de 35 a 100 mg/m2 e teniposido em cerca de 50 a 250 mg/m2 por curso de tratamento. A título de exemplo somente, os derivados de antraciclina podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de 10 a 75 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 15 a 60 mg/m2, particularmente para doxorrubicina numa dosagem de cerca de 40 a 75 mg/m2, para daunorrubicina numa dosagem de cerca de 25 a 45 mg/m2e para idarrubicina numa dosagem de cerca de 10 a 15 mg/m2 por curso de tratamento. A título de exemplo apenas, os compostos anti-estrogénio podem ser vantajosamente administrados numa 29 ΡΕ2081937 dosagem de cerca de 1 a 100 mg diariamente, dependendo do agente em particular e da condição a ser tratada. O tamoxifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de 5 a 50 mg, preferivelmente 10 a 20 mg duas vezes por dia, continuando a terapia por tempo suficiente para atingir e manter um efeito terapêutico. O toremifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia, continuando a terapia por tempo suficiente para atingir e manter um efeito terapêutico. O anastrozol é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 1 mg uma vez por dia. O droloxifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 20-100 mg uma vez por dia. O raloxifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 60 mg uma vez por dia. O exemestano é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 25 mg uma vez por dia. A titulo de exemplo somente, os biológicos podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de cerca de 1 a 5 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, ou conforme conhecido na técnica, se for diferente. Por exemplo, o trastuzumabe é vantajosamente administrado numa dosagem de 1 a 5 mg/m2 particularmente de 2 a 4 mg/m2 por curso de tratamento.

As dosagens podem ser administradas, por exemplo, uma, duas ou mais vezes por curso de tratamento, que pode ser repetido por exemplo a cada 7, 14, 21 ou 28 dias. 30 ΡΕ2081937

Os compostos da presente revelação podem ser administrados a um indivíduo sistemicamente, por exemplo, intravenosamente, oralmente, subcutaneamente, intramuscularmente, intradermicamente ou parentericamente. Os compostos da presente invenção também podem ser administrados a um indivíduo localmente. Exemplos não limitantes de sistemas de entrega local incluem o uso de dispositivos médicos intraluminais que incluem cateteres de entrega de fármaco intravasculares, fios, «stents» farmacológicos e revestimento endoluminal.

Os compostos da presente revelação podem ainda ser administrados a um indivíduo em combinação com um agente de direcionamento para atingir alta concentração local do composto no sítio alvo. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser formulados para libertação rápida ou libertação lenta com o objetivo de manter os fármacos ou agentes em contacto com os tecidos alvos durante um período que varia de horas a semanas.

Composições Farmacêuticas e Administração

Num outro aspeto, a presente revelação refere-se a uma composição farmacêutica, incluindo um modulador de cinase de triazolopiridazina em mistura com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Um perito na técnica reconhecerá que as composições farmacêuticas incluem os sais farmaceuticamente aceitáveis dos moduladores de cinase de triazolopiridazina acima descritos. 31 ΡΕ2081937

Em aplicações terapêuticas e/ou de diagnóstico, os compostos da revelação podem ser formulados para uma variedade de modos de administração, incluindo administração sistémica e tópica ou localizada. Técnicas e formulações podem geralmente ser encontradas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000.

De acordo com um outro aspeto, a revelação proporciona composições farmacêuticas incluindo compostos de fórmula I, e um agente de suporte, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável. A quantidade de composto nas composições da revelação é tal que é eficaz para inibir detetavelmente uma proteina-cinase, particularmente c-Met numa amostra biológica ou num paciente.

Conforme aqui usado, o termo "c-Met" é sinónimo de "cMet", "MET", "Met" ou outras designações conhecidas de um perito na técnica. Num aspeto, uma composição da presente revelação é formulada para administração a um paciente com necessidade de tal composição. Num outro aspeto, a composição da revelação é formulada para administração oral a um paciente.

Os compostos de acordo com a revelação são eficazes ao longo duma larga faixa de dosagem. Por exemplo, no tratamento de seres humanos adultos, as dosagens de 0,01 a 10 000 mg, de 0,5 mg a 1000 mg, de 1 a 500 mg por dia e 32 ΡΕ2081937 de 5 a 100 mg por dia são exemplos de dosagens que podem ser utilizadas. A dosagem exata vai depender da via de administração, da forma na qual o composto é administrado, do indivíduo a ser tratado, da massa corporal do indivíduo a ser tratado e da preferência e experiência do médico assistente.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis são geralmente bem conhecidos dos peritos vulgares na técnica e podem incluir, a título de exemplo, mas não de limitação, acetato, benzenossulfonato, besilato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edetato de cálcio, camsilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsani-lato, hexilresorcinato, hidrabamina, hidrobrometo, hidro-cloreto, hidroxinaftoato, iodeto, isotionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, esteara-to, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartarato ou teoclato. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000. Os sais farmaceuticamente aceitáveis preferidos incluem, por exemplo, acetato, benzoato, brometo, carbonato, citrato, gluconato, hidrobrometo, hidro-cloreto, maleato, mesilato, napsilato, pamoato (embonato), fosfato, salicilato, succinato, sulfato ou tartarato. 33 ΡΕ2081937

Dependendo das condições específicas a serem tratadas, tais agentes pode ser formulado em formas de dosagem líquidas ou sólidas e administradas sistemicamente ou localmente. Os agentes podem ser entregues, por exemplo, numa forma de baixa libertação temporizada ou sustentada como é conhecido pelos peritos na técnica. As técnicas para a formulação e administração podem ser encontradas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000Remington: A ciência e a prática de farmácia (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000). As vias adequadas podem incluir oral, bucal, spray de inalação, sublingual, retal, transdérmica, vaginal, transmucosa, administração nasal ou intestinal; entrega parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea, injeções intramedulares, bem como injeções intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intra-articular, intrasternal, intrassinovial, intra-hepática, intralesio-nal, intracraniana, intraperitoneal, intranasal ou intra-ocular ou outros modos de entrega.

Para injeção, os agentes da revelação podem ser formulados e diluídos em soluções aquosas, tal como em tampões fisiologicamente compatíveis tal como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de salina ou soro fisiológico. Para tal administração transmucosa, são utilizados penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica. 34 ΡΕ2081937 A utilização de agentes de suporte inertes farmaceuticamente aceitáveis para formular os compostos aqui revelados para a prática da revelação em dosagens adequadas para administração sistémica está dentro do âmbito e alcance da revelação. Com a escolha apropriada do agente de suporte e prática de fabrico adequada, as composições da presente revelação, em especial, as formuladas como soluções, podem ser administradas parentericamente, tal como por injeção intravenosa. Os compostos podem ser formulados prontamente usando agentes de suporte farmaceu-ticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral. Tais agentes de suporte capacitam os compostos da revelação de serem formulados na forma de comprimidos, pilulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e afins, para a ingestão oral por um paciente a ser tratado.

Para entrega nasal ou inalação, os agentes da revelação também pode ser formulados por métodos conhecidos dos peritos na técnica e podem incluir, por exemplo, mas sem constituir limitação, exemplos de substâncias de solubilização, diluição ou dispersão tais como, salina, conservantes, tais como álcool benzilico, promotores de absorção e fluorocarbonos.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente revelação incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos numa quantidade eficaz para alcançar a sua finalidade. A determinação das 35 ΡΕ2081937 montantes eficazes está bem dentro da capacidade daqueles peritos na técnica, especialmente à luz da revelação detalhada aqui proporcionada.

Em adição aos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter agentes de suporte farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. As preparações formuladas para administração oral podem estar na forma de comprimidos, drageias, cápsulas ou soluções.

As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas combinando os compostos ativos com excipientes sólidos, facultativamente moendo a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para a obtenção de comprimidos ou núcleos de drageia. Os excipientes adequados são, em particular, agentes de enchimento tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanta, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose (CMC) sódica e/ou polivinilpirrolidona (PVP: povidona). Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como polivinilpirrolidona de ligação cruzada, ágar ou ácido alginico ou um seu sal tal como alginato de sódio. 36 ΡΕ2081937 Núcleos de drageia são proporcionados com revestimentos adequados. Para esta finalidade, podem ser utilizadas soluções concentradas de açúcar, as quais podem facultativamente conter goma arábica, talco, polivinil-pirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol (PEG) e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequados. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drageias para identificação ou para caraterizar diferentes combinações de doses de composto ativo.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas por via oral incluem cápsulas de gelatina de ajuste por empurrão, bem como cápsulas de gelatina macias, vedadas, e um plastificante, tal como glicerina ou sorbitol. As cápsulas de ajuste por empurrão podem conter os ingredientes ativos em mistura com agente de enchimento tal como lactose, ligantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, facultativamente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em liquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina liquida ou polietileno-glicóis (PEGs) liquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizadores.

Dependendo da condição ou do estado de doença particular a ser tratada ou prevenida, agentes terapêuticos adicionais, que normalmente são administrados para tratar 37 ΡΕ2081937 ou prevenir aquela condição, podem ser administrados em conjunto com os inibidores desta revelação. Por exemplo, agentes quimioterapêuticos ou outros agentes antiprolifera-tivos podem ser combinados com os inibidores desta revelação para tratar doenças proliferativas e cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos conhecidos incluem, mas sem constituir limitação, adriamicina, dexametasona, vincristina, ciclofosfamida, fluorouracilo, topotecano, taxol, interferões e derivados de platina.

Outros exemplos de agentes os inibidores desta revelação também podem ser combinados com incluem, sem limitação, agentes anti-inflamatórios, tais como corticos-teroides, bloqueadores de TNF, IL-I RA, azatioprina, ciclofosfamida e sulfassalazina; agentes imunomoduladores e imunossupressores como a ciclosporina, tacrolimus, rapami-cina, micofenolato de mofetilo, interferões, corti-costeroides, ciclofosfamida, azatioprina e sulfassalazina; fatores neurotróficos tais como inibidores da acetilcoli-nesterase, inibidores da MAO, interferões, anticonvulsivos, bloqueadores de canal iónico, riluzole e agentes anti-parkinsonianos; agentes para tratamento da doença cardiovascular, tais como beta-bloqueadores, inibidores ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores do canal de cálcio e estatinas; agentes para o tratamento de doença do figado tais como corticosteroides, colestiramina, interferões e agentes antivirais; agentes para tratamento de doenças do sangue como corticosteroides, agentes antileucémicos e fatores de crescimento; agentes para tratamento de diabetes 38 ΡΕ2081937 tais como insulina, análogos de insulina, inibidores da alfa-glucosidase, biguanidas e sensibilizadores de insulina; e agentes para o tratamento de distúrbios de imunodeficiência tais como gamaglobulina.

Estes agentes adicionais podem ser administrados separadamente, como parte de um regime de dosagem múltipla, a partir da composição contendo inibidor. Alternativamente, estes agentes podem ser parte de uma forma de dosagem única, misturados com o inibidor numa composição única. A presente revelação não é para ser limitada no âmbito ou alcance pelas formas de realização exemplificadas, as quais servem como ilustrações de aspetos únicos da revelação. Na verdade, várias modificações da revelação além daquelas aqui descritas tornar-se-ão evidentes para aqueles que têm pericia na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações destinam-se a cair dentro do âmbito e alcance da revelação. Além disso, qualquer uma ou mais caraterísticas de qualquer forma de realização da revelação podem ser combinadas com qualquer uma ou mais outras caraterísticas de qualquer outra forma de realização da revelação, sem se afastar do âmbito e alcance da revelação. Por exemplo, os moduladores de cinase triazolo-piridazina descritos na secção Moduladores de Cinase de Triazolopiridazina são igualmente aplicáveis aos métodos de tratamento e métodos de inibição de cinases aqui descritos. As referências citadas ao longo deste pedido são exemplos do nivel de pericia na técnica e são aqui incorporadas por 39 ΡΕ2081937 referência aqui na sua integra para todos os efeitos, se anteriormente especificamente incorporadas ou não.

Ensaios

Os compostos da presente revelação podem ser ensaiados facilmente para determinar sua capacidade de modular proteina-cinases, ligar proteína-cinases e/ou impedir o crescimento ou proliferação celular. Alguns exemplos de ensaios úteis são apresentados abaixo.

Inibição de Cinase e Ensaios de Ligação A inibição de várias cinases é medida por métodos conhecidos dos peritos vulgares na técnica, tais como os vários métodos aqui apresentados, e os discutidos na publicação Upstate KinaseProfiler Assay Protocols, junho de 2003.

Por exemplo, onde são realizados ensaios in vitro, a cinase é tipicamente diluída até à concentração apropriada para formar uma solução de cinase. Um substrato de cinase e dador de fosfato, tal como ATP, é adicionado à solução da cinase. A cinase pode transferir um fosfato ao substrato de cinase para formar um substrato fosforilado. A formação dum substrato fosforilado pode ser detectado diretamente por qualquer meio adequado, tal como a radioatividade (e.g.: [γ-32Ρ-ΑΤΡ] ) , ou o uso de anticorpos secundários detetáveis (e.g., ELISA). Alternativamente, a formação dum substrato fosforilado pode ser detectada 40 ΡΕ2081937 usando qualquer técnica apropriada, tal como a deteção da concentração de ATP (e.g., sistema de ensaio Kinase-Glo® (Promega)). Os inibidores de cinase são identificados por deteção da formação de um substrato fosforilado na presença e na ausência de um composto de teste (ver a secção Exemplos abaixo). A capacidade do composto de inibir uma cinase numa célula também pode ser avaliada usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as células que contêm uma cinase podem ser contactadas por um agente de ativação (tal como um fator de crescimento) que ativa a cinase. A quantidade de substrato fosforilado intracelular formado na ausência e presença do composto de teste pode ser determinada por lise das células e deteção da presença de substrato fosforilado por qualquer método adequado (e.g., ELISA). Quando a quantidade de substrato fosforilado produzido na presença do composto de teste é diminuída em relação à quantidade produzida na ausência do composto de teste, a inibição de cinase está indicada. Os ensaios de cinase celular mais detalhados são discutidos na secção Exemplos abaixo.

Para medir a ligação de um composto a uma cinase, pode ser utilizado qualquer método conhecido dos peritos vulgares na técnica. Por exemplo, um kit de teste fabricado pela Discoverx (Fremont, CA) , kit de ensaio de ligação de enzima ED-Staurosporine NSIP™ (ver Patente dos E.U.A. N° 5 643 734), pode ser usado. A atividade da cinase também 41 ΡΕ2081937 pode ser avaliada como na Patente dos E.U.A. N° 6 589 950, emitida em 8 de julho de 2003.

Os inibidores de cinase adequados podem ser selecionados a partir dos compostos da revelação através de rastreio cristalográfico de proteínas, conforme revelado em, por exemplo, Antonysamy et al., Publicação PCT N° WO 03087816A1.

Os compostos da presente revelação podem ser computacionalmente rastreados para ensaiar e visualizar a sua capacidade de ligação a e/ou inibir várias cinases. A estrutura pode ser computacionalmente rastreada com uma pluralidade de compostos da presente revelação para determinar sua capacidade de ligação a uma cinase em vários sítios. Tais compostos podem ser usados como alvos ou dirigem em quimica medicinal esforços para identificar, por exemplo, inibidores de potencial importância terapêutica (Travis, Science, 262 (1993) 1374) . As três estruturas dimensionais de tais compostos podem ser sobrepostas sobre uma representação tridimensional de cinases ou um sítio ativo ou seu bolso de ligação para avaliar se o composto se encaixa espacialmente na representação e, portanto, a proteína. Neste rastreio, a qualidade do ajuste de tais entidades ou compostos ao bolso de ligação pode ser julgada por complementaridade de forma ou por energia de interação estimada (Meng et al., J. Comp. Chem., 13 (1992) 505-24). O rastreio de compostos da presente revelação que 42 ΡΕ2081937 se ligam e/ou modulam cinases (por exemplo, inibem ou ativam cinases) de acordo com esta revelação geralmente envolve a consideração de dois fatores. Primeiro, o composto deve ser capaz de fisicamente e estruturalmente associação, seja covalentemente ou não covalentemente, com cinases. Por exemplo, as interações covalentes podem ser importantes para projetar inibidores irreversiveis ou suicidas de uma proteina. Interações moleculares não covalentes importantes na associação de cinases com o composto incluem ligações de hidrogénio, interações iónicas, interações de van der Waals e hidrofóbicas. Em segundo lugar, o composto deve ser capaz de assumir uma conformação e orientação em relação ao bolso de ligação, que lhe permite associar com cinases. Apesar de certas porções do composto não participarem diretamente nesta associação com cinases, aquelas porções ainda podem influenciar a conformação global da molécula e podem ter um impacto significativo sobre a potência. Os requisitos conformacionais incluem a estrutura tridimensional em geral e a orientação do grupo químico ou composto em relação a toda ou a uma porção do bolso de ligação, ou o espaçamento entre os grupos funcionais de um composto compreendendo vários grupos químicos que diretamente interagem com cinases.

Os programas de ancoragem aqui descritos, tais como, por exemplo, DOCK ou GOLD, são usados para identificar os compostos que se ligam ao sítio ativo e/ou bolso de ligação. Os compostos podem ser rastreados contra 43 ΡΕ2081937 mais do que um bolso de ligação da estrutura da proteína, ou mais de um conjunto de coordenadas para a mesma proteína, tendo em conta diferentes conformações dinâmicas moleculares da proteína. A pontuação de consenso pode em seguida ser usada para identificar os compostos que são o melhor ajuste para a proteína (P. S. Charifson et al., J. Med. Chem., 42 (1999) 5100-9). Os dados obtidos a partir de mais do que uma estrutura de molécula de proteína também podem ser pontuados de acordo com os métodos descritos em Klingler et al., U. S. Utility Application, apresentado em 3 de maio de 2002, intitulado "Computer Systems and Methods for Virtual Screening of Compounds”. Os compostos com o melhor ajuste são em seguida obtidos a partir do produtor da biblioteca química ou sintetizados, e usados em ensaios de ligação e bioensaios.

As técnicas de modelagem de computador podem ser usadas para avaliar a modulação ou efeito de ligação potencial de um composto químico sobre cinases. Se a modelagem de computador indica uma interacção forte, a molécula pode em seguida ser sintetizada e testada à sua capacidade de se ligar a cinases e afetar (por inibição ou ativação) a sua atividade.

Compostos de modulação ou de ligação de cinases podem ser computacionalmente avaliados por meio de uma série de passos em que grupos químicos ou fragmentos são rastreados e selecionados pela sua capacidade de se associarem com os bolsos de ligação individual ou outras 44 ΡΕ2081937 áreas de cinases. Este processo pode começar por inspeção visual de, por exemplo, o site ativo no ecrã do computador com base nas coordenadas de cinases. Os fragmentos ou grupos químicos selecionados podem em seguida ser posicionados numa variedade de orientações, ou ancorados, dentro de um bolso de ligação individual de cinases (J. M. Blaney e J. S. Dixon, Perspectives in Drug Discovery and Design, 1 (1993) 301). A ancoragem manual pode ser realizada usando software tal como Insight II (Accelrys, San Diego, CA) MOE (Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canadá); e SYBYL (Tripos, Inc., St.

Louis, MO, 1992), seguido de minimização de energia e/ou dinâmica molecular com campos de força mecânica molecular padrão, tal como CHARMM (Brooks et al., J. Comp. Chem., 4 (1983) 187-217), AMBER (Weiner et al., J. Am. Chem. Soc., 106 (1984) 765-84) e C2MMFF (Merck Molecular Force Field;

Accelrys, San Diego, CA) . A ancoragem mais automatizada pode ser alcançada usando programas tais como o DOCK (Kuntz et al., J. Mol. Biol., 161 (1982) 269-88; DOCK está disponível em Universidade da Califórnia, São Francisco, CA); AUTODOCK (Goodsell & Olsen, Proteins: Structure, Function and Genetics, 8 (1990) 195-202; AUTODOCK está disponível em Scripps Research Institute, La Jolla, CA) ; GOLD (Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC); Jones et al., J. Mol. Biol., 245 (1995) 43-53; e FLEXX (Tripos, St. Louis, MO; M. Rarey et al., J. Mol. Biol., 261 (1996) 470-89). Outros programas apropriados são descritos em, por exemplo, Halperin, et al. 45 ΡΕ2081937

Durante a seleção de compostos pelos métodos acima, a eficiência com que aquele composto se pode ligar a cinases pode ser testada e otimizada por avaliação computacional. Por exemplo, um composto que foi desenhado ou selecionado para funcionar como um inibidor de cinases pode ocupar um volume que não se sobrepõe ao volume ocupado pelos resíduos do sitio ativo quando o substrato nativo está ligado, contudo, os peritos vulgares na técnica reconhecerão que existe alguma flexibilidade, permitindo o rearranjo das cadeias principais e das cadeias laterais. Além disso, um perito vulgar pode desenhar compostos que podem explorar o rearranjo da proteína após a ligação, tal como, por exemplo, resultando em um ajustamento induzido. Um inibidor de cinase eficaz pode demonstrar uma diferença relativamente pequena na energia entre os seus estados livre e ligado (isto é, ele deve ter uma pequena energia de deformação de ligação e/ou baixa tensão conformacional após a ligação). Assim, os inibidores de cinase mais eficientes devem, por exemplo, ser desenhados com uma energia de deformação da ligação não maior do que 10 kcal/mol, não maior do que 7 kcal/mol, não maior do que 5 kcal/mol ou não maior do que 2 kcal/mol. Os inibidores de cinase podem interagir com a proteína em mais do que uma conformação que é semelhante na energia de ligação global. Nesses casos, a energia de deformação de ligação é tomada como sendo a diferença entre a energia do composto livre e a energia média das conformações observadas quando o inibidor se liga à enzima. 46 ΡΕ2081937 0 software de computador específico está disponível na técnica para avaliar a energia de deformação do composto e a interação eletrostática. Exemplos de programas desenhados para tais utilizações incluem: Gaussian 94, revisão C (Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA. ©1995); AMBER, versão 7. (Kollman, Universidade da Califórnia em São Francisco, ©2002); QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., San Diego, CA, ©1995); Insight II/Discover (Accelrys, Inc., San Diego, CA, ©1995); DelPhi (Accelrys, Inc., San Diego, CA, ©1995); e AMSOL (Universidade de Minnesota) (Quantum Chemistry Program Exchange, Universidade de Indiana). Estes programas podem ser implementados, por exemplo, usando uma estação de trabalho do computador, como são bem conhecidos na técnica, por exemplo, uma estação de trabalho LINUX, SGI ou Sun. Outros sistemas de hardware e pacotes de software serão conhecidos dos peritos na técnica.

Os peritos vulgares na técnica podem exprimir a proteína-cinase usando métodos conhecidos na técnica e os métodos aqui revelados. Os polipeptídeos de cinase nativos e mutantes aqui descritos podem ser sintetizados quimicamente no todo ou em parte usando técnicas que são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecular Principies, W. H. Freeman & Co., NY, 1983) .

Sistemas de expressão do gene podem ser utilizados para a síntese de polipeptídeos nativos e mutantes. Vetores de expressão contendo a sequência de codificação de 47 ΡΕ2081937 polipeptídeo nativo ou mutado e sinais de controlo trans-cricional/translacional apropriados, que são conhecidos pelos peritos na técnica podem ser construidos. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de sintese e recombinação/recombinação genética in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989.

Sistemas de vector de expressão de hospedeiro podem ser usados para expressar a cinase. Estes incluem, mas sem constituir limitação, microorganismos tais como bactérias transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmidio ou DNA de cosmidio que contêm a sequência de codificação; levedura transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo a sequência de codificação; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão de virus de recombinação (por exemplo, baculovirus) contendo a sequência de codificação; sistemas de células de plantas infectadas com vetores de expressão de virus de recombinação (por exemplo, virus do mosaico da couve-flor, CaMV; virus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmidio recombinante (por exemplo, plasmidio de Ti) que contendo a sequência de codificação; ou sistemas de células de animal. A proteina também pode ser expressa em sistemas de terapia de gene 48 ΡΕ2081937 humano, incluindo, por exemplo, a expressão da proteína para aumentar a quantidade da proteína num indivíduo, ou para expressar uma proteína terapêutica de engenharia. Os elementos de expressão destes sistemas variam na sua força e especificidades.

Vetores especificamente desenhados permitem o vaivém de DNA entre hospedeiros tais como bactérias--levedura ou bactérias-células de animal. Um vetor de expressão apropriadamente construído pode conter: uma origem de replicação para replicação autónoma em células hospedeiras, um ou mais marcadores selecionáveis, um número limitado de sítios de enzima de restrição úteis, um potencial para número elevado de cópias, e promotores ativos. Um promotor é definido como uma sequência de DNA que dirige a RNA-polimerase para ligar ao DNA e iniciar a síntese de RNA. Um promotor forte é aquele que é causa de mRNAs serem iniciadas em alta frequência. 0 vetor de expressão também pode compreender vários elementos que afetam a transcrição e tradução, incluindo, por exemplo, promotores constitutivos e induzí-veis. Estes elementos são, muitas vezes, dependentes do hospedeiro e/ou vetor. Por exemplo, quando se faz a clonagem em sistemas bacterianos, promotores induzíveis tais como o promotor T7, pL de bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor do híbrido ptrp-lac) e semelhantes podem ser usados; quando a clonagem é em sistemas de células de inseto, promotores tais como o promotor de poli-hedrina de 49 ΡΕ2081937 baculovírus pode ser usado; quando a clonagem é em sistemas de células de planta, promotores derivados do genoma de células de planta (por exemplo, promotores de choque térmico; o promotor para a subunidade pequena da RUBISCO; o promotor para a proteína de ligação de clorofila a/b) ou de vírus de plantas (por exemplo, o RNA promotor 35S do CaMV; o promotor de proteína de revestimento do TMV) pode ser utilizado; quando a clonagem é em sistemas de células de mamíferos, promotores de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou promotores virais de mamífero, (por exemplo, promotor tardio de adenovírus; promotor de vírus vaccinia 7.5K; promotor de SV40; promotor do vírus do papiloma bovino; e promotor do vírus Epstein-Barr) podem ser usado. Vários métodos podem ser usados para introduzir o vetor em células hospedeiras, por exemplo, transformação, transfeção, infeção, fusão de protoplastos e eletroporação. As células que contém o vetor de expressão são propagadas clonalmente e individualmente analisadas para determinar se elas produzem os polipeptídeos apropriados. Vários métodos de seleção, incluindo, por exemplo, a resistência a antibióticos, podem ser usados para identificar células hospedeiras que tenham sido transformadas. A identificação de clones de célula hospedeira expressando o polipéptido pode ser feita por vários meios, incluindo, mas sem constituir limitação, reatividade imunológica com anticorpos anticinase e a presença de atividade associada à célula hospedeira. 50 ΡΕ2081937

Expressão do cDNA também pode ser realizada usando mRNA sintético produzido in vitro. 0 mNRA sintético pode ser eficientemente traduzido em vários sistemas livres de células, incluindo, mas sem constituir limitação, extratos de germe de trigo e extratos de reticulócitos, bem como eficientemente traduzido em sistemas baseados em células, incluindo, mas sem constituir limitação, micro-injeção em oócitos de sapo.

