BRPI0622227A2 - complexo, anticorpo, mÉtodos para identificar um inibidor deste complexo, inibidor, composiÇço farmacÊutica, mÉtodos para diagnosticar quimioresistÊncia num paciente de cÂncer, mÉtodo para predizer a tendÊncia de uma cÉlula cancerosa a desenvolver quimioresistÊncia, mÉtodo para diagnosticar quimioresistÊncia numa cÉlula cancerosa, uso de um inibidor do complexo - Google Patents

Abstract

COMPLEXO, ANTICORPO, MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM INIBIDOR DESTE COMPLEXO, INIBIDOR, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, MÉTODOSPAPA DIAGNOSTICAR QUIMIORESISTÊNCIA NUM PACIENTE DE CÂNCER, MÉTODO PAPA PREDIZER A TENDÊNCIA DE UMA CÉLULA CANCEROSA A DESENVOLVER QUIMIORESISTÊNCIA, MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR QUIMIORESISTÊNCIA NUMA CÉLULA CANCEROSA, USO DE UM INIBIDOR DO COMPLEXO. A presente invenção se refere a um complexo compreendendo duas ou mais das proteínas S6K2, PKCe e B-Raf. A invenção também se refere a anticorpos que se. ligam especificamente ao complexo, inibidores do complexo e usos dos anticorpos, dos inibidores e do complexo no diagnóstico e na prevenção de quimioresistência num paciente.

Description

COMPLEXO, ANTICORPO, MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM- INIBIDOR DESTE COMPLEXO, INIBIDOR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR QUIMIORESISTÊNCIA NUM PACIENTE- DE CÂNCER, MÉTODO PARA PREDIZER A TENDÊNCIA DE UMA CÉLULA CANCEROSA A DESENVOLVER QUIMIORESISTÊNCIA, MÉTODO . PARA DIAGNOSTICAR QUIMIORESISTÊNCIA NUMA CÉLULA CANCEROSA> USO DE UM INIBIDOR DO COMPLEXO

Á presente invenção se refere a uni complexo, compreendendo duas ou mais das, proteínas S6K2, PKCe e B-Raf. A invenção também se refere a anticorpos que se ligam especificamente ao complexo, inibidores do complexo . e usos dos anticorpos, inibidores e do complexo no diagnóstico e na prevenção de quimioresistêricia num paciente.

Cânceres são freqüentemente tratados utilizando-se quimioterapia, que, é o uso de uma ou mais substâncias químicas tais como uma droga citotóxica, para "matar" as células cancerosas Entretanto, alguns cânceres podem desenvolver1 resistência a 'estás drogas, tornando seu tratamento mais" difícil è, em alguns casos, impossível.

Por exemplo, pacientes com câncer de pulmão de célula pequena (SCLC); freqüentemente morrem por causa da quimioresistência. Câncer de pulmão de célula pequena (SCLC) representa 20% dé todos os tumores de pulmão. Mesmo, com "a sensitividade inicial ao - tratamento, uma recaída com -doença quimioresistente é rápida e a sobrevida total é muito pequena. A quimioresistência pode também ocorrer em outros cânceres, tais como câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama, câncer de ovário, e câncer pancreático.

Sendo assim, existe uma necessidade urgente da prevenção ou reversão desta quimioresistência em células cancerosas.

Fatores de crescimento podem trazer sinais de pró-sobrevivência e, em particular, o fator de crescimento-2 de fibroblasto (FGF-2) foi implicado no desenvolvimento de quimioresistência em cânceres, incluindo SCLC (Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003). Adicionalmente, concentrações séricas elevadas de FGF-2 são um fator de prognóstico para andamento adverso em SCLC (Ruotsalainen et al., 2002). FGF-2 induz a ativação da via sinalizadora extraclular regulada por quinase (MEK/ERK) desta maneira minando a resistência a etoposideo (Pardo et al., 2 002; Pardo et al., 2 003), uma droga comumente utilizada no tratamento de SCLC. O efeito de pró-sobrevivência que ocorre por meio da tradução aumentada das moléculas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-XL, XIAP e cIAPl (Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003). O fator de crescimento de fibroblasto-2 (FGF-2) aumenta a expressão das proteínas anti-apoptóticas XIAP e Bcl-XL, e dispara a quimioresistência em células SCLC.

A proteína 40s ribossomal S6 é um componente da sub-unidade 40s dos ribossomas eucarióticos. A proteína S6 é fosforilada em resposta a certos eventos de sinalização celular, tais como proliferação induzida por fator de crescimento ou hormônios, por duas quinases S6.

Quinases ribossomais S6, S6K1 e S6K2, também conhecidas como S6Ka e S6Kp (Gout et al. , 1998; Lee-Frumen et al. , 1999; Shima et al. , 1998), regulam o mecanismo translacional (Dufner and Thomas, 1999). Cada quinase tem uma forma citoplásmica e nuclear, mas a maioria do trabalho tem focado nas proteínas citoplasmáticas, que são aqui referidas (por simplicidade) como S6K1 e S6K2. Acreditava-se que elas tivessem funções colidentes na medida em que as duas fosforilizam a proteína S6. Entretanto, dados recentes sugerem que seus substratos e atuações podem ser distintos, muito embora a função precisa de S6K2 não seja ainda clara (Richardson et al. , 2004; Valovka et al. , 2003). Assim, mesmo possuindo alto grau de homologia, elas diferem substancialmente em seus domínios N- e C- terminal; S6K1 de camundongos knock-out são pequenas muito embora haja níveis de expressão de S6K2 aumentados (Shima et al. , 1998), enquanto que a S6K2 de camundongos nulos não possui um fenótipo óbvio (Pende et al., 2004); a ativação de S6K1 não é sensível à inibição de MEK, mas os inventores e outros mostraram que a S6K2 é um novo alvo da sinalização MEK (Martin et al. , 2001; Pardo et al., 2001; Wang et al. , 2001) . O documento WO 00/08173 descreve a identificação de S6K2 e sua função como quinase que fosforiliza a proteína S6 ribossomal in vi tro. A S6K2 é também regulada pela proteína quinase C (PKC) (Valovka et al., 2003), uma família de proteínas involvidas na ativação de MEK/ERK em diversos sistemas celulares, incluindo as células SCLC (Kawauchi et al. , 1996; Seufferlein and Rozengurt, 1996; Zou et al., 1996). A família PKC compreende as classes: clássica (cPKCs: PKCa, PKCP, PKCy), não-clássica (nPKCs: PKCõ, PKCs, PKCn e PKCθ) e atípica (aPKCs: ΡKCζ e PKCi/λ). Enquanto que a ativação de cPKCs é dependente tanto de Ca2+ quanto de és ter forbólico, nPKCs somente requerem ésteres forbólicos e aPKC são independentes de ambos os agentes (Way et al. , 2000). Dependendo do estímulo utilizado, sub-classes distintas de PKC levam a efeitos fisiológicos diferentes (Way et al. , 2000) . 0 PKCe pode mediar a pró-sobrevivência/quimioresistência em células de câncer de pulmão (Ding et al. , 2002), mas o mecanismo de sinalização por trás deste efeito não foi identificado. Raf-I e/ou B-Raf estão envolvidos no acoplamento de receptores fatores de crescimento a MEK/ERK e PKC (Cheng et al., 2001; Hamilton et al., 2001).

Os inventores inesperadamente determinaram que PKCs, B-Raf e S6K2 formam iam complexo de sinalização em resposta ao tratamento com FGF-2. A regulação de PKCe induz, enquanto que a super-expressão de PKCs protege, as células SCLC da morte induzida por droga. Isto surpreendentemente se correlaciona com S6K2 aumentada, mas não à atividade S6K1. S6K2 aumentada, mas não a atividade da quinase S6K1 também aumenta a sobrevivência celular, e regulação da S6K2, mas não de S6K1, previne os efeitos anti-apoptóticos mediados por FGF-2.

S6K1, Raf-I e outras isoformas PKC não formam complexos semelhantes. A regulação mediada por RNAi de B-Raf, PKCs ou S6K2 abolem a sobrevivência mediada por FGF-2. Em contraste, a super-expressão de PKCs aumenta os níveis de XIAP e Bcl-XL e a quimioresistência em células SCLC. Num sistema indutível por tetraciclina, a atividade de quinase S6K2 aumentada dispara a regulação de XIAP, Bcl-XL e os efeitos pró-sobrevivência. Entretanto, a atividade de quinase S6K1 aumentada não apresenta tal efeito. Assim, S6K2 media a sinalização de pró-sobrevivência/quimioresistência, mas S6K1 não.

Estes resultados inesperados indicam atividades biológicas divergentes para S6K2 e S6K1. Assim, S6K2, de maneira diferente de S6K1, é seletivamente recrutada num complexo de sinalização contendo PKCs e B-Raf e controla a translação de espécies de mRNA envolvidas na regulação de morte celular mediada por FGF-2.

A presente invenção prove um complexo compreendendo duas ou mais dentre S6K2, PKCs e B-Raf. Este complexo foi determinado como sendo envolvido no desenvolvimento de quimioresistência. Preferivelmente, o complexo compreende S6K2, PKCs e B-Raf.

Como um traço preferido do primeiro aspecto do complexo, ele é capaz de causar quimioresistência numa célula cancerosa. A S6K2 pode compreender a seqüência como mostrada na Figura 1, B-Raf pode compreender a seqüência como mostrada na Figura 2 e/ou PKCe pode compreender a seqüência como mostrada na Figura 3.

Um Segundo aspecto da invenção se refere a um anticorpo que se liga especificamente ao complexo do primeiro aspecto. Tal anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal e produzido e isolado por qualquer meio conhecido na técnica.

Tais anticorpos podem ser úteis na detecção do complexo do primeiro aspecto, ou na inibição do complexo do primeiro aspecto. O anticorpo pode se ligar especificamente a duas ou mais proteínas dentre S6K2, PCKe ou B-Raf no complexo. 0 anticorpo pode se ligar a um epitopo que somente se torna disponível na medida em que as proteínas formem o complexo. Tal epitopo pode ser identificado por métodos conhecidos na técnica ou por um técnico no assunto.

O termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refere a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contenham um sítio de ligação antigênico que especificamente se liguem a antígeno, tanto natural quanto parcialmente ou totalmente produzidos sinteticamente. 0 termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína tendo um domínio de ligação que é, ou é homólogo, vim domínio de ligação de anticorpo. Estes também podem ser derivados de fontes naturais ou parcialmente ou totalmente produzidos sinteticamente. Exemplos de anticorpos são os isotipos de imunoglobulina (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD and IgA) e suas classes isotípicas; fragmentos compreendendo um domínio de ligação de antigênicatais como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd e diacorpos. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

É possível utilizar anticorpos monoclonais ou outros anticorpos e aplicar técnicas de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que mantenham a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem involver a introdução do DNA que codifica a região variável de imunoglobulina, ou as regiões determinantes complementares (CDRs) , de um anticorpo nas regiões constantes, ou regiões constantes mais as regiões de esqueleto, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400. Um hibridoma ou outra célula produzindo um anticorpo pode ser submetido à mutação genética ou outras modificações que podem, ou não, alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

Como anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo "anticorpo" deve ser entendido como cobrindo qualquer membro de ligação específica ou substância tendo um domínio de ligação com a especificidade requerida. Assim, este termo cobre fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, anticorpos humanizados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, tanto natural quanto parcial ou totalmente sintético.

Moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundidas a outros polipeptídeos são assim incluídas. A clonagem e a expressão de anticorpos quiméricos são descritas nos documentos EP-A-0120694 e EP-A-0125023. Um anticorpo humanizado pode ser um anticorpo modificado tendo as regiões variáveis de um anticorpo não-humano, e.g. murino, e a região constante de um anticorpo humano. Métodos de produção de anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, na patente US 5.225.539.

Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem ter a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward, E.S. et al. , Nature 341:544- 546 (1989)) que consiste de um domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um peptídeo de ligação que permite a associação destes dois domínios para formar um sítio de ligação antigenica (Bird et al. , Science 242:423-426 (1988); Huston et al. , PNAS USA 85:5879-5883 (1988)); (viii) dímeros bi-específicos Fv de cadeia simples (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (W094/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993)).

Diacorpos são multímeros de polipeptídeos, cada polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um Segundo domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, os dois domínios sendo ligados (e.g. por um peptídeo de ligação), mas incapazes de se associar com o outro de modo a formar um sítio de ligação antigênica: sítios de ligação antigênica sendo formados pela associação do primeiro domínio de um polipeptídeo dentro do multímero, com um segundo domínio de outro polipeptídeo dentro do multímero (W094/13804).

Onde anteorpos bi-específicos devem ser utilizados, estes podem ser anticorpos bi-específicos convencionais, que podem ser produzidos numa variedade de meios (Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446- 449 (1993)), e.g. quimicamente preparados de hibridomas híbridos, ou podem ser quaiquer dos fragmentos de anticorpo bi-específico mencionados acima. É preferível a utilização de dímeros de scFv ou diacorpos ao invés de anticorpos inteiros. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, utilizando-se apenas domínios variáveis, potencialemte reduzindo os efeitos de reação anti-idiotipica. Outras formas de anticorpos bi- específicos incluem a cadeia simples "Janusins" descrita em Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991).

Diacorpos bi-específicos, ao contrário de anticorpos bi-especificos inteiros, podem também ser úteis, pois eles são facilemte contruidos e expressos em E. coli. Diacorpos (e muitos outros polipeptideos tais como fragmentos de anticorpo) de especificidade de ligação apropriada podem ser prontamente selecionados utilizando-se phage display a partir de bibliotecas (WO94/13804) . Se um braço do diacorpo é para ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra o antígeno X, então uma biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado, e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado.

Um terceiro aspecto da invenção provê um método para identificação de um inibidor do complexo do primeiro aspecto, compreendendo as etapas de contatar uma célula que expressa duas ou mais de S6K2, PKCs e B-Raf com um composto teste e determinar se um complexo é formado.

Tal método pode ser conduzido por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o método pode incluir um gene repórter. Nesta situação, se nenhum complexo for formado, a expressão de um gene repórter pode ser ligada ou desligada (dependendo se o complexo ativa diretamente ou inibe a expressão) para indicar se um complexo é formado. Tal gene repórter pode ser qualquer um conhecido na técnica que claramente indique se a expressão foi ativada ou inibida, tal como β-galactosidase.

Um outro método para identificar um inibidor do complexo do primeiro aspecto é também provido, compreendendo as etapas de contatar duas ou mais de S6K2, PKCe e B-Raf com um composto teste e determiner se um complexo foi formado.

O método pode compreender a imunoprecipitação de proteínas formadoras do complexo utilizando um anticorpo que se ligue especificamente a uma das proteínas, na presença de um composto teste. Se uma ou mais das proteínas não foram "baixadas" pelo anticorpo a formação do complexo é inibida pelo composto. Obviamente, um técnico no assunto reconhece que meios alternativos de se determinar a inibição da formação de complexo por meio de um composto teste podem ser utilizados, e são bastante conhecidos na técnica.

Um quinto aspecto da invenção provê um inibidor do complexo compreendendo duas ou mais dentre S6K2, PKCe e B-Raf. Preferivelmente, o inibidor é identificado pelo método dos terceiro e quarto aspectos da invenção. 0 inibidor pode inibir a expressão da B-Raf e/ou PKCe e/ou S6K2. Alternativamente, o inibidor pode prevenir a associação de S6K2, B-Raf e/ou PKCe.

Um método de prevenir ou reverter quimioresistência numa célula cancerosa também é provido como um sexto aspecto, compreendendo administrar à célula um inibidor do complexo compreendendo dois ou mais dentre S6K2, B-Raf e PCKs. A célula cancerosa na qual o método é aplicado é preferivelmente uma célula de câncer de pulmão de célula pequena (SCLC) . 0 inibidor do método pode ser RNAi, RNA antisenso, RNA de ribozina ou um anticorpo.

Um sétimo aspecto da invenção prove uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor do quinto aspecto e um adjuvante, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção serão usualmente apresentadas como uma parte de uma composição farmacêutica estéril que normalmente inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta composição farmacêutica pode se encontrar em qualquer forma apropriada (dependendo do método desejado de administração a um sujeito).

Ela pode ser provida numa forma de dosagem unitária, que será geralmente provida num recipiente selado e pode ser provida como parte de um kit. Tal kit normalmente (embora não necessariamente) incluirá instruções de uso.

Ela pode incluir uma pluralidade das referidas formas de dosagem unitárias.

A composição farmacêutica pode ser adaptada para administração por qualquer via apropriada, por exemplo, por via oral (incluindo bucal ou sublingual) , tópica (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica) , ou parenteral (incluindo subcutânea, intramusçular, intravenosa ou intradérmica). Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica farmacêutica, por exemplo, pela combinação do ingrediente ativo com veiculo(s) ou excipiente(s) sob condições estéreis.

Composições farmacêuticas adaptadas para discretas tais como cápsulas ou tabletes; como pós ou grânulos; como soluções, xaropes ou suspensões (em líquidos aquosos ou não, ou como cremes ou espumas comestíveis, ou como emulsões).

Excipientes apropriados para tabletes ou cápsulas de gelatina dura incluem lactose, amido de milho ou derivados destes, ácido esteárico ou sais do mesmo. Excipientes apropriados para cápsulas de gelatina mole incluem óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis líquidos ou semi-sólidos, etc.

Para a preparação de soluções e xaropes, excipientes utilizáveis incluem, por exemplo, água, polióis e açúcares. Para a preparação de suspensões, óleos (e.g. óleos vegetais) podem ser utilizados para prover suspensões óleo-em-água ou água-em-óleo.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como bandagens discretas para permanecer em contato íntimo com a epiderme do recebedor por um período de tempo prolongado. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser transportado da bandagem por iontoforese, como abrangentemente descrito em Pharmaceutical Research, 3(6) :318 (1986).

Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser formuladas como unguentos, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, géis, sprays, aerosois ou óleos. Para infecções nos olhos ou outros tecidos externos, por exemplo, boca e pele, as composições são preferencialmente aplicadas como creme ou unguento tópico. Quando formuladas como unguento, o ingrediente ativo pode ser empregado tanto com base de unguento parafínica ou miscível em água. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser formulado num creme com uma base de creme óleo-em-água ou água-em-óleo.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica nos olhos incluem colírios em que o ingrediente ativo é dissolvido ou suspenso num veículo apropriado, especialmente num solvente aquoso.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração parenteral incluem injeções estéreis aquosas e não-aquosas que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que fazem da solução substancialmente um isotônico com relação ao sangue do destinatário; e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem conter agentes de suspensão e espessantes. Excipientes que podem ser utilizados para soluções de injeção incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As composições podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em condição seco-congelada (Iiofilizada) , requerendo somente a adição do líquido estéril carreador, por exemplo, água para injeção, imediatamente antes do uso. Soluções de injeção extemporânea e suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos ou tabletes.

As composições farmacêuticas podem conter agentes preservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes de umedecimento, emulsificantes, adoçantes, corantes, odorizantes, sais (substâncias da presente invenção podem, elas mesmas, ser providas na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis), tampões, agentes de revestimento ou antioxidantes. Elas podem também conter agentes terapeuticamente ativos em adição à substância da presente invenção.

Dosagens das substâncias da presente invenção podem variar dentro de limites amplos, dependendo da doença ou desordem sendo tratadada, condição do indivíduo sendo tratado, etc. e um médico determinará definitivamente as doses apropriadas para uso. As doses podem ser repetidas quantas vezes for apropriado. Se efeitos colaterais aparecerem, a quantidade e/ou freqüência das doses pode ser reduzida, de acordo com as praticas clínicas normais.

Um método para diagnosticar a quimioresistência num paciente de câncer também é provido como um aspecto da presente invenção e compreende a detecção de um complexo compreendendo duas ou mais S6K2, B-Raf e PKCs. A detecção pode ocorrer por meio de um anticorpo ou por qualquer outro método conhecido por um técnico no assunto.

Também é provido um método para diagnosticar a quimioresistência num paciente de câncer compreendendo a detecção do nível de ativação da S6K2 numa célula cancerosa do paciente em comparação com o nível de ativação da S6K2 numa célula não-cancerosa do paciente ou numa célula de paciente não-canceroso, em que a célula cancerosa é resistente a quimioterapia se o nível de ativação da S6K2 for maior na célula cancerosa do que na célula não-cancerosa do paciente ou numa célula de paciente não-canceroso. A detecção do nível pode ocorrer por meio de um anticorpo, imunoprecipitação quantitativa e/ou western blotting, ou semelhante e pela comparação com célula não-cancerosa ou célula de paciente não-canceroso, como uma referência para níveis de ativação da S6K2 normais. Níveis elevados de ativação da S6K2 indicam a probabilidade da quimioresistência.

Por ativação, a S6K2 deve estar numa forma capaz de formar um complexo e/ou causar quimioresistência. Um técnico no assunto entenderá que se níveis não-elevados de ativação de S6K2 são determinados numa célula cancerosa, i.e. níveis semelhantes aos de uma célula não-cancerosa ou de uma célula de paciente não canceroso, então a célula cancerosa será provavelmente quimiosusceptível.

Um método para predizer a tendência de uma célula cancerosa desenvolver quimioresistência também é apresentado, compreendendo medir os níveis de ativação de S6K2 na célula em dois ou mais pontos no tempo, em çpae a célula cancerosa tem tendência a desenvolver quimioresistência se o nível de ativação de S6K2 aumenta entre pontos no tempo.

Os pontos no tempo podem ser qualquer intervalo razoável, tal como diário, semanal ou mensal, dependendo do tipo de câncer, do bem-estar do paciente, da velocidade de progressão do câncer e de outros fatores. Se o nível de S6K2 ativado não aumentar entre os pontos no tempo, então é provável que a célula cancerosa seja susceptível a quimioterapia.

Um método para diagnosticar quimioresistência numa célula cancerosa compreendendo detectar o nível de S6K2 na célula também é provido. 0 nível de S6K2 pode ser determinado por qualquer método conhecido por um técnico no assunto. A célula provavelmente será quimioresistente se níveis elevados se níveis de S6K2 aumentados forem detectados. Um décimo segundo aspecto apresenta o uso de um inibidor do complexo do primeiro aspecto na fabricação de um medicamento para a prevenção ou reversão de quimioresistência numa célula cancerosa.

Todas as particularidades preferidas de cada aspecto se aplicam a todos os outros aspectos mutandis mutatis.

A invenção será agora descrita com referência aos exemplos e figuras não limitantes a seguir, em que:

A Figura 1 mostra as seqüências de ácido nucléico e de aminoácido de S6K2

A Figura 2 mostra as seqüências de ácido nucléico e de aminoácido de B-Raf

A Figura 3 mostra as seqüências de ácido nucléico e de aminoácido de PKCe.

