PT2055786E - Anticorpos para pak fosfoespecíficos e kits de diagnóstico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS PARA PAK FOSFOESPECÍFICOS E KITS DE DIAGNÓSTICO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de proteínas quinases activadas por p21 fosforiladas (PAK) como biomarcadores de tumorigéntumorigénese, anticorpos fosfoespecíficos para detectar PAK fosforilada de biópsias de mamíferos e ensaios de rastreiorastreio para identificar compostos que modulam a actividade de PAK. Também é considerado um método para determinar um subconjunto de uma população determinada que é susceptível ao tratamento com um composto que modula a actividade de PAK.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A proteína quinase activada por p21 (PAK) serina/treonina quinases são importantes efectores das GTPases da família Rho e estão envolvidos na regulação de morfologia e motilidade celular, bem como na transformação celular. Veja-se Callow et al, (2002), J. Biol. Chem., vol. 277, N° 1, 550-558.

Um membro desta família de quinases, PAK 4, é sobre-expresso com frequência em linhas celulares tumorais humanas de diversas origens tecidulartecidulares. A sequência de aminoácidos de PAK4 compreende um sítio de auto-fosforilação no domínio quinase de PAK4. A mutação desta serina para ácido glutâmico (S474E) tem como resultado uma activação constitutiva da quinase. Os anticorpos fosfoespecíficos dirigidos contra a serina 474 detectam PAK4 activada na membrana do Golgi quando a PAK4 é co-expressa com Cdc42 activada. Além disso, a expressão do mutante PAK4 activo (S474E) tem potencial de transformação, o que provoca um crescimento independente de ancoragem das 2 células NIH3T3. A PAK 4 inactivada ao nível da quínase (K350A, K351A), por outro lado, bloqueia de forma eficaz a transformação através do Ras activado e inibe o crescimento independente da ancoragem das células de cancro de cólon HCT116. Portanto, a PAK 4 está fortemente envolvida na transformação oncogénica e sugere que a actividade do PAK4 é necessária para o crescimento independente de ancoragem estimulado por Ras. Veja-se Callow et al, mencionado anteriormente.

Até a data, identificaram-se seis pak humanas. A primera subfamília consiste em ΡΑΚΙ, PAK2 e PAK3, que apresentam uma identidade de sequência de 80-90% dentro dos seus domínios catalíticos. Os membros da segunda subfamília de PAK recentemente identificada, PAK4, PAK5 e PAK6, também estão altamente relacionados entre si, mas apresentam apenas 40-50% de identidade com os domínios quinase das PAK 1-3. Todos os membros da família de PAK caracterizam-se pela presença de um domínio de ligação p21, que se liga a GTPases da família Rho activadas (veja-se, Manser et al (1994) Nature 367, 40-46; Bagrodia et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 22731-22737; Knaus et al, (1995) Science 269, 221-223; Martin et al, (1995) EMBO J. 14, 1970-1978; Teo et al, (1995) J. Biol. Chem. 270, 26690-26697; e Abo et al, (1998) EMBO J. 17, 6527-6540) .

Como efectores de GTPases da família Rho, as quinases PAK desempenham uma função importante na regulação da morfologia e motilidade celular através da regulação do citosqueleto de actina. Veja-se, Sells et al, ( 1997) Curr. Biol. 7, 202-210 ; Sells et al, (2000) J. Cell Biol. 151, 1449-1457; Haung et al, (1998) Mol. Cell. Biol . 18, 7130- 7138; Zhoa et al, (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 2153-2163; Edwards et al, (1999) Nature Cell Biol. 1, 253-259; e Kiosses et 3.1 r (1999) J. Cell Biol. 147, 831-844. Por exemplo, a actividade de PAK foi envolvida na ligação localizada no bordo anterior e desligação no bordo 3 posterior das adesões focais durante a motilidade celular (Sells (1997), mencionado anteriormente; Frost et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 28191-28198; e Eby et al, (1998) Curr. Biol. 8, 967-970). Durante o tratamento de feridas de monocamadas de fibroblastos, a ΡΑΚΙ activada localiza-se rapidamente no bordo anterior a partir das células móveis (Sells et al (2000) mencionado anteriormente). Além disso, demonstrou-se que a sobre-expressão de PAK4 induz polimerização de actina localizada e formação de filopódios (Abo et al, (1998) mencionado anteriormente). As mudanças dependentes de PAK4 no citosqueleto de actina são dependentes da actividade quinase de PAK4 e localização dependente de Cdc42 na membrana do Golgi. A capacidade das pak para modular o citosqueleto de actina deve-se a mecanismos dependentes e independentes de quinase.

Qu et al, (2001) Molecular and Cellular Biology 21 (10), 3523 - 3533) sugerem que a PAK 4 é um mediador essencial no crescimento independente de ancoragem induzido por Cdc42 e factores de troca da família Dbl.

Sendo que a PAK 4 é um efector de Cdc42,mais provavelmente está associada a quimiotaxia, adesão celular, respostas inflamatórias e actividades imunológicas inatas. Por exemplo, existem cada vez mais provas que envolvem as quinases PAK em crescimento independente de ancoragem estimulado por Ras oncogénico e na regulação de sobrevivência celular. Veja-se, por exemplo, Qiu et al, (1995) Nature 374, 457-459; Qiu et al, (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 92, 11781-11785; Qiu et al, (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3449-3458; Khosravi-Far et al, (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 6443-6453; Prendergast et al, (1995) Oncogene 10, 2289-2296; Keely et al, (1997) Nature 390, 632-636; Tang et al, (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 4454-4464; Tang et al, (1998) Proc. Natl. Acad. Sei 95, 5139-5144; Tang et al, Chem. 274, 23633-23641. 4

No entanto, não existe nenhuma sugestão na técnica anterior para utilizar a PAK 4 fosforilada como um biomarcador para tumorigéntumorigénese em amostras de biopsia obtidas de mamíferos saudáveis e doentes. De forma semelhante, não existe nenhuma sugestão para a utilização de anticorpos fosfoespecíficos para PAK 4 para determinar o efeito de uma composição terapêutica num mamífero submetido a tratamento. De forma semelhante, a técnica não diz nada relativamente à utilização de ensaios de rastreio de fosforilação de PAK4 para identificar compostos que são úteis como moduladores da actividade de PAK. Também não existem ensinamentos na técnica anterior para a detecção e comparação de níveis de fosforilação de PAK como um meio para identificar subconjuntos de uma população dada que são susceptíveis ao tratamento com moduladores da actividade de PAK.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para seleccionar um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. Este método compreende (i) determinar a proporção de PAK4 fosforilada em relação à proteína PAK total numa biopsia de ensaio de um tecido de um mamífero candidato; e (ii) comparar a proporção de (i) em relação à PAK4 fosforilada com proteína PAK total numa biopsia de controlo que se obtém do mesmo tipo de tecido do que a biopsia de ensaio do mamífero candidato. Numa realização preferida, o mamífero candidato é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK4 se a proporção de PAK4 fosforilada em relação à proteína PAK total na biopsia de ensaio for maior do que a da biopsia de controlo.

