PT2049477E - Moduladores da actividade do receptor da quimiocina, formas cristalinas e processo - Google Patents

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Robert J Cherney
Zili Xiao
Michael G Yang
Martin G Eastgate
Jale Muslehiddinoglu
Siva Josyula Prasad
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Description

1
DESCRIÇÃO "MODULADORES DA ACTIVIDADE DO RECEPTOR DA QUIMIOCINA, FORMAS CRISTALINAS E PROCESSO"
ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-il)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável, apresentando as mesmas uma inesperada combinação de caracteristicas farmacológicas desejáveis. As formas cristalinas da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e as mesmas para uso como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares constituem também um objectivo desta invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As quimiocinas são citocinas quimiotácticas, de peso molecular 6-15 kDa, que são libertadas por uma ampla variedade de células para atrair e activar, entre outros tipos de células, macrófagos. Linfócitos T e B, eosinófilos, basófilos e neutrófilos (revisto em: Charo and Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445; e Rollins, Blood 1997, 90, 2 909-928). Existem duas classes principais de quimiocinas. CXC e CC, dependendo de as primeiras duas cisteinas na sequência de aminoácidos estarem separadas por um único aminoácido (CXC) ou serem adjacentes (CC) . As quimiocinas CXC, tais como a interleuquina-8 (IL-8) , a proteína de activação dos neutrófilos-2 (NAP-2) e a proteína de actividade estimuladora de crescimento do melanoma (MGSA) são quimiotácticas principalmente para os neutrófilos e os linfócitos T, ao passo que as quimiocinas CC, tais como a RANTES, MIP-Ioí, MIP-Ιβ, as proteínas quimiotácticas de monócitos (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, e MCP-5) e as eotaxinas (-1 e -2) são quimiotácticas para, entre outros tipos de células, macrófagos, linfócitos T, eosinófilos, células dendríticas e basófilos. Existem também as quimiocinas linfotactina-1, linfotactina-2 (ambas quimiocinas C) e fractalquina (uma quimiocina CX3C) que não fazem parte de qualquer das subfamílias principais de quimiocina. As quimiocinas ligam-se a receptores específicos da superfície celular pertencentes à família de proteínas com 7 domínios transmembrana acopladas à proteína G (revisto em: Horuk, Trends Pharm. Sei. 1994, 15, 159-165) que são designadas como "receptores de quimiocina". Ao ligar-se aos respectivos ligandos cognatos, os receptores da quimiocina transduzem um sinal intracelular através das proteínas G triméricas associadas, resultando, entre outras respostas, num aumento rápido na concentração intracelular de cálcio, alterações na forma celular, aumento da expressão das moléculas de adesão celular, desgranulação e promoção da migração celular. Existem pelo menos dez receptores humanos da quimiocina que se ligam ou respondem às quimiocinas CC com os seguintes padrões característicos (revisto em Zlotnik e Oshie Immunity 2000, 12, 121) : CCR-1 (ou "CKR-1" ou "CC-CKR-1") [ΜΙΡ-Ια, MCP-3, MCP-4, RANTES] 3 (Ben-Barruch, et al., Cell 1993, 72, 415-425 e Luster, New Eng. J. Med, 1998, 338, 436-445); CCR-2A e CCR-2B (ou "CKR-2A"/"CKR-2B" ou "CC-CKR-2A"/"CC-CKR-2B") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (Charo. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1994, 91, 2752-2756 e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-3 (ou "CKR-3" ou "CC-CKR-3") [eotaxina- I, eotaxina-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (Combadiere, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 16491-16494 e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-4 (ou "CKR-4" ou "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (Power, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270,19495-19500 e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-5 (ou "CKR-5" ou "CC-CKR-5") [ΜΙΡ-Ια, RANTES. MIP-1β] (Sanson, et al. , Biochemistry 1996, 35, 3362-3367 ) ; CCR-6 (ou "CKR-6" ou "CC-CKR-6") [LARC] (Baba, et al., J. Biol.
Chem. 1997, 272, 14893-14898); CCR-7 (ou "CKR-7" ou "CC-CKR-7") [ELC] (Yoshie et al., J. Leukoc. Biol. 1997, 62, 634-644); CCR-8 (ou "CKR-8" ou "CC-CKR-8") [1-309] (Napolitano et al, J. Immunol, 1996, 157, 2759-2763); CCR-10 (ou "CKR-10" ou "CC-CKR-10") [MCP-1, MCP-3] (Bonini, et al, DNA e Cell Biol. 1997, 16, 1249-1256); e CCR-11 [MCP-1, MCP-2 e MCP-4] (Schweickert, et al, J. Biol. Chem. 2000, 275, 90550).