A Figura 4 mostra que os níveis de PKCs se correlacionam com a expressão de XIAP e Bcl-XL e com a fosforilação ERK em células SCLC, em que: (A) lisatos de células H69 e H510 passaram por Western-blot para a expressão de PKCa, PKCe, XIAP, Bcl-XL e actina. (B) Blots representativos de (A) foram otimizados por densitometria óptica normalisada para actina. (C) células H69 transfectadas com um vetor de expressão (ε) (V) vazio ou um wt-PKCe-GFP foram analisadas para níveis fosfo-ERK, XIAP e Bcl-XL. (D) O nível de base de morte celular um células V-H69 e ε-Η69 cultivadas em 10% FCS foi determinado por citometria de fluxo utilizando tingimento por Anexina V. (E) Células ε-Η69 e V-H69 em SFM foram tratadas com ou sem 0,1 μΜ etoposídeo (VP-16) e números de célula determinados 96 h depois. As condições feitas em quadruplicatas e o número médio de células ± SEM representado como em ciclo sobre não-tratamento. (F) Células H510 cells em SFM foram tratadas com ou sem 40 μΜ εΤΙ-ΤΙΤΑΤ, (ΧΤΙ-ΤΙΤΑΤ ou ΤΙΤΑΤ por 4h antes de estimulação por 5min com ou sem FGF-2 (0,lng/mL). Lisatos de célula foram submetidos a Western-blot para bifosfo-ERK. (F-painel inferior) Resultados de três experimentos independentes foram analisados por densitometria óptica e representados como média ± SEM aumento de ciclo sobre controle. (G) Células H510 transfectadas com PKCs ou siRNA mexido (sc) foram estimuladas com ou sem FGF-2. Lisatos foram analisados para níveis de PKCs e fosforilação ERK. (A, C, FeG) Imunodetecção de lamina B e actina foram utilizadas como controle de carga.

A Figura 5 mostra que PKCe forma um complexo de multi-proteína com B-Raf e S6K2 em células H510 seguindo FGF-2 e que regula a atividade da S6K2, onde: (A) células H510 e H69 em SFM foram tratadas com FGF-2 pelo número de vezes indicado. Lisatos de célula foram submetidos a imunoprecipitação com um anticorpo PKCs antes de serem submetidos a Western blot (WB) para as moléculas indicadas. (A-paínel inferior) Total de lisato de célula foi submetido a Western-blot como indicado. (B e E) S6K2 foi imunoprecipitada a partir de células V-H69 e ε-Η69 (B) ou H510 (E) seguindo 4 h de tratamento com ou sem εTI-ΤΙΤΑΤ, αΤΙ-ΤΙΤΑΤ e ΤΙΤΑΤ. Imunoprecipitados foram submetidos a ensaios in vitro de quinase com peptideo S6 como substrato e os resultados são mostrados como média cpm ± SEM de triplicatas de um experimento representativo. (C) A fosforilação da proteína S6 endógena de células V-H69 e ε-Η69 em SFM tratadas com ou sem εΤΙ-ΤΙΤΑΤ foi determinada utilizando-se um anticorpo fosfo-S6. (D e F) ΡΚΟε KO MEFs re-expressando (KO+ ε) ou não (KO) PKC ε foram (D) cultivados em 10% FCS e analisados para níveis de fosfo-S6 ou (F) estimulados com ou sem FGF-2 e FCS antes de imunoprecipitados com S6K2 e Western blot como indicado. (C e D) Imunodetecção de lamina B e actina foram utilizados como controle de carga. (A-F) Resultados mostrados como os representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 6 mostra que PKC ε é requerido para a associação de B-Raf com S6K2. (A) Células HEK 293 foram estimuladas com FGF-2 e imunoprecipitados (IP) para as moléculas indicadas analisados por Western-blot (WB) para tanto B-Raf ou Ρ^ε (B) Células HEK 293 transfectadas com siRNAi para B-Raf, PKCa, . PKCs1 PKCõ .ou controle misturado (sc) foram estimulados com FGF-2 e imunoprecipitados de S6K2 analisados por WB para B-Raf e ΡΚΟε (C) MEFs de camundongos KO ΡΚΟε, re-expressando (ΚΟ+ε) ou não (KO) ΡΚΟε foram estimulados com ou sem FGF-2. Imunoprecipitados B-Raf foram analisados por WB para S6K2. (D e Ε) ΡΚΟε recombinante, V600EB-Raf e proteínas S6K2 foram combinados como indicado e submetidos a ensaio in vitro de quinase com 32Ρ-γΑΤΡ (D) ou ATP frio (E). GST-MEK recombinante foi utilizado como controle positivo para atividade V600EB-Raf. Amostras foram varridas em SDS-PAGE, tingido com Coomassie (D-painel superior) ou transferidos a nitrocelulose (E), então expostos a um filme de Raios-X (D-painel inferior) ou submetido a WB para as moléculas indicadas (E). Os resultados mostrados são os representativos de um mínimo de três experimentos independentes.

A Figura 7 mostra que a indução específica da atividade de quinase da S6K2 em células HEK 293 aumenta a viabilidade celular e regula Bcl-XL. Clones HEK 293-Tet transfectados com um vetor indutível para atividade de quinase de S6K1 (IKA) , S6K2 (2KA) ou vetor vazio foram tratados com tetraciclina por 6h antes de (A) Western-blot (WB) como indicado ou (B) ensaios de quinase de S6K1 ou 2 utilizando-se um peptídeo S6 como substrato. (C) Células V-, IKA- e 2KA-293 foram incubadas na ausência de tetraciclina com (barras brancas) ou sem (barras hachuradas) soro por 18h ou com tetraciclina na ausência de soro (barras pretas) e a proporção de células apoptóticas determinada utilizando-se tingimento com anexina V. (D) Lisatos de célula de 2 KA e 1KA-293 tratados com ou sem tetraciclina, FGF-2 e PD098059 foram analisados para expressão de Bcl-XL e fosforilação S6. (E) Células HEK 293 incubadas com ou sem FGF-2 (4h) antes de privação de soro (18h) foram analisadas por tingimento com anexina V. (A, D, F) Imunodetecção de actina e lamina B foram utilizadas como controle de carga. (B, C, E) Os resultados representam a média de triplicatas ± SEM. (A-E) Os resultados são os representativos de um mínimo de três experimentos independentes.

A Figura 8 mostra que a regulação de S6K2 e PKC ε diminui a viabilidade celular e crescimento de célula clonogênico em células de mamíferos. (A) Células HEK 293 foram transfectadas com vetor vazio (pSR), ou pSR codificando para seqüências de RNAi de S6K1 (S6KlpSR) ou S6K2 (S6K2pSR) . As células foram cultivadas em 5% FCS ou meio livre de soro por 18h e a viabilidade celular foi determinada por exclusão com azul de tripano. (B) Lisatos de células H510 expressando pSR, S6KlpSR ou S6K2pSR foram submetidas a Western-blot como indicado (painel superior) . A linha de base de morte celular em 10% FCS foi determinada por tingimento por Anexina V (painel intermediário). Quebra por lamina B foi utilizada como leitura para atividade de caspase 3 (painel inferior) . Células pSR tratadas com FGF-2 (pSR+F) foram utilizadas como controle negativo. (C) Células MCF-7, A549, HEK 293 e NIH3T3 foram transfectadas com os construtos pSR shRNAi indicados e cultivadas em 5% FCS por 10 dias. OD das colônias coradas com crystal violet foi determinada a 59 Onm. Para cada linha celular, os resultados foram normalisados para a absorbância encontrada em células de vetor vazio pSR. (D) KO ou KO+ε MEFs foram colocados em pratos na ausência de FCS pelo número de vezes indicado e a proporção de células positivas para azul de tripano determinada. Os resultados para (Α-painel inferior) e (B-painel intermediário) representam a média de triplicatas ± SEM. Os resultados para (A-C) são os representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 9 mostra que a regulação de S6K2, mas não de S6K1, previne a sobrevivência mediada por FGF-2 de células H510 e HEK 293. (A-C) Células H510 foram submetidas a regulação das proteínas indicadas tanto por vetores retrovirais pSR RNAi (A,B) ou RNAi de oligonucleotídeo (C). (A) Células foram pré-incubadas com ou sem FGF-2 antes de tratamento com etoposídeo (VP-16). (B) Lisatos de células H510 infectadas com os vetores indicados e tratados como mostrado foram submetidos a Western-blot paraXIAP e Bcl-XL. (C) Células H510 tratadas com RNAis de oligonucleotídeo (painel superior) lisadas e submetidas a Western-blot como indicado ou (painel inferior) tratadas como descrito em (A). (D-F) Células HEK 2 93 cells foram submetidas à regulação das proteínas indicadas por trasnfecção de vetores pSR codificando RNAi. (D) Células foram pré-incubadas com ou sem FGF-2 antes de privação de soro. (A e D) A sobrevivência foi determinada por exclusão de azul de tripano. (E) Células HEK 293 transfectadas como indicado foram submetidas a Western-blot para fosfo-S729-PKCs (P-PKCs). (F) Células HEK 293 transf ectadas incubadas com ou sem FGF-2 foram submetidas a Western blot para fosfo-S412-S6K2. (A7C7D) Os resultados são médias ± SEM de quadruplicatas e (A, C) normalisados a pSR (A) ou Sc (C) . (Β, E, F) Imunodetecção de lamina B ou actina foram utilizadas como controle de carga. (A-F) Os resultados são representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 10 mostra (A, B, C e D) controles PKCe fosforilação ERK mediada por FGF-2 em células SCLC. (A) Células H510 foram tratadas com ou sem uma faixa de dose de GF109203X (GF), GÕ6976 (Go), Hispidina (His), BAPTA (BA) ou Rotlerina (Rot) por Ih antes de estimulação por 5min na presença ou ausência de tanto FGF-2 (0,lng/ml) ou PDBu (400nM). Lisatos de célula foram analisados por SDS-PAGE/Western-blot para bifosfo-ERK. Imunodetecção de lamina foi utilizada como controle de carga. (B-painel superior) Quantidades iguais de proteína de linhas celulares de SCLC foram comparadas para seus padrões de expressão de PKC. (B-painel inferior) Células SCLC em SFM foram estimuladas com e sem FGF-2 por 5min e os lisatos de célula analisados por SDS-PAGE/WB para fosforilação ERK. Níveis de PKCs e PKCa (ODs do painel lateral) foram comparados à habilidade de forforilar ERK nestas linhagens de célula SCLC. Os resultados mostrados são os representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 11 mostra que: PKCs forma um complexo de multiproteína com B-Raf e S6K2 em células H510. (A e B) Células H510 em SFM foram tratadas com FGF-2 pelos tempos indicados. Lisatos de células foram submetidos à imunoprecipitação tanto com S6K1 ou 2 (A) , anticorpos B-Raf ou Raf-I (B) antes de SDS-PAGE/Western Blot (WB) para S6K1 e 2, B-Raf, Raf-I e PKCs. (A e B) Os resultados mostrados são os representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 12 mostra que: PKCe é necessário para a associação de B-Raf com S6K2. (A) Eficácia de seqüências oligonucleotídicas de siRNAi osimples (1 e 2) e Smartpools (P) direcionados contra S6K1, S6K2, PKCe, PKCa, B-Raf e Raf-I. Células HEK293 foram transfectadas com os oligonucleotídeos e os lisatos analisados para a regulação alvo 48h depois por SDS-PAGE/WB. (B, CeD) PKCa. (a) e B-Raf (B) ou PKCs (ε) foram regulados utilizando vetores pSR retroviral RNAi em células HEK293 e comparados com células transfectadas somente com vetores vazios (V) para sua expressão de alvos RNAi e sua habilidade em fosforilara ERK (B e C) ou formar o complexo multiproteína S6K2/PKCe/B-Raf (D) em resposta a FGF-2. (A-D) Os resultados mostrados são os representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 13 mostra que: a atividade de quinase da S6K2 protege células HEK293 de privação de soro e induz a expressão de Bcl-XL e XIAP. (A e Β) HEK293 expressando proteínas S6K1 (IKA) ou 2 (2KA) que são ativas como quinase indutíveis por tetraciclina foram tratadas com ou sem tetraciclina por 6h (B) ou pelo tempo indicado (A) . (A) Células foram cultivadas na ausência de FCS e um curso temporal de morte celular foi feito. A morte celular foi avaliada microscopicamente pela determinação da positividade a azul de tripano. Os resultados mostrados são médias ± SEM de triplicatas. (C) Células HEK293 foram tratadas por Ih com ou sem 25μΜ PD098059 antes de estimulação com FGF-2 por 4h. (B e C) Lisatos de célula foram analisados por SDS-PAGE/WB para os níveis de Bcl-XL e XIAP. Actina foi utilizada como controle de carga. Os resultados mostrados são os representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 14: Seqüências simples de siRNA de S6K2 e B-Raf previnem o resgate de células H510 tratadas com etoposídeo mediado por FGF-2, mas não de S6K1. Células H510 cultivadas em SFM foram transfectadas com tanto uma ou duas seqüências simples de siRNA (#1 e #2, como mostrado na Fig 3A) direcionando a S6K1, S6K2 ou B-Raf conforme indicado. Duas seqüências não-alvo (sc#l e 2) foram utilizadas como controles. Células foram pré-incubadas por 4h com FGF-2 (F) antes de tratamento com etoposídeo (E) . A morte celular foi avaliada microscopicamente por exclusão de azul de tripano. Os resultados mostrados são médias ± SEM de triplicatas e são representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 15 mostra que: 0 tingimento da S6K2 se correlaciona com a quimioresistência em material de biópsia de SCLC humano. Biópsias corrigidas com formalina e embebidas em parafina de 22 pacientes com SCLC e NSCLC na apresentação foram seccionadas e imunocoradas utilizando-se um anticorpo monoclonal anti-S6K2 murino (adquirido do Prof Gout, UCL, London) e pelo sistema de detecção Envision (DAKO). A especificadade à proteína alvo foi controlada pelo uso de protocolos padrão incluindo amostras de positivo conhecido (H510) e negativo (pneumócitos Tipo II) , anticorpo irrelevante e S6K2 competidor. O patologista (Dr Neil Sebire, Hammersmith Hospitais) desconhecia os dados de desenvolvimento clínico, para evitar um relatório tendencioso. O estudo e a coleta de material de biópsia de SCLC e NSCLC foram revistos e aprovados pelo nosso comitê de ética local.