Noutra realização, a biopsia de controlo obtém-se de um mamífero saudável da mesma espécie do que o mamífero candidato. Noutra realização mais, o mamífero candidato 5 compreende uma célula cancerígena. Noutra realização, o mamífero candidato tem um tumor.

Algumas realizações da divulgação referem-se à utilização de uma PAK diferente da PAK 4. No entanto, a invenção reivindicada limita-se a métodos que envolvem a PAK4 . A divulgação também proporciona um método para monitorizar o efeito de uma composição terapêutica num mamífero. Numa realização, o método compreende (i) medir um primeiro nível de fosforilação de PAK numa primeira biopsia obtida do mamífero antes da administração de uma composição terapêutica ao mamífero; e (ii) medir um segundo nível de fosforilação de PAK numa biopsia posterior obtida do mamífero após a administração da composição terapêutica. De acordo com o método, um menor nível de fosforilação de PAK na biopsia posterior em comparação com a primeira biopsia é indicativo de um efeito da composição terapêutica do mamífero. 0 método também considera numa realização, que ambas ou uma das biopsias são suspeitas de conter células capazes de crescimento celular independente de ancoragem. Como alternativa, numa outra realização, nem a primeira nem a segunda biopsia são suspeitas de conter células capazes de crescimento celular independente de ancoragem. Numa realização preferida, uma biopsia é uma biopsia tecidular. Nesse caso, numa realização, o tecido é tecido da mucosa bucal, pele, folículos pilosos, tecido tumoral ou medula óssea. 0 tecido também se pode obter de um órgão interno do mamífero a ensaiar. Numa outra realização, a biopsia é um fluido biológico. Numa outra realização mais, o fluido biológico é fluido sinovial, sangue fresco completo, células mono-nucleares de sangue periférico, sangue completo congelado, plasma fresco, plasma congelado, urina ou saliva. Numa outra realização, a primeira e posteriores biopsias recolhem-se de um tumor no mamífero. 6

Numa outra realização, a composição terapêutica modula directa ou indirectamente a fosforilação de pelo menos uma PAK. Numa realização preferida, mede-se a fosforilação de qualquer combinação de PAK4, PAK5 ou PAK6. Numa outra realização preferida, mede-se a fosforilação de PAK4.

Relativamente à temporização da dosagem ao mamífero, numa realização, o primeiro nível de PAK fosforilada na primeira biopsia obtida do mamífero mede-se pelo menos 1 dia, pelo menos 5 dias, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos um mês, antes de que se administre a composição terapêutica ao mamífero.

Numa realização, a administração da composição terapêutica compreende pelo menos uma dose da composição terapêutica. Numa outra realização, a administração da composição terapêutica compreende um regime de múltiplas doses da composição terapêutica. As doses podem administrar-se durante um período de 4 horas até aproximadamente 100 dias.

Numa outra realização, a biopsia posterior obtida de mamífero no método produz-se após a administração da dose final da composição terapêutica. Numa outra realização mais, obtêm-se múltiplas biopsias do mamífero durante o regime de dosagem da composição terapêutica.

De acordo com o método, a composição terapêutica, após a administração ao mamífero, pode provocar, ou conseguir, uma mudança numa ou em mais características fisiológicas, bioquímicas, genéticas, celulares ou imunológicas do mamífero. A divulgação também proporciona um método para seleccionar um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. Este método compreende medir o nível de PAK fosforilada numa biopsia de ensaio obtida de um mamífero candidato. Numa realização, um nível de PAK fosforilada na biopsia de ensaio que é maior do que o nível de PAK fosforilada numa biopsia de controlo indica 7 que o mamífero é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de ΡΆΚ.

Numa realização, a biopsia de controlo obtém-se do mesmo tipo de tecido do que a biopsia de ensaio do mamífero candidato. Numa realização preferida, a biopsia de controlo obtém-se de um mamífero saudável da mesma espécie que o mamífero candidato. Numa outra realização, o tipo de tecido é linfócitos. Numa outra realização mais, o tipo de tecido é de cérebro, coração, pulmão, mama, pele, intestino, cólon, estômago, bexiga. Numa realização adicional, o mamífero compreende uma célula cancerígena. A divulgação também proporciona um método para seleccionar de uma população de mamíferos que tem cancro, um mamífero que seja susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. Este método compreende (i) determinar um primeiro nível de PAK fosforilada numa biopsia tumorigénica obtida de um tecido de um mamífero candidato; (ii) determinar um segundo nível de PAK fosforilada numa biopsia não tumorigénica do mesmo tecido do mamífero candidato de (i) e (iii) comparar o primeiro e segundo nível de PAK fosforilada. Numa realização preferida, um nível de fosforilação de PAK que é maior no primeiro nível do que no segundo nível indica que o mamífero candidato é um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. A divulgação também proporciona um método para determinar o nível de PAK fosforilada numa biopsia de mamífero. Este método compreende (i) expor a biopsia a um anticorpo fosfoespecífico específico para PAK; e (ii) detectar o anticorpo. Numa realização preferida, o nível de anticorpo detectado correlaciona-se com o nível de PAK fosforilada na biopsia do mamífero. A divulgação também proporciona um anticorpo fosfoespecífico que é induzido num péptido de PAK4 que compreende uma serina fosforilada na posição 474 da sequência proteica de PAK 4. Numa realização, o péptido PAK 4 compreende a sequência de aminoácidos, KEVPRRKSLVGTPYWMAPE, que compreende uma serina fosforilada. A divulgação também proporciona um método para identificar um composto que modula a fosforilação de PAK. Este método compreende (i) adicionar um composto de ensaio a uma preparação de proteína PAK4; (ii) medir o nível de fosforilação da PAK4 utilizando um anticorpo fosfoespecífico dirigido contra PAK4 e (iii) comparar o nível da preparação de PAK4 tratada com o nível de fosforilação de uma preparação de PAK4 não tratada. Numa realização, um nível de fosforilação na preparação tratada que é diferente do nivel de fosforilação da preparação não tratada indica que o composto de ensaio é um composto que modula a fosforilação de PAK. Numa realização preferida, o composto de ensaio diminui, inibe, reduz ou regula de forma negativa o nível de PAK4 fosforilada na preparação.