Para além dos receptores receptores da quimiocina dos mamíferos, constatou-se que os citomegalovírus, vírus herpes e poxvírus de mamíferos expressam, em células infectadas, proteínas com as propriedades de ligação dos receptores da quimiocina (revisto em: Wells e Schwartz, Curr. Opin. Biotech. 1997, 8, 741-748). As quimiocinas CC humanas, como as RANTES e MCP-3, podem causar a mobilização rápida de cálcio através destes receptores com codificação virai. A expressão do receptor pode ser permissiva à infecção pelo facto de permitir a subversão da vigilância 4 normal do sistema imunitário e da resposta à infecção. Adicionalmente, os receptores humanos da quimiocina, tais como o CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 e CCR8 podem actuar como co- receptores para a infecção de células de mamífero por micróbios, como sucede, por exemplo, com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). As quimiocinas e os seus receptores cognatos foram implicados como sendo importantes mediadores de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorreguladoras, incluindo asma e doenças alérgicas; assim como patologias autoimunes, como por exemplo a artrite reumatóide e esclerose múltipla; e doenças metabólicas, como a aterosclerose e a diabetes (revisto em: Charo e Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Z. Gao e W. A. Metz, Chem. Rev. 2003, 103, 3733; P. H. Cárter, Current Opinion in Chemical Biology, 2002, 6, 510; Trivedi, et al, Ann. Reports Med. Chem. 2000, 35, 191; Sanders e Tarby, Drug Disc. Today 1999, 4, 80; Premack e Schall, Nature Medicine 1996,2,1174). Por exemplo, o quimioatractivo de quimiocina nos monócitos-1 (MCP-1) e o respectivo Receptor de quimiocina CC 2 (CCR-2) desempenham um papel central na atracção de leucócitos para os locais de inflamação e na activação subsequente destas células. Quando a MCP-1 de quimiocina se liga ao CCR-2, induz um aumento rápido na concentração intracelular de cálcio, um aumento na expressão das moléculas de adesão celular e a promoção da migração de leucócitos. A demonstração da importância da interacção MCP-l/CCR-2 foi proporcionada por experiências com ratinhos geneticamente modificados. O ratinho MCP-1 -/- foi incapaz de recrutar monócitos para os sites de inflamação após vários tipos de diferentes de desafio imunitário (Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601) . Do mesmo modo, os ratinhos CCR-2 -/- foram incapazes de recrutar monócitos ou produzir interferão-γ quando 5 inoculados com vários agentes exógenos; mais ainda, os leucócitos de ratinhos CCR-2 zero não migraram em resposta à MCP-1 (Landin Boring, et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552), demonstrando assim a especificidade da
interacção MCP-l/CCR-2. Outros dois grupos relataram independentemente resultados equivalentes com estirpes diferentes de ratinhos CCR-2 -/- (William A. Kuziel, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997,94,12053 e Takao Kurihara, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757) . A viabilidade e saúde geralmente normal dos animais MCP-1 -/-e CCR-2 -/- é notável, na medida em que a interrupção da interacção MCP-l/CCR-2 não induz crise fisiológica. Considerados em conjunto, estes dados levam a concluir que as moléculas que bloqueiam as acções dos MCP-1/CCR2 devem ser úteis no tratamento de uma série de distúrbios inflamatórios e autoimunes (revisto em: M. Feria e F. Diaz-Gonzalez, Exp. Opin. Ther. Patents 2006,16,49; e J. Dawson. W. Miltz e C. Wiessner, C. Exp. Opin. Ther. Targets 2003,7,35). Esta hipótese foi validada num conjunto de diferentes modelos patológicos animais, conforme descrito em baixo. É sabido que a MCP-1 é alvo de resposta celular aumentada (upregulation) em pacientes com artrite reumatóide (Alisa Koch, et al., J. Clin. Invest. 1992, 90, 772 - 779) . Além disso, vários estudos pré-clinicos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento da artrite reumatóide. Uma vacina de DNA codificadora de MCP-1 demonstrou recentemente melhorar a artrite crónica induzida por adjuvantes em ratos (Sawsan Youssef, et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 361). Do mesmo modo, os sintomas da doença puderam ser controlados através da administração directa de anticorpos para MCP-1 em ratos com artrite induzida por colagénio (Hiroomi Ogata, et al., J. Pathol. 6 1997, 182, 106) , ou artrite induzida por parede celular de estreptococos (Ralph C. Schimmer, et al., J. Immunol. 1998, 160, 1466) . Porventura mais significativo será o facto de um peptideo antagonista da MCP-1, a MCP-1 (9-76), ter demonstrado prevenir o aparecimento da doença e reduzir os sintomas da doença (dependendo do tempo de administração) no modelo de artrite de ratinho MRL-lpr (Jiang-Hong Gong, et al., J. Exp. Med. 1997,186,131). Além disso, demonstrou-se que a administração de antagonistas de CCR2 de pequena dimensão molecular reduzem indice clinico em modelos de artrite em roedores (C. M. Brodmerkel, et al, J. Immunol. 2005, 175, 5370; e M. Xia, et al. Pedido de patente norte-americana 0069123, 2006) . A administração de um anticorpo anti-CCR2 exerceu efeitos variáveis em CIA murina, dependendo do tempo de administração (H. Bruhl, et al. J. Immunol. 2004, 172, 890). Estudo recentes com ratinhos CCR2-/- sugeriram que a eliminação de CCR2 pode exacerbar modelos de artrite em roedores em circunstâncias experimentais especificas (Μ. P. Quinones, et al. J. Clin. Invest. 2004, 113, 856; Μ. P. Quinones, et al. J. Mol. Med. 2006, 84, 503). É sabido que a MCP-1 é alvo de resposta celular aumentada (upregulation) em lesões ateroscleróticas e foi demonstrado que os níveis de MCP-1 em circulação são reduzidos através do tratamento com agentes terapêuticos (Abdolreza Rezaie-Majd, et al, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002,22,1194 -1199). Vários estudos chave demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento da aterosclerose. Por exemplo, quando os ratinhos MCP-1 -/- são cruzados com ratinhos com deficiência em receptores LDL, observou-se uma redução de 83% na deposição de lípidos na aorta (Long Gu, 7 et al., Mol. Cell 1998, 2, 275). De modo semelhante, quando se realizou a ablação genética de MCP-1 em ratinhos com uma expressão já exacerbada de apolipoproteína B humana, os ratinhos resultantes encontravam-se protegidos da formação de lesões ateroscleróticas relativamente aos ratinhos de controlo MCP-1 +/+ apoB (Jennifa Gosling, et al., J Clin. Invest. 