Painel superior: imunotintura S6K2 forte observada na maioria das células cancerosas numa biópsia de paciente com tumor quimioresistente (aumento original χ 100).

Painel intermediário: áreas focais de tin tura S6K2 moderada numa biópsia de paciente com doença parcialmente quimioresistente (aumento original χ 100).

Painel inferior: usência de tingimento S6K2 numa biópsia de paciente com doença quimiosensível (aumento original χ 100).

Estes resultados foram observados em 2 dos 4 pacientes quimioresistentes, 3/3 parcialmente quimioresistentes e 6/6 pacientes quimiosensíveis com SCLC. Para substanciar estes resultados, também foram examinados níveis de tingimento S6K2 em biópsias de vários pacientes NSCLC. Em um paciente que era resistente a quimioterapia, o tumor foi difusamente positivo, em três de quatro pacientes com recaída precoce, os tumores foram focalmente positivos para tingimento S6K2 enquanto que três dos quatro tumores quimiosensíveis foram negativos. Os resultados combinados para tingimento em ambas as biópsias SCLC e NSCLC são sumarizados na tabela adjunta. Juntos, estes resultados sugerem que os níveis da expressão de proteína S6K2 em biópsias de pacientes com câncer de pulm ao se correlacionam com quimioresistência.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de células. Linhas celulares de SCLC foram mantidas como anteriormente descrito (Pardo et al., 2001) . Para fins de experimento, as células foram crescidas em SFM (RPMI 1640 suplementado com 5ug/ml insulina, 10ug/ml transferrina, selenito de sódio 30 nM, 0,2 5% albumina sérica bovina) e utilizadas depois de 3 a 7 dias. células A549, HEK293, HEK293Tet, NIH-3T3, MCF-7 e Cos 7 foram crescidas em meio DMEM contendo 10%FCS a 37°C, 10%C02. Para fins de experimento, células HEK 293 foram colocadas em DMEM livre de soro por 6h antes da estimulação de fator de crescimento.

Estabelecimento de linhas celulares expressando transgenes. Células H69 foram transfectadas com construtos pEGFP codificando o tipo selvagem de PKCe utilizando Lipofectina de acordo com as instruções do fabricante e as células foram selecionadas em lmg/ml G418. Células H510 que expressam RNAi foram estabelecidas pela infecção de células H510 com virus anfotrópico que codifica o receptor murino ecotrópico (EcoR). Seguindo a seleção com G418, as células foram infectadas utilizando retrovirus murinos codificando RNAi de "hairpin" curto PKCa PKCe, S6K1, S6K2, B-Raf ou Raf-1. Regulação estável de gene foi alcançada pelo cultivo das células na presença de 2μg/ml puromicina. A expressão transiente de RNAi de B-Raf, Raf-I, PKCe, S6K1 ou S6K2 foi alcançada pela transfecção de células A549, HEK293, NIH-3T3, MCF-7 e Cos 7 com o construto pSR relevante utilizando Lipofectamina Plus. A expressão transgênica ou regulação de proteínas alvo foi feita por Western blotting.

Estabelecimento de linhas celulares induzíveis por tetraciclina S6K1 e S6K2. Células HEK2 93Tet-on (Invitrogen) a 7 0% de confluência foram trasnfectadas com 25yg de pCDNA4-S6K2-T412D, pCDNA4-S6Kl-T40lD ou pCDNA4 (controle) utilizando precipitação por fosfato de cálcio. As células foram selecionadas em 50mg/ml de zeocina. 15 colônias de cada transfecção foram isoladas utilizando-se cilindros, e linhas celulares clonais foram estabelecidas e testadas para expressão de S6K1 ou S6K2 a partir de incubação com lmg/ml de tetraciclina por análise de western blot.

Ensaio de morte celular. Células SCLC (5 χ 10^4 células/mL SFM) foram pré-tratadas com ou sem 0,lng/mL FGF-2 por 4h antes de tratamento com 0,1μΜ etoposídeo e incubadas a 37 °C por 96h. Células HEK 293-Tet foram dispostas em pratos de 48-poços (104 células/poço) , pré-tratadas com ou sem 0,lng/ml FGF-2 por 4h e a morte celular foi induzida por remoção de soro por 18h. A proporção de morte cellular foi tanto determinada por exclusão de trypan blue ou por tingimento com Anexina V e citometria de fluxo, como anteriormente descrito (Pardo et al., 2002) .

Peptxdeo inibidor de translocação de PKCe e PKCa célula-permeável. O inibidor de translocação PKCs (EAVSLKPT) e os inibidores de translocação PKCa (SLNPEWNET) (Souroujon e Mochly-Rosen, 1998; Yedovitzky et al. , 1997) foram tornados permeáveis a células por ligação com a seqüência HlV-derivada TITAT (GRKKRRQRRRPPQ). Células H510 em RPMI foram incubadas por 4h com 40μΜ tanto de peptídeos inibidores de translocação quanto de TITAT antes de tratamento adicional. A atividade destes inibidores em fosforilação ERK foi acessada por Western Blotting.

Experimentos de Co-imunoprecipitação. Células SCLC cultivadas em SFM foram lavadas em RPMI 1640, e alíquotas de 2 χ 10 células foram incubadas neste meio por 3Omin a 37aC. Células HEK 293 foram lavadas e incubadas em DMEM por 6h. Células foram então estimuladas utilizando FGF-2 pelo tempo mostrado nas legendas da figura. As células foram lisadas a 4°C em ImL de tampão lisina, os lisatos clarificados por centrifugação a 15.000g por 10min e imunoprecipitação foi feita por l,5h utilizando-se o anticorpo relevante em conjunto com Proteína tanto A ou G.

Ensaios de complexo imune S6K1/2 e de quinase in vitro. Ver informações suplementares.

Ensaios de crescimento clonogênico. Células A549, HEK293, NIH-3T3, MCF-7 e Cos 7 transfectadas com os construtos relevantes foram colocadas em pratos de 6 poços (2 χ IO3 células/prato) e deixadas para crescer por 10 dias 372C/10% C02 em DMEM /5% FCS. As células foram então tingidas com crystal violet, colônias solubilizadas utilizando-se solução de ácido acético 10% e a absorbância medida a 595nm.

Seqüências de RNAi. A regulação mediada por RNAi de PKCa . PKCe, S6K1, S6K2, B-Raf e Raf-I foi alcançada utilizando seqüências de "hairpin" curtas clonadas em construtos pSUPER Retro ou oligonucleotídeo siRNA. Ver informações suplementares para as seqüências.

NUcleofecção de oligonucleotídeo. 1,5 χ 10"6 células SCLC cultivadas em meio de soro foram transfectadas, seguindo as instruções do fabricante, com 6μ1 de 20μΜ siRNA em 100μl de solução Nucleofector Solution V utilizando o programa T-16 no Nucleofector Amaxa.

Seguindo a transfecção, as células foram transferidas para RPMI/10% FCS durante a noite antes de serem utilizadas para análise. Ensaios de complexo imune de quinase. Células V-H69 e -H69 em SFM foram lavadas três vezes em RPMI 1640, e alíquotas 2 χ IO6 células foram incubadas neste meio por 3Omin a 379C. As células foram tratadas na presença ou ausência de 40μΜ (TI-TITAT, (TI-TITAT ou peptídeo TITAT por 4h como indicado, antes de se conduzir um ensaio de complexação imune de quinase para S6K1 ou S6K2 como descrito (Pardo et al. , 2001). Em experimentos separados, células HEK293Tet expressando formas citoplásmicas ativas para quinase indutível por tetraciclina de S6K1 ou S6K2 foram incubadas com ou sem tetraciclina antes de Iise e ensaio de imunocomplexação de quinase.

Ensaio in vitro de quinase. 0,5ug de His-S6K recombinante e 4ug de PKCε recombinante foram incubadas em gelo em 50mM TRIS (pH 7,5), IOOmM NaCl, OfImM EDTA e 0,1% TritonX-100, 0,3 (v/v)% β-mercatptoetanol e ImM Na3V04 na presença ou ausência de V600EB-Raf recombinante ativa. A reação foi iniciada pela adição de mistura de ATP-mix resultando numa concentração final de ΙΟΟμΜ ATP, IOmM MgC12 com ou sem 33nCi/uL [γ-32Ρ]ΑΤΡ e incubada por 3 Omin a 30SC. Como controle positivo, GST-MEK foi utilizada com substrato para V600EB-Raf. As reações foram terminadas em tampão SDS-amostra e analisadas por SDS-PAGE e autoradiografia.

Seqüências de RNAi. A regulação mediada por RNAi de PKCa . PKCs, S6K1, S6K2, B-Raf e Raf-I foi alcançada pelo uso de seqüências de "hairpin" curtas clonadas em construtos pSUPER Retro ou oligonucleotídeo de siRNA e são listadas nos dados suplementares. Para regulação mediada por pSUPER Retro, cada proteína foi simulataneamente direcionada utilizando três seqüências de "hairpin" curtas diferentes. As seqüências foram as seguintes: PKCa, . .CAAGGCTTCCAGTGCCAAG, GGAACACATGATGGATGGA, CATGGAACTCAGGCAGAAA; PKC ε, TCTGCGAGGCCGTGAGCTT, CTACAAGGTCCCTACCTTC, GGAAGGGATTCTGAATGGT; S6K1, GGTTCTGGGCCAGGGATCC, GCTCTATCTCATTCTGGAC, CATCATCACTCTGAAAGAT; S6K2, GGGGGGCTATGGCAAGGTG, CGGAATCCCAGCCAGCGGA, GATACGGCCTGCTTCTACC; B-Raf, CAACAGTTATTGGAATCTC, CCTATCGTTAGAGTCTTCC, GAATTGGATCTGGATCATT; Raf-1, CAGTGGTCAATGTGCGAAA, GAACTTCAAGTAGATTTCC, CAUGGAACAUUGUGAGAAA, CCAAGGUCAUGUGAAACUA. Direcionamento oligonucleotídico de B-Raf foi alcançado utilizando uma seqüência única: AAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU.