Para determinar a ou as sequências de cDNA que produzem niveis ótimos de atividade e/ou proteína, são construídas moléculas de cDNA modificadas. Um exemplo não limitante de um cDNA modificado pela é onde o uso de codão no cDNA foi otimizado para a célula hospedeira, na qual o cDNA será expresso. As células do hospedeiro são transformadas com as moléculas de cDNA e os níveis de RNA e/ou proteína-cinase são medidos.

Os níveis de proteína-cinase em células de hospedeiro são quantificadas por uma variedade de métodos tais como imunoafinidade e/ou técnicas de afinidade do ligando, pérolas ou anticorpos específicos de afinidade específica de cinase são usados para isolar proteína marcada com 35S-metionina ou não rotulada. A proteína rotulada ou sem rótulo é analisada por SDS-PAGE. A proteína não rotulada é detectada por Western blot, ELISA ou RIA empregando anticorpos específicos. 51 ΡΕ2081937

Após expressão de cinase numa célula hospedeira recombinante, os polipeptídeos podem ser recuperados para fornecer a proteína na forma ativa. Vários procedimentos de purificação estão disponíveis e são adequados para uso. A cinase-cinase recombinante pode ser purificada a partir de lisados celulares ou a partir de meios de cultura condicionados, por várias combinações de, ou aplicação individual de, fracionamento ou passos de cromatografia que são conhecidos na técnica.

Além disso, a cinase recombinante pode ser separada de outras proteínas celulares pelo uso de uma coluna de imuno-afinidade feita com anticorpos monoclonais ou policlonais específico para proteína nascente de comprimento completo ou seus fragmentos de polipeptídeo. Outras técnicas de purificação à base de afinidade conhecidas na técnica também podem ser utilizadas.

Alternativamente, os polipeptídeos podem ser recuperados a partir de uma célula hospedeira de uma forma desdobrada, inativa, por exemplo, a partir de corpos de inclusão de bactérias. As proteínas recuperadas nesta forma podem ser solubilizadas usando um desnaturante, por exemplo, hidrocloreto de guanidínio e em seguida redobrada numa forma ativa usando métodos conhecidos dos peritos na técnica, tal como diálise.

Ensaios de Crescimento Celular

Uma variedade de ensaios de crescimento celular é 52 ΡΕ2081937 conhecida na técnica e eles são úteis na identificação de compostos de triazolopiridazina (isto é, "compostos de teste") capazes de inibir (por exemplo, reduzir) o crescimento e/ou a proliferação celular.

Por exemplo, uma variedade de células é conhecida por exigir cinases especificas para o crescimento e/ou proliferação. A capacidade de uma tal célula crescer na presença de um composto de teste pode ser avaliada e comparada com o crescimento na ausência de composto de teste, e assim identificar as propriedades antiprolife-rativas do composto de teste. Um método comum deste tipo é medir o grau de incorporação do rótulo, tal como timidina tritiada, o DNA de células de divisão. Alternativamente, a inibição da proliferação celular pode ser ensaiada pela determinação da atividade metabólica total de células com um marcador substituto que se correlaciona com o número de células. As células podem ser tratadas com um indicador metabólico na presença e na ausência de composto de teste. As células viáveis metabolizam o indicador metabólico, formando assim um produto metabólico detetável. Onde niveis detetáveis de produto metabólico estão diminuídos na presença de composto de teste em relação à ausência do composto de teste, a inibição do crescimento e/ou proliferação celular é indicada. Indicadores metabólicos exemplares incluem, por exemplo, sais de tetrazólio e AlamorBlue® (consulte a secção Exemplos abaixo).

Um ensaio para cinases que estimulam a migração 53 ΡΕ2081937 celular é o ensaio de raspagem. Este ensaio é usado para avaliar inibidores de cinases imitando eventos tais como a cicatrização de feridas. Numa variante deste ensaio usado para testar inibidores do MET, é permitida a formação duma monocamada confluente de células numa placa de células. Após a formação da monocamada, uma ferida linear sobre a monocamada é gerada por raspagem mecânica da monocamada, formando assim um canal livre de células. Um fator de crescimento exigido pela cinase para crescimento celular é adicionado na presença ou na ausência do composto de teste. 0 encerramento do canal na presença do composto de teste indica uma falha do composto de teste para inibir a cinase, permitindo por conseguinte a migração e crescimento celular para fechar o canal. Inversamente, a presença do canal depois da adição do composto de teste indica que o composto de teste inibiu a cinase, evitando por conseguinte o crescimento celular. A seleção das células apropriadas, condições de crescimento e fatores de crescimento estão bem dentro das capacidades dum perito na técnica (ver a secção Exemplos abaixo).

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar, a invenção reivindicada. A preparação de formas de realização da presente invenção é descrita nos exemplos seguintes. Os peritos vulgares na técnica compreenderão que as reações químicas e os métodos de síntese proporcionados podem ser modificados para 54 ΡΕ2081937 preparar muitos dos outros compostos da presente invenção. Onde os compostos da presente invenção não tenham sido exemplificados, os peritos vulgares na técnica irão reconhecer que estes compostos podem ser preparados modificando os métodos de síntese aqui apresentados e usando métodos de síntese conhecidos na técnica. Síntese de Intermediários Intermediário 1: Ácido (2-metil-quinolin-6-il)-acético

3

HO

Passo 1: Ester de etilo do ácido (2-metil-quinolin-6-il)- -acético

Um frasco sob atmosfera de azoto foi carregado com 6-bromo-quinaldina (500 mg, 2,25 mmol), bis(pinacola-to)diboro (1,14 g, 4,5 mmol), aducto dicloro[1,1'-bis(di-fenilfosfino)-ferroceno]paládio (II) diclorometano (92 mg, 0,112 mmol), acetato de sódio (547 mg, 6,75 mmol) e dimetilformamida (10 mL). A mistura reacional foi agitada a 100 °C durante 18 h em seguida repartida entre acetato de etilo e água. A camada orgânica foi lavada com água salgada duas vezes, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e absorvida sobre gel de sílica. A purificação sobre gel de sílica com gradiente 0-8% de metanol em diclorometano rendeu 432 mg de um óleo escuro. O óleo foi dissolvido em tetra-hidrofurano (5 mL) e adicionado a um vaso, sob 55 ΡΕ2081937 atmosfera de azoto, contendo acetato de paládio (II) (7 mg, 0,03 mmol), tri-l-naftilfosfina (37 mg, 0,09 mmol) e fosfato de potássio tribásico (1 g, 5 mmol). 2-Bromoacetato de etilo (167 mg, 1 mmol) foi em seguida adicionado e a mistura reacional foi agitada em refluxo durante 18 h. Foi adicionada água e a mistura foi extraída com acetato de etilo (3x) . As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e adsorvidas sobre gel de sílica. A purificação sobre gel de sílica com gradiente de 0-80% de acetato de etilo em hexano proporcionou 105 mg de produto na forma dum óleo amarelo. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 1,19 (t, 3H) , 2, 65 (s, 3H) , 3, 85 (s, 2H) , 4,10 (q, 2H) 7,40 (d, 1H) , 7, 61 (dd, 1H) , 7,78 (d, 1H) , 7,86 (d, 1H) 8,20 (d, 1H) ; MS (m/z) 230 [M+H+]+.

Passo 2: Ácido (2-metil-quinolin-6-il)-acético A uma solução de éster de etilo do ácido (2--metil-quinolin-6-il)-acético (100 mg, 0,436 mmol) em metanol (2 mL) foi adicionada uma solução aquosa 4 M de hidróxido de lítio (0,55 mL, 2,18 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 14 h e em seguida foi concentrada em vácuo, diluída com água e tratada com ácido clorídrico aquoso 1 N até pH 5. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em vácuo para proporcionarem 19 mg de produto na forma de um sólido bege claro. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 2,65 (s, 3H) , 3,76 (s, 2H) , 7,40 (d, 1H) , 7,60 56 ΡΕ2081937

(dd, 1H) , 7,77 (d, 1H) , 7,86 (d, 1H) , 8,20 (d, 1H) ; MS (m/z) 202 [M+H+] + .

Intermediário 2: Ácido 3-quinolin-6-il-propiónico p- '.'í> 1

COGH

Passo 1: Éster de etilo do ácido 3-quinolin-6-il-acrílico

Um frasco sob atmosfera de azoto foi carregado com 6-bromo-quinolina (1 g, 4,8 minol) e dimetilformamida (15 mL), seguido por acrilato de etilo (2,1 mL, 19,2 mmol), trietilamina (6,7 mL, 48 mmol) e acetato de paládio (II) (32 mg, 0,142 mmol). A mistura reacional foi agitada a 100 °C durante 5 h, em seguida a mistura quente foi filtrada sobre Celite e o filtrado foi concentrado em vácuo. O resíduo foi repartido entre água e acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de cloreto de amónio, solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio, em seguida, água salgada. A camada orgânica foi adsorvida sobre gel de sílica. A purificação sobre gel de sílica com gradiente de 10-80% de acetato de etilo em hexano proporcionou 952 mg de produto na forma dum óleo amarelo. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 1,28 (t, 3H) , 4,20 (q, 2H) , 6,82 (d, 1H) , 7,58 (d, 1H) , 7,84 (d, 1H) , 8,01 (d, 1H), 8,16 (dd, 1H), 8,30 (d, 1H), 8,37 (dd, 1H), 8,93 (dd, 1H) ; MS (m/z) 228 [M+H+] + . 57 ΡΕ2081937

Passo 2: Éster de etilo do ácido 3-quinolin-6-il-propiónico

Uma mistura de éster de etilo do ácido 3-quino-lin-6-il-acrílico (200 mg, 0.881 mmol) e 10% m/m Pd/C (93 mg, 0,088 mmol) em metanol (3 mL) foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogénio durante 3 h. A mistura foi filtrada através de Celite e o filtrado foi absorvido sobre gel de silica. A purificação sobre gel de silica com gradiente de 0-65% de acetato de etilo em hexano proporcionou 100 mg do produto na forma dum óleo límpido • 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 1,13 (t, 3H) , 2,74 (t, 2H), 3, 05 (t, 2H) 5 4 .04 (q, 2H) , 7,50 (dd, 1H) , 7, 67 (dd, 1H), 7, 78 (d, 1H), 7 , 94 (d, 1H) , 8,29 (dd, 1H) , 8,84 (dd, 1H) ; MS (m/z) 230 [M+H+] + .

Passo 3: Ácido 3-quinolin-6-il-propiónico A uma solução de éster de etilo do ácido 3-hidroxi-6-il-propiónico (100 mg, 0,437 mmol) em metanol (2 mL) foi adicionada solução aquosa 4 M de hidróxido de lítio (0,55 mL, 2,18 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h, em seguida foi concentrada em vácuo, diluída com água e tratada com ácido clorídrico aquoso 1 N até pH 5. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em vácuo para fornecerem 18 mg de produto na forma dum sólido branco. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 2,67 (t, 2H) , 3,02 (t, 2H) , 7,50 (dd, 1H) , 7,67 (dd, 1H) , 7.78 (d, 58 ΡΕ2081937 1Η) , 7,94 (d, 1H) , 8,29 (dd, 1H) , 8,84 (dd, 1H) ; MS (m/z) 202 [M+H+] +.

Intermediário 3: Ácido trans-2-quinolin-6-il-ciclopropanocarboxílico

COOH '· ·'

Passo 1: Éster de etilo de ácido trans-2-quinolin-6-il- -ciclopropanocarboxílico A uma suspensão de hidreto de sódio (71 mg, 1,76 mmol) em DMSO (3 mL) sob atmosfera de azoto foi adicionado cloreto de trimetilsulfoxónio (261 mg, 2,03 mmol). Após agitação à temperatura ambiente durante 30 minutos, uma solução de éster de etilo do ácido 3-quinolin-6-il-acrílico (200 mg, 0,881 mmol) em DMSO (2 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 2,5 h e extinta com uma solução aquosa saturada de cloreto de amónio. A mistura foi extraída com acetato de etilo (2x) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada (3x) e adsorvidas sobre gel de sílica. A purificação sobre gel de sílica com gradiente de 0-80% de acetato de etilo em hexano produziu 126 mg de produto na forma dum sólido branco. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 1, 22 (t, 3H), 1, 55 (m, 2H) , 2,10 (m, 1H), 2,64 (m, 1H) , 4,13 (q, 2H), 7, 50 (dd, 1H), 7,58 (dd, 1H) , 7,80 (d, 1H) , 7,93 (d, 1H), 8, 26 (dd, 1H), 8,84 (dd, 1H); MS (m/z) 242 [M+H+] + . 59 ΡΕ2081937

Passo 2: Ácido trans-2-quinolin-6-il-ciclopropanocarboxi- lico A uma solução de éster de etilo do ácido trans-2--quinolin-6-il-ciclopropanocarboxílico (125 mg, 0,523 mmol) em metanol (2 mL) foi adicionada solução aquosa 4 M de hidróxido de litio (0,65 mL, 2,62 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h e em seguida foi concentrada em vácuo, diluida com água e tratada com ácido clorídrico aquoso 1 N até pH 4-5, 0 precipitado resultante foi filtrado, lavado com água e seco em vácuo para fornecer 102 mg de produto na forma dum

sólido branco. λΕ- RMN 500 MHz (DMSO) δ 1,50 (m, 2H) , 1, 96 (m, 1H) , 2, 60 (m, 1H) , 7,50 (dd, 1H) , 7,57 (dd, 1H) , 7,78 (d, 1H) , 7, 93 (d, 1H) , 8,26 (dd, 1H) , 8,83 (dd , 1H) ; MS (m/z) 214 [M+H+]+.

Intermediário 4: Ácido quinoxalin-6-il-acético ΛΝνίν

f''- N

Passo 1: Ester de etilo do ácido quinoxalin-6-il-acético

Um frasco sob atmosfera de azoto foi carregado com hidrocloreto de ácido benzopirazina-6-borónicos (500 mg, 2,38 mmol), acetato de paládio (II), (16 mg, 0,071 mmol), tri-l-naftilfosfina (88 mg, 0,214 mmol), fosfato de potássio tribásico (2,52 g, 11,9 mmol) e tetra--hidrofurano (10 mL) . 2-Bromoacetato de etilo (0,315 mL, 2,85 mmol) foi em seguida adicionado e a mistura reacional 60 ΡΕ2081937 foi agitada em refluxo durante 6 h. Foi adicionada água e a mistura foi extraída com acetato de etilo (3x) . As camadas orgânicas combinadas foram adsorvidas sobre gel de sílica. A purificação sobre gel de sílica com gradiente 0-100% de acetato de etilo em hexano proporcionou 96 mg de produto na forma dum óleo amarelo escuro. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 1,20 (t, 3H) , 3,99 (s, 2H) , 4,11 (q, 2H) , 7,79 (dd, 1H) , 8,01 (d, 1H) , 8,06 (d, 1H) , 8,94 (d, 2H) ; MS (m/z) 217 [M+H+] + .

Passo 2: Ácido quinoxalin-6-il-acético A uma solução de éster de etilo do ácido quinoxa-lin-6-il-acético (95 mg, 0,44 mmol) em metanol (2 mL) foi adicionado hidróxido de lítio aquoso 4 M (0,55 mL, 2,2 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 17 h e depois foi concentrada em vácuo, diluída em água e extraída com éter dietílico (3x) . A camada aquosa foi tratada com ácido clorídrico aquoso 1 N até pH 2 e extraída com acetato de etilo (3x) . As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em vácuo para proporcionarem 64 mg de produto na forma dum sólido bege. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ (s, 2H) , de 3, 90 7,78 (dd, 1H) , 7,99 (d, 1H) , 8,06 (d, 1H) , 8,93 (dd, 2H) ; MS (m/z) 189 [M+H+] + .

Intermediário 5: Ácido benzotiazol-6-il-acético 61 ΡΕ2081937

Passo 1: Ácido (2-amino-benzotiazol-6-il)-acético Ácido (4-amino-fenil)-acético (20 g, 132,5 mmol) e NH4SCN (20 g, 263,2mmol) foram dissolvidos em 300 mL de ácido acético e a mistura foi arrefecida até 15 °C, tratados com Br2 (21,2 g, 6,8 mL) em ácido acético (10 mL) e a temperatura não passou de 15 °C. Em seguida, a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h. A mistura foi filtrada e o bolo foi redissolvido em água, ajustada a pH = 5, 0 precipitado foi filtrado e seco para se obter o ácido 2-amino-benzotiazol-6-il)-acético na forma de um pó amarelo claro (24 g, 87,1%) .

Passo 2: Ácido benzotiazol-6-il-acético Ácido 2-Amino-benzotiazol-6-il)-acético (20 g, 96,2 mmol) foi dissolvido em 1,4-dioxano (750 mL) . Nitrito de i-amilo (22,4 g, 192,4 mmol) foi adicionado à solução gota a gota à temperatura ambiente. A mistura foi agitada sob atmosfera de azoto em refluxo durante 2 horas. Após a reação estar completa o solvente foi removido sob vácuo e o residuo foi usado no passo seguinte sem mais purificação.

Intermediário 5 e Intermediário 6: Ácido benzotiazol-6-il-acético e ácido 2-cloro-benzotiazol- -6-il)-acético N ,χ·\. ,ΟΟΟΗ # r )i A uma solução de di-hidrocloreto do ácido (2-amino-benzotiazol-6-il)-acético (150 mg, 0,533 mmol) em 62 ΡΕ2081937 dimetilformamida (3 mL) sob atmosfera de azoto foi adicionado nitrito de terc-butilo (0,076 mL, 0,64 mmol) gota a gota. A mistura reacional foi agitada a 50 °C durante 1,5 h e foi concentrada e seca em vácuo como uma mistura de (2:3) de ácido benzotiazol-6-il-acético e ácido (2-cloro-benzotiazol-6-il)-acético. A mistura foi usada como tal no procedimento de acoplamento/ciclização, conforme descrito no método Y.

Intermediário 7: 4-(6-Fenil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil) -benzeno-1,2-diamina

« ύ\ ,íí V

V NHg. •o.

Passo 1: Éster de metilo do ácido 4-amino-fenil-acético A uma suspensão de ácido 4-amino-fenil-acético (5 g, 33 mmol) em metanol (20 mL) foi adicionado ácido sulfúrico concentrado gota a gota (2 mL) . A mistura reacional foi agitada em refluxo durante 1,5 h e, em seguida, concentrada em vácuo. O resíduo foi repartido entre carbonato de potássio aquoso 1 M e éter dietílico. A camada orgânica foi lavada com carbonato de potássio aquoso 1 M, água, em seguida seco sobre sulfato de sódio e filtrado. O filtrado foi concentrado e seco sob vácuo para dar 4,65 g do produto na forma dum óleo amarelo escuro. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 3,43 (s, 2H) , 3,57 (s, 3H) , 4,97 (s, 2H) , 6,49 (d, 2h) , 6,88 (d, 2H) ; MS (m/z) 166 [M+H+]+. 63 ΡΕ2081937

Passo 2: Éster de metilo do ácido 4-acetilamino-3-nitro- -fenil)-acético

Uma solução de éster de metilo do ácido 4-amino--fenil-acético (3 g, 18,2 mmol) em anidrido acético (16 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura reacional foi arrefecida até à temperatura de 0 °C e ácido nitrico fumante (2,3 mL) foi adicionado gota a gota. O banho de gelo foi removido e a mistura reacional foi agitada durante mais 20 minutos antes de ser vertida em água gelada. O precipitado amarelo resultante foi filtrado, lavado com água e seco em vácuo a 50 °C para dar 3,7 g do produto. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 2,05 (s, 3H) 3,63 (s, 3H) , 3,81 (s, 2H) , 7,54 (d, 1H) , 7,58 (dd, 1H) , 7,87 (d, 1H) , 10,2 (s, 1H).

Passo 3: Hidrocloreto de do ácido 4-amino-3-nitro-fenil)- -acético

Uma solução de (éster de metilo do ácido 4-acetilamino-3-nitro-fenil)-acético (1,3 g, 5,15 mmol) em ácido clorídrico aquoso 6 N (10 mL) foi agitada em refluxo durante 1,5 h e em seguida concentrada em vácuo até à secura. O resíduo foi triturado com éter dietílico, filtrado, lavado com éter dietílico e seco em vácuo para dar 978 mg do produto na forma dum sólido amarelo-laranja escuro. 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 3,49 (s, 2H), 6,98 (d, 1H) , 7,30 (dd, 1H), 7,86 (d, 1H) ; MS (m/z) 197 [M+H+] + . 64 ΡΕ2081937

Passo 4: 2-Nitro-4- (6-fenil- [1, 2,4] triazolo [4,3-Jb] -piridazin-3-ilmetil)-fenilamina 0 composto mencionado em título pode ser preparado de acordo com o procedimento descrito no método D na forma dum sólido amarelo (91 mg, 0,263 mmo1 , 23% de rendimento) 1HNMR (DMSO) δ 4,50 (s, 2H) , 6,97 (d, 1H) , 7,43 (s, 2H) 7,45 (dd, 1H) , 7, 60 (m, 3H) , 7,95 (d, 1H) , 8,14 (m, 3H) 8,42 (d, 1H); MS (m/z) 347 (M+H).

Passo 5: 4-(6-Fenil-[1, 2,4] triazolo [4,3-Jb] piridazin-3- -ilmetil)-benzeno-1,2-diamina

Uma mistura de 2-nitro-4-(6-fenil-[1,2,4]triazolo [4, 3-b] piridazin-3-ilmetil)-fenilamina (89 mg, 0,257 mmol) e Pd 10% m/m/C (27 mg, 0,026 mmol) em metanol (4 mL) , tetra-hidrofurano (2 mL) e dimetilformamida (2 mL) foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogénio durante 4 h. O catalisador foi filtrado através de Celite e o filtrado foi concentrado e seco sob vácuo para fornecer 81 mg do produto como um sólido bege. 1H-RMN (DMSO) δ 4,30 (s, 2H) , 4,32 (s, 2H) , 4,43 (s, 2H) , 6,43 (m, 2H) , 6,50 (s, 1H) , 7,60 (m, 3H) , 7,93 (d, 1H) , 8,11 (m, 2H) , 8,39 (d, 1H) ; MS (m/z) 317 [M+H+] + .

Intermediário 8:

Quinolin-6-il-acetonitrilo & & % íi' ; ·%*-χ (21,48 g,

Uma suspensão de 6-metilguinolina 65 ΡΕ2081937 150 mmol) e IV-bromossuccinimida (27,6 g, 155 iranol) em CC14 (430 mL) foi aquecida até ao refluxo. Uma vez obtido o refluxo, peróxido de benzoilo (1,4 g, 5,1 mmol) foi adicionado numa única porção. A mistura foi agitada em refluxo durante mais 2 horas. Após esse tempo, a mistura foi deixada a arrefecer até a temperatura ambiente ao longo de 3 horas e o precipitado formado foi removido através de filtração. O filtrado foi lavado com NaOH aquoso 5% (2x150 mL) , água (200 mL) , seco (Na2S04) e purificado via cromatografia em coluna "flash" (SÍO2, hexano/acetato de etilo 100:0-35/65). As frações contendo o composto de bromo desejado foram diluidas com dimetilformamida (400 mL) e a mistura concentrada em vácuo para remover hexano e acetato de etilo. A esta mistura foi em seguida adicionado KHCO3 (15 g, 150 mmol) seguido por cianeto de sódio (7,34 g, 150 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e a 40 °C por mais 2 horas. Após esse tempo, a mistura foi concentrada em vacuo e o resíduo vertido em KHCO3 aquoso 5% (600 mL) e extraído com acetato de etilo (3x200 mL). Os extractos orgânicos combinados foram lavados com água salgada (100 mL) , secos (Na2S04) e concentrados sobre gel de sílica. A purificação por cromatografia de coluna "flash" (Si02, hexano:acetato de etilo 80/20-30/70) retornou o composto mencionado em título na forma dum sólido branco 4,8 g, 28,6 mmol, rendimento de 20%). 1H-RMN 500 MHz (DMSO-d6) δ 4,28 (2H, s), 7,56 (1H, dd) , 7,11 (1H, dd) , 7,97 (1H, d), 8,01 (1H, d), 8,40 (1H, dd) , 8,92 (1H, dd) ; MS (m/z) 169 [M+H+] + . ΡΕ2081937 - 6 6-

Intermediário 9:

Hidrocloreto do ácido 2-metil-2-quinolin-6-il-propiónico 0 M. £ !

HsC' SCHà

Passo 1: 2-Metil-2-quinolin-6-il-propionitrilo

Uma solução de quinolin-6-il-acetonitrilo (Intermediário 8) (200 mg, 1,2 mmol) em tetra-hidrofurano (12 mL) foi arrefecida até -78 °C à qual iodeto de metilo (2,5 mmol, 157 pL) foi adicionado seguido por terc-butóxido de potássio (2,5 mmol, 280 mg) . A mistura foi deixada a aquecer até à temperatura ambiente durante a noite. Após esse tempo a mistura foi concentrada em vácuo e recebida em NaHCCb aquoso (30 mL) e extraída com diclorometano (3x30 mL). Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) e concentrados sobre gel de sílica. A purificação por cromatografia em coluna "flash" (S1O2, hexano:acetato de etilo 90/10-50/50) retornou o composto mencionado em título na forma dum óleo incolor límpido (214 mg, rendimento de 91%) . XH- RMN 50 0 MHz (DMSO-d6) δ 1,80 (6H, s), 7,58 (1H, dd), 7, 94 (1H, dd), 8, 08 (1H, d), 8,11 (1H, d), 8,45 (1H, dd), 8, 93 (1H, dd); MS (m/z) 197 [M+H+]+.