1999, 103, 773). Do mesmo modo, quando ratinhos CCR-2 -/- são cruzados com ratinhos apolipoproteína E -/-, observa-se uma diminuição significativa da incidência de lesões ateroscleróticas (Landin Boring, et al, Nature 1998, 394, 894; T. C. Dawson, et al. Atherosclerosis 1999, 143, 205) . Finalmente, quando se administra a ratinhos apolipoproteína E -/- um gene codificador de um peptídeo antagonista de CCR2, a dimensão da lesão diminui e a estabilidade da placa aumenta (W. Ni, et al. Circulation 2001, 103, 2096 - 2101) . O transplante de medula óssea de ratinhos CCR2-/- para ratinhos ApoE3-Leiden inibiu a aterogénese nas fases iniciais (J. Guo, et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003, 23, 447), mas teve efeitos mínimos sobre lesões avançadas (J. Guo, et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005, 25, 1014). Os pacientes com diabetes mellitus tipo 2 exibiram tipicamente resistência à insulina como umas das marcas da doença. A resistência à insulina foi também associada ao agrupamento de anomalias conhecido como "síndrome metabólico" ou "síndrome X," que inclui obesidade, aterosclerose, hipertensão e dislipidemia (revisto em: Eckel, et al. Lancet 2005, 365, 1415) . É bem reconhecido que a inflamação desempenha um papel na exacerbação da doença na diabetes tipo 2 e nas patologias da "síndrome X" (revisto em: Chen, Pharmacological Research 2006, 53, 469; Neels e Olefsky, J. 8
Clin. Invest. 2006, 116, 33; Danadona e Aljada, Am J Cardiol. 2002 90, 27G-33G; Pickup e Crook, Diabetologia 1998, 41, 1241) . É reconhecido que a MCP-1 desempenha um papel na resistência à insulina induzida pela obesidade. Em cultura, os pré-adipócitos humanos expressaram constitutivamente MCP-1 (Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology 2001, 175, 81) . 0 CCR2 é expresso nos adipócitos; a adição de MCP-1 a adipócitos diferenciados in vitro diminui a captação da glicose estimulada pela insulina e a expressão de vários genes adipogénicos (LpL, adipsina, GLU-4, aP2, receptor p3-adrenérgico e PPARy) (P. Sartipy e D. Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei USA 1999, 96, 6902) . Os pacientes com diabetes tipo 2 apresentaram níveis mais elevados de MCP-1 circulante do que os controlos não diabéticos (S. Nomura, et al. Clin. Exp. Immunol. 2000, 121, 437) e a libertação de MCP-1 do tecido adiposo pôde ser reduzida por tratamento com terapêuticas antidiabética, tais como a metformina ou tiazolidinedionas (J. M. Bruun, et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005, 90, 2282) . Do mesmo modo, a MCP-1 foi também sobreexpressa em modelos experimentais murinos de obesidade, tendo sido produzido principalmente pelo tecido adiposo (Sartipy e Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003, 100, 7265). Em ratinhos obesos, a expressão de MCP-1 precedeu e ocorreu também concomitantemente com o aparecimento da resistência à insulina (H. Xu, et al. J. Clin. Invest. 2003, 112, 1821). Outro estudo demonstrou que a expressão de MCP-1 se correlacionou positivamente com a massa corporal no tecido adiposo perigonadal de ratinhos (Weisberg, et al. J. Clin. Invest. 2003, 112, 1796). Consistente com estes dados é o facto de o desenvolvimento de resistência à insulina em ratinhos db/db ter sido melhorado através de eliminação 9 genética de MCP- 1 ou por expressão induzida geneticamente de um peptideo negativo dominante (H. Kanda, et al. J. Clin. Invest. 2006, 116, 1494). É também possível demonstrar o raciocínio contrário: a sobreexpressão de MCP-1 no tecido adiposo promoveu resistência à insulina (N. Kamei, et al. J. Biol. Chem. 2006, 281, 26602). Ocorreu também um resultado conflituoso que demonstrou que a eliminação genética de MCP-1 não afecta a resistência à insulina no ratinho db/db (F. Y. Chow, et al.
Diabetologia 2007, 50, 471). Em concordância com os dados sobre a MCP-1, estudos directos com CCR2 (o receptor da MCP-1) demonstraram que desempenha um papel na formação de obesidade e de resistência à insulina induzida pela obesidade. A manutenção de uma dieta rica em gorduras aumentou os números de monócitos inflamatórios CCR2+ circulantes tanto em ratinhos do tipo selvagem (C. L. Tsou, et al. J. Clin. Invest. 2007, 117, 902) como ApoE-7- (F. Tacke, et al. J. Clin. Invest. 2007, 117, 185). A eliminação genética de CCR2 reduziu os números de macrófagos activados em tecido adiposo murino (C. N.
Lumeng, et al. Diabetes 2007, 56, 16), mas não afectou uma população de macrófagos adiposos M2 que se pensava manterem o estado de "magreza" (C. N. Lumeng, et al. J. Clin. Invest. 2007,117,175). A eliminação genética de CCR2 reduziu a obesidade induzida pela dieta e melhorou a sensibilidade à insulina no modelo de obesidade induzida pela dieta (S. P. Weisberg, et al. J. Clin. Invest. 2006, 116, 115; P Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian, patente WO 2006/013427 A2), 2006), dependendo das condições experimentais (A. Chen, et al. Obes. Res. 2005, 13, 1311) . A administração de antagonistas de CCR2 de pequena dimensão molecular também melhorou a sensibilidade à insulina neste 10 mesmo modelo (S. P. Weisberg, et al. J. Clin. Invest. 2006, 116, 115).
Dois estudos descreveram o papel importante do CCR2 na inflamação, remodelação e hipertrofia vasculares induzidas pela hipertensão (E Bush et al., Hypertension 2000, 36, 360; M Ishibashi, et al. Circ. Res. 2004, 94, 1203) . É sabido que a MCP-1 é alvo de resposta celular aumentada (upregulation) na esclerose múltipla humana e foi demonstrado que a terapêutica eficaz com interferão β-lb reduz a expressão da MCP-1 em células mononucleares sanguíneas periféricas, sugerindo que a MCP-1 desempenha um papel na progressão da doença (Carla Iarlori, et al., J. Neuroimmunol. 2002,123,170-179). Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-l/CCR-2 no tratamento da esclerose múltipla; todos estes estudos forma demonstrados em encefalomielite experimental auto-imune (EAE), o modelo animal convencional para esclerose múltipla. A administração de anticorpos para MCP-1 a animais com EAE diminuiu significativamente a recidiva da doença (K. J. Kennedy, et al., J. Neuroimmunol. 1998, 92, 98). Além disso, dois relatórios demonstraram que os ratinhos CCR-2 -/- são resistentes à EAE (B. T. Fife, et al., J. Exp. Med. 2000,192, 899; L. Izikson, et al., J. Exp. Med. 2000,192,1075). Um relatório subsequente estendeu estas observações iniciais através do exame dos efeitos da eliminação de CCR2 em ratinhos de estirpes diferentes (S. Gaupp, et al. Am. J. Pathol. 2003, 162, 139). De notar que a administração de um antagonista de CCR2 de pequena dimensão molecular também enfraqueceu a progressão da doença em ratinhos C57BL/6 (C. M. Brodmerkel, et al. J.