Reagentes. Etoposídeo foi comprado de Calbiochem. Antoicorpos PKCa,. PKCp,. PKCõ,. PKCX, PKCy,. PKCζ,. PKCa,. PKCe, Bcl-XL e XIAP foram comprados de Becton Dickinson. Os anticorpos de proteína fosfo-PKCa. e fosfo-S6 eram de Cell Signalling. O anticorpo fosfo-PKCE. contra Ser729 e um anticorpo PKCs adicional (somente para Western-blotting) foram obtidos de Upstate. 0 anticorpo fosfo-PKCs. contra Thr566 foi como descrito anteriormente (Parekh et al. , 1999). Anticorpos S6K1, B-Raf, Raf-1, Lamina B e Actina foram comprados de Santa Cruz. 0 anticorpo S6K2 antibody foi como descrito anteriormente (Gout et al. , 1998). Proteínas AeG foram obtidas de Amersham. Lipofectin, Lipofectamin Plus, G418, zeocina e puromicina foram obtidas de Invitrogen. O anticorpo ERK ativado, etoposídeo, polibreno e crystal violet foram obtidos de Sigma. FGF-2, PD098059, GÕ6976, Hispidina, BAPTA, Rottlerina e GF109203X foram comprados de Calbiochem.

Exemplo 1

Níveis de PKCe se correlacionam com expressão de Bcl-XL e XIAP e sobrevivência celular.

Investigou-se inicialmente se os níveis de PKCs se correlacionariam com a expressão de Bcl-XL e XIAP, reguladores conhecidos de sobrevivência celular de SCLC H510 e H69 (Pardo et al. , 2002; Pardo et al. , 2003). Western blots revelaram que células H69 com níveis baixos de PKCs. mostravam expressão menor de Bcl-XL e XIAP que células H510 que continham níveis altos de PKCc (Fig. 4A e 4B). Uma correlação semelhante entre níveis de PKCs XIAP e Bcl-XL existia em sete linhas de células adicionais de SCLC mas não tinha sido vista para outras PKCs, incluindo PKCõ . (dados não mostrados) . Também, na maioria das linhas celulares, uma correlação inversa entre os níveis de PKCa. e PKCs parecia existir (Fig 4A e Fig 10C]). Estes resultados sugeriam que PKCs .poderia controlar a expressão de Bcl-XL e XIAP em células de SCLC. De fato, células ε-Η69 super-expressando PKCs nativo mostraram níveis aumentados de ambos Bcl-XL e XIAP quando comparados a células do vetor sozinho (V-H69) (Fig. 4C) . As células ε-Η69 também mostraram fosforilação de base de ERK aumentada (Fig. 4C) , sobrevivência aumentada em condições de cultura normais (Fig. 4D) e resistência a morte celular induzida por etoposídeo (VP-16) (Fig. 4E).

Exemplo 2

Fosforilação ERK induzida por FGF-2 é mediada por PKCe.

A sinalização MEK/ERK induzida por FGF-2 aumenta a expressão de Bcl-2, Bcl-XL, XIAP e cIAPl em células SCLC (Pardo et al. , 2002; Pardo et al. , 2003). Investigou-se se PKCs tais como PKCe mediariam a sinalização MEK/ERK induzida por FGF-2 em células H510. Para investigar esta noção, o efeito do quelante BAPTA permeável a Ca2+ em célula foi testado em um painel de inibidores incluindo GÕ6976, Hispidina, Rottlerina e GF109203X que focam em PKCa/βΙ, PKCβ, nPKCs ou não-seletivo, respectivamente. Somente GF109203X e Rottlerina inibiram a fosforilação ERK mediada por FGF-2 em células H510, embora todos os compostos tenham sido ativos na medida em que bloquearam fosforilação ERK aguda induzida por PDBu (Fig. 10A) . A Rottlerina inibe tanto PKCÕ (Gschwendt et al. , 1994) quanto PKCs .(Davies et al. , 2000), mas em conjunto com pesquisas anteriores parece que PKCs é o mediador crítico da sinalização ERK induzida por FGF-2 em células H510. De acordo com isto, a comparação de níveis de expressão de isoforma de PKC em sete linhas de células SCLC mostrou que somente PKCe se correlaciona com a fosforilação ERK induzida por FGF-2 (Fig 10B)

Para confirmar o envolvimento de PKCB na sinalização ERK mediada por FGF-2, um peptídeo translocador permeável a célula para PKCs (εΤΙ-ΤΙΤΑΤ) foi utilizado e comparado com um inibidor de PKCa (aTI-TITAT) ou peptídeos carreador sozinho (TITAT) (Vives et al. , 1997). Tratamento com ETI-TITAT levou a 60% de inibição de fosforilação ERK em resposta a FGF-2 (Fig. 4F) . Em contraste, nem αΤΙ-ΤΙΤΑΤ nem TITAT inibiram esta resposta. Para verificar estas constatações, PKCs foram regulados em células H510 utilizando tanto RNA sintético de pequena interferência (siRNA) como pools ativos (P) ou siRNAs deconvolutos individuais. Experimentos preliminares confirmaram a eficácia e seletividade destes siRNAs individuais ou em pool (Fig 12A e dados não mostrados). A Fig 4G demonstra que a regulação preveniu completamente a ativação ERK induzida por FGF-2 enquanto que o siRNA misturado não tem efeito. Resultados semelhantes foram vistos em células HEK293 utilizando tanto as mesmas moléculas de siRNA (dados não mostrados) ou vetores pSR codificando RNAi de "hairpin" curto (shRNAi) direcionadas a seqüências distintas dentro de PKCs (Fig. 12C). Em contraste, experimentos paralelos focando outras isoformas PKC incluindo PKCõ não tiveram tal efeito (dados não mostrados). Tomados juntos, estes resultados implicam PKCs na sinalização ERK mediada por FGF-2 em ambas células H510 e HEK293.

Exemplo 3

ΡΚΟε, B-Raf e S6K2 formam um complexo de multiproteína seguindo o tratamento com FGF-2 em células H510.

A sinalização MEK/ERK é necessária para a ativação da S6K2 por FGF-2 em células H510 SCLC. No entanto, nas células H69 células, em que os receptores FGF são desacoplados de MEK/ERK, FGF-2 falha ao ativar a S6K2 (Pardo et al., 2001) e também falha ao induzir quimiresistência (Pardo et al., 2002). Assim, a investigação adicional destas duas linhas de células proporcionou a valiosa oportunidade de elucidar os mecanismos moleculares pelos quais PKCs integra sinais a ambas S6K2 e ERK seguindo a estimulação com FGF-2. Lisatos de células H510 e H69 tratados com ou sem FGF-2 foram co-imunoprecipitados para identificar diferenças potenciais na fosforilação PKCs e nos parceiros de ligação. Já que a fosforilação de T566 e S729 em PKCs conhecidamente se correlaciona com a atividade desta quinase (Cenni et al., 2002), anticorpos fosfo-específicos a estes sítios foram utilizados na análise. Em células H510, há fosforilação aumentada por FGF-2 em ambos estes sítios dentro de 5min (Fig. 5A painel superior), um curso de tempo consitente com fosforilação ERK (Fig. 5A painel inferior). Isto foi correlacionado com a co-imunoprecipitação de S6K2 e B-Raf, mas não de S6K1 ou Raf-I. Em contraste, em células H69, FGF-2 não induziu a fosforilação dos resíduos T566 ou S729 em PKCe (Fig. 5A) . Adicionalmente, FGF-2 não disparou a co-associação de S6K2, S6K1, B-Raf ou Raf-I com PKCs e, como previamente descrito, não induziu a fosforilação ERK nestas células. Entretando, estas proteínas foram facilmente detectadas em lisatos totais de célula de células H69 (Fig. 5A-painel inferior). Assim, FGF-2 parece ativar PKCs e pode induzir a formação de um novo complexo de sinalização compreendendo PKCs/B-Raf e S6K2 em células H510.

As identidades protéicas deste novo complexo de sinalização induzido por FGF-2-foram confirmadas em células H510, pela repetição dos experimentos de co-imunoprecipitação utilizando anticorpos direcionados contra S6K2, S6K1, Raf-I ou B-Raf (Fig IlA e B) . Na medida em que a ativação de B-Raf tem sido repetidamente implicada na sinalização ERK (Calipel et al. , 2003; Dillon et al., 2003; Erhardt et al., 1999; Peraldi et al. , 1995; Wan et al. , 2004), os resultados sugerem a existência de um módulo de sinalização no qual ambos B-Raf e PKCs podem ser necessários para a fosforilação ERK no sentido abaixo de FGF-2. Adicionalmente, a associação da S6K2 a PKCs de maneira dependente de FGF-2 levantou a possibilidade desta isoforma de PKC estar envolvida na ativação de S6K2. Para investigar tal hipótese, a atividade basal de S6K2 na super-expressão PKCs de células H69 (ε-Η69) foi comparada com a das células transfectadas com vetor vazio (V-H69). A atifidade de fundo de S6K2 foi aumentada duas vezes em células ε-Η69 quando comparada a células V-H69 (Fig 2B). Este aumento foi dependente da atividade basal de PKCe como inibição de PKCs com εΤΙ-ΤΙΤΑΤ diminuiu a atividade de S6K2 em células ε-Η69 a um nível comparável ao encontrado em células V-H69 (Fig. 5B). Em contraste, a incubação de células ε-Η69 com o inibidor de translocação de PKCa (aTI-TITAT) ou TITAT sozinho não tiveram nenhum efeito sobre a atividade de S6K2. Esta atvidade de S6K2 elevada é correlacionada com a fosforilação S6 aumentada in vivo, que foi prevenida por εΤΙ-ΤΙΤΑΤ (Fig. 5C). Inversamente, em MEFs sem PKCε (KO) , a re-expressão de PKCε (K0+ε) (Ivaska et al. , 2 002), aumentou a fosforilação S6 em resposta a soro ou FGF-2 (Fig 5D e dados não mostrados) . A linha de célula KO+ε MEF mostrou respostas fisiológicas equivalentes às de linha de célula selvagens MEF apesar dos níveis de expressão PKCε ligeiramente aumentados (Ivaska et al. , 2 002; Kermorgant et al., 2004). Adicionalmente, em células H510, a ativação induzida por FGF-2 de S6K2 também foi inibida por εΤΙ-ΤΙΤΑΤ, mas não por αΤΙ-ΤΙΤΑΤ ou TITAT (Fig 5E).

Para substanciar adicionalmente a importância de ΡΚΟε na ativação de S6K2 por FGF-2 ou soro, MEFs sem ΡΚΟε (KO) foram comparadas com as células ΚΟ+ε para co-associação de Ρ^ε com S6K2 e fosforilação de T388 na região C-terminal da S6K2, uma região que conhecidamente é correlacionada com a ativação desta quinase. Somente MEFs ΚΟ+ε mostraram associação induzida por FGF-2 de PKCs com S6K2, que paralelamente aumentou a fosforilação de S6K2 em T388 (Fig 5F) . Soro também induziu a co-associação destas duas quinases, mas ao contrário de FGF-2, estimulou a fosforilação T388 em ambas as células KO e células ΚΟ+ε. Tomados juntos, estes dados demonstram que ΡΚΟε, B-Raf e S6K2 são parte de um complexo multi-proteína formado em resposta a estimulo FGF-2 e que regula a atividade de S6K2.