Passo 2: Hidrocloreto do ácido 2-metil-2-quinolin-6-il--propiónico A uma mistura de 2-metil-2-quinolin-6-il-propio-nitrilo (760 mg, 3,88 mmol) em água (3 mL) foi adicionado ácido clorídrico concentrado (7 mL) e aquecida a 160 °C no 67 ΡΕ2081937 micro-ondas durante 5 minutos. Após esse tempo, a mistura foi concentrada em vacuo e o residuo seco através de destilação azeotrópica em tolueno (3x5 mL) para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (949 mg, 3,77 mmol, 97% de rendimento). 1H-RMN 500 MHz (D20) δ 1,54 (6H, s) , 7,89 (1H, dd) , 8,03-7, 96 (2H, m) , 8,11 (1H, d), 8, 95-8,85 (2H, m) .

Intermediário 10: Ácido 2-quinolin-6-il-propiónico ? 1 MO^Y'

Passo 1: Éster de metilo do ácido quinolin-6-il-acético A uma solução agitada de ácido quinolin-6-il--acético (10 g, 53,0 mmol) em 100 mL de metanol foi adicionado 2,5 mL de H2SO4 concentrado. A mistura foi aquecida em refluxo durante 3 horas. A mistura reacional foi concentrada para dar um residuo castanho, o qual foi diluído com 100 mL de diclorometano, lavado com NaHCCb aq° sat° e água salgada, em seguida, a camada orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro e concentrado para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum óleo castanho (7,9 g, 73,6%) .

Passo 2: Éster de metilo do ácido 2-quinolin-6-il--propiónico

Uma solução de n-butil-lítio em hexano (1,6 M 68 ΡΕ2081937 50,9 mL) foi adicionada a uma solução agitada de diiso-propilamina (5,32 g, 52,6 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (100 mL) arrefecido a -40 °C sob atmosfera de azoto e a mistura foi agitada durante 30 min. A mistura reacional foi arrefecida até -78 °C, a esta solução foi adicionada uma solução de éster de metilo do ácido quinolin-6-il-acético (7,9 g, 39,3 mmol) em 10 mL de tetra-hidrofurano e HMPA (10,0 g, 55,8 mmol). A mistura foi agitada a -78 °C durante 1 hora e em seguida a -30 °C durante 30 min. A esta mistura reaccional foi adicionada uma solução de iodeto de metilo (8,0 g, 56,3 mmol) em tetra-hidrofurano anidro a -78 °C e a mistura foi agitada a -78 °C durante 1,5 horas. A mistura reacional foi aquecida lentamente até à temperatura ambiente e diluída com solução aquosa saturada de NH4C1 (100 mL) e água (80 mL) . A mistura foi extraída com éter

terc-butílico e metílico, as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e água salgada, secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas para darem um óleo castanho, o qual foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com éter de petróleo e acetato de etilo (20:1) para dar um óleo amarelo pálido (7,7 g, 91,1%). A análise por 1H-RMN e LC-MS revelou que o composto mencionado em título estava contaminado com éster de metilo do ácido 2-metil-2-quinolin-6-il-propiónico 10%.

Passo 3: Ácido 2-quinolin-6-il-propiónico Éster de metilo do ácido 2-quinolin-6-il-propió-nico contendo éster de metilo do ácido 2-metil-2-quinolin- 69 ΡΕ2081937

-6-il-propiónico 10% (7,7 g, 35,8 mmol) e NaOH aq. 2 N (27 mL) foi aquecido até ao refluxo durante 4 horas até a mistura reacional se tornar limpida. Após arrefecimento até a temperatura ambiente, a mistura foi extraída com diclorometano e a camada aquosa foi acidificada com ácido clorídrico concentrado até pH 4-5. Acetato de etilo (30 mL) foi adicionado e agitado durante 10 min, o sólido resultante foi separado por filtração para se obter o produto, o qual foi recristalizado por duas vezes em metanol para proporcionar o composto mencionado em título (5,3 g, 73,7%): 1H-RMN 300 MHz (DMSO-d6) δ 12,43 (s, 1H) , 8,86 (d, 1H) , 8,33 (d, 1H) , 7, 99-7, 86 (m, 2H) , 7,72-7,49 (m, 2H), 3,92 (q, 1H), 1,48 (d, 3H). ES-MS m/z: 200 [M-H+]~, 400 (dímero) .

Intermediário 11: Ácido (5, 7-difluoro-quinolin-6-il)-acético

Passo 1: 6-Bromo-5,7-difluoro-quinolina

Uma mistura de 4-bromo-3,5-difluoro-fenilamina (6,0 g, 28,8 mmol), sulfato ferroso (1,82 g), glicerol (8,6 mL) , nitrobenzeno (1,79 mL) e 5,0 mL de ácido sulfúrico concentrado (5 mL) foi aquecida suavemente. Após a primeira reação vigorosa, a mistura foi aquecida em refluxo durante cinco horas. O nitrobenzeno foi removido por destilação sob vácuo. A solução aquosa foi acidificada 70 ΡΕ2081937 com acético ácido glacial e o precipitado castanho escuro foi separado, o qual foi purificado por cromatografia "flash" (gel de silica, petróleo/acetato de etilo = 12/1) para retornar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (3,5 g, 49,8%).

Passo 2: Éster de etilo do ácido 2-(5,7-difluoro-quinolin- -β-il)-malónico

Malonato de etilo (9.28 g, 8,8 mL, 58,0 mmol) foi adicionado gota a gota a uma mistura de hidreto de sódio (60 por cento em óleo mineral, 2,32 g, 58,0 mmol) em 1,4--dioxano (29 mL) a 60 °C. CuBr (4,176 g, 29,0 mmol) e 6-bromo-5,7-difluoro-quinolina (7,07 g, 29,0 mmol) foram adicionados e a mistura foi aquecida em refluxo durante 16 h. Após esse tempo, ácido clorídrico concentrado foi adicionado sob arrefecimento em gelo e, em seguida, foram adicionados éter metílico e terc-butílico e água. A camada orgânica separada foi lavada com ácido clorídrico (10%) e água em sequência, e foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para produzir o composto mencionado em título (3,13 g, 35,4%).

Passo 3: Ácido (5,7-difluoro-quinolin-6-il)-acético A um balão de fundo redondo contendo éster de dietilo do ácido 2-(5,7-difluoro-quinolin-6-il)-malónico (2,48 g, 7,68 mmol) foram adicionados etanol (77 mL) e NaOH aquoso 10% (103,2 mL). A solução foi refluxada durante 3 h. 71 ΡΕ2081937

Após esse tempo, o etanol foi removido sob pressão reduzida para formar uma suspensão amarela e foi adicionado tetra-hidrofurano (50 mL) para dar uma solução amarela limpida, a qual foi colocada num banho de gelo e agitada. Ácido clorídrico 6 N (50 mL) foi adicionado lentamente à solução até atingir pH 1. A solução laranja clara foi refluxada durante outra hora, tempo durante o qual se formaram duas camadas. A camada superior de tetra-hidrofurano foi recolhida e a solução aquosa foi extraída com diclorometano. As camadas orgânicas foram adicionadas de água salgada e secas com sulfato de sódio anidro. A solução foi em seguida filtrada e o filtrado foi concentrado para se obter o composto mencionado em título (1,20 g, 70,1%). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,82 (s, 1H) , 8, 98-9, 00 (m, 1H) , 8,47-8,50 (d, 1H) , 7,61-7,74 (m, 2H) , 3,86 (s, 2H) . ES-MS m/z: 224,2 (M++ 1).

Intermediário 12 Ácido (7-fluoro-quinolin-6-il)-acético HQv • v\<* ^ li

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Passo 1: 6-Bromo-7-fluoro-quinolina

Uma mistura de 4-bromo-3-fluoro-fenilamina (2,85 g, 15 mmol), sulfato ferroso (0,95 g), glicerol (5,658 g, 4,5 mL), nitrobenzeno (1,125 g, 0,93 mL) e ácido sulfúrico concentrado (2,61 mL) foi aquecida suavemente. Após a primeira reação vigorosa, a mistura foi aquecida em refluxo durante 7 horas. O nitrobenzeno foi evaporado em 72 ΡΕ2081937 vácuo. A solução aquosa foi acidificada com ácido acético glacial e um precipitado castanho escuro separou-se, o qual foi purificado por cromatografia "flash" (gel de sílica, petróleo/acetato de etilo = 8/1) para proporcionar o composto mencionado em título na forma de cristais brancos (1,44 g, 42,5%).

Passo 2: Éster de terc-butilo do ácido (7-fluoro-quinolin- -6-il)-acético A uma solução de 6-bromo-7-fluoro-quinolina (1,04 g, 4,6 mmol) em tetra-hidrofurano (1 mL) foi adicionada uma solução de acetato de brometo de terc-butilzinco (20 mL, 10,4 M em tetra-hidrofurano) seguido por Pd(PPh3)4 (0,58 g, 0,5 mmol). A mistura foi aquecida num reator de micro-ondas durante 35 minutos a 120 °C. A mistura reacional foi extinta com cloreto de amónio saturado (60 mL) e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para produzir o composto mencionado em título (0,75 g, 63%).

Passo 3: Ácido (7-fluoro-quinolin-6-il)-acético

Uma mistura de éster de terc-butilo do ácido (7-fluoro-quinolin-6-il)-acético (3,67 g) e hidróxido de sódio aquoso 4 N (14,8 mL) foram aquecidos a 90 °C durante 3 h. A solução foi extraída com acetato de etilo. A camada aquosa foi ajustada a pH ácido com ácido acético e filtrada 73 ΡΕ2081937 e seca para produzir o composto mencionado em titulo (2,3 g, 79,8%). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,52 (1H, s) , 8,88-8,90 (d, 1H) , 8,34-8,38 (d, 1H) , 7, 97-7, 99 (d, 1H) ,

7,73-7,76 (d, 1H) , 7,50-7,54 (m, 1H), 3,85 (s, 2H) . ES-MS m/z: 206,2 (M+l).

Intermediário 13: Ácido (7-Metil-quinolin-6-il)-acético tiú. &

Passo 1: 6-Bromo-7-metil-quinolina

Uma mistura de 20 g de 4-bromo-3-metil-fenilamina, 6, 6 g de sulfato ferroso, 40,8 g de propano-1,2,3-triol, 8,12 g de nitrobenzeno e 23 mL de ácido sulfúrico concentrado foi aquecida suavemente. Após a primeira reação vigorosa, a mistura foi aquecida em refluxo durante 3 h e em seguida evaporada para remover o excesso de nitrobenzeno. À solução foi adicionado NaHCC>3 saturado até pH 8 e a solução foi filtrada e extraída com diclorometano. As camadas de diclorometano foram combinadas e secas sobre Na2SC>4 e concentradas. 0 sólido foi purificado por cromatografia em coluna "flash" para dar um sólido amarelo que foi lavado com éter de petróleo para proporcionar o composto mencionado em titulo (7,5 g, 65%). 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) δ 8,89 (m, 1H) , 8,04 (m, 2H) , 7,96 (s, 1H) , 7,36 (m, 1H) , 2, 60 (s, 3H) . - 74 - ΡΕ2081937

Passo 2: Éster de terc-butilo do ácido (7-metil-quinolin- -6-il)-acético A 1,02 g de 6-bromo-7-metil-quinolina foi adicionada uma solução de 20 mL de acetato brometo de terc-butil-zinco e 0,58 g de Pd(PPh3)4. A mistura foi colocada no reator de micro-ondas durante 30 min para atingir uma temperatura de 120 °C (repetido 3 vezes). A purificação por cromatografia em coluna "flash" proporcionou o composto mencionado em titulo (3,2 g, 68%). 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) δ 8,84 (m, 1H) , 8,07 (m, 1H) , 7,89 (s, 1H) , 7,63 (s, 1H) , 7,3 1 (m, 1H), 3,72 (s, 2H), 2,51 (s, 3H), 1,46 (s, 9H).

Passo 3: Ácido (7-metil-quinolin-6-il)-acético 3,2 g de éster de terc-butilo do ácido (7-metil--quinolin-6-il)-acético em 25 mL de NaOH aquoso (4 N) foram aquecidos em refluxo durante 4 h. A mistura foi lavada com acetato de etilo e foi adicionado ácido clorídrico concentrado até pH 7. Formou-se um sólido branco o qual foi filtrado e seco para proporcionar o composto mencionado em título (1,5 g, 71,1%). 1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz) δ 12,46 (s, 1H), 8,82 (m, 1H), 8,26 (m, 1H), 7,82 (s, 1H) , 7,77 (s, 1H) , 7,44 (m, 1H) , 3,80 (s, 2H) , 2,44 (s, 3H) ; ES-MS m/z: 202 (M++H).

Intermediário 14:

Hidrocloreto do ácido fluoro-quinolin-6-il-acético 75 ΡΕ2081937

Passo 1: Fluoro-quinolin-6-il-acetonitrilo

Uma solução de quinolin-6-il-acetonitrilo (1,06 g, 6,3 mmol) em tetra-hidrofurano (40 mL) foi arrefecida até -78 °C ao qual terc-butil-lítio (0,8 M em pentano; 7,6 mmol; 7,9 mL) foi adicionado de forma gota a gota durante 10 minutos. Após a adição estar concluída, a mistura foi agitada a -78 °C durante 30 min antes de uma solução de IV-fluoro-di(benzenossulfonil)-amina (1,5 eq, 9,45 mmol, 3,0 g) em tetra-hidrofurano (10 mL) ser adicionada. A mistura reacional foi agitada durante 2 horas a -78 °C antes de água ser adicionada seguido por NaHCCb aquoso. A mistura foi extraída com diclorometano (3x80 mL) , seca (Na2SC>4) e concentrada em vácuo sobre gel de sílica e purificada via cromatografia em coluna "flash" (Si02, hexano:acetato de etilo 100/0-50/50) para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido vermelho (520 mg, 2,8 mmol, 44%). 1H-RMN 500 MHz (DMSO-d6) δ 6,05 (1H, d), 7,66 (1H, dd) , 7,95 (1H, dd) , 8,19 (1H, d), 8,32 (1H, t), 8,55 (1H, d), 9,03 (1H, dd) ; MS (m/z) 187 [M+H+] + .

Passo 2: Hidrocloreto do ácido fluoro-quinolin-6-il- -acético

Fluoro-quinolin-6-il-acetonitrilo (370 mg, 2,0 mmol) foi recebido em ácido clorídrico concentrado (4 mL) e aquecido a 145 °C durante 8 minutos num microondas. Após esse tempo, a mistura foi concentrada em vácuo para proporcionar o composto mencionado em título na forma de um sólido branco com rendimento quantitativo. 1H-RMN 500 MHz 76 ΡΕ2081937 (D20) δ 6,05 (1H, d), 7, 99-6, 93 (1H, m) , 8,14-8,05 (2H, m) , 8,26 (1H, s), 9, 05-8, 95 (2H, m) . MS (m/z) 204 [M-H+]_.

Intermediário 15: [6-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-piridazin-3-il]-hidrazina h3c 11

N N, \\

N

N

H

Passo 1, Método 1.1 3-Cloro-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- piridazina

Uma mistura de 3,6-dicloropiridazina (5,37 g, 33.5 mmol), éster de pinacol do ácido l-metil-4-pirazolo-borónico (5 g, 24,0 mmol) e carbonato de césio (23,44 g, 72 mmol) em 1,4-dioxano (150 mL) e água (750 mL) sob azoto foi desgaseada por borbulhamento em azoto durante 15 min. Aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paládio (II) diclorometano (1 g, 1,37 mmol) foi adicionado em seguida e foi borbulhado azoto na mistura durante mais 10 minutos. A mistura reacional foi agitada a 80 °C durante 2.5 h, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada em vácuo. 0 resíduo foi repartido entre carbonato de potássio aquoso 1 N e acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com carbonato de potássio aquoso 1 N e água salgada, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e adsorvida sobre gel de sílica para purificação. A purificação por cromatografia "flash" sobre gel de sílica usando um gradiente de 0-50% de acetato de etilo/hexano 77 ΡΕ2081937 produziu 2,8 g do composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (60% de rendimento); MS (m/z) 195 [M+H+] +.

Passo 1, Método 1.2 3-Cloro-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- piridazina

Uma mistura de 3,6-dicloropiridazina (20,1 g, 135 mmol), éster de pinacol do ácido l-metil-4-pirazolo-borónico (25,46 g, 122 mmol) e carbonato de potássio (50,7 g, 367 mmol) em 1,4-dioxano (500 mL) e água (200 mL) sob azoto foi desgaseifiçada por borbulhamento em azoto durante 15 min. Diclorobis(trifenilfosfina)paládio (II) (1,2%, 1 g, 1,4 mmol) foi adicionado e foi borbulhado azoto na mistura durante mais 10 minutos. A mistura reacional foi agitada a 90 °C durante 3 h, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada em vácuo para remover a maioria do 1,4-dioxano. O resíduo foi repartido entre carbonato de potássio aquoso 1 N (400 mL) e acetato de etilo (400 mL) e as fases separadas. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2x300 mL) e diclorometano (300 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em vácuo. O resíduo foi agitado em éter dietílico (150 mL) e o precipitado laranja foi filtrado e seco para proporcionar o composto mencionado em título (12,76 g, 65,6 mmol, 54% de rendimento). O filtrado foi concentrado sobre gel de sílica e purificado por sobre gel de sílica usando um cromatografia "flash" 78 ΡΕ2081937 gradiente de 0-50% de acetato de etilo/hexano para proporcionar a 3, 6-dicloropiridazina de partida na forma dum sólido branco (9,9 g, 66,4 mmol, 49% de rendimento).

Passo 2: [6-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-piridazin-3-il]- -hidrazina A uma suspensão de 3-cloro-6-(1-metil-lH--pirazole-4-il)-piridazina (1,0 g, 4,81 mmol) em etanol (20 mL) foi adicionado mono-hidrato de hidrazina (2,33 mL, 48 mmol) . A mistura reacional foi agitada a 80 °C durante 3,5 h, arrefecida à temperatura ambiente e concentrada em vácuo. O residuo foi triturado com carbonato de potássio aquoso 1 N, filtrado, lavado com água e seco sob vácuo para fornecer 2 g do composto na forma dum sólido bege (670 mg, 73% de rendimento): 1H-RMN (DMSO-de) δ 3, 92 (s, 3H), 4,28 (s, 1H) 7,02 (d, 1H) , 7,59 (d, 1H), 7,84 (s, 1H) , 7,90 (s, 1H), 8, 19 (d, 1H); MS (m/z) 191 [M+H+] +.

Intermediário 16: Ácido 2-benzotiazol-6-il-propiónico HÒ,, Λ

scA nA" A

O

Passo 1: Éster de metilo do ácido benzotiazol-6-il-acético SOCI2 (13,5 g, 114,0 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução agitada de ácido benzotiazol-6-il--acético (20,0 g, 103,6 mmol) em 150 mL de metanol a 0 °C sob N2. Após agitação durante 2 horas à temperatura 79 ΡΕ2081937 ambiente, o solvente foi evaporado e o resíduo foi diluído com acetato de etilo (150 mL) . A mistura foi lavada com solução saturada de carbonato de sódio (3x100 mL) e água salgada (100 mL) e em seguida concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna eluindo com acetato de etilo/éter de petróleo (1:5) para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum óleo amarelo pálido (15,0 g, 71,5%).

Passo 2: Éster de metilo do ácido 2-benzotiazol-6-il- -propiónico

Uma solução de n-BuLi (2,5 M em hexano, 27,0 mL) foi adicionada a uma solução agitada de di-isopropilamina (7,08 g, 70,0 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (150 mL) arrefecida a -30 °C, sob uma atmosfera de azoto. A mistura foi agitada durante 30 minutos e a mistura reacional foi arrefecida a -78 °C. A esta solução foi adicionada uma solução de éster de metilo do ácido benzotiazol-6-il--acético (10,4 g, 50,0 mmol) em 10 mL de tetra-hidrofurano e hexametilfosforamida (13,5 g, 75,0 mmol). A mistura foi agitada a -78 °C durante 2 horas antes da adição de uma solução de iodeto de metilo (10,2 g, 72,0 mmol) em tetra--hidrofurano anidro a -78 °C. A mistura foi agitada durante mais 2 horas a -78 °C. A mistura reacional foi aquecida lentamente até à temperatura ambiente e diluída com solução aquosa saturada de NH4C1 (200 mL) . A mistura foi extraída com acetato de etilo (x2 e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e água salgada, secas sobre sulfato 80 ΡΕ2081937 de sódio anidro e concentradas para darem um óleo castanho. Este óleo foi purificado por cromatografia em coluna "flash" eluindo com petróleo e acetato de etilo (10:1) para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum óleo amarelo pálido (4,5 g, 40,5%).

Passo 5: Ácido 2-benzotiazol-6-il-propiónico

Uma mistura de éster de metilo do ácido 2-benzo-tiazol-6-il-propiónico (6,6 g, 30,0 mmol) e NaOH aquoso 2 N (23,0 mL) foi aquecida em refluxo durante 1 hora até a mistura reaccional se tornar uma solução vermelha escura. A mistura foi em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e a mistura extraida com diclorometano (x2) e a camada aquosa foi acidificada com ácido clorídrico conc. até pH 4-5. O sólido resultante foi separado por filtração para produzir o produto cru, o qual foi agitado em acetato de etilo e seco em vácuo para produzir o composto mencionado em título (4,3 g, 69,2%) na forma dum sólido branco. 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,41 (s, 1H) , 9,35 (s, 1H) , 8, 0 9 — 8, 08 (d, J=l,5 Hz, 2H) , 8, 05-8,02 (d, J=8,7 Hz, 2H) , 7,48-7,45 (dd, J=l,5 Hz, 8,7 Hz, 1H) , 3,89 (q, 1H) , 1,45 (d, 3H). MS m/z: 208 (M++H).

Intermediário 17 · Ácido (8-metil-quinolin -acético 81 ΡΕ2081937

Passo 1: 6-Bromo-8-metil-quinolina

Uma mistura de 10 g de 4-bromo-2-metilanilina, 3,3 g de sulfato ferroso, 20,4 g de glicerol, 4,06 g de nitrobenzeno e 11,5 mL de ácido sulfúrico concentrado foi aquecida suavemente. Depois da primeira reação vigorosa, a mistura foi fervida durante 3 h sob refluxo e em seguida evaporada para remover o nitrobenzeno. A solução foi adicionada de NaHCCb aq° sat° e extraída com diclorometano, seca com Na2S04 e concentrada para dar um sólido. O sólido foi purificado com cromatografia em coluna "flash" para proporcionar o composto mencionado em título (9,5 g, 80%). 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) δ 8,92 (m, 1H) , 8,01 (m, 1H) , 7,81 (d, 1H), 7,66 (m, 1H), 7,43 (m, 1H) , 2,79 (s, 3H) .

Passo 2: Éster de terc-butilo do ácido (8-metil-quinolin- -6-il)-acético

Sob N2, 20 mL de tetra-hidrofurano e 0,5 mL (3,9 mmol) de clorotrimetilsilano foram adicionados a 5,2 g (80 mmol) de zinco em pó. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 min. Uma solução de 2-bromoacetato de terc-butilo (5,9 mL, 40 mmol) em 50 mL de tetra-hidrofurano foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada a 42 °C-45 °C durante 20 min. Isto foi deixado arrefecer até 25 °C para se obterem 7 6 mL de uma solução 0,52 M do reagente Reformatsky de terc-butilo. A 1,039 g de 6-bromo-8-metil-quinolina foi adicionada uma solução do reagente de Reformatsky anteriormente preparado (20 mL) , seguido pela adição de 0,541 g de Pd(PPh3)4. A mistura foi 82 ΡΕ2081937 colocada no reator de micro-ondas durante 30 min para alcançar a temperatura de 120 °C. O procedimento acima foi repetido mais 4 vezes. As misturas reacionais combinadas foram combinadas e purificadas via cromatografia em coluna para proporcionar o composto mencionado em titulo (3,5 g, 49%). 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) δ 8,92 (m, 1H) , 8,11 (m, 1H) , 7,54 (s, 1H) , 7,50 (s, 1H) , 7,40 (s, 1H) , 3,67 (s, 2H) , 2,81 (s, 3H), 1,46 (s, 9H).

Passo 3: Ácido (8-metil-quinolin-6-il)-acético 3,5 g de éster de terc-butilo do ácido (8-metil- -quinolin-6-il) -acético em 18 mL de NaOH (4 N, aq°) foram aquecidos em refluxo durante 3 h. A mistura foi lavada com acetato de etilo e a camada de água foi acidificada com ácido cloridrico 1 N até pH 4-5 e extraída com diclorometano. 0 solvente foi evaporado e o sólido resultante foi lavado com água e seco em vácuo para proporcionar o composto mencionado em trtulo na forma de um sólido esbranquiçado (1,3 g, 48%)· 1H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) δ 12,42 (s, 1H) , 8,90 (m, 1H)# 8'30 (m' 1H)/ 7#66 (s, 1H), 7,54 (m, 2H), 3,74 (s, 2H) , 2'78 (s, 3H) .

Intermediário 18: Ácido (e-fluoro-quinolin-G··11) acético

F 83 ΡΕ2081937

Passo 1: 6-Bromo-8-fluoro-quinolina

Uma mistura de 4-bromo-2-fluoroanilina (12,825 g, 67,5 mmol), 4,275 g de sulfato ferroso, 25,46 g (20,2 mL) de glicerol, 5,067 g (4,2 mL) de nitrobenzeno e 11,79 mL de ácido sulfúrico concentrado foi aquecida suavemente. Depois da primeira reação vigorosa, a mistura foi fervida durante 7 horas. O nitrobenzeno foi removido em vácuo. Foi adicionada água. A solução aquosa foi acidificada com ácido acético glacial, e o precipitado castanho escuro separou-se, o qual foi purificado por cromatografia "flash" (gel de silica, petróleo/acetato de etilo = 12/1) para proporcionar 0 composto mencionado em título na forma dum sólido branco (9, 72 g, 63,7%) .