Numa outra realização, a preparação de PAK4 compreende proteína PAK4 isolada de uma biopsia de um mamífero. Numa outra realização mais, a preparação de PAK 4 compreende proteína PAK4 produzida de forma recombinante. A divulgação também proporciona um método para identificar um composto que modula a fosforilação de PAK. Este método compreende, (i) expor uma cultura de células a um composto de ensaio; (ii) medir o nível de fosforilação de PAK utilizando um anticorpo fosfoespecífico dirigido contra PAK4; e (iii) comparar esse nível com o nível de fosforilação de PAK em células não tratadas. Numa realização, um nível de fosforilação que é menor ou maior do que o das células não tratadas indica que o composto de ensaio é um composto que modula a fosforilação de PAK. Numa realização preferida, o composto de ensaio diminui, inibe, reduz ou regula negativamente o nível de PAK fosforilada produzida pelas células tratadas. 9 A divulgação também proporciona um método para seleccionar um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. Este método compreende determinar se a proteína PAK4 é sobre-expressa numa biopsia obtida do mamífero. Numa realização, um nível de proteína PAK que é maior do que o nível normal da expressão de PAK4 numa amostra de biopsia do mesmo tipo de tecido, indica que o mamífero é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. A divulgação também proporciona outro método para seleccionar um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. Este método compreende (i) medir o nível de proteína PAK numa biopsia obtida de um primeiro tecido de um órgão de um mamífero candidato; (ii) medir o nível de proteína PAK4 numa biopsia obtida de um segundo tecido do órgão de um mamífero candidato; e (iii) comparar os dois níveis. Numa realização, uma diferença entre os níveis de proteína PAK4 nas duas biopsias indica que o mamífero candidato é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK.

Revela-se um outro método que é um método para seleccionar um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK que compreende (i) determinar se é sobre-expressado ARNm de PAK4 numa biopsia de um tecido obtido de um mamífero candidato. Numa realização, um nível de ARNm de PAK4 que é maior do que o nível normal de expressão de ARNm de PAK4 numa biopsia obtida de um tecido equivalente de um mamífero saudável conhecido indica que o mamífero candidato é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK.

As seguintes realizações são aplicáveis a todos os métodos da presente invenção. Deste modo, numa realização, um mamífero é seleccionado do grupo que consiste num ser humano, rato, ratinho, porco, vaca, cabra, macaco, gato e cão. Numa realização preferida, o mamífero é um ser humano. 10

Numa outra realização mais, o mamífero tem uma doença. Numa outra realização, a doença é um cancro. Numa outra realização mais, o cancro selecciona-se do grupo que consiste em cancro de tiróides, cancro colo-rectal, cancro pancreático, cancro de mama, cancro da parótida, cancro de células sinoviais, cancro de próstata, cancro de laringe, cancro testicular, cancro hepatocelular e leiomiossarcoma.

De forma semelhante, numa realização preferida de métodos da presente invenção, o nível de PAK fosforilada é determinado utilizando um anticorpo fosfoespecífico específico para serina fosforilada de PAK4. Numa realização, o anticorpo fosfoespecífico é produzido contra o péptido PAK4, RRKSLVGTPYWMAPE, que compreende uma serina fosforilada. Numa outra realização, que é aplicável a métodos da presente invenção o nível de proteína PAK4 total é determinado utilizando um anticorpo específico para PAK4. Numa realização preferida, o anticorpo específico para PAK4 é produzido contra a sequência peptídica, ATTARGGPGKAGSRGRFAGHSEA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta secções de tecido humano coradas para se detectar a presença de fosforilação de PAK4 num paciente com adenoma viloso com adenocarcinoma de alto grau in situ. Figura 1 (a) carcinoma de cólon in sítu/displasia de alto grau; (b) epitélio benigno distante de adenoma; e (c) coloração com hematoxilina e eosina. A FIGURA 2 apresenta secções de um paciente humano coradas para se detectar a fosforilação de PAK 4 de tecidos em adenocarcinoma metastásico de etapa III. Gráfico 2 (a) carcinoma de cólon in situ/displasia de alto grau; (b) epitélio benigno distante de adenoma; e (c) coloração com hematoxilina e eosina. 11

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS A presente invenção baseia-se na nova utilização de anticorpos de PAK4 fosfoespecíficos para determinar os niveis de PAK fosforilada em biopsias obtidas de tecidos de mamíferos de ensaio e de controlo.

Uma "biopsia" refere-se à extracção e exame de uma amostra de tecido de um corpo vivo com fins diagnósticos.

De acordo com a presente invenção, um "tecido" pode ser um tecido sólido, como o de qualquer órgão interno de um mamífero, como coração, pulmão, cérebro, fígado, estômago, pâncreas ou intestino. Um "tecido" também pode exemplificar-se com tecido de mucosa bucal, pele, folículos pilosos, tecido tumoral ou medula óssea. Um tecido pode ser também um fluido biológico, como fluido sinovial, sangue fresco completo, células mono-nucleares de sangue periférico, sangue completo congelado, plasma fresco, plasma congelado, urina ou saliva.

Uma "biopsia de ensaio" pode obter-se de um mamífero candidato, cujo nível de PAK fosforilada deve determinar-se . 0 mamífero candidato pode ser um mamífero suspeito de estar doente ou que de facto tenha uma doença. A doença pode ser cancro. Por exemplo, o mamífero candidato pode ter cancro de tiróides, cancro colo-rectal, cancro pancreático, cancro de mama, cancro da parótida, cancro de células sinoviais, cancro de próstata, cancro de laringe, cancro testicular, cancro hepatocelular ou leiomiossarcoma. Um mamífero candidato também se pode denominar "paciente". Deste modo, um "mamífero", ou "indivíduo" da presente invenção, pode ser um ser humano, rato, ratinho, porco, vaca, cabra, macaco, gato ou cão.