Exemplo 4

Complexo de PKCs, B-Raf e S6K2 é formado em células

HEK293: a regulação de PKCe.quebra a associação de B-Raf com S6K2.

Para se determinar se FGF-2 poderia induzir a formação de complexo BRaf/ΡΚΟε/S6K2 em tipos adicionais de células, utilizou-se células HEK293, células KO e ΚΟ+ε. B-Raf foi co-imunoprecipitada tanto com ΡΚΟε ou S6K2 seguindo estimulação com FGF-2 em células 293 ou ΚΟ+ε, mas não em células KO sem ΡΚΟε (Fig 6A, 6C 5F e dados não mostrados). Mais ainda, nem PKCa Raf-I nem S6K1 associada com S6K2 (dados não mostrados) . Assim, a indução deste novo complexo de sinalização por FGF-2 não é restrito a células SCLC.

Para identificar a possível seqüência de interações envolvidas na montagem deste complexo de mui ti-proteínas B-Raf, PKC ε ou como controles, PKCa e PKC δ foram regulados seletivamente e seu efeito na formação do complexo avaliado. Células HEK293 foram transfectadas com vetores siRNA ou pSR codificando shRNAi individuais ou em forma de pool. A seletividade de alvo e a habilidade em forçar fosforilação ERK induzida por FGF-2 foi determinada (suppl Fig. 6A-C e dados não mostrados) . 0 efeito da regulação destas proteínas na associação de B-Raf e PKCs com S6K2 em resposta ao FGF-2 foi avaliado. 0 knockdown de PKCδ. ou α . ou o uso de RNAi misturado não teve efeito sobre a formação do complexo (Fig 6B e Fig. 12D). Na ausência de B-Rafi PKCs. ainda se associou à S6K2. No entanto, B-Raf failed to associate with S6K2 in the absence of PKCs. (..Fig. 6B e Fig 12D) . Importante destacar que resultados idênticos foram obtidos com estratégias siRNA ou shRNAi focando diferentes seqüências, muito embora a anterior tenha sido mais eficiente como proteína alvo de knockdown. Isto sugere que enquanto a associação de PKCs à S6K2 pode ser direta, a associação de B-Raf com S6K2 precisa de PKCs. Neste sentido, o FGF-2 somente induziu a associação de B-Raf com S6K2 em células KO+ε, mas não células KO (Fig 6C) .

Para ainda investigar este aspecto e examinar se PKCs .e/ou B-Raf podem modular o status de fosforilação de S6K2, preparações purificadas destas quinases foram co-incubadas em várias combinações com 32Pi-ATP. Quando B-Raf ativada (V600EB-Raf) foi co-incubada com S6K2 nenhuma fosforilação de S6K2 foi observada; embora em experimentos paralelos V600EB-Raf tenha fosforilado eficientemente MEK (Fig. 6D, painel inferior) . Em contraste, PKCs induziu uma fosforilação marcada de S6K2, que foi ainda aumentada pela adição de V600EB-Raf (Fig. 6D, painel inferior). Tingimento com Coomassie confirmou que estas mudanças não foram conseqüência de carga desigual das quinases adicionadas (Fig. 6D painel superior). A repetição destes experimentos utilizando ATP frio e western blot para T388S6K2 (também detecta T3 89S6K1 e em local equivalente em PKCs) mostrou que este não era o local de fosforilação na S6K2 induzido por PKCs ou V6OOEBRaf (Fig 6E). Em conjunto, estes resultados indicam que PKCe pode associar diretamente e fosforilar a S6K2 enquanto que a B-Raf deverá precisar da presença de PKCs para se juntar ao complexo.

Exemplo 5

A atividade de quinase da S6K2, mas não da S6K1, aumenta a sobrevivência e regula Bcl-XL e XIAP.

Já que a sobrevivência celular induzida por FGF-2 necessita de PKCs que forma um complexo com B-Raf e S6K2, mas exclui S6K1, é palusível que duas isoformas S6K tenham habilidades diferentes no controle de sobrevivência celular. Para testar esta hipótese, foram gerados vários clones de células HEK293Tet (Invitrogen) expressando construtos indutíveis por tetraciclina com atividade de quinase das formas citoplásmicas de ambas S6K1 e S6K2. A tetraciclina aumentou seletivamente os níveis protéicos de isoformas S6K transfectadas sem nenhum efeito na linha celular parental (293Tet) em todos os clones testados (Fig 7 A e dados não mostrados). Ensaios in vitro de quinase e western blot para fosforilação S6 confirmaram que o tratamento com tetraciclina aumentou a atividade da quinase correspondente (Fig. 7B, D) de modo semelhante aos vistos após estimulação com FGF-2 ((Pardo et al., 2001) e dados não mostrados). O efeito deste aumento seletivo na atividade de quinase sobre a habilidade de clones de células HEK293Tet sobreviverem privação de soro foi então avaliado. Na ausência de tetraciclina, a proporção de morte celular foi semelhante em KA-S6K1, KA-S6K2 e células HEK293Tet com vetor sozinho. Após exposição a tetraciclina, somente as células super-expressando KA- S6K2 tiveram morte celular reduzida (Fig 7C), vista entre 12-24 h após retirada do soro (Fig 13A). Estes resultados não puderam ser atribuídos a um aumento de proliferação celular já que células expressando KA-S6K2-não mostraram aumento na síntese de DNA quando comparadas a células V-293Tet. Entretanto, a expressão de Bcl-XL e XIAP foi seletivamente aumentada em células KA-S6K2. Isto não foi posteriormente induzido por FGF-2, não foi suprimido pela inibição seletiva de MEK com PD098059 e também não foi visto nem em células KA-S6K1 ou células selvagens super-expressando S6K2 (Fig 7D e dados não mostrados). Da mesma forma que células super-expressando KA-S6K2, o estímulo de células HEK293Tet com FGF-2 mostrou sobrevivência aumentada e expressão de Bcl-XL e XIAP, mas esta última pode ser bloqueada por inibição de MEK (Fig 7E, Fig. Supl. 13C). Tomados juntos, estes resultados sugerem que S6K2, mas não S6K1, regula a expressão de Bc1-XL e XIAP e que a S6K2 ativada é suficiente para reproduzir os efeitos pró-sobrevivência induzidos por FGF-2.

Exemplo 6

A regulação de S6K2, mas não de S6K1, aumenta a morte celular e inibe o crescimento clonogênico.

Para adicionalmente suportar a noção de que a S6K2 é um mediador crítico de sobrevivência celular, RNAi foi empregado para regular especificamente isoformas S6K e para examinar morte celular pela contagem de células viáveis. Primeiramente, vetores RNAi pSR de S6K1 ou S6K2 foram transfectados em células HEK2 93 e a regulação seletiva dos respectivos alvos foi verificada por western blot (Fig. 8A painel superior) . Quando comparada a S6K1 (S6KlpSR) , a regulação de S6K2 (S6K2pSR) aumentou a morte celular por cerca de duas vezes em condições normais de crescimento (Fig. 8A painel inferior). Por ocasião de retirada de soro, morte celular de fundo aumentou tanto em células de vetor e de S6K1 com knockdown. Entretanto, knockdown de S6K2 induziu mais morte celular (Fig. 8A painel inferior).

Em células H510, S6KlpSR e S6K2pSR também induziram regulação específica da proteína correspondente (Fig. 8B painel superior). Adicionalmente, enquanto que a expressão de S6KlpSR não teve efeito na sobrevivência celular quando comparada ao controle de vetor vazio (pSR), a regulação de S6K2 aumentou a morte celular basal por mais de duas vezes sobre o controle (Fig. 8B painel inferior). Isto se correlaciona com um aumento na quebra de lamina B, um substrato de caspase 3 e 7 (Fig. 8B painel inferior) . Adicionalmente, S6K2pSR-H510, diferentemente de pSR- ou células S6KlpSR-H510, não conseguiu se propagar em cultura devido a morte celular (dados não mostrados). Estes resultados suportam nossos achados iniciais de que S6K2, mas não S6K1, desempenha um papel crucial na promoção de sobrevivência celular.

Como uma abordagem adicional para examinar os efeitos específicos de S6K2, ensaios cologênicos foram utilizados, o que pelo menos em parte reflete a sobrevivência celular. A Fig 8C demonstra que somente knockdown mediado por RNAi de S6K2, e não a expressão de S6K1, inibe o crescimento clonogênico de células HEK293. Resultados semelhantes foram obtidos com knockdown de PKCε por shRNAi (Fig 8C) . Importante destacar que estes resultados não foram específicos para células HEK293, mas puderam ser reproduzidos em linhas de células A549 humana não-SCLC (NSCLC) e em MCF7 de carcinoma de mama humano (Fig 8C) . O efeito da regulação de S6K2 também não foi específico para espécia, já que a regulação de S6K2 em NIH 3T3 de fibroblastos murinos utilizando o mesmo vetor (que foca numa seqüência conservada) levou a decréscimo de crescimento clonogênico (Fig 8C) . Em contraste, as seqüências alvo PKC£ aqui utilizadas, que não são conservadas entre humanos e camundongos, não reduziu os níveis de PKCs em célula NIH 3T3 ou crescimento clonogênico (Fig 8C e dados não mostrados). Entretanto, a importância de PKCs na mediação de efeitos de pró-sobrevivência em células murinas foi vista nas células KO+ε, que sobreviveram a retirada de soro muito melhor do que células KO (Fig 8D) . Tomados juntos, estes dados mostram que S6K2, mas não S6K1, promove sobrevivência celular de células HEK293 e H510 SCLC e pode estar amplamente envolvido na regulação do crescimento clonogênico de células de mamíferos.

Exemplo 7

A regulação da S6K2, mas não da S6K1, inibe os efeitos anti-apoptóticos de FGF-2.

Os resultados anteriores sugerem que a S6K2 media os efeitos de pró-sobrevivência de FGF-2. Para substanciar isto, S6K1 e 2 foram alvo em células H510 utilizando-se vetores retrovirais RNAi descritos acima e as linhagens celulares resultantes submetidas a tratamento com etoposídeo com ou sem FGF-2. Células H510 com vetor vazio (pSR) e reguladas por S6K1 (S6KlpSR) tiveram quantidade equivalente de morte celular em resposta a etoposídeo e foram ambas resgatadas por pré-incubação com FGF-2 (Fig. 9A). Conforme anteriormente descrito (Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003), este resgate foi espelhado por um aumento no nível protéico de Bcl-XL e XIAP (Fig. 9B) . Em contraste, células H510 knocked-down para S6K2 (S6K2pSR) demonstraram uma razão de morte de fundo maior e foram quase totalmente destruídas por etoposídeo (Fig. 9Α). Adicionalmente, o pré-tratamento com FGF-2 não regulou XIAP ou Bcl-XL e não conseguiu recuperar estas células da morte por etoposídeo (Fig 9A e B) . Estes resultados suportam a hipótese de que a S6K2 media a quimioresitência induzida por FGF-2.