Passo 2: Éster de terc-butilo do ácido (8-fluoro-quinolin- -6-il)-acético

Sob N2, 20 mL de tetra-hidrofurano e 0,5 mL (3,9 mmol) de clorotrimetilsilano foram adicionados a 5,2 g (80 mmol) de zinco em pó. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 min. Uma solução de 5,9 mL (40 mmol) de 2-bromoacetato de terc-butilo em 50 mL de tetra-hidrofurano foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada a 42 °C-45 °C durante 20 min. Isto foi deixado arrefecer até 25 °C para se obterem 7 6 mL de uma solução 0,52 M do reagente de Reformatsky de terc-butilo. A uma solução de 6-bromo-8-fluoro-quinolina (1,04 g, 4,6 mmol) em 1 mL de tetra-hidrofurano foi adicionada uma solução de reagente de zinco acima (20 mL, 10,4 mmol), seguido por 84 ΡΕ2081937

Pd(PPh3)4 (0,58 g, 0,5 mmol) . A mistura foi colocada no reator de micro-ondas durante 35 min para alcançar a temperatura de 120 °C. Em seguida, a reação foi extinta com NH4C1 aq° sat° (60 mL) e a mistura foi extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para produzir o composto mencionado em título (0,78 g, 65%).

Passo 3: Ácido (8-fluoro-quinolin-6-il)-acético 0,5 g de éster de terc-butilo do ácido (8-fluoro- -quinolin-6-il)-acético com 2,0 mL de solução aqa 4 N de hidróxido de sódio foi aquecido a 90 °C durante 3 h. Após arrefecimento a mistura reacional foi extraída com acetato de etilo. A camada aquosa foi tornada acídica com ácido acético e filtrada para produzir o composto mencionado em título na forma de um sólido esbranquiçado (0,24 g, 61%). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,91-8,93 (m, 1H), 8,37-8,40 (m, 1H), 7,51-7,69 (m, 3H) , 3,80 (s, 2H); ES-MS m/z: 206,2 (M++l) .

Intermediário 19: Éster de metilo do ácido (3-bromo-quinolin-6-il)-acético

A uma solução agitada de ácido quinolin-6-il--acético (Passo 1, Intermediário 11) (21,6 g, 107 mmol) em 150 mL de tetracloreto de carbono foi adicionado bromo 85 ΡΕ2081937 (34,4 g, 215 mmol) e aquecida em refluxo durante 4 horas. A mistura reacional foi em seguida diluida com 17,0 g de piridina, e agitada ainda durante 2 horas sob refluxo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura foi repartida entre diclorometano e hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado. A camada orgânica foi lavada com água e em seguida água salgada, seca sobre sulfato de magnésio em seguida evaporada sob pressão reduzida para dar um residuo castanho. O residuo foi purificado via cromatografia em coluna com petróleo (60-90 °C), e em seguida a solvente misto 30/1 de petróleo e acetato de etilo para dar o composto mencionado em titulo (13,6 g, 45,3%) na forma dum sólido cristalino branco. (300 MHz, DMSO-d6) : 8,89 (d, 1H) , 8,27 (d, 1H) , 8,06 (d, 1H) , 7, 67-7, 64 (m, 2H) , 3,82 (s, 2H) , 3,72 (s, 3H) . ES-MS m/z: 280 (M+H+) , 360 (M+H+) .

Intermediário 20: Ácido (3-bromo-quinolin-6-il)-acético HO. /-v ,Sr ir | h

Uma mistura de éster de metilo do ácido (3-bromo--quinolin-6-il)-acético (14,8 g, 52,8 mmol) e NaOH aquoso 2 N (80 mL, 160 mmol) foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas até a mistura reacional se tornar limpida. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura reacional foi lavada com diclorometano e em seguida a camada de água foi acidificada com ácido clorídrico 86 ΡΕ2081937 concentrado até pH 4. Um precipitado branco foi separado por filtração, agitado em metanol refluxante, filtrado e seco em vácuo para dar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (10,3 g, 73,5%) . (300 MHz, DMSO- d6) : 12,52 (b, 1H) , 8,91 (d, 1H), 8, ,69 (d, 1H) , 7, 99 (d, 1H) ) , 7,82-7,70 (m, 2H), 3, 80 (s, 2H) . ES-MS m/z: 266 (M+H+) .

Intermediário 21: l-Etil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1H- -pirazole SW-w"

Svj'

Preparado de acordo com o procedimento descrito em Journal of Heterocyclic Chemistry, 41(6) (2004) 931-939.

Intermediário 22: Ácido (lH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-acético

O

r\.H / o

fW

H

Preparado de acordo com o procedimento descrito em Journal of the American Chemical Society, 78 (1956) 1247-51. ΡΕ2081937 87

Intermediário 23 : (6—Metil—piridazin—3—il)—hidrazina

HâC„. N

Preparado de acordo com o procedimento descrito em Australian Journal of Chemistry, 30(10) (1977) 2319-22.

Intermediário 24: 3-(6-Hidrazino-piridazin-3-il)-benzonitrilo

H

Passo 1: 3-(6-Cloro-piridazin-3-il)-benzonitrilo Gás azoto foi borbulhado através duma mistura de ácido 3-cianofenil-borónico (90,0 g, 612 mmol), 3,6-di-cloropiridazina (1,2 eq, 109,4 g, 735 mmol), carbonato de potássio (3,0 eq, 253,5 g, 1,836 mol) em 1,4-dioxano (900 mL) e água (360 mL) durante 15 minutos. Após aquele tempo aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]-paládio (II) diclorometano (0,06 eq, 26,8 g, 36,7 mmol) foi adicionado. O azoto borbulhou ao longo de mais outros 10 min e em seguida a mistura foi aquecida a 90 °C durante 3 horas. A reação foi arrefecida e a maior parte do 1,4--dioxano foi removido sob vácuo. A mistura foi recebida em diclorometano e lavada com água três vezes. A camada orgânica foi concentrada e o residuo foi purificado por ΡΕ2081937 cromatografia em coluna para proporcionar o composto mencionado em titulo (60 g, 45,5% de rendimento) na forma dum sólido branco. 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 8,58-8,59 (m, 1H), 8,44-8,52 (m, 2H) , 8,09-8, 12 (d, 1H) , 8,02-8,05 (d, 1H), 7,76-7,81 (m, 1H); MS (m/z) 216,1 (M++l) .

Passo 2: 3-(6-Hidrazino-piridazin-3-il)-benzonitrilo

Uma solução de 3-(6-cloro-piridazin-3-il)-benzonitrilo (75,6 g, 350 mmol) em 900 mL de piridina seca foi arrefecida num banho de gelo e 119,2 mL de hidrato de hidrazina foi adicionado. O arrefecimento foi continuado de maneira a manter a temperatura abaixo de 30 °C momento em que agulhas amarelas se separaram. A mistura foi em seguida aquecida a 65 °C e agitada durante a noite. Em seguida a mistura foi concentrada e o resíduo foi lavado com água e metanol para proporcionar o composto mencionado em título (60 g, 81%) na forma de um sólido amarelo. 1H-RMN (300 MHz, DMS0-d6) : δ 8,38-8,39 (m, 1H) , 8,32-8,35 (m, 1H) , 8,24 (s, 1H) , 7, 97-8, 00 (d, 1H) , 7,82-7,85 (m, 1H) , 7, 64-7, 69 (m, 1H) , 7,09-7,12 (d, 1H) , 4,39 (s, 2H) ; MS (m/z) 212,1 [M++l] .

Intermediário 25: l-{2-[4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)--pirazol-l-il]-etil}-piperidina ΡΕ2081937 89 A um frasco de micro-ondas de 5 mL foram adicionados 2 mL de dimetilformamida para dissolver 150 mg (0,773 mmol) de 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,2,3]dioxaborolan--2-il)-ΙΗ-pirazole. Após a adição de 2 eq (1,546 mmol) de 1-(2-cloro-etil)-piperidina a mistura reacional foi aquecida a 190 °C num micro-ondas (Personel Chemistry, Emrys Optimizer) durante uma hora. Água (5 mL) foi em seguida adicionada à mistura reacional e extraida com acetato de etilo (2x3 mL) . As fases orgânicas foram combinadas e secas sobre sulfato de sódio. O solvente foi removido em vácuo para proporcionar o composto mencionado em titulo o qual foi usado no passo seguinte sem demais purificação.

Intermediário 2 6: 2-Fluoro-4-(6-hidrazino-piridazin-3-il)-N-metil-benzamida

O p í*> II

H

Passo 1: 4-(6-Cloro-piridazin-3-il)-2-fluoro-N-metil- -benzamida Gás azoto foi borbulhado através duma mistura de 4-ácido borónico-2-fluoro-N-metil-benzamida (50 g, 254 mmol), 3,6-dicloropiridazina (1,02 eq, 38,6 g, 259 mmol), carbonato de potássio (3,0 eq, 105,2 g, 761 mmol) em 1,4-dioxano (500 mL) e água (200 mL) durante 15 minutos. Após aquele 90 ΡΕ2081937 tempo aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]-paládio (II) diclorometano (0,06 eq, 15,0 mmol, 11,0 g) foi adicionado. Azoto foi borbulhado ao longo de mais outros 10 min e em seguida a mistura foi aquecida a 90 °C durante 3 horas, oi arrefecida e a maior parte do dioxano removido em vácuo. A mistura foi recebida em diclorometano e lavada com água três vezes. A camada orgânica foi concentrada e o residuo foi purificado por cromatografia em coluna para proporcionar o composto mencionado em titulo (27,1 g; 40% de rendimento) na forma dum sólido branco. 1H-RMN (300 MHz, CDC13) : δ (ppm) : δ 8,24-8,30 (m, 1H) , 7,96-8,01 (m, 1H) , 7,83-7,87 (m, 2H) , 7,61-7,64 (d, 1H) , 6, 80-6, 84 (m, 1H) 3, 06-3, 08 (m, 3H) ; MS (m/z) : 266, 1 [M++l].

Passo 2: 2-Fluoro-4-(6-hidrazino-piridazin-3-il)-N-metil- -benzamida

Uma solução de 34 g (128 mmol) de 4-(6-cloro--piridazin-3-il)-2-fluoro-N-metil-benzamida em 500 mL de piridina seca foi arrefecida num banho de gelo e 43,5 mL de hidrato de hidrazina foi adicionado. O arrefecimento foi continuado de maneira a manter a temperatura abaixo de 30 °C, momento em que se separaram agulhas amarelas. A mistura foi em seguida aquecida a 65 °C e agitada durante a noite. A mistura foi filtrada e o sólido lavado com água e metanol para proporcionar o composto mencionado em titulo (28,8 g, 84% de rendimento) na forma de um sólido amarelo claro. 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) : δ (ppm): 8,27 (s, 2H) , ΡΕ2081937 91 7, 96-7,99 (d, 1H) , 7,86-7,92 (m, 7, 09-7,12 (d, 1H) , 4,42 (s, 2H) 2H) , 7,69-7,75 2,78-2,80 (d, (m/z) : 2 62,1 [M++l]. (m, 1H) ,

3H); MS

Intermediário 27: Éster de metilo do ácido (3-bromo-quinolin-6-il)-acético

A uma solução agitada de ácido quinolin-6-il--acético (21,6 g, 107 mmol) em 150 mL de tetracloreto de carbono foi adicionado bromo (34,4 g, 215 mmol) e aquecida em refluxo durante 4 horas. A mistura reacional foi em seguida diluida com 17,0 g de piridina e agitada ainda durante 2 horas sob refluxo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura foi repartida entre diclorometano e hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado. A camada orgânica foi lavada com água, em seguida água salgada, seca sobre sulfato de magnésio e em seguida evaporada sob pressão reduzida para dar um resíduo castanho. O residuo foi purificado via cromatografia em coluna com petróleo (60-90 °C), e em seguida um solvente misto 30/1 de petróleo e acetato de etilo para dar o composto mencionado em titulo (13,6 g, 45%) na forma dum sólido cristalino branco. (300 MHz, DMSO-d6) : 8,89 (d, 1H) , 8,27 (d, 1H), 8,06 (d, 1H) , 7, 67-7, 64 (m, 2H) , 3,82 (s, 2H), 3,72 (s, 3H). ES-MS m/z: 280 (M+H+). 92 ΡΕ2081937

Intermediário 28:

Hidrazida do ácido (3-bromo-quinolin-6-il)-acético

H

A uma mistura de ácido (3-bromo-quinolin-6-il)--acético (5 g, 18,9 mmol) em metanol (100 mL) foi adicionado ácido sulfúrico concentrado (1 mL) e a mistura aquecida em refluxo durante 16 horas. 0 aquecimento foi removido e sulfato de sódio (20 g) foi adicionada e a mistura filtrada. Ao filtrado foi em seguida adicionado mono-hidrato de hidrazina (3,2 mL) e a mistura foi aquecida em refluxo durante mais 16 horas. A mistura foi em seguida deixada arrefecer até à temperatura ambiente e em seguida foi adicionada água (60 mL) e o precipitado formado foi recolhido via filtração e seco para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (4,72 g, 16, 9 mmol, 90% de rendimento) . 1H-RMN 500 MHz (DMSO-d6) 3,57 (2H, s) , 4,26 (2H, d) , 7,72 (1H, dd) , 7,80 (1H, d), 7, 97 (1H, d) , 8, 69 (1H, d) , 8, 90 (1H, d), 9,35 (1H, bs). ES-MS m/z: 280 (M+H+ ) ·

Intermediário 29: Ácido (3-bromo-quinolin-6-il)-acético

Uma mistura de éster de metilo do ácido (3-bromo--quinolin-6-il)-acético (14,8 g, 52,8 mmol) e NaOH aquoso 93 ΡΕ2081937 2 Ν (80 mL, 160 mmol) foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas até a mistura reacional se tornar límpida. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura reacional foi lavada com diclorometano e em seguida a camada de água foi acidificada com ácido clorídrico concentrado até pH 4. Um precipitado branco foi separado por filtração, agitado em metanol refluxante, filtrado e seco em vácuo para dar o composto produto mencionado em título na forma dum sólido branco (10,3 g, 74%). (300 MHz, DMSO-d6) : 12,52 (b, 1H) , 8,91 (d, 1H) , 8,69 (d, 1H) , 7,99 (d, 1H) ) , 7,82-7,70 (m, 2H) , 3,80 (s, 2H) . ES-MS m/z: 266 (M+H+) .

Intermediário 30: Ácido [3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acético

::N J-f /"Αν νγ í 1 í O 1 ν,ν-Α]' o υ de mi n-ch3 adicionado ácido (3-bromo-quinolin-6-il)-acético (1 g, 3,77 mmol), l-metil-4-pirazole-éster de pinacol do ácido borónico e 1,4-dioxano (10 mL). Azoto foi borbulhado através da mistura durante 10 minutos. Carbonato de potássio (1,56 g, 11,3 mmol) e água (5 mL) foram em seguida adicionados e foi borbulhado azoto através duma mistura durante mais três minutos. Após aquele tempo, diclorobis-(trifenilfosfina)paládio (138 mg, 0,19 mmol) foi adicionado, o frasco foi vedado e aquecido num micro-ondas durante 1250 segundos a 130 °C. A mistura foi em seguida filtrada 94 ΡΕ2081937 através de Celite, que foi lavada com água e bicarbonato de sódio aquoso saturado. 0 1,4-dioxano na solução foi removido em vácuo e a solução aquosa restante foi lavada com diclorometano três vezes. A camada de água foi acidificada até pH 6 usando ácido clorídrico 4 M e o precipitado formado foi recolhido via filtração e seco para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido esbranquiçado. (500 MHz, DMSO-d6) : ES-MS m/z: 268 (M+H+) .

Intermediário 31: Éster de metilo do ácido [3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- -quinolin-6-il]-acético

A uma solução de ácido [3-(l-metil-lH-pirazole-4--il)-quinolin-6-il]-acético (2,4 g, 8,6 mmol) e metanol (12 mL) a 0 °C foi adicionado cloreto de tionilo (2 eq, 17,2 mmol) num modo gota a gota. A mistura reacional foi em seguida aquecida a 60 °C durante uma hora. O solvente foi removido em vácuo e usado no passo seguinte sem purificação adicional. MS m/z: 282 (M+H+) . INTERMEDIÁRIO 32 :

Hidrazida do ácido [3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6- -il]acético

ΡΕ2081937 95

Uma solução de éster de metilo do ácido [3 — (1 — -metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acético (8,6 mmol) e hidrazina (80,6 mmol) em metanol (75 mL) foi aquecida a 55 °C durante uma hora antes duma segunda adição de hidrazina (80,6 mmol) ser adicionada e a reação aquecida a 55 °C durante mais 16 horas. Após aquele tempo, a mistura foi arrefecida até 0 °C e o precipitado resultante recolhido via filtração e lavado com metanol frio e seco para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (1,74 g, 70%) . 1H-RMN 500 MHz (DMSO-d6) : ES-MS m/z: 282 (M+H+) .

Intermediário 33: Éster de metilo do ácido (3-bromo-5,7-difluoro-quinolin-6- -il)-acético Ψ

A uma solução de ácido (5,7-difluoro-quinolin-6--il)-acético (18,6 g, 83,4 mmol) em metanol (200 mL) foi adicionado H2S04 conc. (4,7 mL, 87,0 mmol). A mistura reacional foi concentrada para dar um resíduo castanho, o qual foi diluido com 200 mL de acetato de etilo, lavado com NaHC03 aq° sat° e água salgada, em seguida a camada orgânica foi seca sobre Na2SC>4 anidro e concentrada para dar éster de metilo do ácido (7-fluoro-quinolin-6-il)--acético na forma dum sólido amarelo (17,7 g, rendimento de ΡΕ2081937 96

Intermediário 34 :

Cloreto de (5,7—difluoro—quinolin—6—il)—acetilo Ácido (5,7-difluoro-quinolin-6-il)-acético (1 g, 4,48 mmol) foi adicionado a um balão de fundo redondo seco no forno e suspenso em diclorometano (18 mL) . A suspensão foi mantida sob atmosfera de azoto e arrefecida até 0 °C. A seguir, cloreto de oxalilo (470 pL, 5,38 mmol) foi adicionado lentamente, seguido por uma quantidade catalítica de dimetilformamida. A solução foi deixada aquecer até à temperatura ambiente ao longo de 2 horas. A solução foi em seguida concentrada em vácuo e seca via destilação azeotrópica com tolueno para produzir o composto mencionado em título. ES-MS m/z: 238 (M+H+) de éster de metilo.

Intermediário 35: Ácido (3-Bromo-5,7-difluoro-quinolin-6-il)-acético

F Y~Y Y'Y ° H<X ^ A ^ ^Br

Passo 1: Preparação de éster de metilo do ácido (3-bromo--5,7-difluoro-quinolin-6-il)-acético A uma mistura de éster de metilo do ácido (5,7--difluoro-quinolin-6-il)-acético (35,3 g, 148,9 mmol) e piridina (24 mL, 298 mmol) em 300 mL de tetracloreto de 97 ΡΕ2081937 carbono foi adicionado bromo (15,3 mL, 298 mmol) de uma maneira gota a gota. A mistura foi aquecida em refluxo durante 2 h antes de ser arrefecida até à temperatura ambiente. 0 liquido no recipiente foi decantado e lavado com NaHCCb e água. 0 sólido escuro no fundo do recipiente foi tratado com NaHCCb e diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas (Na2SC>4) e evaporadas até à secura. 0 produto cru foi purificado via cromatografia em coluna "flash" eluindo com éter de petróleo/acetato de etilo (40/l~3/l) para proporcionar 31,5 g (67% de rendimento) do composto mencionado em titulo na forma dum sólido cristalino branco. 1H-RMN (DMS0-d6): δ 8,92 (d, 1H) , 8,50 (d, 1H) , 7,57-7,61 (m, 1H) , 3,91 (s, 2H), 3,75 (s, 3H).

Passo 2: Preparação de ácido (3-bromo-5,7-difluoro-quino- lin-6-il)-acético

Uma suspensão de éster de metilo do ácido (3-bromo-5,7-difluoro-quinolin-6-il)-acético (10,0 g, 31,6 mmol) em 48 mL de NaOH aquoso (2 N) foi aquecida em refluxo durante 2 h e em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura foi lavada com diclorometano (50 mL><2) e a fase aquosa foi acidificada com ácido clorídrico 5 N até pH 4. O precipitado branco foi recolhido via filtração, lavado com água e seco. 9, 6 g do composto mencionado em titulo foi obtido na forma de pó branco com 100% de rendimento. 1H-RMN (DMSO-d6) : δ 12,87 (s, 1H) , 9,05 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 7,75-7,79 (d, 1H) , 3,87 (s, 2H) . LC-MS: 303 (M++l) . 98 ΡΕ2081937

Intermediário 3 6 : Ácido [5,7-difluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6- -il]-acético

A um frasco de micro-ondas de 20 mL foram adicionados éster de metilo do ácido (3-bromo-2,4-difluoro--quinolin-6-il)-acético (1 g, 3,16 mmol), l-metil-4-(4,4,-5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (1,2 eq, 3,79 mmol, 788 mg) e 1,4-dioxano (10 mL) . Azoto foi borbulhado através duma agulha, em seguida carbonato de potássio (3 eq, 9,49 mmol) e água (5 mL) foram adicionados e foi borbulhado azoto através da mistura durante 3 minutos. Diclorobis(trifenilfosfina)-paládio (138 mg, 0,19 mmol) foi adicionado e a mistura foi aquecida durante 1250 segundos a 130 °C. A mistura foi filtrada através de Celite e lavada com água e bicarbonato de sódio aquoso saturado. O 1,4-dioxano foi em seguida removido em vácuo e a camada de água foi extraída com diclorometano três vezes. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e o solvente removido em vácuo. O material cru foi carregado sobre sílica em seguida purificado sobre «isco» usando um gradiente de diclorometano, metanol (metanol 0 a 10%) para se obterem 508 mg de material amarelo claro com um rendimento de 50%. MS: m/z 318,0 (M+H+) . 99 ΡΕ2081937

Intermediário 37 :

Hidrazida do ácido [5,7-difluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4--il)-quinolin-6-il]-acético

A um frasco de 40 mL foi adicionado metanol (12 mL), éster de metilo do ácido [5,7-difluoro-3-(1-metil--lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acético (508 mg, 1,6 mmol) e hidrazina anidra (4 eq, 6,4 mmol). Após 1 hora a 55 °C uma segunda porção de hidrazina (4 eq, 6,4 mmol) foi adicionada e a reação foi aquecida a 55 °C durante mais 1 hora. A mistura reacional foi arrefecida até à temperatura ambiente, filtrada e lavada com metanol frio. O produto foi seco para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido branco (425 mg, 83% de rendimento). MS: m/z 318,0 (M+H+) .

Intermediário 38: Éster de metilo do ácido (7-fluoro-quinolin-6-il)-acético

A uma solução de ácido (7 — fluoro-quinolin-6-il)--acético (13,4 g, 65,36 mmol) em metanol (140 mL) foi adicionado H2S04 cone. (3,5 mL, 68,63 mmol). A mistura reacional foi concentrada para dar um resíduo castanho, o qual foi diluído com 100 mL de acetato de etilo, lavado com em

NaHC03 aq° sat° e água salgada seguida a camada 100 ΡΕ2081937 orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro e concentrado para dar éster de metilo do ácido (7 — fluoro-quinolin-6-il) --acético na forma dum sólido amarelo (14,0 g, rendimento de 98%) .

Intermediário 39:

Acido (3-bromo-7-fluoro-quinolin-6-il)-acético

Passo 1: Preparação de éster de metilo do ácido (3-bromo- -7-fluoro-quinolin-6-il)-acético A uma mistura de éster de metilo do ácido (7-flu- oro-quinolin-6-il)-acético (14,0 g, 63,9 mmol) e piridina (10,4 mL, 127,8 mmol) em 200 mL de tetracloreto de carbono foi adicionado bromo (6,6 mL, 127,8 mmol) de uma maneira gota a gota. A mistura foi aquecida em refluxo durante 2 h antes de ser arrefecida até à temperatura ambiente. O liquido no recipiente foi decantado e lavada com NaHCCq e água. 0 sólido escuro no fundo do recipiente foi tratado com NaHCCq e diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas (Na2S04) e evaporadas até à secura. O produto cru foi purificado via cromatografia em coluna "flash" eluindo com éter de petróleo/acetato de etilo (40/l~3/l) para proporcionar 13,9 g (75% de rendimento) do composto mencionado em titulo na forma dum sólido cristalino branco. 1H-RMN (DMSO-d6) : δ 8,89 (s, 1H) , 8,27 (m, 1H) , 7, 66-7,74 (m, 2H) , 3,87 (s, 2H) , 3,74 (s, 3H) . 101 ΡΕ2081937

Passo 2: Preparação de ácido (3-bromo-7-fluoro-quinolin-6- -il)-acético

Uma suspensão de éster de metilo do ácido (3--bromo-7-fluoro-quinolin-6-il)-acético (13,9 g, 46,5 mmol) em 72 mL de NaOH aquoso (2 N) foi aquecida em refluxo durante 2 h e em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura foi lavada com diclorometano (50 mL><2) e a fase aquosa acidificada com ácido clorídrico 5 N até pH 4. 0 precipitado branco foi recolhido via filtração, lavado com água e seco. 11,0 g do composto mencionado em título foi obtido na forma de pó branco com 83,3% de rendimento. 1H-RMN (DMSO-d6) : δ 12,64 (s, 1H) , 8,94-8,95 (d, 1H) , 8,72-8,72 (m, 1H) , 7, 94-7, 97 (d, 1H) , 7,77-7,81 (d, 1H) , 3,85 (s, 2H) . LC-MS: 283, 9 (M++l) .