Immunol. 2005, 175, 5370) . É sabido que a MCP-1 é alvo de 11 resposta celular aumentada (upregulation) em pacientes que desenvolvem a síndrome da bronchiolitis obliterans após o transplante pulmonar (Martine Reynaud-Gaubert, et al., J. de Heart e Lung Transplant., 2002, 21, 721 - 730; John Belperio, et al. , J. Clin. Invest. 2001, 108, 547 - 556). Num modelo murino de sindrome de bronchiolitis obliterans, a administração de um anticorpo para a MCP-1 levou à atenuação da obliteração das vias respiratórias; do mesmo modo, os ratinhos CCR2 -/- foram resistentes à obliteração das vias respiratórias neste mesmo modelo (John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547 - 556) . Estes dados sugerem que o antagonismo da MCP-1/CCR2 pode ser benéfico no tratamento da rejeição de órgãos após o transplante. Além disso, estudos demonstraram que a fragmentação do eixo MCP-1/CCR2 era capaz de prolongar a sobrevivência do transplante dos ilhéus (I Lee et al. J. Immunol 2003, 171, 6929; R Abdi et al., J Immunol 2004,172, 767) . Em modelos de enxerto em rato, o CCR2 e a MCP-1 demonstraram ser alvo de resposta celular aumentada (upregulation) em enxertos que desenvolvem vasculopatia do enxerto (K Horiguchi et al., J Heart Lung Transplant. 2002, 21, 1090). Noutro estudo, a terapia genética anti-MCP-1 atenuou a vasculopatia do enxerto (A Saiura et al., Artherioscler Thromb Vasc Biol 2004, 24, 1886) . Um estudo descreveu inibição da formação neointimal de enxerto venoso experimental, por bloqueio da MCP-1 (H Tatewaki et al., J Vase Surg. 2007, 45,1236).
Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento de asma. O sequestro da MCP-1 com um anticorpo de neutralização em ratinhos inoculados com ovalbumina resultou numa diminuição marcada na hiper-reactividade e 12 inflamação brônquicas (Jose-Angel Gonzalo, et al., J. Exp. Med. 1998,188,157). Demonstrou-se ser possível reduzir a inflamação alérgica das vias respiratórias em ratinhos inoculados com ovo de Schistosoma mansoni através da administração de anticorpos for MCP-1 (Nicholas W. Lukacs, et al., J. Immunol. 1997, 158, 4398) . De forma consistente, os ratinhos MCP-1 -/- exibiram uma resposta reduzida à inoculação com ovo de Schistosoma mansoni (Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601) . Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento de doença renal. A administração de anticorpos para a MCP-1 num modelo murino de glomerulonefrite resultou numa diminuição marcada da formação e deposição no crescente glomerular de colagénio tipo I (Clare M. Lloyd, et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 1371) . Além disso, ratinhos MCP-1 -/- com nefrite sérica nefrotóxica induzida apresentaram significativamente menos danos tubulares do que os seus equivalentes MCP-1 +/+ (Gregory H. Tesch. et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 73). Vários estudos chave demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento de lupus eritematoso sistémico. Os ratinhos CCR2_/~ exibiram uma sobrevivência prolongada e uma redução da doença renal em relação aos seus equivalentes WT num modelo murino de lupus eritematoso sistémico (G. Perez de Lema, et al. J. Am. Soc. Neph. 2005, 16, 3592). Estes dados são consistentes com a actividade de modificação da doença encontrada em estudos recentes sobre a eliminação genética de MCP-1 (S. Shimizu, et al. Rheumatology (Oxford) 2004, 43, 1121; Gregory H. Tesch, et al., J. Exp. Med. 1999, 190, 1813) ou administração de um peptídeo antagonista de CCR2 13 (H. Hasegawa, et al. Arthritis & Rheumatism 2003, 48, 2555) em modelos de lupus em roedores.
Observou-se um aumento notável de 30 vezes nos linfócitos CCR2+ da lâmina própria nos intestinos delgados de pacientes com doença de Crohn, relativamente ao íleo sem doença (S. J. Connor, et al. Gut 2004, 53, 1287) . Também de notar, ocorreu uma expansão no subconjunto de monócitos CCR2+/CD 14+/CD56+ circulantes em pacientes com doença de Crohn activa, relativamente aos controlos. Vários estudos realizados em roedores demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento da doença de Crohn/colite. Ratinhos CCR-2~/_ foram protegidos dos efeitos da colite induzida por sulfato de sódio dextrano (Pietro G. Andrés, et al., J. Immunol. 2000, 164, 6303) . A administração de um antagonista de pequena dimensão molecular de CCR2, CCR5 e CXCR3 (afinidades de ligação murina = 24,236 e 369 nM, respectivamente) também conferiu protecção contra colite induzida por sulfato de sódio dextrano (H. Tokuyama, et al. Int. Immunol. 2005, 17, 1023). Finalmente, ratinhos MCP-1 -/- apresentaram danos substancialmente reduzidos no cólon (tanto macroscópicos como histológicos) num modelo colite induzida por hapteno (W. I. Khan, et al. Ant. Physiol . Gastrointest . Liver Physiol. 2006, 291, G803).
Dois relatórios descreveram a sobreexpressão de MCP-1 nas células epiteliais do intestino e na mucosa intestinal de pacientes com doença intestinal inflamatória (H. C. Reinecker, et al., Gastroenterology 1995, 108, 40 e Michael C. Grimm, et al., J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804).
Um estudo descreveu a associação de polimorfismo promotor no gene da MCP-1 com escleroderma (esclerose sistémica) (S Karrer et al., J Invest Dermatol. 2005, 124, 14 92). Em modelos relacionados de fibrose tecidular, a
inibição do eixo CCR2/MCP-1 reduziu a fibrose na pele (T Yamamoto e K Nishioka, J Invest Dermatol 2003, 121, 510; AM Ferreira et al., J Invest Dermatol. 2006, 126, 1900 ) , pulmão (T Okuma et al., J Pathol. 2004, 204, 5 94; M Gharaee- Kermani et al., Cytokine 2003 , 24, 266), rim (K Kitagawa et al., Am J Patho/. 2004, 165, 237; T Wada et al., J Am Soc Nephrol 2004, 15, 940) , coração (S
Hayashidani et al., Circulation 2003,108, 2134) e fígado (S Tsuruta et al., Int J Mol Med. 2004,14, 837).