Entretanto, a grande «quantidade de morte celular induzida por etoposídeo, assim como a razão de morte de fundo elevada nas células H510 S6K2pSR, pode interferir na habilidade de se observar os efeitos pró-sobrevivência de FGF-2. Assim, estes experimentos foram repetidos utilizando seqüências alvo de siRNA em forma de pool dentro de B-Raf, S6K2 ou S6K1 distintas das reconhecidas por pSR shRNAis. A Fig 9C (painel superior) mostra que B- Raf, S6K2 e S6K1 foram reguladas seletivamente em células H510 com resultados dos respectivos siRNA em forma de pool semelhantes aos vistos em células HEK293 (Fig 12A) . Adicionamente, a regulação transiente de S6K2 bloqueou completamente o resgate disparado de FGF-2 da morte por etoposídeo (Fig 9C, painel inferior). Resultados similares foram obtidos com o siRNA B-Raf (Fig 9C, painel inferior). Em contraste, o knockdown transiente de S6K1 não bloqueou a quimioresistência induzida por FGF-2. Resultados semelhantes foram vistos quando estes experimentos foram repetidos utilizando-se siRNA individual para seqüências alvo distintas (Fig 14) . Assim, B-Raf, S6K2, mas não S6K1, são necessárias para que FGF-2 apresente sinais de pró-sobrevivência que previnam a morte por etoposídeo em células H510 SCLC. Demonstração da importância de S6K2 e B-Raf na sinalização pró-sobrevivência induzida por FGF-2 num sistema de célula distinto. Os mesmos construtos pSR foram transientemente transfectados em células HEK293, seguidos de privação de soro na presença ou ausência de FGF-2. Adicionalmente, vetores RNAi para PKCei PKCa e S6K1 foram testados em paralelo. Enquanto que quantidade semelhantes de morte celular foram induzidas por privação de soro de células pSR e S6K2pSR, o FGF-2 aumentou a sobrevivência de células pSR sozinho (Fig. 9D) . De maneira semelhante, FGF-2 não conseguiu resgatar células reguladas para B-Raf ou PKCe , as duas proteínas que mostraram interação com S6K2. Em contraste, o FGF-2 resgatou completamente células HEK293 knocked-down para PKCa (Fig. 9D). De maneira intrigante, estas células demonstraram uma razão de sobrevivência basal alta na ausência de soro e FGF-2. Isto pode ser potencialmente explicado por um aumento na fosforilação PKCe em S729, um sítio ligado à sua atividade de quinase (Fig. 9E) . Alternativamente, PKCa pode ser necessária para a introdução de morte celular em células HEK293. Surpreendentemente, a regulação S6K1 resultou em níveis de morte celular comparáveis aos observados em células pSR tratadas com FGF-2 (Fig. 9D) . Isto pode refletir envolvimento de S6K1 na indução de morte celular. Entretanto, a regulação de S6K1 aumentou a fosforilação de S6K2 em S401, um sítio conhecido por se correlacionar com a atividade S6K2, de maneira semelhante à vista na resposta a estimulação de FGF-2 (Fig. 9F) . Em contraste, os níveis de fosforilação basal de S401 foram notadamente reduzidos na presença de RNAi focando S6K2 quando comparado a células controle pSR (Fig. 9F). Sendo assim, a regulação de S6K1 provavelmente aumenta a atividade basal S6K2 mimetizando os efeitos de pró-sobrevivência induzidos por FGF-2. Adicionalmente, isto explica porque a adição de FGF-2 não melhora adicionalmente a sobrevivência de células knocked-down para S6K1, já que estas células já possuem S6K2 ativada. Tomados juntos, estes dados demonstram que S6K2 é o mediador dos efeitos de pró-sobrevivência FGF-2. Os resultados também revelam uma não-sobreposição na atuação de S6K1 e S6K2 na sobrevivência celular.

Os inventores determinaram que PKC ε é tanto necessária quanto suficiente para acoplar FGFRs a regulação MEK/ERK, Bcl-XL e XIAP e efeitos pró- sobrevivência em ambas as células SCLC e HEK 293. Assim, (1) a comparação de níveis de expressão em membros da família PKC num painel de linhagens celulares SCLC revelou que somente PKCs correlaciona a habilidade de FGF-2 induzir sinalização MEK/ERK e regulação de Bcl-XL e XIAP, (2) a super-expressão de PKCs foi suficiente para induzir sinalização MEK/ERK, regulação de Bcl-XL e XIAP e efeitos de pró-sobrevivência, (3) supressão seletiva da função ou expressão de PKCs previne estes efeitos induzidos por FGF-2.

O mecanismo pelo qual PKCs pode se acoplar à sinalização MEK/ERK já foi investigado. Em células endoteliais, PKCe e PKCa podem ser co-imunprecipitadas com Raf-1 em ativação MEK/ERK mediada por stress (Cheng et al., 2001). Em células NIH-3T3, PKCs pode residir num complexo latente e inativo com Raf-I1 que pode ser estimulado por éster forbólico para desencadear a sinalização MEK/ERK (Hamilton et al., 2001). Em contraste com estes relatos, os inventores não foram capazes de demosntrar um complexo entre PKCs ou PKCa com Raf-I nem em células SCLC ou HEK293. Entretanto, estes resultados mostram que FGF-2 dispara indutivamente a associação de PKCs com B-Raf (Figs 5, 6 e 12). Adicionalmente, a regulação de B-Raf com várias espécies seletivas de RNAi bloqueia a sinalização MEK/ERK induzida por FGF-2 e efeitos de pró-sobrevivência (Fig 9, 12 e 14).

A sinalização MEK/ERK induzida por FGF-2, necessária para efeitos pró-sinalização (Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003), também é necessária para a ativação de S6K2, mas não de S6K1 (Pardo et al., 2001). Muitos outros achados sugerem que S6K2 pode ter funções discretas como as discutidas na introdução. Assim, postulamos que S6K2 pode se associar ao complexo PKCs/BRaf e mediar a quimioresistência.

Estes novos achados mostram que S6K2, mas não S6K1, de fato se associa ao complexo PKCs/B-Raf induzido por FGF-2, -um achado comum a células tanto SCLC, HEK293 e MEF. De maneira intrigante, não foi possível mostrar de maneira reprodutível a presença de tanto MEK ou ERK neste complexo, talvez porque a associações fossem fracas, transientes ou tivessem reconhecimento por anticorpo bloqueado. Mesmo assim, estudos de RNAi knockdown em células intactas e estudos de co-associação de quinases purificadas in vitro indicam que a associação de PKCs com S6K2 é direta e resulta na fosforilação de S6K2. Em contraste, B-Raf somente se associa com S6K2 na presença de PKCe em células intactas e não fosforila diretamente S6K2 na ausência de PKCs. Entretanto, incubação destas três enzimas juntas ainda aumenta a fosforilação de S6K2, levantando a possibilidade de que B-Raf pode fosforilar S6K2 quando PKCs está presente. Alternativamente, B-Raf pode alterar a conformação de PKCs e/ou S6K2 apresentando mais sítios PKC em S6K2. Um relato recente examinando células HEK293 estimuladas com éster forbólico sugere que S486 dentro do domínio C-terminal da S6K2 deve ser um dos sítios regulados por PKC (Valovka et al. , 2003). Claramente, a natureza dos sítios de fosforilação S6K2 regulados por PKCs e/ou B-Raf seguindo estimulação fisiológica com FGF-2 agora merece investigação adicional. A despeito da natureza destes sítios, entretando, nossos resultados para super-expressão seletiva ou inibição da função ou expressão de PKCs indicam que esta quinase media a ativação de S6K2 induzida por FGF-2 (Fig. 5).

O uso de mutantes ativos indutivos por tetraciclina de S6K2 e S6K1 demosntra que somente S6K2 desencadeia a regulação de XIAP e Bcl-XL e efeitos pró-sobrevivência induzidos em células HEK293 (Fig. 7). Adicionalmente, estudos de RNAi knockdown em ambas as células HEK2 93 e SCLC mostra que a regulação de S6K2, mas não de S6K1, previne a sobrevivência (Fig 8, Fig 13). Adicionalmente, S6K2 também é importante para suportar o crescimento clonogênico em várias linhas de células diferentes (Fig. 8). Crucialmente, a regulação seletiva de S6K2, mas não de S6K1, bloqueia a regulação induzida por FGF-2 de Bcl-XL, XIAP em ambas as células SCLC e HEK293 e também inibe morte em resposta a etoposídeo e retirada de soro, respectivamente (Fig. 9, Fig 14). Sendo assim, S6K2 é tanto necessária quanto suficiente para mediar a sinalização pró-sobrevivência induzida por FGF-2.

De maneira intrigante, recentemente determinamos que níveis de expressão protéica elevados de S6K2 em ambas as biópsias SCLC e NSCLC aparentemente se correlacionam com o desenvolvimento de quimioresistência (Fig 15) .

Um novo complexo de sinalização induzido por FGF-2 compreendendo PKCs/BRaf e S6K2, mas excluindo S6K1. A formação deste complexo pode explicar como S6K1 e S6K2 podem ser guiadas a diferentes compartimentos celulares para atingir substratos distintos a despeito de sua alta homologia dentros dos domínios de quinase. De fato, este complexo via S6K2 (mas não S6K1), regula a expressão protéica de Bcl-XL e XIAP assim promovendo sobrevivência/quimioresistência. Assim, a função discreta de S6K2, em oposição a S6K1, foi revelada. Investigação adicional dos mecanismos moleculares pelos quais S6K2 pode interagir seletivamente com o sistema translacional da célula para controlar diferenciadamente um sub-conjunto de proteínas anti-apoptóticas se faz agora necessário. De maneira importante, o foco de membros individuais do complexo de sinalização PKCε/BRaf/S6K2 ou sua associação pode proporcionar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para reverter a quimioresistência. Mais ainda, os níveis de expressão de S6K2 e possivelmente de outros membros do complexo também podem apresentar novos biomarcadores prognósticos.

Referências

Calipel, A., Lefevre, G., Pouponnot, C., Mouriaux, F., Eychene, A. e Mascarelli, F. (2003) Mutation of B-Raf in human choroidal melanoma cells mediates cell proliferation and transformation through the MEK/ERK pathway. J Biol Chem, 278, 42409-42418.

Cenni, V. , Doppler, H., Sonnenburg, E.D., Maraldi, N., Newton, A.C. e Toker, A. (2002) Regulation of novel protein kinase C epsilon by phosphorylation. Biochem J, 363, 537-545.

Cheng, J.J., Wung, B.S., Chao, Y. J. e Wang, D. L. (2001) Sequential activation of protein kinase C (PKC)- alpha and PKC-epsilon contributes to sustained Raf/ERKl/2 activation in endothelial cells under mechanical strain. J Biol Chem, 276, 31368-31375.

Davies, S.P., Reddy, H., Caivano, M. e Cohen, P. (2000) Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J, 351, 95-105.

Dillon, T.J., Karpitski, V., Wetzel, S.A., Parker, D.C., Shaw, A. S. e Stork, P.J. (2003) Ectopic B-Raf expression enhances extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling in T cells and prevents antigen- presenting cell-induced anergy. J Biol Chem, 278, 35940- 35949.

Ding, L., Wang, H., Lang, W. e Xiao, L. (2002) Protein kinase C-epsilon promotes survival of Iung câncer cells by suppressing apoptosis through dysregulation of the mitochondrial caspase pathway. J Biol Chem, 277, 35305-35313.

Dufner, A. e Thomas, G. (1999) Ribosomal S6 kinase signaling and the control of translation. Exp Cell Res, 253, 100-109.

Erhardt, P., Schremser, E.J. e Cooper, G.M. (1999) B-Raf inhibits programmed cell death downstream of cytochrome c release from mitochondria by activating the MEK/Erk pathway. Mol Cell Biol, 19, 5308-5315.

Gout, I., Minami, T., Hara, K., Tsujishita, Y., Filonenko, V., Waterfield, M. D. e Yonezawa, K. (1998) Molecular cloning and characterization of a novel p7 0 S6 kinase, p70 S6 kinase b containing a proline-rich sequence. J Biol Chem, 273, 30061-30064.

Gschwendt, M., Muller, H.J., Kielbassa, K., Zang, R., Kittstein, W., Rincke, G. e Marks, F. (1994) Rottlerin, a novel protein kinase inhibitor. Biochem Biophys Res Commun, 199, 93-98.