Intermediário 40: Ácido [7-fluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il] acético 1 ]i .. Gás azoto foi borbulhado através duma suspensão de ácido (3-bromo-7-fluoro-quinolin-6-il)-acético (5 g, 17,7 mmol), l-metil-4-pirazole-éster de pinacol do ácido borónico (3,86 g, 18,6 mmol), carbonato de potássio (7,3 g, 53 mmol) em 1,4-dioxano (50 mL) e água (20 mL) durante 10 minutos. Após aquele tempo, diclorobis(trifenilfosfina)- 102 ΡΕ2081937 paládio (II) (248 mg, 0,35 mmol) foi adicionado e a mistura aquecida em refluxo durante 3 horas. A fase aquosa foi removida via pipeta, diluída com carbonato de potássio aquoso 2 N (15 mL) e lavada com acetato de etilo (2><30 mL) . A fase aquosa foi em seguida acidificada até pH 3 com ácido clorídrico concentrado. O precipitado formado foi recolhido via filtração e lavado com água e seco para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido branco (4,2 g, 14 ,7 mmo1, 8 3 % de rendimento) . 1H-RMN 500 MHz (DMSO -d6) i : δ 3 ,84 (2H, s! ), 3, 92 (3H, s), 7,71 (1H, d) , 7, 90 (1H, d) , 8 ,10 (1H, s), 8,39 (1H, s), 8 ,47 (1H, d) , 9, 18 (1H, d) . ES -MS m/z: 286 (M+H+ ) ·

Intermediário 41:

Hidrazida do ácido [7-fluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il) -quinolin-6-il]acético H ,N h2n γ Ò J J F ^ N mistura de ácido iwN~CHã -pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acético (4 g, 14,0 mmol) em metanol (80 mL) foi adicionado ácido sulfúrico concentrado (0,8 mL) e a mistura foi aquecida em refluxo durante 16 horas. O aquecimento foi removido e sulfato de sódio (20 g) foi adicionado e a mistura filtrada. Ao filtrado foi em seguida adicionado mono-hidrato de hidrazina (3,2 mL) e a mistura aquecida em refluxo durante mais 16 horas. A mistura foi em seguida deixada arrefecer até à temperatura 103 ΡΕ2081937 ambiente em seguida água foi adicionada (60 mL) e o precipitado formado foi recolhido via filtração e seco para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido cinzento claro (3,51 g, 11,7 mmol, 84% de rendimento). 1H-RMN 500 MHz (DMSO- -d6) 3, 63 (2H, s) , 3, 91 (3H, s), 4,28 (2H, d) , 7, 69 (1H, d) , 7,88 (1H, d) , 8, 09 (1H, s), 8,38 (1H, s) , 8,47 (1H, d) , 9,16 (1H, d) , 9, 32 (1H, bs) . ES-MS m/z: 300 (M+H+) .

Intermediário 42: 3-Cloro-6-iodo-piridazina 01 vs

tsx X A um frasco de 40 mL foram adicionados 2,5 g de 3,6-dicloropiridazina (16,9 mmol) seguido por 12,5 mL de ácido iodidrico e 3,75 g de iodeto de potássio. A mistura reacional foi aquecida a 40 °C durante três horas e em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura reacional foi vertida em gelo contando NaOH 10 M e o precipitado formado foi recolhido via filtração e seco para proporcionar o composto mencionado em título (2,36 g, 60%). MS: m/z 340,9.

Intermediário 43: 3-Cloro-6-trifluorometil-piridazina 104 ΡΕ2081937 A um balão de fundo redondo de 200 mL um grama (4,16 mmol) de 3-cloro-6-iodo-piridazina foi combinado sob azoto com 1,5 eq de iodeto de cobre (6,24 mmol), 2 eq (8,32 mmol) de fluoreto de potássio e 2 eq (8,32 mmol) de dicloro-fluoro-acetato de metilo em 75 mL de dimetilforma-mida. A mistura reacional foi aquecida a 115 °C durante 16 horas. O solvente foi removido em vácuo e o sólido repartido entre diclorometano e água (150 mL) . A emulsão formada foi filtrada através de Celite e a camada orgânica seca sobre sulfato de sódio. A camada orgânica foi carregada sobre gel de silica e purificada sobre gel de silica eluindo com acetato de etilo 0% até acetato de etilo 50% em hexanos para proporcionar o composto mencionado em titulo (150 mg, 20%). MS: m/z 183,1.

Intermediário 44: 4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1-(2--trimetilsilanil-etoximetil)-lH-pirazole , ,CH3 ^ch3 ch3

H3O

PB h3c ;

Vo H3c ch3 O composto mencionado em titulo foi preparado pelo método descrito por Timothy J. Guzi, Kamil Paruch, Michael P. Dwyer, Marc Labroli, Kartik M. Keertikar, Preparation of novel pyrazolopyrimidines as cyclin dependent kinase inhibitors, Publ. Ped. Pat. E.U.A. (2007), pp 144, US2007072881, fazendo alterações não críticas. ΡΕ2081937 105

Intermediário 45:

Ester de terc-butilo do ácido 4-[4-(4,4,5,5-tetrametil--[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-pirazol-l-il]-piperidina-1- -carboxílico ch3 HsC-4-ο h3c^/. h3c'

N À. o N o’ i ch3 CHj 0 composto mencionado em título foi preparado pelo método descrito por Jingrong Jean Cui, Lee Andrew Funk, Lei Jia, Pei-Pei Kung, Jerry Jialun Meng, Mitchell David Nambu, Mason Alan Pairish, Hong Shen, Michelle Bich Tran-Dube, Preparation of pyrazole-substituted amino-heteroaryl compounds as c-Met protein kinase inhibitors for use against câncer and other abnormal cell growth disorders, Ped. Int. PCT (2006), pp 185, W02006021881, fazendo alterações não críticas.

Intermediário 4 6: 1-(2-Metoxi-etil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]-dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole °'CH;

•N yH H3C λ

U-Q h3c-í b h3c-)--(5 h3c O composto mencionado em título foi preparado pelo método descrito por Alexandre V. Ivachtchenko, Dmitry 106 ΡΕ2081937 V. Kravchenko, Valentina I. Zheludeva, Dmitry G. Pershin, Synthesis of pinacol esters of l-alkyl-lH-pyrazol-5-il- and l-alkyl-lH-pyrazol-4-ylboronic acids, in Journal of Heterocyclic Chemistry, 41(6) (2004) 931-939, fazendo alterações não críticas.

Intermediário 47: 1-[4-(4,4,5-Trimetil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-pirazol-1- -il]-butan-2-ona

Pirazole-4-éster de pinacol do ácido borónico (1 g, 1 eq, 5,15 mmol) foi dissolvido em dimetilformamida (15 mL) seguido pela adição de CS2CO3 (0,86 g, 1,5 eq, 7,73 mmol) e l-bromo-2-butanona (1,1 eq, 5,67 mmol, 0,86 g). A mistura foi aquecida a 90 °C durante a noite. A reação foi extraída em acetato de etilo e lavada com água (3χ) e água salgada (3χ) . O filtrado foi concentrado em vácuo sobre gel de sílica e purificado por cromatografia "flash" (Si02, CH2C12:CH30H 100:0-80:20) para proporcionar o composto mencionado em título (0,19 g, 14% de rendimento). 1H-RMN 500 MHz (DMSO) δ 0,97 (3H, t) 1,26 (12H, s) , 2,50 (2H, q) , 4,71 (2H, s), 7,65 (1H, s), 8,04 (1H, s). MS m/z 265 (M+H+) +. ΡΕ2081937 107

Intermediário 48: 3-[4-(4,4,5,5—Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-pirazol- -1-il]-propionitrilo

HSC Λ F 'B'Λ-Ò H*C CHg

N -Kv ,N-“\

-CN

Pirazole-4-éster de pinacol do ácido borónico (1 g, 1 eq, 5,15 mmol) foi dissolvido em dimetilformamida (15 mL) seguido pela adição de Cs2C03 (0, 86 g, 1,5 eq, 7,73 mmol) e 3-cloropropionitrilo (1,1 eq, 5,67 mmol, 0,44 mL). A mistura foi aquecida a 90 °C durante a noite. A reação foi diluída com acetato de etilo e lavada com água (3χ) e água salgada (3*). As fases orgânicas foram concentradas em vácuo sobre gel de sílica e purificadas por cromatografia "flash" (Si02, 0Η20ΐ2:0Η30Η 100:0-90:10) para proporcionar o composto mencionado em título (0,11 g, 9%). 1H-RMN (500 MHz, DMSO) : δ 1,26 (12H, s) , 3,07 (2H, t), 4,40 (2H, t), 7,65 (1H, s), 8,04 (1H, s) . MS m/z 248 (M+H+) + .

Intermediário 4 9: Éster de terc-butilo do ácido 3-(4-bromo-pirazol-l-il)- -azetidina-l-carboxilico

Intermediário 50: Éster de terc-butilo do ácido 3-(4-bromo-pirazol-l-il-metil)-azetidina-l-carboxilico; e Intermediário 51: 2-(4-Bromo-pirazol-l-il)-etanol ΡΕ2081937 108

kx~N 51 49 50

Os Intermediários 49, 50, 51 foram preparados pelos métodos descritos por Jingrong Jean Cui, Lee Andrew Funk, Lei Jia, Pei-Pei Kung, Jerry Jialun Meng, Mitchell David Nambu, Mason Alan Pairish, Hong Shen, Michelle Bich Tran-Dube, Preparation of pyrazole-substituted aminohetero-aryl compounds as c-Met protein kinase inhibitors for use against câncer and other abnormal cell growth disorders, Ped. Int. PCT (2006), pp 185, W02006021881, fazendo alterações não criticas.

Intermediário 53: l-Etil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1H- -pirazole

r o h3c O composto mencionado em titulo foi preparado pelo método descrito por Alexandre V. Ivachtchenko, Dmitry V. Kravchenko, Valentina I. Zheludeva, Dmitry G. Pershin, Synthesis of pinacol esters of l-alkyl-lH-pyrazol-5-yl- and l-alkyl-lH-pirazol-4-ylboronic acids, in Journal of Heterocyclic Chemistry, 41(6) (2004) 931-939, fazendo alterações não criticas. 109 ΡΕ2081937

Intermediário 54 : Éster de etilo do ácido 1-(4-iodo-pirazol-l-il) -ciclobutanocarboxilico Λ CHa A uma solução de iodopirazole (2,93 g, 15,09 mmol) em dimetilformamida (25 mL) foi adicionado NaH (60% em óleo, 724 mg, 30,18 mmol) enquanto foi borbulhado azoto através da solução e a mistura agitada sob azoto durante 30 min. Uma solução de éster de etilo do ácido 1-bromo-ciclobutanocarboxílico (1,95 mL, 12,07 mmol) foi adicionada lentamente e a solução foi agitada durante a noite. Acetato de etilo foi adicionado à reação para extrair o produto. A camada de acetato de etilo foi lavada com água (3*) e água salgada (3x) e seca sobre sulfato de sódio. O filtrado foi concentrado em vácuo sobre gel de silica e purificado por cromatografia "flash" (SÍO2, hexanos:acetato de etilo 100:0-75:25) para proporcionar o composto mencionado em titulo (0,71 g, 15% de rendimento). 1H-RMN (DMSO): δ 1,15 (t, 3H), 1,90-2,04 (m, 2H), 2,69-2,77 (m, 2H) , 4,10 (q, 2H) , 7,59 (s, 1H) , 8,13 (s, 1H) . MS m/z=321 (M+H+) +.

Intermediário 55: 3-Cloro-6-vinil-piridazina

.-A ,N„

N 'Cí ΡΕ2081937 110

Uma mistura de 3, 6-dicloropiridazina (6 g, 40,3 mmol), éster de pinacol do ácido vinilborónico (6,21 g, 6,83 mL, 40,3 mmol), carbonato de potássio (120 mmol, 16,7 g), 1,4-dioxano (60 mL) e água (24 mL) foi desgaseada durante 15 min com gás azoto. Aducto de dicloro[1,1r -bis(difenilfosfino)ferroceno]paládio (II) diclorometano (0,4 mmol, 292 mg) foi em seguida adicionado e a mistura aquecida a 80 °C durante 4 horas. A fase aquosa foi em seguida removida via pipeta e a fase orgânica concentrada sobre gel de silica e purificada via cromato-grafia em coluna "flash" (SÍO2, hexano:acetato de etilo 100:0-60:40) para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (5,2 g, 92% de rendimento). 1H-RMN (CDCI3) : δ 5,75 (1H, d), 6,25 (1H, d), 7,05 (1H, dd) , 7,49 (1H, d), 7,59 (1H, d). MS m/z=141 (M+H+) + .

Intermediário 56: 3-Cloro-6-etil-piridazina

Uma mistura de 3-cloro-6-vinil-piridazina (1 g, 7,09 mmol), paládio sobre carbono (10% m/m, 200 mg) em acetato de etilo (14 mL) sob uma atmosfera de hidrogénio foi agitada vigorosamente à temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura foi em seguida filtrada através duma almofada de Celite e o filtrado concentrado sobre gel de silica e purificado via cromatografia em coluna "flash" 111 ΡΕ2081937 (Si02, hexano:acetato de etilo 90:10-50:50) para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (627 mg, 63% de rendimento) . 1H-RMN (CDCI3) : δ 1,27 (3H, t), 2,93 (2H, q) , 7,72 (1H, d), 7,83 (1H, d). MS m/z= 143 (M+H+) + .

Intermediário 57:

Hidrazida do ácido [5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-1H--pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-acético O //

H

Passo 1: 5-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[2,3—b]- piridina 5-Bromo-lH-pirrolo [2,3-b]piridina (1,0 g, 5,05 mmol) l-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1H--pirazole (1,17 g, 5,55 mmol) e Pd(dppf)2Cl2 (37 mg, 0,045 mmol) foram colocados num balão de fundo redondo carregado com N2. DMA (6 mL) foi adicionada ao vaso de reação e a solução foi borbulhada com N2 durante 10 minutos. K2C03 (978 mg, 7,07 mmol) foi dissolvido em água (6 mL) , borbulhado com N2 e adicionado ao vaso de reação enquanto se mantém a temperatura abaixo da temperatura ambiente com um banho de gelo/água. 0 vaso de reação foi borbulhado com N2 adicional durante 10 minutos, equipado com uma coluna de Vigreux e linha de N2 e aquecido a 75 °C durante a noite. A reação não foi completa; por conseguin- 112 ΡΕ2081937 te, l-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2--il)-ΙΗ-1-pirazole adicional (1,0 g) e Pd(dppf)2Cl2 (124 mg) foram adicionados à reação. A solução foi aquecida por um adicional de 4 horas. Após este período, foi adicionada água (12 mL) ao vaso de reação e a solução foi aquecida durante 1 hora a 60 °C. A solução foi transferida para um funil de separação com diclorometano (300 mL) e repartida a partir da camada aquosa. A camada orgânica foi seca sobre Na2SC>4, concentrada sobre gel de sílica e purificada por cromatografia "flash" (gradiente de metanol 0-10%/diclorometano) para produzir o composto mencionado em título (780 mg, 78% de rendimento). MS m/z=199 [M+H+]+.

Passo 2: Ácido [5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo-[2,3-b]piridin-3-il]-acético 5-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[2,3-b]-piridina (780 mg, 3,94 mmol) e sal de Eschenmoser (1,46 g, 7,88 mmol) foram combinados em acetonitrilo:ácido acético (19:1, 12,3 mL e 700 yL, respetivamente) e aquecidos durante 5 horas a 40 °C. A seguir, hidróxido de potássio 4 N foi adicionado até pH>9. A solução foi transferida para um funil de separação e extraída com quantidade copiosa de acetato de etilo. A camada orgânica foi seca sobre Na2SC>4 e concentrada. A seguir iodeto de metilo (246 pL, 3,94 mmol) em etanol (11 mL) foi adicionado a «gramine» e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi concentrada em vácuo e redissolvida em dimetilformamida (10 mL) e água (2 mL). Isto foi em seguida 113 ΡΕ2081937 aquecido a 70 °C durante 3 horas. A reação foi deixada voltar à temperatura ambiente, transferida para um funil de separação com acetato de etilo (250 mL) e lavada com água (2x200 mL) . As camadas aquosas foram combinadas e contra-extraidas com acetato de etilo (200 mL) . A camada orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para produzir o [5 — (1 — metil-lH-pirazol-4-il)-ΙΗ-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il] -acetonitrilo cru. Este material foi em seguida dissolvido em metanol (6 mL) e hidróxido de potássio 4 N (8 mL) e aquecido a 90 °C durante a noite. A solução foi em seguida acidificada com ácido clorídrico (aq) 1 N até se formar um precipitado. O precipitado foi em seguida filtrado e lavado com água para produzir o produto cru. O produto foi purificado por cromatografia "flash" (gradiente de metanol 0-15%/diclorometano) para produzir o composto mencionado em título (284 mg, 28%). MS m/z=251 [M+H+]+.

Passo 3: Éster de metilo do ácido [5-(1-metil-lH-pirazol- -4-il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-acético Ácido [5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo-[2,3-b]piridin-3-il]-acético (200 mg, 0,78 mmol) foi suspenso em metanol (4 mL) . A seguir, foi adicionado ácido sulfúrico (125 yL) e a solução foi aquecida em refluxo durante 2 horas. A solução foi concentrada em vácuo e o material cru foi dissolvido em diclorometano, transferido para um funil de separação e lavado com NaHCCh (aq) sat°. A camada orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada. 0 produto cru foi purificado por cromatografia "flash" 114 ΡΕ2081937 (gradiente de metanol 0-10%/diclorometano) para produzir o composto mencionado em titulo (148 mg, 70% de rendimento). MS m/z=211 [M+H+] +.

Passo 4: Hidrazida do ácido [5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)--lH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-acético Éster de metilo do ácido 5-(l-metil-lH-pirazol-4--il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-acético (148 mg, 0,55 mmol) foi dissolvido em etanol (3,0 mL) e hidrato de hidrazina (500 pL). A solução foi aquecida em refluxo durante 1 hora. A reação foi descontinuada e a solução foi deixada voltar à temperatura ambiente. O produto cristalizou e foi separado por filtração para produzir o composto mencionado em titulo (92 mg, 63% de rendimento). MS m/z=211 [M+H+]+; (DMSO-d6) 3, 88 (3H, s) , 4,21 (2H, bs), 7,27 (1H, s) , 7, 85 (1H, O \—1 k>. 00 (2H, s) , 8,42 (1H, d), 9, 17 (1H, s), 11, 37 (1H, s

Intermediário 58:

Hidrazida do ácido [6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-pirrolo-[3,2-b]piridin-l-il]-acético

N l

N

OrVNHi N

H

Passo 1: 6-Bromo-lH-pirrolo[3,2-b]piridina A uma solução de 5-bromo-2-metil-3-nitro-piridina (1,58 g, 7,28 mmol) [preparada de acordo com WO 2006/103449] em dimetilformamida (10 mL) foi adicionada 115 ΡΕ2081937

acetal dimetílico da dimetilformamida (1,65 mL, 12,37 mmol). A mistura reacional foi agitada a 100 °C durante 1 h, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada em vácuo. 0 residuo foi dissolvido em ácido acético glacial (25 mL) e pó de ferro (3,25 g, 58,24 mmol) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada a 100 °C durante 21 h, em seguida foi arrefecida até à temperatura ambiente. Metanol (25 mL) foi adicionado e a suspensão foi filtrada e lavada com metanol. O filtrado foi concentrado em vácuo. O residuo foi repartido entre bicarbonato de sódio aquoso saturado e acetato de etilo. A camada orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e adsorvida sobre gel de silica. A purificação sobre gel de silica por cromatografia "flash" usando um gradiente de acetato de etilo 0-70%/hexano proporcionou 869 mg do composto mencionado em titulo na forma de um sólido cor de marfim (60% de rendimento): ^-RMN (DMSO-d6) : δ 6,77 (s, 1H) , 7,68 (s, 1H) , 8,00 (s, 1H) , 8,36 (s, 1H) , 11,46 (s largo, 1H) ; MS (m/z) 197, 199 [M+H+] + .

Passo 2: 6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[3,2-b]- piridina A um frasco de micro-ondas carregado com N2, 6-bromo-lH-pirrolo[3,2-b]piridina (327 mg, 1,65 mmol) foi adicionada e dissolvida em DMA (2 mL). A solução foi borbulhada com N2 durante 5 minutos. A seguir, l-metil-4--(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (516 mg, 2,48 mmol) foi adicionado à solução, a qual foi 116 ΡΕ2081937 borbulhada com N2 durante um adicional de 5 minutos. K2C03 (320 mg, 2,31 mmol) foi dissolvido em água (2 mL) e a solução foi borbulhada com N2 durante 5 minutos. A solução aquosa foi adicionada ao vaso de reação e a solução foi borbulhado com N2 outra vez. Finalmente, o Pd(dppf)2Cl2 (81 mg, 0,10 mmol) foi adicionado à solução, borbulhado com N2, vedado e sujeito a micro-ondas durante 15 minutos a 130 °C. A reação foi em seguida transferida para um funil de separação com diclorometano (75 mL) e lavada com água (2x75 mL). A camada aquosa foi re-extraida com diclorometano (75 mL) . As camadas orgânicas foram combinadas, secas sobre Na2S04 e sujeitas a vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia "flash" (gradiente de 0-80% de acetonitrilo/diclorometano) para produzir o composto mencionado em titulo (200 mg, 61% de rendimento) . MS m/z=199 [M+H+] +.

Passo 3: Éster de etilo do ácido [6-(l-metil-lH-pirazol-4- -il)-pirrolo[3,2-b]piridin-l-il]-acético

Num balão de fundo redondo carregado com N2, hidreto de sódio, 60%, (41 mg, 1,01 mmol) foi suspenso em dimetilformamida (2,5 mL) . A solução foi mantida sob N2 e arrefecida a 0 °C durante 10 minutos. A seguir, 6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[3,2-b]piridina (200 mg, 1,01 mmol) foi dissolvida em dimetilf ormamida (2,5 mL) e adicionada gota a gota à solução arrefecida. A solução foi deixada em agitação a 0 °C durante mais 10 minutos. Finalmente, éster de etilo do ácido bromo-acético (123 pL, 117 ΡΕ2081937 1,11 mmol) foi lentamente adicionado ao vaso de reação. A reação foi deixada a equilibrar de volta até à temperatura ambiente, enquanto era agitada durante 2 horas. Finalmente, a solução foi transferida para um funil de separação com diclorometano (75 mL) e lavada com água (2x75 mL). A camada orgânica foi seca sobre Na2S04, concentrada e purificada por cromatografia "flash" (gradiente de 0-10% de meta-nol/diclorometano) para produzir o composto mencionado em titulo (122 mg, 43% de rendimento). MS m/z=285 [M+H+]+.

Passo 4: Hidrazida do ácido [6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- -pirrolo[3,2-b]piridin-l-il]-acético Éster de etilo do ácido [6-(l-metil-lH-pirazol-4--il)-pirrolo[3,2-b]piridin-l-il]-acético (122 mg, 0,42 mmol) foi dissolvido em etanol (1 mL) e hidrato de hidrazina (500 pL). A solução foi aquecida em refluxo durante 1 hora. A seguir a solução foi concentrada em vácuo e redissolvida numa quantidade minima de metanol quente. O produto cristalizou e foi recolhido por filtração para produzir o composto mencionado em título (114,8 mg, 99% de rendimento). MS m/z=211 [M+H+] + .

Intermediário 59: 5-(3-Bromo-quinolin-6-ilmetil)-[1,2,4]triazole-3,4-diamina H2N,

N

N

Br 118 ΡΕ2081937

Passo 1: 5-(3-Bromo-quinolin-6-ilmetil)-[1,3,4]oxadiazol- -2-ilamina

Uma mistura de hidrazida do ácido (3-bromo- -quinolin-6-il)-acético (preparada de acordo com o procedimento aqui descrito) (4,12 g, 14,7 mmol), brometo de cianogénio (1,1 eq, 16,2 mmol, 1,7 g) e KHCO3 (1,25 eq, 18,3 mmol, 1,83 g) foi agitada em metanol (30 mL) à temperatura ambiente durante 18 horas. Foi em seguida diluída com água (40 mL) e o sólido foi recolhido via filtração e lavado com metanol frio e seco para proporcionar o composto mencionado em título na forma de um sólido esbranquiçado (4,02 g, 13,2 mmol, 90%). 1H-RMN (DMS0-d6) : δ 4,27 (2H, s) , 6,94 (s, 2H) , 7,71 (dd, 1H) ,

7,86 (d, 1H) , 8,02 (d, 1H), 8,73 (d, 1H); 8,93 (d, 1H) ; MS (m/z) 305 [M+H+]+.