Um estudo demonstrou o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento de alveolite. Quando ratos com lesão pulmonar do complexo imunitário de IgA foram tratados contra a MCP-1 (JE) de rato, os sintomas de alveolite foram aliviados parcialmente (Michael L. Jones, et al., J. Immunol. 1992, 149, 2147). Vários estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento de neoplasias (revisto em: M. J. Craig e R. D. Loberg, Câncer Metastasis Rev. 2006,25, 611; I. Conti e B. Rollins, Seminars in Câncer Biology. 2004,14,149; R. Giles e R. D. Loberg, Curr. Câncer Drug Targets 2006, 6, 659) . Quando ratinhos imunodeficientes com células de carcinoma mamário humano foram tratados com um anticorpo anti-MCP-1, observou-se uma inibição de micrometastases pulmonares e aumentos na sobrevivência (Rosalba Salcedo, et al., Blood 2000, 96, 34 - 40) . Utilizando espécimes de tumor clínico humano, a expressão de CCR2 foi associada à progressão do cancro da próstata (Y. Lu. et al. J. Cell. Biochem. 2007, 101, 676) . In vitro, a expressão de MCP-1 demonstrou mediar o crescimento e a invasão celular de cancro da próstata (Y. Lu, et al. Prostate 2006, 66, 1311); além 15 disso, a MCP-1 expressa por células de cancro da próstata induziram reabsorção óssea em progenitores induzidos com medula óssea humana (Y. Lu, et al., Câncer Res. 2007, 67, 3646).
Estudos múltiplos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento de restenose. Em seres humanos, os níveis de MCP-1 correlacionam-se directamente com o risco de restenose (F. Cipollone. et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 327) . Os ratinhos com deficiência em CCR2 ou em MCP-1 apresentaram reduções na área da íntima e no rácio íntima/média (em relação à ninhada equivalente do tipo selvagem) após lesão arterial (Merce Roque, et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002,22, 554; A. Schober, et al. Circ. Res. 2004, 95,1125; W. J. Kim, et al. Biochem
Biophys Res Commun. 2003, 310, 936). Em ratinhos, a transfecção de um inibidor negativo dominante de MCP-1 no músculo esquelético (K. Egashira, et al. Circ. Res. 2002,90,1167) também reduziu a hiperplasia da íntima após lesão arterial. O bloqueio de CCR2 utilizando um anticorpo de neutralização reduziu a hiperplasia da neo-íntima após enxerto em primatas (C. Horvath, et al. Circ. Res. 2002, 90, 488).
Dois relatórios descrevem a sobreexpressão de ratos MCP-1 com traumatismo cerebral induzido (J. S. King, et al., J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127 e Joan W. Berman, et al., J. Immunol. 1996, 156, 3017). Além disso, estudos demonstraram que tantos os ratinhos CCR2~/_ (O. B.
Dimitri jevic, et al. Stroke 2007, 38, 1345) como MCP-1^- (P. M. Hughes, et al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002, 22, 308) são protegidos parcialmente de lesões por isquemia/reperfusão. 16 É sabido que os monócitos/macrófagos desempenham um papel importante no desenvolvimento de dor neuropática (Liu T, van Rooijen N, Tracey DJ, Pain 2000, 86, 25) . Consistente com esta noção, foi descrito recentemente um papel potencial do CCR2 no tratamento de dor inflamatória e neuropática. Os ratinhos CCR2_/~ apresentaram respostas alteradas à dor inflamatória em relação aos seus equivalentes WT, incluindo redução do comportamento de dor após a injecção intraplantar de formalina redução ligeira da alodinia mecânica após a injecção intraplantar de CFA [Adjuvante Completo de Freund] (C. Abbadie, et al. Proc. Natl. Acad. Sei., USA 2003, 100, 7947). Além disso, os ratinhos CCR2_/_ não exibiram alodinia mecânica significativa após lesão do nervo ciático. Do mesmo modo, um antagonista de CCR2 de pequena dimensão molecular reduziu a alodinia mecânica para -80% dos níveis pré-lesão após a administração por via oral (C. Abbadie, J. A. Lindia e H. Wang, WO PCT 110376, 2004).
Um estudo descreveu o papel crítico da MCP-1 na cardiomiopatia isquémica (N. G. Frangogiannis, et al., Circulation 2007, 115, 584). Outro estudo descreveu a atenuação de falha cardiaca experimental após inibição da MCP-1 (S Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134) .
Outros estudos forneceram evidências de que a MCP-1 é sobreexpressa em vários estados patológicos não mencionados anteriormente. Estes relatórios fornecem evidência correlativa de que os antagonistas da MCP-1 poderiam ser agentes terapêuticos úteis em tais doenças. Outro estudo demonstrou a sobreexpressão de MCP-1 em enxertos alogénios em roedores, sugerindo um papal da MCP-1 na patogénese da arteriosclerose do transplante (Mary E. Russell, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 6086) . A 17 sobreexpressão de MCP-1 foi assinalada nas células endoteliais do pulmão de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (Harry N. Antoniades, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, 89, 5371) . De modo semelhante, a sobreexpressão de MCP-1 foi assinalada na pela de pacientes com psoriase (M. Deleuran, et al., J. Dermatol. Sei. 1996, 13, 228 e R. Gillitzer, et al., J. Invest. Dermatol. 1993, 101, 127); achados correlativos com predominância de células CCR2+ foram também relatados (C. Vestergaard. et al. Acta Derm. Venerol. 2004, 84, 353) . Finalmente, um relatório recente demonstrou que a MCP-1 é sobreexpressa nos cérebros e fluido cerebrospinal de pacientes com demência associada ao HIV-1 (Alfredo Garzino-Demo, WO 99/46991).
Além disso, o polimorfismo do CCR2 revelou estar associado a sarcoidose pelo menos num subconjunto de pacientes (P. Spagnolo, et al. Am JRespir Crit Care Med. 2003, 168, 1162).