Hamilton, M., Liao, J., Cathcart, M.K. e Wolfman, A. (2001) Constitutive association of c-N-Ras with c-Raf-1 and protein kinase C epsilon in latent signaling modules. J Biol Chem, 276, 29079-29090. Ivaska, J., Whelan, R.D., Watson, R. e Parker, P.J. (2002) PKC epsilon controls the traffic of betai integrins in motile cells. Embo J, 21, 3608-3619.

Kawauchi, K., Lazarus, A.H., Sanghera, J.S., Man, G.L., Pelech, S.L. e Delovitch, T.L. (1996) Regulation of BCR- and PKC/Ca(2+)-mediated activation of the Raf1/MEK/MAPK pathway by protein-tyrosine kinase and - tyrosine phosphatase activities. Mol Immunol, 33, 287- 296 .

Kermorgant, S., Zicha, D. e Parker, P.J. (2004) PKC controls HGF-dependent c-Met traffic signalling and cell migration. EMBO J, 23, 3721-3734.

Lee-Frumen, K.K., Kuo, C.J., Lippincott, J., Terada, N. e Blenis, J. (1999) Characterization of S6K2, a novel kinase homologous to S6K1. Oncogene, 18, 5108-5114.

Martin, K.A., Schlam, S.S., Romanelli, Ά., Keon, K.L. e Blenis, J. (2 001) Ribosomal S6 kinase 2 inhibition by a potent C-terminal repressor domain is relieved by mitogen-activated protein-extracellular signal-related kinase kinase regulated phosphorylation. J. Biol. Chem, 276,7892-7898.

Pardo, O.E., Arearo, A., Salerno, G., Raguz, S., Downward, J. e Seekl, M.J. (2002) Fibroblast growth factor-2 induces translational regulation of Bel-XL and Bcl-2 via a MEK-dependent pathway: correlation with resistance to etoposide-induced apoptosis. J Biol Chem, 277,12040-12046.

Pardo, O.E., Arearo, A., Salerno, G., Tetley, T.D., Valovka, T., Gout, I. e Seckl, M.J. (2001) Novel cross talk between MEK and S6K2 in FGF-2 induced proliferation of SCLC cells. Oncogene, 20, 7658-7667.

Pardo, O.E., Lesay, A., Arcaro, A., Lopes, R., Ng, B.L., Warne, P.H., McNeish, I.A., Tetley, T.D., Lemoine, N.R., Mehmet, H., Seckl, M.J. e Downward, J. (2003) Fibroblast growth factor 2-mediated translational control of IAPs blocks mitochondrial release of Smac/DIABLO and apoptosis in small cell Iung câncer cells. Mol Cell Biol, 23, 7600-7610.

Parekh, D., Ziegler, W., Yonezawa, K., Hara, K. e Parker, P.J. (1999) Mammalian TOR controls one of two kinase pathways acting upon nPKCdelta and nPKCepsilon. J Biol Chem, 274, 34758-34764.

Pende, M., Um, S.H., Mieulet, V., Sticker, M., Goss, V.L., Mestan, J., Mueller, M., Fumagalli, S., Kozma, S.C. e Thomas, G. (2004) S6K1(-/-)/S6K2(-/-) mice exhibit perinatal lethality and rapamycin-sensitive 5'-terminal oligopyrimidine mRNA translation and reveal a mitogen- activated protein kinase-dependent S6 kinase pathway. Mol Cell Biol, 24, 3112-3124.

Peraldi, P., Frodin, M., Barnier, J.V., Calleja, V., Scimeca, J.C., Filloux, C., Calothy, G. e Van Obberghen, E. (1995) Regulation of the MAP kinase cascade in PC12 cells: B-Raf activates MEK-I (MAP kinase or ERK kinase) and is inhibited by cAMP. FEBS Lett, 3 57, 290-296.

Richardson, C.J., Broenstrup, M., Fingar, D.C., Julich, K., Ballif, B.A., Gygi, S. e Blenis, J. (2004) SKAR is a specific target of S6 kinase 1 in cell growth control. Curr Biol, 14, 1540-1549. Ruotsalainen, T., Joensuu, H., Mattson, Κ. e Salven, Ρ. (2002) High pretreatment seriam concentration of basic fibroblast growth factor is a predictor of poor prognosis in small cell Iung câncer. Câncer Epidemiol Biomarkers Prev, 11, 1492-1495.

Schonwasser1 D.C., Marais, R.M., Marshall, C.J. e Parker, P.J. (1998) Activation of the mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway by conventional, novel, and atypical protein kinase C isotypes. Mol Cell Biol, 18, 790-798.

Seufferlein, T. e Rozengurt, E. (1996) Galanin, neurotensin and phorbol esters rapidly stimulate activation of mitogen activated protein kinase in small cell Iung câncer cells. Câncer Res, 56, 5758-5764.

Shima, H., Pende, M., Chen, Y., Fumagalli, S., Thomas, G. e Kozma, S.C. (1998) Disruption of the p70(s6k)/p85(s6k) gene reveals a small mouse phenotype and a new functional S6 kinase. Embo J, 17, 6649-6659.

Soh, J.W., Lee, E.H., Prywes, R. e Weinstein, I.B. (1999) Novel roles of specific isoforms of protein kinase C in activation of the c-fos serum response element. Mol Cell Biol, 19, 1313-1324.

Souroujon, M.C. e Mochly-Rosen, D. (1998) Peptide modulators of protein-protein interactions in intracellular signaling. Nat Biotechnol, 16, 919-924.

Tillman, D.M., Izeradjene, K., Szucs, K.S., Douglas, L. e Houghton, J.A. (2003) Rottlerin sensitizes colon carcinoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis via uncoupling of the mitochondria independent of protein kinase C. Câncer Res, 63, 5118-5125.

Valovka, T., Verdier, F., Cramer, R., Zhyvoloup, Α., Fenton, T., Rebholz, H., Wang, Μ.L., Gzhegotsky, M., Lutsyk, Α., Matsuka, G., Filonenko, V., Wang, L. , Proud, C. G. , Parker, P.J. e Gout, Ι.Τ. (2003) Protein kinase C phosphorylates ribosomal protein S6 kinase betall and regulates its subcellular localization. Mol Cell Biol, 23, 852-863.

Vives, E., Brodin, P. e Lebleu, B. (1997) A truncated HIV-I Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 272, 16010-16017.

Wan, P.T., Garnett, M.J., Roe, S.M., Lee, S., Niculescu-Duvaz, D., Good, V.M., Jones, C.M., Marshall, C.J., Springer, C.J., Barford, D. e Marais, R. (2004) Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell, 116, 855-867.

Wang, L., Gout, I. e Proud, C.G. (2001) Cross-talk between the ERK and p7 0 S6 kinase (S6K) signaling pathways. MEK-dependent activation of S6K2 in cardiomyocytes. J Biol Chem, 276, 32670-32677.

Way, K.J., Chou, E. e King, G.L. (2000) Identification of PKC-isoform-specific biological actions using pharmacological approaches. Trends Pharmacol Sei, 21, 181-187.

Wu, D., Thakore, C.U., Wescott, G.G., McCubrey, J.A. e Terrian, D.M. (2004) Integrin signaling links protein kinase Cepsilon to the protein kinase B/Akt survival pathway in recurrent prostate câncer cells. Oncogene, 23, 8659-8672.

Yedovitzky, M., Mochly-Rosen, D., Johnson, J.A., Gray, M.O., Ron, D., Abramovitch, E., Cerasi, E. e Nesher, R. (1997) Translocation inhibitors define specificity of protein kinase C isoenzymes in pancreatic beta-cells. J Biol Chemj 272, 1417-1420.

Zou, Y., Komuro, I., Yamazaki, T., Aikawa, R., Kudoh, S., Shiojima, I., Hiroi, Y., Mizuno, T. e Yazaki, Y. (1996) Protein kinase C, but not tyrosine kinases or Ras, plays a criticai role in angiotensin II-induced activation of Raf-I kinase and extracellular signal- regulated protein kinases in cardiac myocytes. J Biol Chem, 271, 33592-33597.

Claims (24)

1. Complexo caracterizado pelo fato de compreender duas ou mais das proteínas S6K2, B-Raf e PKCs.

2. Complexo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser capaz de causar quimioresistência numa- célula cancerosa.

3. Complexo de acordo ^ com as. reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que S6K2 compreende a seqüência como mostrada na Figura 1.

4. Complexo de acordo, com qualquer uma. das reivindicações -1 a 3, caracterizado pelo fato de que B-Raf compreende a seqüência como mostrada na Figura 2.

5. Complexo de acordo còm qualquer uma das reivindicações -1 a 4, caraçtérizado pelo fato de que PKCs compreende a seqüência como mostrada na Figura, 3.

6. Anticorpo caracterizado pelo fato de que se' liga especificamente ao complexo- conforme definido na reivindicação, 1.

7. Método par.à identificar um inibidor do complexo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de colocar em contato uma célula- que. expresse duas ou mais de-S6K2, PKCs e B-Raf com um composto. teste e determinar se um complexo se forma.

8. Método, para identificar um inibidor do cpmplexo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de colocar em contato duas ou mais de S6K2, PKCe e B-Raf com um composto teste é determinar se um complexo se forma.

9. Inibidor caracterizado pelo fato de ser inibidor do complexo conforme· definido na reivindicação 1.

10. Inibidor de acordo, com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é identificado pelo método conforme definido nas reivindicações 6 ou 7.

11. Inibidor de acordo cora a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que inibe a expressão de B-Raf.

12. Inibidor de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato"de/'que inibe a expressão de PKCe.

13. Inibidor de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que inibe a expressão de S6K2.

14. Inibidor de acordo com a reivindicação-9,. caracterizado pelo fato de que previne' a associação de S6K2, B-Raf e/ou PKC έ.

15. Uso de um inibidor do complexo conforme definido ná reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser para preparar uma composição, para prevenir ou reverter o quadro de quimioresistência.

16. Uso" de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o inibidor é identificado pelo método conforme definido nas reivindicações 6 ou 7.

17. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a célula cancerosa é uma célula pequena de câncer de pulmão (SCLC) .

18. Uso de acordo com a íeivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o inibidor é RNAi, RNA antisenso, RNA ribozima ou um anticorpo.

19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um inibidor conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 9 a 14 , é um adjuvantè, diluente \ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

20. Método para diagnosticar cfuimioresistência num paciente de câncer caracterizado pelo fato de compreender detectar um complexo compreendendo S6K2, B-Raf je PKCê. numa célula cancerosa do paciente.

21. Método para diagnosticar quimioresistência num paciente de câncer caracterizado pelo fato de compreender detectar o nível de ativação de S6K2 numa célula cancerosa do paciente e comparar ao nível de ativação de S6K2 numa célula não-cancerosa do pàciente ou numa célula dé paciente· não-cariceroso, em que a célula cancerosa é resistente à quimioterapia se o nível de ativação de- S6K2, for maior na célula cancerosa do que na célula não-cancerosa do paciente ou numa célula de paciente não-cancerosò.

22. Método para predizer a tendência de uma célula cancerosa a desenvolver quimioresistência, caracterizado pelo fato de compreender medir o nivel de ativação de S6K2 na célula era dois ou mais pontos no tempo, em que a célula tende. a desenvolver quimioresistência se o nível de ativação de S6K2 aumentar entre os pontos no tempo.

23. Método para diagnosticar quimioresistência numa célula cancerosa caracterizado pelo fato de compreender detectar o nível de S6K2 na célula.

24. Uso de um inibidor do complèxp conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uiiw medicamento para a prevenção ou reversão de quimioresistência numã célula cancerosa.