Passo 2: 5-(3-Bromo-quinolin-6-ilmetil)-[1,2,4]triazole- -3,4-diamina

Uma mistura de 5-(3-bromo-quinolin-6-ilmetil)--[1,3,4]oxadiazol-2-ilamina (3,53 g, 11,6 mmol), hidrato de hidrazina (30 mL) e água (15 mL) foi aquecida num frasco de micro-ondas a 170 °C e 2 bar de pressão durante 1 hora. Após arrefecimento, o sólido formado foi recolhido via filtração e lavado com metanol frio e seco para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido branco (1,79 g, 5,6 mmol, 49%). 1H-RMN (DMSO-d6) : δ 4,13 (2H, s), 5,46 (s, 2H) , 5,56 (s, 2H) , 7,23 (d, 1H) , 7,81 (s, 1H), 7,98 (d, 1H), 8,71 (d, 1H); 8,91 (d, 1H); MS (m/z) 319 [M+H+] +. ΡΕ2081937 119

Intermediário 60:

Hidrazida do ácido (3-bromo-5,7-difluoro-quinolin-6-il)-

-acético Η P 8r ^nyVvy

N b „ .Λ & SOCI2 (394 mg, 3,31 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução agitada de ácido (3-bromo-5,7-difluoro--quinolin-6-il)-acético (500 mg, 1,65 mmol) em 12 mL de metanol a 0 °C sob N2. Após agitação durante 2 horas à temperatura ambiente o solvente foi evaporado e o éster de metilo do ácido (3-bromo-5,7-difluoro-quinolin-6-il)--acético cru foi usado diretamente no passo seguinte. A uma mistura de éster de metilo do ácido (3-bromo-5,7-difluoro-quinolin-6-il)-acético (2,29 g, 7,22 mmol) em metanol (100 mL) foi adicionada hidrazina anidra (2,31 g, 72,2 mmol). A mistura foi aquecida a 55 °C durante 4 horas. Um adicional de hidrazina anidra (1,16 g, 36,1) foi adicionado e a mistura foi aquecida a 55 °C durante 2 horas. A mistura reacional foi arrefecida até à temperatura ambiente para dar um sólido branco. O sólido branco foi filtrado e lavado com metanol frio para se obterem 2,1 g do composto mencionado em titulo (92% de rendimento). MS: m/z 318 [M+H+] . 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) : δ 1,99 (2H, s), 4,25 (2H, bs), 7,72 (1H, d), 8,74 (1H, s) , 9,03 (1H, s) , 9,35 (1H, s) . ΡΕ2081937 120

Intermediário 61: Ácido (3-bromo-5-fluoro-quinolin-6-il)-acético 8r li II í

O

Passo 1: 6-bromo-5-fluoro-quinolina

Uma mistura de 4-bromo-3-fluoro-fenilamina (100 g, 526 mmol), sulfato ferroso (30 g) , glicerol (200 g) , nitrobenzeno (40 g) e ácido sulfúrico concentrado (100 mL) foi aquecida suavemente. Depois da primeira reação vigorosa, a mistura foi aquecida em refluxo durante 5 horas. 0 nitrobenzeno foi evaporado em vácuo. A solução aquosa foi acidificada com ácido acético glacial e separou-se um precipitado castanho escuro, o qual foi purificado por cromatografia "flash" (gel de silica, petróleo/acetato de etilo = 12/1) para proporcionar uma mistura de 6-bromo-5-fluoro-quinolina e 6-bromo-7-fluoro-quinolina na forma dum sólido branco (80 g, 68%). Esta mistura foi aquecida até ao refluxo em éter de petróleo. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente, filtrada e seca para proporcionar 6-bromo-7-fluoro-quinolina na forma dum sólido branco. À solução foi adicionado HCl/MeOH, e um sólido branco precipitou da solução. O sólido foi filtrado e basifiçado. O precipitado resultante foi recolhido por filtração e seco para se obter 6-bromo-5-fluoro-quinolina na forma dum sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): 9,0 (d, 1H) , LO 00 (d, 1H), 8,0 (m, 1H) , 7,8 (d, 1H) , 7,7 (m, 1H) ; MS: m/z 228 [M+H+] +. 121 ΡΕ2081937

Passo 2: Éster de terc-butilo do ácido (5-fluoro-quinolin--6-il)-acético A uma solução de 6-bromo-5-fluoro-quinolina (1,0 g, 4,5 mmol) em tetra-hidrofurano (1 mL) foi adicionada uma solução de brometo acetato de terc-butilzinco (9 mmol, 20 mL, 10,4 M em tetra-hidrofurano) seguido por Pd(PPh3)4 (0,52 g, 0,45 mmol) . A mistura foi aguecida num reator de micro-ondas durante 30 min a 120 °C. A mistura reacional foi extinta com cloreto de amónio saturado (60 mL) e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para produzir o composto mencionado em título (0,83 g, 71%). 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz) : 8,9 (d, 1H) , 8,4 (d, 1H) , 7,8 (d, 1H) , 7,6 (m, 1H), 7,5 (m, 1H), 3,7 (d, 2H), 1,4 (s, 9H).

Passo 3: Éster de metilo do ácido (5-fluoro-quinolin-6- -il)-acético Éster de terc-butilo do ácido (5-fluoro-quinolin--6-il)-acético (5 g, 19 mmol) em 25 mL de NaOH ag° (4 N) foi aguecido em refluxo durante 4 h. A mistura foi lavada com acetato de etilo e a camada aguosa foi acidificada até pH 5 com HC1 conc°. O precipitado resultante foi recolhido e lavado com água e seco em vácuo para proporcionar o ácido (5-fluoro-quinolin-6-il)-acético. A este sólido foi adicionado H2SO4 conc° (1,2 mL) e MeOH (20 mL) e a solução foi aguecida em refluxo durante 6 h. Após arrefecimento, o 122 ΡΕ2081937 solvente foi removido em vácuo e o resíduo purificado por cromatografia em coluna "flash" para proporcionar o composto mencionado em título (2,0 g 48%).

Passo 4: Éster de metilo do ácido (3-bromo-5-fluoro— quinolin-6-il)-acético

Uma solução de éster de metilo do ácido (5--fluoro-inolin-6-il)-acético (2,0 g, 9 mmol) em CC14 (20 mL) e piridina (1,48 mL, 18 mmol) foi adicionado bromo (0,9 mL, 18 mmol) gota a gota a 5 °C. A solução foi aquecida em refluxo durante 20 minutos. Após arrefecimento, a reação foi extinta por NaHCCb aq° sat° e a mistura foi extraída com diclorometano e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna "flash" para proporcionar o composto mencionado em título (1,8 g, 66%). 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) : 8,9 (d, 1H) , 8,5 (d, 1H) , 7,8 (d, 1H) , 7,6 (m, 1H) , 3,9 (d, 2H) , 3,7 (s, 3H) .

Passo 5: Ácido (3-bromo-5-fluoro-quinolin-6-il)-acético Éster de metilo do ácido 3-bromo-5-fluoro--quinolin-6-il)-acético (1,2 g) em 10 mL de NaOH aq° (4 N) foi aquecida em refluxo durante 4 h. A mistura foi lavada com acetato de etilo e a camada aquosa foi acidificada até pH 5 com HC1 conc°. O precipitado resultante foi recolhido e lavado com água e seco em vácuo para proporcionar o composto mencionado em título (838 mg 74%) . 1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): 12,6 (s, 1H) , 9,0 (d, 1H) , 8,7 (d, 1H) , 7,9 (d, 1H), 7,8 (m, 1H), 3,9 (d, 2H). MS: 283, 285 (M+l). ΡΕ2081937 123

Intermediário 62 :

Hidrazida do ácido (3-bromo-5-fluoro-quinolin-6-il)-acético H f H2H Y qj h' ^

- XJ\J

Uma solução de ácido (3-bromo-5-fluoro-quinolin--6-il)-acético (800 mg, 2,7 mmol) e hidrato de hidrazina (98%, 2 mL) em metanol (15 mL) foi aquecida em refluxo durante 1 h. O solvente foi removido em vácuo para se obter um sólido branco o qual foi lavado com metanol e seco para proporcionar o composto mencionado em título (750 mg, 94%) na forma dum sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): 9,34 (s, 1H) , 8,996-9,00 (d, 1H), 8,72-8,73 (d, 1H) , 7,85-7, 88 (d, 1H) , 7,73-7,79 (m, 1H), 4,26-4,27 (d, 2H) , 3,64-3, 66 (d, 2H) ; MS: m/z 299 [M+H+] + .

Intermediário 63:

Hidrazida do ácido 2-quinolin-6-il-propiónico ,-N. H <?H3 vqb"-'-

h2n

)í T o l .,r

Ácido 2-quinolin-6-il-propiónico (5,6 g, 26,1 mmol), hidrato de hidrazina (1,6 mL) e metanol (150 mL) foram combinados e aquecidos em refluxo durante 72 horas. Após aquele tempo, a mistura foi concentrada em vácuo e repartida entre NaHCCb (200 mL) e diclorometano (150 mL). A 124 ΡΕ2081937 fase aquosa foi extraída com diclorometano (2x150 mL) e os extractos orgânicos combinados secos (Na2S04) e concentrados em vácuo para proporcionarem o composto mencionado em título na forma dum sólido branco (4, 6 g, 21,4 mmol, 82% ) . ^-RMN (DMS0-d6, 500 MHz) : 9, 30 (1H, bs) , 8,85 (1H, dd) , 8,33 (1H, dd), 7, 95 (1H, d) , 7,86 (1H , d), 7,74 (1H, dd) , 7,51 (1H, dd), 4,22 (3H, s) , 3,74 (1H , q), 1,44 (3H; MS: m/z 216 [M+H+] + .

MÉTODOS PARA A SÍNTESE DE EXAMPLES O Composto 21 e o Método A são retidos para efeitos de referência.

Método A

Composto 21: (R, S) -3-[3-(l-Quinolin-6-il-etil)-[1,2,4]-triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-benzonitrilo L !i .-•ν' to vv

N\ L N

Vn A uma mistura de água desgaseada (azoto borbulhado durante 15 mins) (1 mL) e 1,4-dioxano (3 mL) foi adicionada (R,S)-6-[1-(6-cloro-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piri-dazin-3-il)-etil]-quinolina (100 mg, 0,32 mmol, 1,0 eq), ácido 3-cianofenilborónico (52 mg, 0,35 mmol, 1,1 eq), carbonato de potássio (2 eq, 0,64 mmol, 89 mg) e aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)-ferroceno]paládio (II) diclorometano (15 mg, 0,07 eq) . O tubo de micro-ondas foi 125 ΡΕ2081937 tapado e aquecido num reator de micro-ondas a 130 °C durante 20 minutos. Após aquele tempo, a mistura foi concentrada sobre gel de silica e purificada via cromatografia em coluna "flash" eluindo com diclorometano:-metanol 100:0 até 90:10. O resíduo foi dissolvido em dimetilf ormamida (1 mL) e ainda purificado por HPLC de inversão de fases disparada por massa (CH3CN 5-95% em H2O) para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido branco (71 mg, 0,19 mmol, 59% de rendimento) . Dados analíticos apresentados no Quadro 1. Separação de enantiómeros descrita no Método B.

Método C

Composto 156: 3-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-vinil- —[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)--quinolina

A uma mistura de água desgaseada (azoto borbulhado durante 15 mins) (1 mL) e 1,4-dioxano (2 mL) foi adicionada 6-(6-cloro-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-il-metil)-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolina (117 mg, 0,31 mmol), éster de pinacol do ácido vinilborónico (59 pL, 0,35 mmol), carbonato de potássio (0,93 mmol, 128 mg) e aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)-ferroceno]-paládio (II) diclorometano (15 mg, 0,02 mmol). O tubo de 126 ΡΕ2081937 micro-ondas foi tapado e aquecido num reator de micro-ondas (Personel Chemistry, Emrys Optimizer) a 135 °C durante 1500 segundos. Após aquele tempo a fase orgânica foi concentrada sobre silica e purificada via cromatografia em coluna "flash" eluindo com metanol 0-10% em diclorometano para se obter o composto mencionado em titulo (22 mg, 19% de rendimento) na forma dum sólido branco. Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método I

Composto 140: 6-(6-Metoxi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin- -3-ilmetil)-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- -quinolina

N

A um frasco de micro-ondas de 5 mL, 1 mL de metanol foi adicionada seguido por 15 mg de carbonato de potássio e 25 mg (0, 067 mmol) de 6-(6-cloro-[1,2,4]-triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-3-(1-metil-lH-pirazol--4-il)quinolina. A mistura reacional foi aquecida durante 3800 segundos a 130 °C num micro-ondas. A mistura reacional foi em seguida filtrada e purificada por HPLC preparativa para proporcionar o composto mencionado em título (11,6 mg, 47%). Dados analíticos apresentados no Quadro 2. 127 ΡΕ2081937

Método L

Composto 124: 3-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil- -[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)--quinolina

Uma solução de 3-bromo-6-(6-metil-[1,2,4]triazo-lo[4,3 —b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (50 mg, 0,141 mmol, 1,0 eq) em 1,4-dioxano (1 mL) foi desgaseada com azoto e adicionado a um tubo de micro-ondas contendo l-metil-4--(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (0,177 mmol, 1,25 eq, 37 mg). Uma solução desgaseada de carbonato de potássio (0,282 mmol, 2 eq, 39 mg) em água (0,5 mL) foi em seguida adicionada ao tubo de micro-ondas seguido por aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)-ferroceno]paládio (II) diclorometano (5 mg, 0,0071 mmol, 0,05 eq) . O tubo de micro-ondas foi tapado e reagiu num reator de micro-ondas a 100 °C durante 30 minutos. A mistura reacional foi repartida entre diclorometano e água, e a camada orgânica foi evaporada e o resíduo diretamente adsorvido sobre gel de sílica. A purificação sobre gel de sílica com gradiente de metanol 0-10% em diclorometano, seguido por trituração com metanol produziu o composto mencionado em título (1,8 mg, 0,005 mmol, 4% de rendimento) na forma dum sólido branco. Dados analíticos apresentados no Quadro 2. ΡΕ2081937 128

Método N

Composto 152: 6-(6-Cloro-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin- -3-ilmetil)-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)--quinolina

Clx^N ,/ 'Ç' N V

H !

H — N A uma mistura de ácido [3-(l-metil-lH-pirazol-4- -il)-quinolin- -β-il]-acético (530 mg, 1,98 mmol) em dicloro- metano (2 mL) a 0 °C foi adicionado cloreto de oxalilo (1,2 eq) e uma gota de dimetilformamida. A mistura reacional foi deixada a agitar durante uma hora. Uma pequena alíquota foi tomada e dissolvida em metanol para fazer o éster de metilo, e verificar em LCMS: m/z 382,1. 0 solvente foi removido em vácuo, seguido pela adição de diclorometano que foi removido em vácuo, e adição de tolueno que foi removido em vácuo para proporcionar cloreto de [3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acetilo na forma de um sólido amarelo com 88% de rendimento. (6-Cloro-piridazin-3-il)-hidrazina (190 mg, 1,315 mmol) foi dissolvido em dimetilformamida seguido pela adição de trietilamina (3 eq) . Esta mistura foi agitada durante 5 minutos. A mistura tornou-se verde escuro e em seguida foi arrefecida até 0 °C. Uma solução de cloreto de [3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il]acetilo (375 mg, 1,315 mmol) em dimetilformamida foi adicionado gota a gota e a mistura reacional virou para amarelo, e foi agitada durante uma hora. Após aquele tempo, a mistura foi 129 ΡΕ2081937 concentrada até à secura e em seguida recebida em ácido acético (10 mL) e agitada a 60 °C durante 16 horas. O solvente foi removido em vácuo e o residuo repartido entre acetato de etilo e água, e a fase aquosa ainda extraída com acetato de etilo. As fases orgânicas combinadas foram purificadas via cromatografia em coluna "flash" (SÍO2, CH2CI2, gradiente de metanol de 0 a 10%) para proporcionar o composto mencionado em título (217 mg, 42% de rendimento) . Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método O

Composto 145: 5,7-Difluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-6- -(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3b]piridazin-3--ilmetil)-quinolina

A um frasco de 40 mL foi adicionado 1-butanol (10 mL) , hidrazida do ácido [2,4-difluoro-3-(1-metil-lH--pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acético (425 mg, 1,34 mmol) e 3-cloro-6-metilpiridazina (172 mg, 1,34 mmol). A mistura foi aquecida a 120 °C durante 24 horas. O solvente foi removido em vácuo e o residuo agitado em etanol antes de filtração para se obterem 200 mg de material cru. A purificação via cromatografia em coluna "flash" (S1O2, diclorometano/metanol 0 a 10%) devolveu 182 mg de material puro com 35% de rendimento. Dados analíticos apresentados no Quadro 2. 130 ΡΕ2081937

Método P

Composto 123: 3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-trifluoro- metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3--ilmetil)-quinolina

Uma mistura de 1-butanol (2 mL) , 3-cloro-6-tri-fluorometil-piridazina (0,13 mmol, 25 mg), hidrazida do ácido [3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-il]-acético (0,13 mmol, 40 mg) foi aquecida a 120 °C durante 18 horas. 0 solvente foi em seguida por corrente de azoto, o resíduo castanho dissolvido em 1 mL de dimetilformamida e 1 mL de metanol e purificado por HPLC preparativa para proporcionar o composto mencionado em título (15,8 mg, 0,04 mmol, 29%). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método Q

Composto 159: Dimetil-{3-[3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- -quinolin-6-ilmetil]-[1,2,4]triazolo[4,3-b]-piridazin-6-il}-amina

A um frasco de micro-ondas de 5 mL, 1 mL de 131 ΡΕ2081937 dimetilamina 40% em água foi adicionado seguido por 300 pL de DMSO para dissolver 25 mg (0,067 mmol) de 6-(6-cloro--[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-3-(1-metil-lH--pirazol-4-il)quinolina. A reação foi aquecida num micro--ondas durante 2000 segundos a 130 °C. A mistura reacional foi filtrada, em seguida purificada via HPLC preparativa para proporcionar o composto mencionado em titulo (7,7 mg, 30% de rendimento). Dados analiticos apresentados no Quadro 2.

Método R

Composto 144: 2-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]- piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]pirazol- -1-il}-etanol

A um recipiente de micro-ondas foi adicionada 3-bromo-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-il-metil)-quinolina (80 mg, 0,23 mmol, 1 eq) , bis (pinacol)- borano (69 mg, 0,27 mmol, 1,2 eq), acetato de potássio (66 mg, 0,67 mmol, 3,0 eq) seguido por dimetilacetamida (0,8 mL) . A solução foi desgaseada durante 10 min e aducto de dicloro[1,1r-bis(difenilfosfino)ferroceno]paládio (II) diclorometano (7 mg, 0,01 mmol, 0,048 eq) foi adicionado. 0 recipiente de micro-ondas foi tapado e reagiu num reator de micro-ondas a 120 °C durante 1 hora. O recipiente de micro- ondas foi arrefecido e em seguida 2-(4-bromo-pirazol-l-il)- 132 ΡΕ2081937 etanol (0,18 mmol, 0,8 eq) dissolvido em dimetilacetamida (0,6 mL) foi adicionado, seguido por carbonato de sódio aquoso 2 M (0,6 mL). A solução foi desgaseada durante 10 min e aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferro-cenojpaládio (II) diclorometano (7 mg, 0,01 mmol, 0,048 eq) foi adicionado. O recipiente de micro-ondas foi tapado e reagiu num reator de micro-ondas a 120 °C durante 2 horas. Após arrefecimento, Na2SC>4 (3 g) foi adicionado e a mistura diluída com acetonitrilo e filtrada através duma almofada de Celite. O filtrado foi concentrado sobre gel de sílica e purificado por ou cromatografia "flash" (SÍO2, CH2Cl2:CH30H 100:0-80:20) ou HPLC preparativa para proporcionar o composto mencionado em título. Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método T

Composto 157: 6-(6-Etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3- -ilmetil)-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)--quinolina

A uma solução de 3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-6-- (6-vinil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (22 mg, 0,06 mmol) em diclorometano (5 mL) e metanol (0,5 mL) sob uma atmosfera de N2 (g) foi adicionado paládio 10% sobre carbono (20 mg) e a atmosfera substituída por H2 (g) . Depois de agitar vigorosamente durante 3 horas, a 133 ΡΕ2081937 mistura foi filtrada através duma almofada de Celite e purificada via cromatografia em coluna "flash" (S1O2, CH2C12, metanol 0-10%) para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma dum sólido branco (17 mg, 77%). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método U

Composto 142: 3-(lH-Imidazol-4-il)-6-(6-metil-[1,2,4]- triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)- -quinolina

H A uma solução de 4-bromo-l-tritil-lH-imidazole (103 mg, 0,24 mmol, 1,0 eq) em tetra-hidrofurano (1 mL) foi adicionado brometo de etil-magnésio (3 M em éter dietilico, 0,094 mL, 0,28 mmol, 1,2 eq) e a reação foi agitada durante 90 min. ZnCl2 (38 mg, 0,28 mmol, 1,2 eq) foi em seguida adicionado e a solução agitada durante mais 90 min. Tetraquis(trifenilfosfina)paládio (2 mg, 0,024 mmol, 0,10 eq) e 3-bromo-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pirida-zin-3-ilmetil)-quinolina (100 mg, 0,28 mmol, 1,2 eq) foram adicionados e a solução aquecida a 70 °C durante 18 horas. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo absorvido sobre gel de sílica e purificado por cromatografia "flash" (SÍO2, CH2Cl2:CH3OH 100 : 0-80 :20 para proporcionar 6-(6--metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-3-(3- 134 ΡΕ2081937 -tritil-3H-imidazol-4-il)-quinolina. 0 grupo tritilo foi removido por agitação o composto em ácido cloridrico metanólico (0,5 N) durante 3 horas. Os voláteis foram removidos em vácuo e o residuo agitado em etanol e recolhido via filtração e seco para proporcionar o composto mencionado em titulo (5, 6 mg, 8% de rendimento) . Dados analiticos apresentados no Quadro 2.

Método V

Composto 132: 3-Imidazol-l-il-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo-[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina

N % 'Vi N— . sv

“N A um recipiente de reação foi adicionada 3-bromo-- 6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)--quinolina (71 mg, 0,2 mmol, 1,0 eq), Cul (7 mg, 0,04 mmol, 0,008 eq), L-prolina (9 mg, 0,08 mmol, 0,4 eq) e K2C03 (83 mg, 0,60 mmol, 3,0 eq). O sistema foi evacuado e cheio com azoto (3χ). Uma solução de imidazole desgaseado (27 mg, 0,4 mmol, 2,0 eq) em DMSO (1 mL) foi em seguida adicionada. A reação foi aquecida a 120 °C durante 18 horas. O solvente foi removido em vácuo e o residuo absorvido sobre gel de silica e purificado por cromatografia "flash" (Si02, CH2Cl2:CH3OH 100 : 0-90 : 10 para proporcionar o composto mencionado em titulo (15 mg, 22% de rendimento) . Dados analiticos apresentados no Quadro 2. ΡΕ2081937 135

Método W

Composto 125: 6—(6—Metil—[1,2,4]triazolo[4,3—b]piridazin- -3-ilmetil)-3-(lH-pirazol-4-il)-quinolina /'"Vis \'

f N

k.. NH A um frasco de micro-ondas foi adicionada 3-bro-mo-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (100 mg, 0,28 mmol, 1 eq), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioxaborolan-2-il)-l-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-pirazole (113 mg, 0,35 mmol, 1,25 eq), K2CO3 (78 mg, 0,566 mmol, 2,0 eq) seguido por 1,4-dioxano (3 mL) e água (1,5 mL). A solução foi desgaseada com azoto durante 10 min e em seguida aducto de dicloro[1,1’-bis(difenilfosfino) -ferroceno]paládio (II) diclorometano (10 mg, 0,014 mmol, 0,05 eq) foi adicionado. 0 recipiente de micro-ondas foi tapado e aquecido num reator de micro-ondas a 130 °C durante 30 min. A mistura foi arrefecida e repartida entre diclorometano e água. A fase orgânica foi absorvido sobre gel de silica e purificada por cromatografia "flash" (SÍO2, CH2Cl2:CH30H 100:0-80:20) para dar 6-(6-metil-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-3-[1-(2-trimetilsilanil-etoximetil) -lH-pirazol-4-il]-quinolina (106 mg, 80% de rendimento). O sólido foi em seguida adicionado a uma solução a 20% de etilenodiamina em dimetilformamida e agitado durante 3 horas. O solvente foi removido e o resíduo triturado com etanol para produzir o composto men- 136 ΡΕ2081937 cionado em título (65 mg, 85% de rendimento). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método Z

Composto 149: 2-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]-piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol- -1-il}-acetamida

6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-il- metil)-3-(lH-pirazol-4-il)-quinolina (65 mg, 0,19 mmol, 1 eq) foi dissolvido em dimetilformamida (0,5 mL) e NaH (60% em óleo, 1,2 eq, 0,228 mmol, 9 mg) foi adicionado. A solução foi agitada sob azoto durante 30 min e em seguida 2-bromoacetamida (26 mg, 0,19 mmol, 1 eq) foi adicionada e a solução aquecida a 90 °C durante 18 h. O produto foi extraído em diclorometano e lavado com água. A fase orgânica foi concentrada até à secura para produzir o composto mencionado em título (40 mg, 52% de rendimento). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método BB

Composto 166: 6-(6-Etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3- -ilmetil)-5,7-difluoro-3-(1-metil-lH--pirazol-4-il)-quinolina 137 ΡΕ2081937 N"

N V-N v

k ,N--CH3 N A uma mistura de 3-bromo-6-(6-etil-[1,2,4]tri-azolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-5,7-difluoro-quinolina (86 mg, 0,2 mmol), l-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]-dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (0,21 mmol, 44 mg) e carbonato de césio (0,6 mmol<195 mg) em 1,4-dioxano (2 mL) em refluxo foi adicionado [2-[(D-N)metil]fenil-c](triciclo--hexilfosfina)trifluoroacetato-O-(SP-4-3)-paládio (R. B. Bedford, C. S. J. Cazin, S. J. Coles, T. Gelbrich, P. N. Horton, Μ. B. Hursthouse, Μ. E. Light, Organometallics, 22 (2003) 987) (0,5 mol%, 0,1 μιηοΐ, 0,1 mg). Após 30 min, a mistura reacional foi filtrada através duma almofada de gel de silica (2 g) eluindo com diclorometano/metanol (17/3, 12 mL) . 0 filtrado foi concentrado sobre gel de silica e purificado via cromatograf ia em coluna "flash" (SiC>2, CH2Cl2:CH30H 100:0-90:10) para proporcionar o composto mencionado em titulo na forma de um sólido esbranquiçado (52 mg, 60% de rendimento). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método CC

Composto 175: 1-(3-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]- piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol--l-il}-azetidin-l-il)-etanona 138 ΡΕ2081937

Α 3- (i-azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil [1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (25 mg, 0,063 mmol) em diclorometano (1 mL) foi adicionada trietilamina (9,7 pL, 0,069 mmol) seguido por cloreto de acetilo (5,0 pL, 0,069 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi diluida com água e o produto extraido em diclorometano. A reação foi diluida com água e extraída em diclorometano e lavada com água. O filtrado foi concentrado em vácuo sobre gel de sílica e purificado por cromatografia "flash" (Si02, CH2Cl2:CH3OH 100:0-90:10) para proporcionar o composto mencionado em título (4,20 mg, 15% de rendimento). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método DD