Deve também ser salientado que o CCR-2 foi implicado como co-receptor para algumas estirpes de HIV (B. J. Doranz, et al., Cell 1996, 85, 1149) . Foi também determinado que o uso de CCR-2 como co-receptor de HIV pode ser correlacionado com a progressão da doença (Ruth I. Connor, et al., J. Exp. Med 1997, 185, 621) . Este achado é consistente com o achado recente relativo ao facto de a presença de um mutante de CCR-2, o CCR2-641, estar correlacionado de forma positiva com o aparecimento retardado HIV na população humana (Michael W. Smith, et al., Science 1997, 277, 959). Embora a MCP-1 não tenha sido implicada nestes processos, é possível que os antagonistas da MCP-1 que actuam através da ligação aos CCR-2 tenham efeitos terapêuticos benéficos no retardamento da 18 progressão da doença para SIDA em pacientes infectados com HIV.
Deve ser salientado que o CCR2 é também o receptor das quimiocinas humanas MCP-2, MCP-3 e MCP-4 (Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338. 436-445). Uma vez que os novos compostos da fórmula (I) descritos nesta invenção antagonizam a MCP-1 por ligação ao receptor CCR-2, é possivel que estes compostos de fórmula (I) sejam também antagonistas eficazes das acções da MCP-2, MCP-3 e MCP-4, que são mediadas pelo CCR-2. Consequentemente, quando é feita referência neste documento ao "antagonismo da MCP-1", deve assumir-se que este é equivalente ao "antagonismo da estimulação da quimiocina do CCR-2."
Consequentemente, os compostos que modulam a actividade da quimiocina puderam demonstrar uma ampla gama de utilidades no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares. A publicação de pedido de patente norte-americana W02005021500 AI (incluído na íntegra por referência neste documento e atribuído ao pedido presente) revela compostos que modulam a actividade da MCP-1, MCP-2, MCP-3 e MCP-4 via CCR2. A referência também revela vários processos de preparação destes compostos, incluindo sínteses multifásicas que incluem a introdução e subsequente remoção de grupos de protecção. É desejável encontrar novos compostos com características farmacológicas melhoradas quando comparadas com moduladores da quimiocina conhecidos. Por exemplo, é desejável encontrar novos compostos com actividade inibitória do CCR-2 melhorada e selectividade para o CCR-2 versus outros receptores acoplados à proteína G (i.e. receptor 5HT2A). É também desejável encontrar compostos com 19 características vantajosas e melhoradas numa ou mais das categorias seguintes: (a) propriedades farmacêuticas (isto é, solubilidade, permeabilidade, sujeição a formulações de libertação sustentada); (b) requisitos de dosagem (por exemplo, dosagens inferiores e/ou dose única diária); (c) factores que diminuem as caracteristicas de concentração sanguínea em pico-vazio (isto é, depuração e/ou volume de distribuição); (d) factores que aumentam a concentração do medicamento activo no receptor (isto é, ligação à proteína, volume de distribuição); (e) factores que reduzem a probabilidade de interacções medicamentosas clínicas (inibição ou indução da enzima do citocromo P450, tal como a inibição do CYP 2D6, consultar G.K. Dresser, J.D. Spence. D.G. Bailey, Clin. Pharmacokinet. 2000, 38, 41-57, que é incorporada no presente documento por referência); (f) factores que reduzem o potencial de efeitos secundários (por exemplo, selectividade farmacológica além dos receptores acoplados à proteína G, reactividade química ou metabólica potenciais, penetração limitada no SNC, selectividade do canal iónico). É especialmente desejável encontrar compostos que contenham uma combinação desejável das caracteristicas farmacológicas mencionadas anteriormente. 20
RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um novo antagonista ou agonista parcial/antagonista da actividade do receptor da MCP-1: N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, ou um seu sal farmacologicamente aceitável, apresentando as mesmas uma inesperada combinação de caracteristicas farmacológicas desejáveis. As formas cristalinas da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e as mesmas para uso como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares constituem também um objectivo desta invenção. A presente divulgação também proporciona o uso de N-((IR,2S,SR)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazoína-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmacologicamente aceitável para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,2S,SR)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma N-l do sal do ácido dibenzenossulfónico. 21 A Figura 2 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma N-2 da base livre. A Figura 3 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma E-l da base livre (mono-etanolato). A Figura 4 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma H4-1 do sal cloridrato (tetraidrato). A Figura 5 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3- (6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma A-l da base livre (solvato mono-acetona). A Figura 6 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma DC-1 da base livre (solvato mono-diclorometano). A Figura 7 apresenta os padrões de pó experimental e simulado de N-((IR,25,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4- ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, Forma AN-3 da base livre (solvato mono-acetonitrilo). 22 A Figura 8 apresenta a análise por calorimetria exploratória diferencial da N-((IR,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, Forma N-l do sal dibesilato. A Figura 9 apresenta a análise termogravimétrica da N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, Forma N-l do sal dibesilato. A Figura 10 apresenta a análise por calorimetria exploratória diferencial da N-((IR,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, Forma N-2. A Figura 11 apresenta a análise termogravimétrica da N-((IR, 2S, 5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, Forma N-2. A Figura 12 apresenta a Isotérmica de Adsorção de Água da N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, Forma N-2. A Figura 13 apresenta uma estrutura cristalina aos raios X de (IR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)ciclohexilcarbamato de terc-butilo.
Figura 14. Modelo de peritonite TG de 48 horas em ratinhos hCCR2 Kl: Exemplo I inibição de infiltração de monócitos/macrófagos na cavidade peritoneal (contagem de células diferencial). 23 FIG. 15. Modelo de peritonite TG de 48 horas em ratinhos hCCR2 Kl: Exemplo 1 inibição de infiltração de monócitos/macrófagos na cavidade peritoneal (análise FACS [Espectrometria de Fluorescência]). FIG. 16. EAE em ratinhos hCCR2 Kl: índice clínico do tratamento do Exemplo 1
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção proporciona um novo antagonista ou agonista parcial/antagonista da actividade do receptor da MCP-1: N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)guinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, ou um seu sal farmacologicamente aceitável, apresentando as mesmas uma inesperada combinação de características farmacológicas desejáveis. As formas cristalinas da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e as mesmas para uso como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares constituem também um objectivo desta invenção. N- ( (IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S) -2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, demonstra inesperadamente uma combinação desejável de caracteristicas farmacológicas incluindo um grau surpreendentemente elevado de biodisponibilidade oral em combinação com indicações de ser altamente eficaz e possuir excelentes critérios de segurança.