Uma "biopsia de controlo" pode obter-se de um mamífero saudável, como um que não tem uma doença, como cancro. 0 mamífero saudável deveria ser da mesma espécie que o mamífero candidato. Em consequência, o nível de 12 fosforilação de PAK numa biopsia "de ensaio" de fígado de um paciente humano com cancro compara-se com o nível de fosforilação de PAK numa biopsia "de controlo" de fígado de um ser humano saudável. Deste modo, tipicamente, a biopsia de controlo "saudável" recolhe-se do mesmo tipo de tecido que do tecido do qual se recolhe a biopsia de ensaio do mamífero candidato.

Como alternativa, a "biopsia de controlo" pode recolher-se de um sítio sem doença (por exemplo, um sítio não tumorigénico) de um tecido ou órgão doente do qual se obtém a biopsia de ensaio. Neste caso, tanto a biopsia de controlo como a biopsia de ensaio obtêm-se do mesmo mamífero. Tanto a biopsia de controlo como a biopsia de ensaio deveriam ser do mesmo tamanho, peso, número de células ou quantidade, por exemplo, antes da determinação da actividade de PAK. Ambas ou uma das biopsias de controlo e ensaio podem ser modificadas, como cortar-se, diluir-se ou manusear-se de algum modo para garantir que são essencialmente iguais em número de células, tamanho ou peso, por exemplo. O acrónimo "PAK", como é utilizado na presente invenção, refere-se às proteínas quinases activadas por p21, PAK 4, PAK5 e PAK6. Em consequência, ser capaz de detectar níveis anormalmente elevados dessas PAK, especialmente PAK 4, em amostras de mamíferos é útil para identificar compostos que modulam (isto é, inibem, diminuem, regulam negativamente ou reduzem) a actividade de PAK. Esses compostos podem depois de ser formulados em composições terapêuticas e ser administrados a mamíferos que requerem regulação negativa da actividade de PAK. Os indivíduos que "requerem" regulação negativa da actividade de PAK são tipicamente aqueles indivíduos que têm uma população de células que apresentam crescimento independente de ancoragem (veja-se posteriormente). Além disso, a detecção de proteína PAK fosforilada numa amostra 13 obtida directamente de um indivíduo tratado com um modulador de PAK permite controlar a eficácia do tratamento terapêutico ao longo do tempo. Identificar indivíduos que compreendem níveis elevados de proteína PAK fosforilada é uma primeira etapa útil na identificação de indivíduos que podem ser susceptíveis ao tratamento com um modulador de PAK.

Com esta finalidade, um indivíduo que tem um nível de PAK fosforilada numa biopsia de ensaio que é maior do que o normalmente associado com o tecido do qual se obteve, tem um nível anómalo de PAK que é potencialmente tratável com um modulador de PAK. Um "modulador" da presente invenção preferentemente diminui a actividade de PAK. Os níveis elevados de PAK fosforilada, especialmente PAK4 activada, correlacionam-se bem com células que têm uma propensão aumentada a experimentar crescimento independente de ancoragem. Este último fenómeno é um mecanismo que se sabe que é um factor atribuível na formação de tumores e crescimentos de cancro. Por exemplo, sabe-se que o crescimento independente de ancoragem significa que células viáveis obtidas de uma biopsia de tumor podem formar colónias no meio de cultura semi-sólida. Ao contrário, as células dependentes de ancoragem não podem formar essas colónias. Em consequência, um nível de PAK fosforilada que é maior que o que é considerado normal, é um bom biomarcador de tumorigéntumorigénese, porque esses níveis elevados são indicadores de crescimento celular independente de ancoragem.

Os métodos revelados aplicam a detecção de níveis de referência, aumentados e anómalos de fosforilação de PAK a diversos fins diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, um método revelado controla o efeito de uma composição terapêutica num mamífero, como um paciente humano, através da comparação do nível de fosforilação de PAK em amostras de biopsia recolhidas antes e depois do tratamento com a 14 composição terapêutica. Antes de tratar o indivíduo, no entanto, preferentemente deveria identificar-se primeiro que o indivíduo realmente necessita desse tratamento. Em consequência, determinar a actividade de PAK endógena ajuda a determinar se a actividade de PAK do paciente necessita de ser regulada de forma negativa. A presente invenção proporciona um método para seleccionar um mamífero que é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK4 .

Pode conseguir-se um método de selecção tal de diferentes formas. Por exemplo, é possível determinar a proporção de PAK fosforilada em relação à proteína PAK4 total numa biopsia de ensaio obtida de um tecido de um mamífero candidato. Esses níveis podem depois ser comparados com a mesma proporção medida no mesmo tipo de tecido, mas num mamífero controlo saudável da mesma espécie que o mamífero candidato. É possível ensaiar vários desses indivíduos saudáveis para obter um conjunto de proporções de PAK fosforilada em relação à proteína PAK4 total "normais" para órgãos e tecidos particulares. Em consequência, uma proporção, de um paciente, que é maior que a normal indica que esse paciente provavelmente é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK. Como alternativa, a proporção de PAK fosforilada em relação à PAK4 pode comparar-se na biopsia de ensaio e uma biopsia de controlo do mesmo paciente. 0 paciente, neste contexto, pode ter já uma doença diagnosticada, como cancro. Deste modo, a presente invenção considera seleccionar um subconjunto de pacientes com cancro que se beneficiariam do tratamento com um modulador de PAK. Em consequência, é possível utilizar o método da invenção para comparar os níveis de PAK fosforilada numa biopsia de ensaio de um tumor de um paciente (isto é, "mamífero candidato") com uma biopsia de controlo obtida de um tecido não tumorigénico do mesmo órgão ou tecido, ou um 15 adjacente. De acordo com a invenção, um maior nível de fosforilação de ΡΆΚ na biopsia do tumor que no tecido não tumorigénico indica que esse paciente de cancro é susceptível de tratamento com um modulador de actividade de PAK.

De acordo com a presente invenção, a PAK4 fosforilada e a proteína PAK4 total podem detectar-se utilizando anticorpos que reconhecem a forma fosforilada de PAK4 e a proteína PAK4 em geral. A presente invenção proporciona um método, então, para determinar o nível de PAK fosforilada numa biopsia de ensaio de mamífero através da exposição da biopsia de ensaio a, por exemplo, um anticorpo fosfoespecífico, específico para PAK. 0 anticorpo pode marcar-se para que seja facilmente detectável. Deste modo, a quantidade de anticorpo que se liga a PAK4 fosforilada numa amostra, se correlaciona com o nível de PAK fosforilada na biopsia de ensaio. Esse anticorpo fosfoespecífico pode ser desenhado para a serina 474 fosforilada da proteína PAK4. Por exemplo, um anticorpo pode produzir-se contra a sequência peptídica de PAK4, rrkslvgtpy-wmape (SEQ id N° 1), em que a serina 474 compreende uma fracção de fosfato (negrita, sublinhado). Os anticorpos produzidos contra outras sequências peptídicas que compreendem a serina fosforilada 474 também se consideram na presente invenção.