Composto 171: 3-[1-(l-Etil-azetidin-3-il)-lH-pirazol-4- -il]-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]-piridazin-3-ilmetil)-quinolina

A 3- (l-azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil--[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (50 mg, 0,126 mmol) em diclorometano (3 mL) foi adicionado 139 ΡΕ2081937 acetaldeído (15 pL, 0,505 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos e em seguida triacetoxi-hidretoborato de sódio (67 mg, 0,136) foi adicionado. Após 1 hora, a solução foi diluída com diclorometano (1,5 mL) e lavada com bicarbonato de sódio (1,5 mL). A camada aquosa foi ainda extraída com diclorometano (1,5 mL) . As camadas de diclorometano combinadas foram lavadas com água salgada (3 mL) e secas sobre Na2S04. O filtrado foi concentrado em vácuo sobre gel de sílica e purificado por cromatografia "flash" (Si02, CH2Cl2:CH3OH 100:0-90:10) para proporcionar o composto mencionado em título (4,8 mg, 9% de rendimento). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método EE

Composto 172: 3-[1-(l-Metanosulfonil-azetidin-3-ilmetil)- -lH-pirazol-4-il]-6-(6-metil-[1,2,4]triazo-lo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina Γ V-N.r\J 1 N-'3s Χ;^χ ! N i O ch3Ts, ~H N0

~N Ν Α (l-azetidin-3-ilmetil-lH-pirazol-4-il)-6- (6--metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (22 mg, 0,054 mmol) em diclorometano (1 mL) foi adicionada trietilamina (7,5 pL, 0,054 mmol) seguido por cloreto de metanossulfonilo (4,0 pL, 0,054 mmol) e dimetilaminopiridi-na (6,6 mg, 0,054 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi diluída 140 ΡΕ2081937 com água e o produto extraído em diclorometano. A reação foi diluída com água e extraída em diclorometano e lavada com água. 0 filtrado foi concentrado em vácuo sobre gel de sílica e purificado por cromatografia "flash" (S1O2, CH2Cl2:CH3OH 100:0-90:10) para proporcionar o composto mencionado em título (5,4 mg, 21% de rendimento) . Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método FF

Composto 177: 6-Metil-3-[5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-1H--pirrolo[2,3-b]piridina-3-ilmetil]--[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina

H

H3C

N

~N W·/ Λ

N CHa

Hidrazida do ácido [5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)--lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-il]-acético (60 mg, 0,22 mmol) e 3-cloro-6-metil-piridazina (35 mg, 0,27 mmol) foram suspensas em n-butanol (1 mL). A suspensão foi aquecida num micro-ondas durante 1 hora a 200 °C. A seguir, a solução foi transferida para um funil de separação com diclorometano (20 mL) . A solução foi lavada com NaHCCg (aq°) saturado (30 mL) . A camada orgânica foi repartida, seca sobre Na2S04 e concentrada em vácuo. O material cru foi carregado seco em gel de sílica e purificado por cromatografia "flash" (gradiente de metanol 0-10%/dicloro-metano) para produzir o produto, 6-metil-3-[6-(1-metil-lH- 141 ΡΕ2081937 -pirazol-4-il)-pirrolo[3,2-b]piridina-l-ilmetil]-[1,2,4]-triazolo[4,3-b]piridazina (24,3 mg, 32% de rendimento) o qual foi em seguida cristalizado numa quantidade minima de metanol. Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método GG

Composto 176: Éster de terc-butilo do ácido 3—{4—[6—(6— -metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3--ilmetil)-quinolin-3-il]pirazol-l-ilmetil}--azetidina-l-carboxílico í" \\

HC PH» h r/ '0 H3C \ JxszQ

HsC, í γη Ni . ; ' N l,\ * 'V- ' }st

ts N-'N A um recipiente de micro-ondas foi adicionada 3-bromo-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-il-metil)-quinolina (476 mg, 1,35 mmol, 1 eq), éster de terc--butilo do ácido 3-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3]dioxolan-2--il)-pirazol-l-ilmetil]-azetidina-l-carboxílico (1,2 g, 3,37 mmol, 2,5 eq) , K2CO3 (393 mg, 2,84 mmol, 2,0 eq) seguido por dioxano (12 mL) e água (6 mL) . A solução foi desgaseada com azoto durante 10 min e em seguida aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paládio (II) diclorometano (44 mg, 0,06 mmol, 0,05 eq) foi adicionado. O recipiente de micro-ondas foi tapado e reagiu num reator de micro-ondas a 130 °C durante 30 min. O recipiente de micro-ondas foi arrefecido e em seguida a mistura foi extraída em diclorometano e lavada com água. Os voláteis foram 142 ΡΕ2081937 removidos em vácuo e o residuo absorvido sobre gel de silica e purificado por cromatografia "flash" (SÍO2, CH2Cl2:CH3OH 100:0-80:20) para se obter éster de terc-butilo do ácido 3 —{4 —[6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin--3-ilmetil)-guinolin-3-il]-pirazol-l-ilmetil}-azetidina-1--carboxilico (189 mg, 28% de rendimento). Dados analiticos apresentados no Quadro 2.

Método HH

Composto 155: 3-(l-Azetidin-3-ilmetil-lH-pirazol-4-il)-6-—(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3--ilmetil)-quinolina •V» /=Λ l '/. //

'N

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N

U .Ν' "N /

j—NH A éster de terc-butilo do ácido 3-{4-[6-(6-metil- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]- pirazol-l-ilmetil}-azetidina-l-carboxílico (189 mg) foram adicionados 6 mL de solução de TFA:diclorometano/1:1. A mistura foi deixada em repouso durante 2 horas. Os voláteis foram removidos por evaporação rotativa e em seguida metanol (6 mL) e MP-carbonato (400 mg, 3,18 mmol/g) foram adicionados. A resina foi filtrada e os voláteis foram removidos em vácuo para se obter um rendimento quantitativo de 3-(l-azetidin-3-ilmetil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina. Dados analiticos apresentados no Quadro 2. 143 ΡΕ2081937

Método II

Composto 179: 3-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-6-[1,2,4]- triazolo[4,3-b][1,2,4]triazin-3-ilmetil--quinolina

N-CH3

N

Uma mistura de 3-bromo-6-[1,2,4]triazolo[4,3-b]- [1,2,4]triazin-3-ilmetil-quinolina (69 mg, 0,204 mmol), éster de pinacol do ácido l-metil-4-pirazolborónico (51 mg, 0,25 mmol), carbonato de potássio (56 mg, 0,41 mmol), 1,4-dioxano (2 mL) e água (1 mL) foi borbulhado gás azoto durante 10 minutos. Após aquele tempo, diclorobis-(trifenilfosfina)paládio (8 mg, 5 mol%) foi adicionado, o frasco vedado e aquecido num micro-ondas durante 1500 segundos a 135 °C. A mistura foi diluída com diclorometano e água salgada, antes da fase orgânica ser concentrada sobre gel de sílica e via cromatografia em coluna "flash" (SiC>2 4 g, diclorometano/CH3OH 0-10%) para proporcionar o composto mencionado em título a sólido branco (11 mg, 16%). Dados analíticos apresentados no Quadro 2.

Método NN

Exemplo: 3-[1-(l-Metil-azetidin-3-il)-lH-pirazol-4-il]-6- -(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3--ilmetil)-quinolina

N n' ch3

H3C-f V^N 144 ΡΕ2081937 A 3- (l-azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil--[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilmetil)-quinolina (194 mg, 0,4898 mmol) em diclorometano (9 mL) foi adicionado formaldeido (37% em água, 1,959 mmol, 147 yL). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos e em seguida triacetoxi-hidretoborato de sódio (260 mg, 1,22 mmol) foi adicionado. Após 1 hora, a solução foi diluida com diclorometano (6 mL) e lavada com bicarbonato de sódio (6 mL) . A camada aquosa foi ainda extraida com diclorometano (6 mL). As camadas de diclorometano combinadas foram lavadas com água salgada (12 mL) e secas sobre Na2SC>4. O filtrado foi concentrado em vácuo sobre gel de silica e purificado por cromatografia "flash" (Si02, CH2C12: CH3OH:NH4OH, 95:4, 995:0,005-80:19, 98:0,02) para proporcionar o composto mencionado em titulo (69 mg, 35% de rendimento). Dados analíticos apresentados no Quadro 2. A estrutura, nome, dados físicos e biológicos e métodos são ainda descritos em forma de tabela no Quadro 2.

Quadro 2

ΡΕ2081937 145 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (ra/z) 124 I L 0-N'N ÇN~CH3 3-(l-Metil-lfí-pirazol-4-il)-6-(6- (DMSO-dG) 2,55 (3H, s), 3,91 (3H, s) 4,70 (2H, s), 7,27 (1H, d), 7,67 (1H, dd), 7,51 (1H, s), 7,94 Í1I-I, d), 8,09 (II-I, 356 metil- [1,2,4] triazolo [4,3- s), 8,27 (1H, d), 8,39 i>]piridazin-3-ilmetil) -quinolina (1H, s), 8,43 (1H, d), 9,14 (1H, d) 125 I II w ÇNH 6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-t>]piridazin-3-ilmetil) -3- (1H-pirazol-4-il)-quinolina (DMSO-d6) 2,56 {3H, s), 4,74 (2H, s), 7,30 (1H, d), 7,80 (1H, dd), 7,74 (1H, s), 8,02 (1H, d), 8,28 (1H, d), 8,36 (2H, s), 8,71 (1H, s), 9,32 (2H, s) 342 (EMSO-d6) 2,11-2,19 (2H, m), 2,26-2,28 (2I-I, L L .n-/ \.w m), 2,54 (3H, s), 3,09-3,17 {2H, m), 3,42-3,46 (2H, m), 4,53-4,58 (1H, m), 4,73 (2H, s), 7,29 126 I 2 L 6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3- (1H, d), 7,76 (1H, dd), 425 i>]piridazin-3-ilmetil) -3- (1- 8,00 (1H, d), 8,21 (1H, piperidin-4-il-lH-pirazol-4-il)- s), 8,27 (1H, d), 8,54 quinolina (1H, s), 8,54 (1H, br s), 8,62 (1H, s), 8,78 (1H, br s), 9,27 (1H, s) ΡΕ2081937 146 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-RMN (500 MHz) MIS (ra/z) 127 Ti V H3C. .N Y ("χ ÇY*N- N^/ 6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -3-pirazol-1-il-quinolina (DMSO-dG) 2,55 (3H, s), 4,73 (2H, s), 6,65 (1H, d), 7,27 (1H, d), 7,75 (1H, dd), 7,75 (1H, dd), 7,88 (1H, d), 7,90 (1H, s), 8,02 (1H, d), 8,26 (1H, d), 8,70 (1H, dd), 9,45 (1H, d) 342 128 ti ui L F 3-(3,5-Difluoro-fenil)-8-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-i>] piridazin-3-ilmetil)-quinolina (DMSO-d6) 2,55 {3H, s), 4,74 (2H, s), 7,28 (1H, d), 7,34 (1H, td), 7,72 (1H, dd), 7,80 (1H, dd), 7,88 (1H, s), 8,03 (1H, d), 8,27 (1H, d), 8,72 (II-I, d), 9,27 (II-I, d) 388 129 II ui L I 1 N // XN 6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-i>]piridazin-3-ilmetil) -3-pirimidin-5-il-quinolina (EMSO-db) 2,55 (3I-I, s), 4,74 (2H, s), 7,28 (1H, d), 7,83 (1H, dd), 7,90 (1H, s), 8,05 (1H, d), 8,27 (1H, d), 8,81 (1H, d), 9,27 (1H, s), 9,32 (1H, d), 9,35 (1H, s) 354 130 I I L r^Xjl Vy·. L y - N // Y 3-[6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -quinolin-3-il]benzonitrilo (DMSO-d6) 2,55 (3H, s), 4,74 (2H, s), 7,27 (1H, d), 7,75 (1H, t), 7,81 (1H, dd), 7,89 (1H, s), 7,92 (1H, dd), 8,04 (1H, d),8,24 (1H, s), 8,27 (II-I, d), 8,41 (II-I, s), 8,73 (1H, d), 9,27 (1H, d) 377 ΡΕ2081937 147 (continuação)

ΡΕ2081937 148 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-RMN (500 MHz) MS (ra/z) 134 I II R rOCx L jL.-N (¾. N._·-·-“ΟΗ -'-' N '-•N' Ácido {4-[6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-i>] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-il}-acético (EMSO-d6) 2,55 (3H, s), 4,71 (2H, s), 5,01 (2H, s), 7,28 (1H, d), 7,68 (1H, d), 7,78 (1H, s), 7,95 (1H, d), 8,14 (1H, s), 8,27 (1H, d), 8,41 (2H,s), 8,46 (1H, s), 9,16 (1H, d) 400 135 II III L T^V-N U ,N jj 7' ΌΗ Ácido 3-[6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-i>] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-benzóico (DMSO-d6) 2,55 {3H, s), 4,73 (2H, s), 7,27 (1H, d), 7,80 (1H, dd), 7,93 (1H, d), 8,01-8,09 (5H, m), 8,27 (1H, d), 8,71 (1H, d), 9,26 (1H, d) 396 136 II III L ΓΠΓ 1 JL IA xo» VN \ \._^í=N ° Ácido 4-[6-(6-metil- [1,2,4] triazolo [ 4,3-i>] piridazin-3- ilmetil)-quinolin-3-il]-benzóico (DMSO-db) 2,55 (3H, s), 4,73 (2H, s), 7,27 (1H, d), 7,80 (1H, dd), 7,93 (1H, d), 8,01-8,08 (5I-I, m), 8,27 (1H, d), 8,71 (1H, d), 9,26 (1H, d) 396 137 I II L H,C. J N~'nss=\ .... YL> oífX A F3C OH 3-(lH-Indol-2-il)-6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolina ácido trifluoroacético (DMSO-d6) 2,56 (3H, s), 4,76 (2H, s), 7,05 (1H, t), 7,17 (1H, t), 7,25 (1H, s), 7,30 (1H, d), 7,46 (1H, d), 7,60 (1H, d), 7,82 (II-I, dd), 7,91 (1H, s), 8,04 (1H, d), 8,28 (1H, d), 8,83 (1H, s), 9,50 (1H, s), 11,86 (1H, s) 391 ΡΕ2081937 149 (continuação)

Eg. MET Cl 50 16 CE50 Mé todo Estrutura 1H-RMN (500 MHz) MS (m/z) 138 I III L NH XX-N X? 6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -3- [1H-pirrol-2-il)-quinolina (EMSO-d6) 2,48 (3H, s), 4,62 (2H, s), 6,13 (1H, dd), 6,74 (1H, dd), 7,20 (II-I, d), 7,56 (II-I, dd), 7,66 (1H, s), 7,83 (1H, d), 8,19 (1H, d), 8,30 (1H, d), 9,14 (1H, d), 11,50 (1H, s) 341 139 I T L ^Λν·Ν V'™3 3-(l-Metil-lH-pirazol-4-il)-6-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil-quinolina (EMSO-d6) 3,84 (3H, s), 4.68 (2H, s), 7,28 (1H, dd), 7,59 (1H, dd), 7.68 (II-I, s), 7,86 (II-I, d), 8,02 (1H, s), 8,30 (1H, d), 8,31 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,57 (1H, dd), 9,07 (1H, d) 342 140 I j I fc] AjQ hsc γ Ν'γ γ-Λ L. L ,n-ch, 6-(6-Metoxi-[1,2,4]triazolo[4,3-t)]piridazin-3-ilmetil) -3- (1-metil-lH-pirrol-4-il)-quinolina (EMSO-d6) 3,83 (3H, s), 3,90 (3H, s) 4,57 (2H, s), 6,95 (1H, d), 7,62 (1H, dd), 7,67 (1H, s), 7,85 (II-I, d), 8,02 (II-I, s), 8,16 (1H, d), 8,31 (1H, s), 8,35 (1H, d), 9,06 (1H, d) 372 141 I T A ."=* rXjT^I 7^ ΝΎ L i-.'N L. N— 'fÇ 3- (l-Metil-lfí-pirazol-4-il) -6- [6-(l-metil-lH-pirazol-4-il) [1,2,4] triazolo [4,3-£>]-piridazin-3-ilmetil]-quinolina (EMSO-d6) 3,83 (3H, s), 3.86 (3H, s) 4,66 (2I-I, s), 6,61 (1H, d), 7,66 (1H, dd), 7,79 (1H, s), 7.86 (II-I, d), 8,01 (II-I, s), 8,10 (1H, s), 8,29 (1H,s), 8,30 (1H, d), 8,37 (1H, d), 8,46 (1H, s) 9,06 (1H, d) 422 ΡΕ2081937 150 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-RMN (500 MHz) MS (ra/z) 142 tt II U 3-(3H-Imidazol-4-il)-6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolina (DMSO-cib) 2,57 (3I-I, s), 4,77 (2H, s), 7,32 (1H, d), 7,86 (1H, dd), 7,93 (II-I, s), 8,08 (1H, d), 8,29 (1H, d), 8,44 (1H, d), 8,97 (1H, s), 9,35 (1H, s), 9,43 (1H, d) 342 143 I τ R l-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]-triazolo [4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-il)-butan-2-ona (DMSO-d6) 0,98 (3H, t), 2,55 (3H, s), 4,71 (2I-I, s), 5,20 (2H, s), 7,27 (1H, d), 7,68 (1H, dd), 7,78 (1H, s), 7,95 (1H, d), 8,15 (1H, s), 8,27 (1H, d), 8,34 (1H, s), 8,46 (1H, d), 9,15 (1H, d) 412 144 I II R r^xXj L -N L N—·—-oh V*N %)' 2-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]- triazolo [4,3-£>] piridazin-3- ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1- il)-etanol (DMSO-d6) 2,55 (3H, s), 3,79 (2I-I, q), 4,19 (2I-I, t), 4,70 (2H, s), 4,98 (1H, t), 7,27 (1H, d), 7,66 (1H, dd), 7,75 (1H, s), 7,93 (1H, d), 8,12 (1H, s), 8,26 (1H, d), 8,41 (1H, s), 8,44 (1H, d), 9,16 (1H, d) 386 145 I T 0 F 0n-n-ch, 5,7-Difluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolina (EMSO-d6) 2,47 (3H, s), 3,84 (3H, s) 4,61 (2H, s), 7,21 (1H, d) . 7,64 (1H, d), 8,13 (1H, s), 8,17 (1H, d), 8,43 (1H, s), 8,49 (1H, d), 9,22 (1H, d) . 145 ΡΕ2081937 151 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (ra/z) 146 I T L R H,CX ,S, J Γ \ss»\ L L· ,N—Λ ^ ,C 5,7-Difluoro-6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-3-[1-(2-morfolin-4-il-etil)-lH-pirazol-4-il]-quinolina (EMSO-d6) 2,43 (4H, fcm), 2,53 (3H, s) 2,75 (2H, m), 3,54 {4H, ατό, 4,28 (2H, t), 4,68 (2H, s), 7,28 (II-I, d), 7,71 (1H, d), 8,15 (1H, s), 8,21 (1H, s), 8,24 (1H, d), 8,56 (1H, d), 9,30 (1H, d) . 146 i /i? _L4t / I I R r\Ã ) L L h~---o"ch' 3-[1-(2-Metoxi-etil)-l.H-pirazol-4-il]-6-(6-metil- [1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolina (DMSQ-d6) 2,55 (3H, s), 3,25 (3H, s), 3,74 (2H, t), 4,31 (2H, t), 4,70 (2H, s), 7,27 {1H, d), 7,67 (1H, dd), 7,75 (1H, d), 8,12 (1H, s), 8,41 (1H, s), 8,44 (1H, d), 9,15 (1H, d) 1 /ít ±*á / i /i π -L4tO I I R r^UCjl H3CX^N.MJ ΐ Λ> 3-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]-triazolo [4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-il}-propionitrilo (EM30-d6) 2,82 (3H, s), 3,41 {2H, t), 4,73 {2H, t), 4,98 (2H, s), 7,55 (11-1, d), 7,96 (11-1, dd), 8,04 (1H, s), 8,22 (1H, d), 8,48 (1H, s), 8,53 (1H, d), 8,74 (1H, d), 8,78 (1H, s), 9,43 (1H, d) 1 /iO 140 ΡΕ2081937 152 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-RMN (500 MHz) MS (ra/z) 149 I III z f'\ Jl ") HjC J VK 5 Ύ N 1 V-\ L J**J* k N -/ 0 R- N m 2-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]-triazolo [4,3-5] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-il}-acetamida (EMSO-d6) 2,60 (3H, s), 4,70 (2H, s), 4,80 (2H, s), 7,27 (1H, d), 7,33 (1H, brs), 7,59 (1H, br s), 7,67 (1Η, dd), 7,77 (1H, s), 7,94 (1H, d), 8,12 (1H, s), 8,26 (1H, d), 8,39 (1H, s), 8,46 (1H, d), 9,16 (1H, d) 149 150 II L LXnN X 'NH h3c^n 3-(3-Metil-lH-pirazol-4-il) -6-(6-metil- [1,2,4] triazolo [4,3-5]piridazin-3-ilmetil) -quinolina (DMS0-O6) 2,54 (3H, s), 4,70 (2H, s), 7,26 (1H, d), 7,67 (1H, d), 7,85 (1H, s), 7,94 (1H, d), 8,26 (1H, d), 8,30 (1H, d), 9,03 (II-I, d) 150 151 I III R f hV'Ní Hi 1 L N F Γ ν.„>·Ό Acido {4-[5,7-difluoro-6-(6-metil [1,2,4] triazolo [4,3-5]-piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-l-il]-acético (DMSO-db) 2,50 (3H, s), 4,62 (2H, s), 4,90 (2H, s), 7,22 (1H, d), 6,66 (1H, d), 8,17 (1H, d), 8,45 (1H, s), 8,52 (1H, d), 9,24 (1H, s) 151 152 NA NA. N ci>^n'nX CVch3 N N 3 6-(6-Cloro-[1,2,4]triazolo[4,3-5]piridazin-3-ilmetil)-lH-pirazol-4-il]-quinolina (EM50-d6) 3,91 (3H, s), 4,73 (2I-I, s), 7,56 (11-1, d), 7,73 (1H, dd), 7,82 (1H, s), 7,98 (1H, d.), 8,11 (1H, s), 8,41 (1H, s), 8,48 (1H, d), 8,53 (1H, s), 9,22 (1H, d) 152 ΡΕ2081937 153 (continuação)

ΡΕ2081937 154 (continuação)

ΡΕ2081937 155

ΡΕ2081937 156 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (ra/z) 164 I III R οχ™ Ácido 1-{4-[6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-il} -ciclobutanocarboxilicx) (DMSO-db) 1,69-2,07 (m, 2H), 2,47 (s, 3H), 2,57-2,69 (m, 4H), 7,20 (d, 1H), 7,59 (dd, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,86 (d, 1H), 8,03 (s, 1H), 8,19 (d, II-I), 8,40 (d, II-I), 8,42 (s, 1H), 9,21 (d, 1H) 440 165 I T 0 ry\ H3C f N-Ç \es\ O**" Cn.--ch, 6-(6-Etil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -7-fluoro-3-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) -quinolina (EM50-d6) 1,48 (3H, t), 3,11 (2H, q), 3,90 (3H, s), 4,71 (2H, s), 7,32 (1H, d), 7,76 (1H, d), 7,86 (1H, d), 8,07 (1H, s), 8,27 (1H, d), 8,37 (1H, s), 8,45 (1H, d), 9,18 (1H, d) 388 166 I I BB F j, r ί j MjC'" ''. F 5Λ· vn~CM3 6-- (6-Etil- [1,2,4] triazolo [4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -5,7-difluoro-3- (l-rnetil-lH-pirazol-4-il)-quinolina {Elv!SO-d6) 1,24 (3H, t), 2,85 (2H, q), 4,16 (3H, s), 4,95 (2I-I, s), 7,55 (1H, d), 7,95 (1H, d), 8,44 (1H, s), 8,49 (1H, d), 8,74 (1H, s), 8,79 (1H, d), 9,54 (1H, d) 406 167 I IV 0 F XXn ΧΛ™3 7-Fluoro-3- (l-metil-lff-pirazol-4-il)-6-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -quinolina (DMSO-d6) 3,90 {3H, s), 4,76 (2H, s), 7,37 (1H, dd), 7,77 (II-I, dd), 7,79 (1H, d), 8,06 (1H, s), 8,37 (1H, s), 8,40 (1H, dd), 8,46 (1H, d), 8,65 (II-I, dd), 9,18 (1H, d) 360 ΡΕ2081937 157 (continuação)

ΡΕ2081937 158 (continuação)