Moduladores conhecidos de receptores CCR2, tais como
os apresentados na publicação da patente W02005021500 AI 24 publicada em 10 de Março de 2005 (Patente norte-americana n.° 7,163,937, emitida em 16 de Janeiro de 2007, atribuída ao presente Requerente) que demonstram um grau adequado de permeabilidade membranária (um factor crítico de biodisponibilidade oral), não são suficientemente eficazes, conforme medição da sua capacidade de ligação ao CCR2 (uma medida de eficácia) e/ou por carecerem de critérios apropriados de segurança conforme indicado pela selectividade do canal iónico, medida por estudos dos canais dos iões Na+ e hERG.
Em contraste, tal como ilustrado pelos dados apresentados neste documento na secção intitulada "Características farmacológicas comparativas", infra, a molécula relativamente polar, N-((IR,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida demonstra um grau surpreendentemente elevado de permeabilidade membranária, mantendo todavia uma potente capacidade de ligação ao CCR2, juntamente com uma excelente selectividade do canal iónico.
Consequentemente, a presente invenção fornece um novo modulador da quimiocina com características farmacológicas melhoradas que se espera seja útil no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares.
CONCRETIZAÇÕES
Numa concretização, a divulgação é direccionada para a N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1- 25 il)ciclohexil)acetamida e seus sais farmacologicamente aceitáveis.
Outra concretização é uma forma cristalina de N- ((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre.
Outra concretização é uma forma cristalina de N- ((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, a forma cristalina compreendendo a Forma N-2.
Outra concretização é a Forma N-2 caracterizada por (ou possuindo) parâmetros celulares unitários substancialmente iguais aos seguintes:
Dimensões da célula: a = 11.8427 (3) b= 18,1503(7) c = 12.7923 (4) α = 90 β = 105.362 (2) γ = 90
Grupo espacial P2i
Moléculas/Célula unitária 2 em que o cristal referido se encontra a uma temperatura de cerca de +22°C (RT). 26
Outra concretização é a Forma N-2 caracterizada por (ou possuindo) um padrão de difracção por raios X do pó compreendendo três ou mais de valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Â) seleccionados entre 7.2, 8.7, 9.7, 12.5, 12.8, 13.3, 16.0, 16.6, 18.2 e 18.8, a uma temperatura de cerca de 22°C.
Outra concretização é a Forma N-2 caracterizada por (ou possuindo) um padrão de difracção por raios X do pó compreendendo ainda quatro ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Á) seleccionados entre o grupo composto por 7.2, 8.7, 9.7, 12.5, 12.8, 13.3, 16.0, 16.6, 18.2 e 18.8, a uma temperatura de cerca de 22°C.
Outra concretização é a Forma N-2 caracterizada por (ou possuindo) coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 7.
Outra concretização é a Forma N-2 caracterizada por (ou possuindo) o padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 2.
Outra concretização é uma forma cristalina de N-((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, sal do ácido dibenzenossulfónico, compreendendo a Forma N-l, caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3, 4 ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Á) seleccionados entre os do quadro 10; coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 2, e/ou um padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 1.
Outra concretização é uma forma cristalina de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1- 27 il)ciclohexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma E—1 (mono-etanolato), caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3 ou 4 ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Â) seleccionados entre os do quadro 10; coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 5 e/ou um padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 3.
Outra concretização é uma forma cristalina de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, sal cloridrato, compreendendo a Forma H4-1 (tetraidrato), caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3 ou 4 ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Â) seleccionados entre os do quadro 10; coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 9 e/ou um padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 4.
Outra concretização é uma forma cristalina de N- ((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma A-l (solvato mono-acetona) , caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3 ou 4 ou mais valores 2Θ (CuKa Ã=1.541 Â) seleccionados entre os do quadro 10; coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 6 e/ou um padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 5.
Outra concretização é uma forma cristalina de N- ((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S) -2-oxo-3-(6- 28 (trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma DC-1 (solvato mono-diclorometano) , caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3 ou 4 ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Á) seleccionados entre os do quadro 10; coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 3 e/ou um padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 6.
Outra concretização é uma forma cristalina de N-((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre compreendendo a Forma AN-3 (solvato mono-acetonitrilo), caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3 ou 4 ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Â) seleccionados entre os do quadro 10; coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 8 e/ou um padrão de difracção por raios X do pó substancialmente de acordo com a Figura 7.
Outra concretização é uma forma cristalina de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre compreendendo a Forma THOO- 1 (solvato monotetrahidrofurano), caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados no quadro 1; 3 ou 4 ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1.541 Â) seleccionados entre os do quadro 10; e/ou coordenadas atómicas fraccionais substancialmente conforme listado no quadro 4. Outra concretização é a composição farmacêutica, compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável e um composto dos Exemplos. 29
Outra concretização é uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de distúrbios seleccionados entre diabetes, obesidade, sindrome metabólico, apoplexia, dor neuropática, cardiomiopatia isquémica, psoriase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, falência cardiaca congestiva, doenças autoimunes, infecção por HIV, demência associada ao HIV, psoriase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose do transplante, traumatismo cerebral induzido física ou quimicamente, doença intestinal inflamatória, alveolite, colite, lupus eritematoso sistémico, nefrite sérica nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia da neo-íntima venosa, hiperplasia da neo-íntima do enxerto para diálise, hiperplasia da íntima em shunt arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia crónica do enxerto alogénio e cancro.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de distúrbios seleccionados entre diabetes, obesidade, doença de Crohn, psoriase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose do transplante, trauma cerebral induzido física ou quimicamente, doença intestinal inflamatória, alveolite, colite, lupus eritematoso sistémico, nefrite sérica nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose e artrite reumatóide, restenose, transplante de órgão e cancro.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de distúrbios seleccionados entre diabetes, obesidade, 30 doença de Crohn, lupus eritematoso sistémico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, restenose e transplante de órgão.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de distúrbios seleccionados entre esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn e diabetes.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de distúrbios seleccionados entre restenose, transplante de órgão e cancro.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de diabetes.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de doença de Crohn.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de esclerose múltipla.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para uso no tratamento de aterosclerose.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos para o tratamento de restenose.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Exemplo 1 para o tratamento de transplante de órgão. 31
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Exemplo 1 para o tratamento de cancro.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do Exemplo 1 para uso no tratamento de cancro, em que o cancro é seleccionado entre cancro da mama, cancro hepático, cancro da próstata e melanoma.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do Exemplo 1 para uso no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares.