De forma semelhante, a sequência peptídica, ATTARGGPGKAGSRGRFAGHSEA (SEQ ID N° 2), é exclusiva de PAK4 e pode utilizar-se para produzir um anticorpo que reconhece e se liga a esta sequência particular. Em consequência, um anticorpo induzido na SEQ ID N° 2 para detectar a proteína PAK4 por si própria é considerado na presente invenção.

Os anticorpos da presente invenção podem ser monoclonais, policlonais ou uma molécula de cadeia simples recombinante específica. Um anticorpo da presente invenção também se pode marcar para que seja detectável. Por 16 exemplo, um anticorpo pode conjugar-se ou realizar uma ligação cruzada com uma enzima, fluoróforo ou cromóforo para ajudar a detecção do anticorpo após a ligação com o seu alvo pretendida. Como alternativa, pode utilizar-se um anticorpo secundário marcado de forma semelhante que se liga ao anticorpo especifico de PAK, facilitando deste modo a detecção do anticorpo ligado.

Com esses anticorpos, é possível rastrear compostos de ensaio que modulam a actividade de PAK. A divulgação também proporciona um método para identificar um composto que modula a fosforilação de PAK através da medição do nível de fosforilação de PAK4 isolada e/ou purificada antes e depois da administração de um composto de ensaio. A PAK4 isolada ou purificada pode obter-se a partir de células lisadas ou produzir-se de forma recombinante. 0 composto de ensaio também se pode administrar a células completas que se ensaiam posteriormente com um anticorpo fosfoespecífico para PAK para determinar o efeito do composto de ensaio na actividade de PAK nas células. Após identificado como modulador da actividade de PAK, o composto de ensaio pode formular-se numa composição terapêutica para a sua administração a um mamífero in vivo, ex vivo e in vitro.

Antes do tratamento com uma composição terapêutica, pode recolher-se uma biopsia de ensaio do mamífero alvo para estabelecer o nível de fosforilação de PAK num tecido particular. Deste modo, a biopsia de ensaio pode recolher-se 1, 5, 7, 14 ou 30 dias, por exemplo, antes do tratamento com a composição terapêutica. Podem recolher-se múltiplas biopsias de ensaio do mesmo tecido durante esse tempo para determinar um nível de fosforilação de PAK "médio" e para considerar possíveis flutuações nesses níveis. Após esse tempo, o mamífero pode submeter-se a um regime de dosagem particular em que a composição terapêutica é administrada diariamente, semanalmente ou mensalmente, por exemplo. A composição terapêutica pode administrar-se em pelo menos 17 uma dose da composição terapêutica, ou pelo menos duas doses, ou pelo menos 5 ou pelo menos 10 dose, até pelo menos 55 ou 56 doses. Estas doses podem administrar-se durante um período de 4 horas até aproximadamente 100 dias. As doses podem administrar-se durante um período de 24 horas, 2 dias ou 28 dias. Como alternativa, podem administrar-se duas doses a cada 24 horas ou administrar-se aproximadamente a cada 12 horas. Os peritos na especialidade entenderão que a administração da composição terapêutica pode ser alterada para se adequar às necessidades individuais do mamífero a tratar. Por exemplo, num regime de dosagem típico, o paciente recebe duas doses por dia de composição terapêutica, durante vários dias, tal como aproximadamente 28 ou aproximadamente 56 dias. Noutros regimes de dosagem, a composição terapêutica é administrada aproximadamente uma vez por dia, duas vezes por semana ou uma vez por semana.

Após acabado o regime de dosagem, recolhe-se uma outra biopsia posterior do mesmo tecido que o utilizado para proporcionar a biopsia "de ensaio". O nível de fosforilação de PAK nesta biopsia posterior então é determinado de acordo com os métodos da invenção e é comparada com os níveis determinados antes do tratamento. O efeito da composição terapêutica no mamífero pode, portanto, estabelecer-se através de uma diminuição no nível de fosforilação de PAK após o tratamento ou identificando alterações nos aspectos fisiológicos, bioquímicos, genéticos ou imunológicos do mamífero. As biopsias também podem ser recolhidas durante o regime de dosagem e utilizar-se para determinar a eficácia da composição terapêutica no mamífero enquanto continua o tratamento.

Pretende-se que os exemplos de seguida ilustrem mas não limitem a invenção. Apesar de serem os típicos que poderiam utilizar-se, podem ser utilizados outros procedimentos conhecidos pelos peritos na especialidade. 18

EXEMPLOS EXEMPLO I ANTICORPOS

Anticorpos policlonais de coelho contra proteína PAK 4 total (N° 933) foram produzidos contra o péptido ATTARGGPGKAGSRGRFAGHSEA (SEQ ID N° 2), que representa os aminoácidos 122-144 da proteína PAK4. 0 anticorpo de coelho policlonal anti-PAK4 fosfoespecífico N° 108 foi produzido contra o fosfopéptido conjugado com KLH sintetizado com Ser-474 fosforilada (CRRKpSLVGTPYWMAPE) (SEQ ID N° 1) . A sequência, RRKSLVGTPYWMAPE, de SEQ ID N° 1 abrange a região 371-385 da sequência da proteína PAK4. Os soros policlonais contra PAK4 fosfoespecíficos N° 108 purificaram-se adicionalmente numa coluna de afinidade de proteína A. A especificidade dos soros purificados com proteína A para PAK4 fosforilada foi confirmada através de ensaiocom péptidos antigénicos CRRKpSLVGTPYWMAPE (SEQ ID N° 1), versões não fosforilada CRRKSLVGTPYWMAPE (SEQ ID N° 3) (isto é, péptido "N° 704") e fosforilada em Thr-478 (CRRKSLVGpTPYWMAPE) (SEQ ID N° 4) (isto é, péptido "N° 681") do péptido de PAK4 para confirmar a especificidade para a serina fosforilada 474. Retirou-se qualquer anticorpo que apresentasse uma reacção cruzada com o péptido não fosforilado passando os soros purificados com proteína A através do péptido N° 681 acoplado a uma coluna de Iodoacetilo-Ultralink (Pierce, Estados Unidos).