ΡΕ2081937 159 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (ra/z) Ί ~j/\ I II p F ^N'N~CH» 5,7-Difluoro-3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-6-[1,2,4]-triazolo [4,3-£>] piridazin-3-ilmetil-quinolina (DMSO-d6) 3,84 (3H, s), 4,67 (2H, s), 7,31 (1H, dd), 7,64 (1H, d), 8,13 (1H, s), 8,28 (1H, d), 8,43 (1H, s), 8,48 (1H, d), 8,60 (II-I, dd), 9,22 (1H, d) 377 175 I II CC r\JT Ί L L ,C H3 o 1-(3—{4—[6-(6-Metil-[1,2,4]-triazolo [4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-ilj-azetidin-l-il)-etanona (DMSO-d6) 1,84 {3H, s), 2,55 (3H, s), 4,15-4,18 (m, 1H), 4,34 (11-1, t), 4,44- 4,46 (1H, m), 4,61 (1H, t), 4,70 (2H, s), 5,29 (1H, m), 7,27 (1H, d), 7,68 (1H, dd), 7,75 (1H, dd), 7,95 (1H, d), 8,26 (1H, d), 8,25 (11-1, s), 8,47 (1I-I, d), 8,65 (1H, s), 9,17 (1H, d) 439 176 I τ GG ur « HiC CHS L u N /. n...,-' \. o --¾ '^V VN-É s Éster de terc-butilo do ácido 3-{4-[6-(6-metil- [1,2,4]triazolo[4,3-b] piridazin-3-ilmetil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-il}-azetidina-l-carboxílico (EM30-d6) 1,57 (9H, s), 2,69 (3H, s), 4,33 (2H, br m), 4,49 (2H, br m), 4,85 (2H, s), 5,41 (1H, m), 7,42 (1H, d), 7,83 (1H, dd), 7,90 (1H, s), 8,10 (1H, d), 8,40 (1H, s), 8,41 (11-1, d), 8,62 (1H, d), 8,78 (1H, s), 9,33 498 ΡΕ2081937 160 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-RMN (500 MHz) MS (ra/z) 177 I II FF H .N rxJ Η30-γΝ'Ν^Ν ^N'N'CH3 6-Metil-3- [5- (1-Metil-lH-pirazol-4-il) -lil-pirrolo [2,3-t>]piridin-3-ilmetil] - [1,2,4] triazolo [4,3-£>] -piridazina {Ilv!SO-d6) 2,56 (3H, s), 3,87 (3H, s), 4,57 (2H, s), 7,25 (II-I, d), 7,36 (1H, d), 7,84 (1H, d), 8,11 (1H, s), 8,16 (1H, d), 8,21 (1H, d), 8,44 (11-1, s), 11,45 (1H, s) 345 178 III ΝΆ FF Í^\“N Λ S) H3C^N'N^n nn 'CH3 6-Metil-3-[6-(1-Metil-lH-pirazol-4-il) -pirrolo [3,2-£>]piridin-l-ilmetil ] - [ 1,2,4 ] triazolo [ 4,3-i>] -piridazina (CD30D) 2,60 (3H, s), 3,96 (3H, s), 6,03 (2H, s), 6,60 (1H, d), 7,29 (1H, d), 7,76 (1H, d), 7,95 (II-I, s), 8,07 (11-1, d), 8,09 (1H, s), 8,34 (1H, m), 8,55 (1H, d) 345 179 I T li UNiN' ^nN'CH3 3-(l-Metil-lfí-pirazol-4-il)-6-[1,2,4] triazolo [4,3~b] -[1,2,4]triazin-3-ilmetil-quinolina (DMSO“d6) 3,90 (3H, s), 4,73 (2H, s), 7,65 (1H, d), 7,76 (1H, s), 7,92 (1H, d), 8,07 (1H, s), 8,37 (1H, s), 8,40 (1H, s), 8,72 (II-I, d), 8,73 (1H, d), 9,13 (1H, s) 343 ΡΕ2081937 161 (continuação)

ΡΕ2081937 162 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (ra/z) 183 I NA Ml Vv\ 3-[1-(l-Metil-azetidin-3-il)-1H-pirazol-4-il]-6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-i>] piridazin-3-ilmetil)-quinolina (EMSO-d6) 2,35 (3H, s), 2,54 (3H, s), 3,41 (2H, t), 3,73 (2H, t), 4,69 (2H, s), 4,97 (1H, 'quinteto), 7,26 (1H, d), 7,67 (1H, dd), 7,73 (1H, s), 7,93 (1H, d), 8,16 (1H, s), 8,25 (1H, d), 8,45 (1H, d), 8,60 (1H, s), 9,16 (1H, d) 411 184 I NA HH ; CN H’c w 3- (l-Azetidin-3-il-lff-pirazol-4-il)-6-(6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -5-fluoro-quinolina (EMSO-d6) 1,25 (3H, t), 2,87 (2H, q), 4,35-4,44 {4H, m), 4,72 {2H, s), 5,44 (1H, quinteto), 7,32 Í1I-I, d), 7,70 (II-I, t), 7,83 (1H, d), 8,25 (1H, d), 8,47 (1H, s), 8,63 (1H, d), 8,72 (1H, s), 9,22 (2H, br s), 9,28 (1H, d), 429 185 I NA. HH HaC-'Χ.,Ν /~\ /f~H r ν-'λ y-7 :n f 3- (l-Azetidin-3-ii-líf-pirazol-4- il)-6-(6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3-i>]piridazin-3-ilmetil) -5,7-difluoro-quinolina (EMSO-d6) 1,23 (3H, t), 2,87 (2H, q), 4,37-4,45 {4H, m), 4,71 {2H, s), 5,44 (1H, quinteto), 7,32 (1H, d), 7,73 (1H, d), 8,48 (1H, s), 8,62 (1H, d), 8,70 (1H, s), 9,08 (11-1, br s), 9,20 (1H, brs), 9,32 (1H, d) 447 ΡΕ2081937 163 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (m/z) (DMSO~d6) 0,93 (3H, t), í il Ί 1,25 (3H, t), 2,55 (2H, L >l 1 i Is n q), 2,88 (2H, q), 3,38 186 I NA. DD β-Η^'Η "'Ν' { r \ W O V-CH, 3- [1-(l-Etil-azetidin-3-il)-1H-pirazol-4-il]-6-(6-etil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-ilmetil)-5-fluoro-quinolina (2H, m), 3,71 (2H, m), 4,72 (2I-I, s), 5,00 (II-I, quinteto), 7,31 (1H, d), 7,67 (1H, t), 7,81 (1H, d), 8,26 (1H, d), 8,28 (1H, s), 8,61 (1H, d), 8,74 (1H, s), 9,28 (1H, d) 457 (DMSO-d6) 0,93 (3H, t), 2,50 (3H, t), 2,57 (2H, 187 I NA DD /~~Λ //~H t H-i > - VaJ« p 3-[1-(l-Etil-azetidin-3-il)-1H- q), 2,87 (2H, q), 3,37 (2H, m), 3,71 (2H, m), 4,71 (2H, s), 5,00 (1H, quinteto), 7,31 (1H, 475 pirazol-4-il]-6-(6-etil- d), 7,70 (1H, d), 8,25 [1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3- (11-1, d), 8,28 (11-1, s), ilmetil)-5,7-difluoro-quinolina 8,61 (1H, d), 8,74 (1H, s), 9,33 (1H) f CHí (DMSO-d6) 0,93 (3H, t), 2,51 (2H, q), 2,57 (3H, 188 I NA DD ? 1 HjC \ '4—N F N 3-[1-(l-Etil-azetidin-3-il)-5,7- s), 3,37 (2H, m), 3,71 (2H, m), 4,69 (2H, s), 5,00 (1H, quinteto), 7,29 (1H, d), 7,72 (1H, 461 difluoro-6-- (6—rnetil— d), 8,25 (11-1, d), 8,29 [1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3- (1H, s), 8,61 (1H, d), ilmetil)-quinolina 8,74 (1H, s), 9,33 (1H, d) ΡΕ2081937 164 (continuação)

Eg. MET CI50 16 GTL CE50 Mé todo Estrutura 1H-EMN (500 MHz) MS (ra/z) 189 I NA. HH fVO* h3C~\ VN 3-(l-Azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilmetil) -quinolina (EMSO-d6) 1,25 (3H, t), 2,86 (2H, q), 4,42 (4H, m), 4,71 (2H, s), 5,45 (1H, quinteto), 7,31 (1H, d), 7,72 (1H, dd), 7,81 (1H, d), 8,27 (1H, d), 8,36 (1H, s), 8,48 (1H, d), 8,58 (1H, s), 9,06 (1H, br s), 9,16 (1H, d), 9,18 (1H, br s) Λ 1 q *iJ.± 190 I NA DD u λ L / x·'" OH? H>\ GH3 _ hV/St^o '-v· ^ N 3-[1-(l-Etil-azetidin-3-il)-1H-pirazol-4-il] -6- [1- (6-metil-[1,2,4] triazolo [ 4,3-£>] piridazin-3-il)-etil]-quinolina (DMSO-db) 0,93 (3H, t), 1,88 (3H, d), 2,51-2,54 (5H, m), 3,35-3,38 (2H, m), 3,71-3,71 (2H, m), 5,01 (1H, m), 7,22 (1H, d), 7,71 {1H, dd), 7,74 (1H, d), 7,93 (1H, d), 8,16 (1H, d), 8,24 (1H, d), 8,48 (1H, d), 8,60 (1H, s), 9,17 (1H, d) 439 191 I NA 0 r N“CH, CH3 W )ssN j WV 'N'N 3-(l-Metil-lH-pirazol-4-il]-6-[1-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-il) -etil] -quinolina (DMSO-db) 1,88 (3H, d), 2,51 (3H, s), 3,90 (3H, s), 5,01 (1H, quinteto), 7,23 (1H, d), 7,70 (1H, dd), 7,74 (1H, s), 7,93 (1H, d), 8,08 (II-I, s), 8,24 (II-I, d), 8,37 (1H, s), 8,43 (1H, d), 9,13 (1H, d) 370 em que:

I ’T CT5Í 10! 165 ΡΕ2081937 II 100 ηΜ < c-MET CI50 < 1 μΜ; III 1 μΜ < c-MET CI5o A 10 μΜ; IV 10 μΜ < c-MET CI50 A 50 μΜ.

Bioensaios mhecidos do perito na ensaiar a s a. t r v i. o. a g e s .ções > da presente reve- em, mas sem constituir técnica podem ser usados par; inibidoras dos compostos e compc lação. Os ensaios de cinase incluem, mas limitação, os exemplos seguintes.

Os dados de rastreio foram avaliados usando a equação: Z '=1- [3* (σ++σ~) / | μ+-μ~ I ] (Zhang et al., J. Biomol, Screening., 4 (2) (1999) 67-73), onde μ designa a média e σ o desvio padrão. O subscrito designa controlos positivo ou negativo. A pontuação Z' para um ensaio de rastreio robusto deverá ser A 0,50. O limiar típico = μ+-3*σ+. Qualquer valor que caia abaixo do limiar foi designado um "hit" ou sucesso.

Ensaio de Enzima Baseado na Luminescência de MET

Materiais: substrato de Poli Glu-Tyr (4:1) (Sigma N° Cat. P-0275) , ATP (Sigma N° Cat. A-3377, FW=551), tampão í-IEPES, pH 7,5, albumina de soro bovino (BSA) (Roche 92423420), MgCl2, Estaurosporina (Streptomyces sp. Sigma N°

Cat. 8 5 6 6 0-1MG) , placa de fi ando plano de 384 cavi Gostar branca (VWR N° Cat. 29444-088). Cinase MET abaixo) , Kinase- -Cio™ (Promeoa N° Cat. V6712) . 166 ΡΕ2081937

Soluções de Stock: poli Gli. i-Tyr 10 mg/mL em água, guardadas a -20 °C; tampão HEPES 100 mM, pH 7,5 (stocJ· c 5 mL 1 M + miliQH20 45 mL); ATP 10 mM (5,51 mg/mL em dH20) guardada a -20 °C (diluida 50 pL num total de 10 mL miliQH20 diariamente = ATP 50 μΜ stock de trabalho); BSA 1% (1 g de BSA em 100 mL de I-IEPES 0,1 m, pl-l 7,5, guardado a “2 0 °C) , MgCl2 100 mM; Staurosporine 200 μΜ, 2χ reagente Kinase-Glo™ (feito de fresco ou guardado a -20 °C).

Arranjo para Ensaio Padrão para formato de 384 cavidades (reação de cinase 20 pL, reação de deteção 40 μη) : MgCl2 10 mM; poli Glu-Tyr 0,3 mg/mL; BSA 0,1%; composto de teste 1 pL (em DMSO); cinase MET 0,4 pg/mL; ATP 10 μΜ; tampao HEPES 100 mM. Os controlos positivos continham DMSO e nenhum composto de teste. Os controlos 10 pM. As reações de _r\ — 'J pela. adição de A TP. cl do. s a 21 °C dura nte 1 r o i Kinase-Glo™ fo ram ext. ingui r a reação de scência. Após 20 min de '±3 foi detetada num

As reações de cinase foram incubad cinase e iniciar a reação de lur incubação a 21 °C, a lumineí luminómetro de leitura de claca.

Ensaio de Enzima Baseado na Luminescência de AurA

Materiais: substrato de péptido Kemptide= LRRASLG (Biopeptide

San Diego,

CA), ATP (Sigma N

Cat. A-3377 167 ΡΕ2081937 FW=b51) , tampão HEPES, pH 7,5, Brij 35 10% (Calbiochem N° Cat. 203728), MgCl2, Staurosporine (Streptomyces sp. Sigma N‘ it. 85660-1MG), placa de fundo plano de 384 cavidades

Gostar branca (VWR N° Cat. 29444-088), cinase autofosfori-lada AurA (ver abaixo), Kinase-Glo™ (Promega N° Cat. V 6 712) .

Soluções de Stock: péptido Kemptide 10 mM (7,72 mg/mL em água), guardado a -20 °C; tampão HEPES 100 mM 4- Brij 35 0, 015%, pH 7,5 (stock HEPES 1 M 5 mL 4-

Brij 35 10% 75 pL + miliQH20 45 mL) ; ATP 10 mM (5,51 mg/mL em dH20) guardado a -20 °C (diluída 50 pL num total de 10 mL miliQH20 diariamente = ATP 50 pM stock de trabalho) ;

Staurosporine 200 μΜ, 2χ ;co ou guardado a -20 0 O ^ rro n 1“ ο ποολ-Γ'Ί n

Reação de Autofosforilação de AurA: ATP e MgClo foram adicionados a AurA 1-5 mg/mL em concentrações finai-de 10 mM e 100 mM, respetivamente. A reação de autofosfo-rilação foi incubada a 21 °C durante 2-3 h. A reação foi parada pela adição de EDTA a uma concentração final de 50 mM, e as amostras foram repentinamente congeladas com ISm liquido e guardadas a -80 °C.

Padrao para formato de 384 20 pL, reação de deteção

Arranjo para Ensaio cavidades (reação de cinase 40 pL) : MgCl2 10 mM; péptido Kemptide o,2 mM; composto de teste 1 pL (em DMSO); cinase AurA autofosforilada 0,3 pg/mL; ATP 10 pM; tampão HEPES 100 rpjyj _|_ g 015% Os 168 ΡΕ2081937 controlos positivos continham DMSO e nenhum composto de teste

Os controloí negativos :ontinham estaurosporina 5 μΜ. As reações de cinase foram iniciadas no instante t=0 pela adição de ATP. As reações de cinase foram incubadas a 21 °C durante 45 min, em seguida 20 pL de reagente Kinase- para extinguir a .uminescência. Após ência foi detetada

Glo™ foram adicionados a cada cavidade reação de cinase e iniciar a reação de 1 20 min de incubação a 21 °C, a luminesc num luminómetro de leitura de placa.

Purificação de Met:

Os metade duma expressando ressuspensos péletes celulares produzidos a partir de cultura de 12 L de células de insetos Sf9 o domínio de cinase do Met humano foram num tampão contendo Tris 50 mM-í-ICl pl-l 7,7 e

NaCI cultu de in 250 mM, num volume de aproximadamente 40 mL por 1 L de ra original. Um comprimido de Roche Complete, coquetel ibidor de protease livre de EDTA (N° Cat. 1873580) foi

adicionado por 1 L de cultura original. A suspensão foi agitada durante 1 hora a 4 °C. Os fragmentos foram removidos por centrifugação durante 30 minutos a 39 800xg a 4 °C. O sobrenadante foi decantado para um copo de boca larga de 50 0 mL e 10 mL de pasta a 50% de Oiagen Ni-NTA pré-equilihrada em Tris glicerol 10%, imidazole adicionados e agitados ra foi em seguida vertida

Ag a r o s e (N ° Cat. 30250) que t o i 50 mM-HCl pH 7,8, NaCI 50 mM, 10 mM, e metionina 10 mM, foram durante 30 minutos a 4 °C. A amost numa coluna de gotejamento 4 °C e lavada com 10 volumes 169 ΡΕ2081937 de coluna de Tris 50 rnM-HCl pH 7,8, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazole 10 1114 e metionina 10 mM. A proteína foi eluída usando ura gradiente de passos com dois volumes de coluna cada um do mesmo tampão contendo imidazole 50 mM, 200 mM e 500 mM, sequencialmente. A etiqueta I-Iistidina 6* foi clivada durante a noite usando 40 unidades de protease TEV (Invitrogen N° Cat. 10127017) por 1 mg de proteína enquanto de dialisava em Tris 50 mM-HCl pí-I 7,8, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazole 10 mM e metionina 10 mM a 4 °C. A etiqueta Histidina 6x foi removida passando a amostra sobre uma coluna IMAC 5 mL Pharmacia (N° Cat. 17-0409-01) carregada com níquel e equilibrada em Tris 50 mM-HCl pH 7,8, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazole 10 mM e metionina 10 mM. A proteína ligada à coluna de níquel a uma baixa afinidade e foi eluída com um gradiente de passos. O gradiente de passos foi corrido com 15% e em seguida 80% do lado B (lado A= Tris-HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazole 10 mM e metionina 10 mM; lado B= Tris 50 mM-HCl pH 7,8, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazole 50 0 mM e metionina 10 mM) para cada um dos 4 volumes de coluna. A proteína Met eluiu no primeiro passo (15%), enquanto o Met não clivado e a etiqueta Histidina clivada eluiu nas frações a 80%. As frações 15% foram combinadas após análise SDS-PAGE gel confirmou a presença de Met clivado; purificação adicional foi feita por cromatografia de filtração gel em Amersham Biosciences HiLoad 16/60 Superdex 200 grau prep (N° Cat. 17-1069-01) equilibrada em Tris 50 mM-HCl pH 8,5, NaCl 150 mM, glicerol 10% e DTT 5 mM. As frações mais limpas foram combinadas e 170 ΡΕ2081937 conce :aaas at de filtro em cer -1 uf 4 mg/mn por centrifugação numa unidade rífuga Amicon Ultra-15 10 000 Da MWCO (N°

Ensaios Celulares Células HCT116 foram mantidas em Meio 5a de McCoy suplementado com soro bovino fetal (FBS) 10%, L-glutamina 2 mM e 100 unidades de penicilina/100 çg de estreptomicina, a 37 °C em C02 5%,

Ensaios de Sobrevivência Celular

Os compostos foram testados nos seguintes ensaios em duplicado.

Ensaio XTT em. 96 cavidades: As células cresceram em meio de crescimento contendo várias concentrações de compostos (duplicados) numa placa de 96 cavidades de fundo plano durante 72 horas a 37 °C em C02 5%. O número de células de partida foi de 50 0 0 células por cavidade e o volume foi de 120 pL. No fim da incubação de 72 horas, 40 pL de mistura de rotulagem de XTT (solução 50:1 de sódio hidrato do ácido 3f-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazó-lio]-bis (4-metoxi-6-nitro)benzenossulfónico e reagente de acoplamento Electron: PMS (N-metil-dibenzopirazina-metil-sulfato) foram adicionados a cada cavidade da placa. Após um adicional de 2-6 horas 650 nm foi medido com um espetrofotómetro.

Ensaio de f osf orilaição de Histone-H3: Células HCT116 foram postas em placa a 1> <106 células por prato de 171 ΡΕ2081937 )χ15 mm (Falcon) em 3 mL de meio de crescimento (meio 5' de McCoy, FBS 10%, pen 1%-estrep) e i ncubadas du. noite (37 ΟΡ Ο CO2 5%). 0 composto do dia seguir adicionado β incubado durante 1 h (37 °C, C02 5%: toi 1 h, as células foram lavadas uma vez com lxPBS, e em seguida lisadas diretamente na placa com 100 pL de tampão de lise (Tris 125 mM-HCl pH 6,8 e 2xtampão de carga de SDS) e transferidas para um tubo de Eppendorf de 1,7 mL e postas em gelo. As amostras foram sujeitas a ultrassons durante aproximadamente 5 segundos e foram postas num bloco de aquecimento a 95 °C durante 3 minutos. Após o aquecimento, as amostras foram carregadas em NuPage 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) , seguido por transferência eletroforética para membranas de nitrocelulose 0,45 pm (Invitrogen). Após a transferência, as membranas foram colocadas em tampão de bloqueio Qiagen com Tween 0,1% durante 1 hora. à temperatura ambiente com balanço suave. Anticorpo anti-fosfo-Histona H3 (SerlO) (Upstate n° 06-570), foi diluído 1:250 em tampão de bloqueio e foi adicionado às manchas e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. A mancha foi em seguida lavada três vezes com 1*PBS + Tween20 0,1%, anticorpo secundário HRP de coelho anticabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. n° 111-035-003) foi diluído 1:3000 em tampão de bloqueio, e foi em seguida adicionado durante 1 h à temperatura ambiente. A mancha foi lavada três vezes com 1xPBS+Tween20 0,1%, e visualizada por quimioluminescência com SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce n° 34078). 172 ΡΕ2081937

Exemplo 25

Modelo Xenoenxerto de Tumor GTL16 Materials e Métodos

Ratos nus atímicos fêmeas (nu/nu de Harlan) com 6-8 semanas de idade com uma massa corporal no intervalo de 18-22 g no inicio do estudo. Os animais tiveram livre acesso a comida e água ao longo de todo o estudo. Os ratos foram alojados em Alpha-dri© bed-o-cobs® Laboratory Animal Bedding irradiadas em gaiolas isoladoras microestáticas com um ciclo de luz de 12 horas a 70-74 °F e 40-60% de humidade. Todos os procedimentos envolvendo os animais foram conduzidos em conformidade com. o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Anima 1s e todos os pr otocolos foram aprovados por um Internai Animal Care and Use

Committee (IACUC).

Análise de Western blot. e quantificação de marcador farmacodinâmico: Aproximadamente 100 mg de cada tumor foram homogeneizados em 2* volume de tampão RIPA (Upstate) mais inibidores de protease (Sigma) usando o Tissuelyser (Qiagen). 80 ug de cada lisado foram sujeitos a SDS-PAGS seguido por análise de Western blot oara detetar fosfo-Met (Cell Signaling) que foi em seguida quantificado usando o sistema de imagiologia Typhoon (GE Life Sciences).

Implantação de Tumor

Os xenoenxertos foram iniciados a partir de células de tumor GTL-16 cultivadas e mantidas por um 173 ΡΕ2081937

Departamento de Biologia Celular interno. Cada rato de teste recebeu uma injeção subcutânea de 4*106 células suspensas em 100 pL de meio RPM'í livre de soro. Os tumores foram aleatorizados era grupos de tratamento no Dia 5 quando o tamanho de tumor médio alcançou aproximadamente 150 mm3. Cada um dos grupos de dose continha n=5 ratos, O volume de tumor foi calculado usando a fórmula:

Volume de Tumor = (rv2 χ l) /2, tumor. A massa de que 1 mg é onde w = largura e 1 = comprimento em mm do do tumor pode ser estimada com a assunção equivalente a 1 mm3 de volume de tumor.

Análise da Inibição do Crescimento do Tumor (TGI) TGI (ou ICT) foi calculada a part ir da entre os volumes de tumor médios de r a t o s tratados com veiculo e tratados com fármaco, expressa na forma de uma percentagem.

Volume Tumor Médio^roio - Volume Tumor Médio,-c/ x 100 TGI % = -

Volume Tumor Médiocontroio 0 VTM é definido como o volume de tumor médio (VTM) para o número de animais, n, restantes no estudo naquele dia.

Resultados

A Figura 4 mostra os efeitos do Composto 124 administrado oralmente (PO) a 1, 3, 10, 30 mg/kg. O 174 ΡΕ2081937 tumores Ad 6 s a tratamento foi realizado no Dia 13 quando os alcançaram um volume de tumor médio de -65 0 mrrd. administração da dose, n=3 ratos foram sacrificados aos T=15 min, 2 h, 6 h, 12 h. Os tumores foram homogeneizados em tampão RIPA e inibidores de protease. 80 ug de lisado foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por análise de Western blot para detetar fosfo-Met e quantificar usando o sistema de imagiologia Typhoon, A Figura 6 mostra os efeitos da administração do

Composto 124 o ralmente (PO) a 1, 3, 10, 30 mg/kg duas vez es por dia (Q12H) durante 14,5 di as consecutivos. 0 tratamen to começou no Dia 6. No último dia de tratamento a Q12 H e doses PO de 1, 3, 10, 30 mg/kg diminuíram o volume de tumor médio de 32% (p=Q,0079), 55% (p<0,0001), 72% (p <0,0001) e 79% (p<0 ,0001) respetivamente comparando com o volume de tumor médio do grupo tratado c orn veículo. A Figura 7 mostra os efeitos da administre oral do Composto 124 sobre a inibição do crescimento tumor (TGI) em tumores GTL16 em ratos nus. Todos os tratamentos começaram no Dia 6 após o implante da célula tumoral. No fim do regime de dosagem de 14,5 dias, a TGI % foi calculada a partir da diferença entre os volumes de tumor médios de ratos tratados com veiculo e tratados com fármaco, expressa como uma percentagem do volume de tumor médio do grupo de controlo tratado com veiculo. 175 ΡΕ2081937

Abreviaturas PO per os (pela boca) Q12H Todas as 12 horas Q24H Todas as 24 horas RPMI Roswell Park Memorial Institute NIH National Institute of Health IACUC Animal Care and Use Committee MTV Volume de Tumor Médio PD Farmacodinâmica É compreendido que os Exemplos e formas de realização aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou trocas à sua luz serão sugeridas às pessoas peritas na técnica e são para serem incluídas dentro do âmbito e alcance das reivindicações apensas.

Lisboa, 8 de outubro de 2012

Claims (4)

1. ΡΕ2081937 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto selecionado de entre: U''VN, f ^\J f F 1 ΰ N 1 Sm h^y« n/ Ά,-'Α ^N^"CHa fVH. "Ν' •Ά HSC

   HscvN"r{, ν"':·'ν· h^-Xh-L h3cyn.^ 0-nN

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   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Um composto de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de cancro.
3. 3. Um composto ou um seu sal farmaceuticamente aceitável para utilização de acordo com a reivindicação 2 em que o cancro é cancro da mama, cancro do pulmão, melanoma, cancro colorretal, cancro da bexiga, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro renal, cancro da célula escamosa, glioblastoma, cancro do pâncreas, leiomios-sarcoma, mieloma múltiplo, carcinoma da células renais papilar, cancro gástrico, cancro de figado, cancro da cabeça e pescoço, melanoma ou leucemia.
4. 4. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 8 de outubro de 2012