Para as análises de transferência de Western, utilizaram-se os soros anti PAK4 fosfoespecíficos purificados com proteína A (serina 474 fosforilada) a uma diluição 1/4000. Para as experiências de imuno-fluorescência, o anticorpo anti PAK4 fosfoespecifico purificado com proteína A foi pré-adsorvido com os péptidos N° 681 e N° 704. As diluições dos anticorpos de PAK4 utilizadas para a imuno-histoquímica são as seguintes: Para o N° 108 preferiu-se o intervalo de diluição de 1/250 a 19 1/100 para os métodos de IHC; para o N° 933 o intervalo de diluição variou 1/50 para o método de Vector Red, enquanto foi utilizada uma diluição de até 1/200 para o método de coloração ABC.

Exemplo II

Protocolo IHC para Anticorpos Primários de Coelho

Utilizou-se um micrótomo para cortar secções de tecido a 4-5 micrómetros. Veja-se o Quadro 1 abaixo para exemplos dos tipos de tecido utilizados na presente invenção. As secções colocaram-se a flutuar num banho de água e recolheram-se em lâminas. As lâminas que continham secções de parafina foram desparafinizadas com xileno e álcool, foram re-hidratadas e depois foram submetidas a método de vapor de recuperação do alvo (reagente DAKO N° S1700) . Realizaram-se experiências imuno-histoquimicas num DAKO Autostainer seguindo os procedimentos e reagentes desenvolvidos pela DAKO. Especificamente, as lâminas foram bloqueadas (o agente bloqueante vem incluído no kit Vectastain ABC-AP), lavadas com águas, aplicou-se o anticorpo primário, incubaram-se durante 45 minutos a temperatura ambiente e lavaram-se as lâminas com água novamente. Aplicou-se depois o anticorpo secundário biotinilado (anticorpo secundário anti-ratinho de Vector, BA-100, diluído a 5 μΐ/ml) ao tecido na lâmina. As lâminas foram incubadas posteriormente durante 30 minutos a temperatura ambiente, lavaram-se com água, e foi aplicado o reagente ABC-AP de Vector (AK-5000). Utilizou-se o Vector Red (SK-5100) como um substrato para Vector ABC-AP (AK-5000) . Obteve-se o anticorpo controlo, CD31, de DAKO (monoclonal de ratinho M0823) e utilizou-se seguindo as suas condições a uma diluição de 1:80 para assegurar a qualidade e integridade do tecido de amostra. 20

Exemplo III

Procedimento de Imuno-peroxidase ABC (i) Preparação das lâminas 1. Cortar secções de tecido de 4 [im em lâminas carregadas. Veja-se Quadro 1 a seguir para exemplos de tipos de tecido utilizados na presente invenção. Colocar lâminas num forno de secagem a 60°C durante 20 minutos. Como alternativa, as lâminas podem secar-se com ar durante a noite, se desejado. 2. Etiquetar as lâminas e colocá-las em grelhas. 3. Eliminar a parafina e re-hidratar as lâminas (3 mudanças de xileno-10 minutos seguido de etanol a 100% 3X, etanol a 95% 2X-10 minutos totais; enxaguar com água destilada). 4. Bloquear peroxidase endógena: colocar as lâminas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 5 minutos. 5. Enxaguar as lâminas com água destilada. 6. Pré-tratamentos: Realizar pré-tratamento se desejado. Observar que o possivel pré-tratamento inclui digestão com protease ou outra enzima de aquecimento das lâminas em tampão citrato 10 mM, pH 6,0 ou tampão EDTA, pH 8,0. Permitir que arrefeçam gradualmente as lâminas tratadas com calor (durante 20 minutos no tampão) antes de transferi-las para a água destilada. Não permitir que as lâminas sequem. 7. Bloqueio de Biotina Endógeno: Realizar procedimentos de bloqueio de biotina se pretendido, utilizando, por exemplo, um kit Vector de DAKO. Como alternativa, usar o seguinte método: adicionar 200 ml de água destilada a 75 ml de substituto de ovo; molhar as lâminas durante 15 minutos na mistura de ovo, enxaguar em água destilada duas vezes; molhar as lâminas durante 15 minutos em leite magro; enxaguar em água destilada duas vezes; transferir as lâminas a PBST (tampão PBS mais Tween). 21 8. Lavar em três mudanças de PBST; no entanto, observar que alguns anticorpos são sensíveis a Tween-20, em cujo caso não se deveria adicionar Tween-20 ao tampão de PBS. (ii) Aplicação de Anticorpo 1. Primário: Diluir anticorpo primário de ratinho (isto é, o anticorpo de PAK4 fosfoespecíf ico ou o anticorpo de PAK4 total) em PBS com BSA a 1%. Para anticorpos monoclonais purificados, habitualmente são óptimas concentrações no intervalo de 1-5 μρ/πιΐ. Devem determinar-se as concentrações reais, no entanto através de titulação. Aplicar um volume adequado, por exemplo, de aproximadamente 100 μΐ, do anticorpo primário diluído no tecido; cobrir o tecido completo. 2. Incubar as lâminas durante 40 minutos numa câmara húmida a temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Entretanto preparar anticorpo secundário e reagente terciário (por exemplo, IgG biotinilado anti-ratinho de cavalo de Vector (H+L) diluído 1:300 para primários de ratinho monoclonais e ABC Vector Elite) . Tipicamente, o anticorpo secundário dirige-se à mesma espécie em que foi preparado o anticorpo primário. 3. Lavar as lâminas em três mudanças de solução PBST. 4. Aplicar o anticorpo secundário biotinilado e incubar durante 30 minutos numa câmara húmida a temperatura ambiente. 5. Lavar as lâminas em 3 mudanças de pBST como anteriormente. 6. Aplicar terciário (ABC) a lâminas e incubar durante 25 minutos numa câmara húmida a temperatura ambiente. 7. Durante a incubação encher dois recipientes de grelhas de lâminas com 175 ml de tampão Tris 0,05 M e colocar num banho de água a 37°C para pré-aquecer. Descongelar uma alíquota congelada de diaminobenzidina (DAB). 22 8. Lavar em 3 mudanças de PBST durante um mínimo de 10 minutos. 9. Enxaguar as lâminas em tampão Tris 0,05 M pré-aquecido, pH 7,8-8,0. 10. Colocar as lâminas numa solução de DAB e incubar durante 8 minutos. 11. Lavar as lâminas duas vezes em água destilada. 12. Realizar a contra-coloração nas lâminas com hematoxilina de Mayer durante 25-30 segundos. 13. Enxaguar as lâminas em água até estarem transparentes. 14. Colocar as lâminas em hematoxilina azul, que se dissolve em água com amoníaco a 0,5%, durante aproximadamente 30 segundos. Lavar com três mudanças de água. 15. Desidratar as lâminas com etanol a 95% duas vezes e com etanol a 100% três vezes e enxaguar com três lavagens de xileno. 16. Colocar um lamínula utilizando meio de montagem compatível com xileno e lamínula de vidro ou fita.

Exemplo IV Imuno-fluorescência

As lamínulas colocaram-se em placas de cultura de tecido de 24 poços e semearam-se a uma densidade de 2 x 104 células por poço. As células transfectaram-se no dia seguinte com um vector de expressão de mamíferos que dirige a expressão de um clone de PAK4 humana. O meio foi substituído seis horas após a transfecção e deixou-se que as células crescessem durante 48 horas. Foram lavadas as lamínulas de forma prolongada com PBS e depois foram fixas com paraformaldeído a 4% frio. As células fixas foram solubilizadas utilizando uma solução convencional de Triton-X-100 a 0,5%, lavaram-se e incubaram-se com anticorpos primários diluídos em PBS que continha BSA a 1%, 23 soro de coelho purificado com Proteína A dirigido contra o péptido N° 682 (S474-fosfoespecífico), foram dessalgados e foi confirmada a especificidade relativamente a S474 fosfoespecífico mediante análise de transferência de Western antes da sua utilização. Utilizou-se o anticorpo HA-7 (Sigma, Estados Unidos) para detectar PAK4 exógena. A PAK4 expressa compreende um marcador de epítopo reconhecido por anticorpo HA-7 fundido com a sua extremidade N terminal. As lamínulas foram lavadas de forma prolongada com PBS e incubaram-se com um anticorpo secundário para coelho oc de cabra conjugado com rodamina (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Estados Unidos) ou com um anticorpo para ratinho α conjugado com isotiocianato de fluoresceína("FITC") de de cabra conjugado com fitc (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Estados Unidos), junto com Hoechst N° 33342 1 μg/ml (bis-Bencimida, Sigma, Estados Unidos) na escuridão durante duas horas a temperatura ambiente. As lamínulas foram lavadas e montadas em Fluorosave (Calbiochem Corp., Estados Unidos) e deixou-se que secassem durante a noite. Conseguiram-se as imagens utilizando uma objectiva de 1,30/ 40 x com emersão em óleo de Nikon, num microscópio Nikon Eclipse E800 com uma câmara SPOT RT.

Quadro 1

Amostra Tecido Diagnóstico Idade/Sexo 1 1 Cérebro Normal 74 M 2 Cérebro Normal N/A 2 1 Cérebro Glioblastoma Multiforme 49 M 2 Cérebro Glioblastoma Multiforme 49 M 3 1 Mama Normal 49 F 2 Mama Normal 49 F 4 1 Mama Adenocarcinoma. Metastásico 79 F 2 Mama Adenocarcinoma. Metastásico 62 F 24 (cont.)

Amostra Tecido Diagnóstico Idade/Sexo 5 1 Mama Adenocarcinoma, Intraductal F 2 Mama Adenocarcinoma, Intraductal 54 F 6 1 Mama Adenocarcinoma, Não-Metastásico Local F 2 Mama Adenocarcinoma, Não-Metastásico Local Addendum 7 1 Cólon Normal N/A 2 Cólon Normal F 8 1 Cólon Adenocarcinoma, In Situ ou Micro-invasivo N/A 2 Cólon Adenocarcinoma, In Situ ou Micro-invasivo 68 M 9 1 Cólon Adenocarcinoma, Metastásico 54 M 2 Cólon Adenocarcinoma, Metastásico 57 F 10 1 Cólon Adenocarcinoma, Não-Metastásico Local 68 M 2 Cólon Adenocarcinoma, Não-Metastásico Local 75 F 11 1 Rim Normal 52 F 2 Rim Normal 49 F 12 1 Rim Carcinoma de células Renais <7cm 66 M 2 Rim Carcinoma de células Renais <7cm 33 M 13 1 Rim Carcinoma de células Renales >7cm 67 M 25 (cont.)

Amostra Tecido Diagnóstico idade/Sexo 2 Rim Carcinoma de células Renais >7cm 79 M 14 1 Pulmão Normal 36 F 2 Pulmão Normal 76 F 15 1 Pulmão Adenocarcinoma, Metastásico 65 M 2 Pulmão Adenocarcinoma, Metastásico 34 F 16 1 Pulmão Adenocarcinoma, Não-Metastásico (Tl, Etapa fa) 75 F 2 Pulmão Adenocarcinoma, Não-Metastásico (Tl, Etapa Ia) 66 M 17 1 Pulmão Adenocarcinoma, Não-Metastásico (T2, Etapa Ib) 73 M 2 Pulmão Adenocarcinoma, Não-Metastásico (T2, Etapa Ib) Addendum 18 1 Ovário Normal F 2 Ovário Normal F 19 1 Ovário Tumor Seroso ou Mucoso limite F 2 Ovário Tumor Seroso ou Mucoso de limite 26 F 20 1 Ovário Carcinoma Seroso Papilar 39 F 2 Ovário Carcinoma Seroso Papilar (Limitado a Ovário) Addendum 26 (cont.)

Amostra Tecido Diagnóstico idade/Sexo 3 Ovário Carcinoma Seroso Papilar (Limitado a Ovário) Addendum 21 1 Ovário Carcinoma Seroso Papilar com Metástase 26 F 2 Ovário Carcinoma Seroso Papilar com Metástase F 22 1 Próstata Normal 18 M 2 Próstata Normal 55 M 23 1 Próstata Adenocarcinoma (Gleason 2-6) 64 M 2 Próstata Adenocarcinoma (Gleason 2-6) 65 M 24 1 Próstata Adenocarcinoma (Gleason 7-10) 66 M 2 Próstata Adenocarcinoma (Gleason 7-10) 60 M 25 1 Próstata Adenocarcinoma, Metastásico 75 M 2 Próstata Adenocarcinoma, Metastásico 71 M 26 1 Pele Normal 72 M 2 Pele Normal 7 F 27 1 Pele Angiosarcoma 92 F 2 Pele Angiosarcoma Addendum 28 1 Pele Sarcoma de Kaposi 46 M 2 Pele Sarcoma de Kaposi Addendum 29 1 Vaso, Artéria, Coronária Normal 69 M 27 (cont.)

Amostra Tecido Diagnóstico idade/Sexo 2 Vaso, Artéria, Coronária Normal 26 F

Exemplo V Resultados

Os dados para o anticorpo fosfoespecífico (N° 108) em carcinomas de cólon são especialmente informativos (6 de 6 pacientes apresentaram coloração perinuclear notável em tecido tumoral e benigno não distai; observe-se que a coloração se detectou utilizando substrato de Vector Red, que proporciona um depósito de cor fúcsia/vermelho. Este resultado sugere firmemente que PAK4 é especificamente activo nas células tumorais de cólon e não em tecido de cólon benigno do mesmo paciente. A coloração de PAK4 fosforilada também se observou em carcinoma de células renais, adenocarcinoma de pulmão, adenocarcinoma prostático, adenocarcinoma de mama intraductal e adenocarcinoma de ovário.

Em tumores, uma coloração forte com anticorpo de PAK4 fosfoespecífico identificou-se em adenocarcinomas de cólon (enquanto o tecido benigno distai não mostrou coloração de fosfo—PAK4). Numa escala de 0-3, "0" indica sem coloração, "1" indica coloração débil, "2" indica coloração moderada e "3" indica coloração forte. O epitélio adenomatoso foi positivo de débil a moderadamente, mas a maior parte do epitélio normal apresentou apenas coloração de "1" para PAK4 fosforilada. Os adenocarcinomas prostáticos apresentaram coloração moderada ("2") .

Em tecidos benignos, a coloração mais proeminente para PAK4 fosforilada detectou-se em adipócitos, miócitos cardíacos, glândulas sebáceas e macrófagos ocasionais. Os tipos celulares e tecidulares positivos adicionais 28 incluíram folículos pilosos, epitélio prostático benigno, epitélio de mama e urotélio. Os tipos celulares negativos para PAK4 fosforilada incluíram pneumócitos, ovócitos, fibroblastos, células nevróglicas, neurónios corticais, glomérulos renais, epitélio tubular renal diferente de tubos colectores, ovócitos, estroma ovárico e epitélio da superfície ovárica.

Ocasionalmente, foram positivos neutrófilos e eosinófilos. Identificou-se um resultado positivo menos proeminente em tubos colectores renais, alças largas de Henle, mastócitos e epitélio colónico benigno. Identificou-se uma coloração débil ("1") em epitélio respiratório, células granulosas ováricas, células da teca, glândulas sudoríparas écrinas, estroma prostático e focalmente em endotélio e músculo liso vascular. Foram tingidas várias amostras de epitélio escamoso na camada basal. Os linfócitos também apresentaram coloração ocasional.

Em consequência, um nível de PAK4 consolidada que está acima do normal num determinado tecido é um biomarcador útil para determinar a integridade e estado das células do tecido. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Sugen, inc. <120> Anticorpos para PAK fosfoespecíficos e kits de diagnóstico <130> PC23574 <150> US 60/429.363 <151> 27-11-2002 <160> 5 29 <17 0> Patentin versão <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_ RES <222> (5) . . (5) <223> Ser fosforilada <400> 1

Cys Arg Arg L.ys ser leu Vai Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu 1 S 10 15 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Thr Thr Ala Arg Gly Gly Pro Gly Lys Ala Gly Ser Arg Gly Arg 1 5 10 15 Phe Ala Gly His Ser Glu Ala 20

<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 30

Cys Arg Arg Lys Ser Leu Vai Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu 15 10 15

<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (9) .. (9) <223> Thr fosforilada <400> 4

Cys Arg Arg Lys Ser Leu Vai Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu 15 10 15 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_ RES <222> (8) . . (8) <223> Ser fosforil <400> 5

Lys Glu val Pro Arg Arg Lys Ser Leu Vai Gly Thr Pro Tyr Trp Met 15 10 15

Alá Pro Glu 31

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

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Claims (2)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para seleccionar um mamífero susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK4, que compreende: (i) determinar a proporção de PAK4 fosforilada em relação à proteína PAK4 total numa biopsia de ensaio de um tecido de um mamífero candidato; e (ii) comparar a proporção de (i) com a proporção de PAK4 fosforilada em relação à proteína PAK4 total numa biopsia de controlo que se obtém do mesmo tipo de tecido do que a biopsia de ensaio do mamífero candidato, em que o mamífero candidato é susceptível ao tratamento com um modulador da actividade de PAK4 se a proporção de PAK4 fosforilada em relação à proteína PAK4 total na biopsia de ensaio for maior do que o da biopsia de controlo. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a biopsia de controlo se obtém de um mamífero saudável da mesma espécie que o mamífero candidato. 3. 0 método da reivindicação 1, em que o mamífero candidato compreende uma célula cancerígena. 4. 0 método da reivindicação 1, em que o mamífero candidato tem um tumor. 5. 0 método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o mamífero candidato é seleccionado do grupo que consiste num ser humano, rato, ratinho, porco, vaca, cabra, macaco, gato e cão. 2 6. 0 método da reivindicação 5, em que o mamífero é um ser humano. 7. 0 método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o nível de PAK4 fosforilada é determinado utilizando um anticorpo fosfoespecífico específico para a serina fosforilada de PAK4. 8. 0 método da reivindicação 7, em que o anticorpo fosfoespecífico é produzido contra o péptido PAK4, RRKSLVGTPY-WMAPE (SEQ ID N°: 1), que compreende uma serina fosforilada. 9. 0 método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o nível de proteína PAK4 total é determinado utilizando um anticorpo específico para PAK4.

10. O método da reivindicação 9, em que o anticorpo específico para PAK4 é produzido contra a sequência peptídica ATTARGGPG-KAGSRGRFAGHSEA (SEQ ID N°: 2). A. Paciente com adenoma viloso com adenocarcinoma de alto grau in situ

1/2 Carcinoma de cólon In Situ/displasia de alto grau Epitélio benigno distante de adenoma ColoraçãoColoração com hematoxilina e eosina Figura 1 2/2 Β. Paciente com adenocarcinoma metastásico de etapa III Adenocarcinoma de cólon

Epitélio benigno

ColoraçãoColoração com hematoxilina e eosina

C. Secção de cólon normal do paciente (detalhes do paciente desconhecidos) Figura 2