Outra concretização é a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do Exemplo 1 para uso no tratamento de doenças que são pelo menos parcialmente mediadas pelo CCR-2.
Outra concretização é um composto do Exemplo 1 na preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes, obesidade, síndrome metabólico, apoplexia, dor neuropática, cardiomiopatia isquémica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, falência cardíaca congestiva, doenças autoimunes, infecção por HIV, demência associada ao HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose do transplante, trauma cerebral induzido física ou quimicamente, doença intestinal inflamatória, alveolite, colite, lupus eritematoso sistémico, nefrite sérica nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia da neo-íntima venosa, hiperplasia da neo-íntima do enxerto para diálise, hiperplasia da intima em shunt arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia crónica do enxerto alogénio e cancro. 32
Outra concretização é um composto dos Exemplos para uso em terapia. A invenção pode ser concretizada noutras formas especificas sem sair do espirito ou atributos essenciais da mesma. Esta invenção também engloba todas as combinações de aspectos alternativos e concretizações da invenção referida neste documento. Pressupõe-se que qualquer e todas as concretizações podem ser tomadas em conjunto com qualquer outra concretização para descrever concretizações adicionais da presente invenção. Além disso, quaisquer elementos de uma concretização destinam-se a ser combinados com todos e quaisquer outros elementos de qualquer das concretizações para descrever concretizações adicionais.
DEFINIÇÕES
As definições de termos seguintes são usadas nesta especificação e reivindicações anexas. A definição inicial fornecida para um grupo ou termo neste documento aplica-se a esse grupo ou termo ao longo da especificação e reivindicações, individualmente ou como parte de outro grupo, excepto em caso de indicação em contrário. A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregue neste documento para referir os compostos, materiais, composições e/ou formas farmacêuticas que são, no âmbito de uma avaliação médica consciente, adequados para o uso em contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcionados com uma razão beneficio/risco razoável.
Tal como utilizado na presente invenção, "sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se a derivados dos 33 compostos apresentados em que a substância activa é modificada produzindo sais ácidos ou básicos da mesma. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais ácidos minerais ou orgânicos de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos e resíduos acídicos, tais como ácidos carboxílicos; e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais convencionais não tóxicos ou os sais quaternários de amónio de uma substância activa formada, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos não tóxicos ou orgânicos. Por exemplo, tais sais convencionais não tóxicos incluem os derivados de ácidos inorgânicos como o clorídrico, benzenossulfónico, hidrobrómico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos como o acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenossulfónico, metanossulfónico, etanodissulfónico, oxálico, isotiónico e semelhantes.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir de uma substância activa que contém uma fracção básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Em geral, estes sais podem ser preparados por meio da reacção das formas ácido ou base livre destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou num solvente orgânico ou numa mistura dos dois, sendo geralmente preferidos meios não aquosos como éter, acetato de etilo, álcool etílico, isopropanol ou acetonitrilo. Encontram-se listas de sais adequados em Reminton's Pharmaceutical 34
Sciences, 17th eda., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, cuja divulgação é incorporada no presente documento por referência. "Composto estável" e "estrutura estável" pretendem indicar um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento até um grau útil de pureza a partir de uma mistura de reacção e formulação para constituir um agente terapêutico eficaz. A presente invenção destina-se a concretizar compostos estáveis. "Quantidade terapeuticamente eficaz" destina-se a incluir uma quantidade de um composto da presente invenção isoladamente ou uma quantidade da combinação de compostos reivindicada ou uma quantidade de um composto da presente invenção em combinação com outros ingredientes activos eficazes para inibir MCP-1 ou eficaz para tratar ou prevenir distúrbios conforme discutido neste documento.
Tal como utilizado na presente invenção, "tratar" ou "tratamento" cobre o tratamento de um estado de doença num mamífero, particularmente num humano e incluem: (a) prevenção da ocorrência do estado de doença num mamífero, em particular, quando tal mamífero está predisposto ao estado de doença mas ainda não foi diagnosticado com a mesma; (b) inibição do estado de doença, isto é, retardamento do seu desenvolvimento; e/ou (c) alívio do estado de doença, isto é, causar a regressão do estado da doença. Os nomes usados neste documento para designar uma forma especifica, por exemplo, "N-2", não deverão ser consideradas como limitativas relativamente a qualquer outra substância que possua características físicas e químicas semelhantes ou idênticas, devendo antes ser considerado que estas designações são meros identificadores 35 que devem ser interpretados de acordo com a informação de caracterização também apresentada neste documento. A presente invenção proporciona formas cristalinas da base livre de N-((IR, 2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-OXO-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida como um material novo, em particular, numa forma farmaceuticamente aceitável. Em determinadas concretizações preferidas, as formas cristalinas dos sais encontram-se na forma substancialmente pura. As concretizações preferidas dos sais são apresentadas nos Exemplos como a forma N-l do sal do ácido dibenzenossulf ónico e a forma H4-1 do sal cloridrato.
Tal como utilizado na presente invenção, "polimorfa" refere-se às formas cristalinas que possuem a mesma composição quimica mas diferentes arranjos espaciais das moléculas, átomos e/ou iões que formam o cristal.
Tal como utilizado na presente invenção, "solvato" refere-se a uma forma cristalina de uma molécula, átomo e/ou iões que contêm também moléculas de um solvente ou solventes incorporadas na estrutura cristalina. As moléculas do solvente no solvato podem estar presentes numa disposição regular e/ou numa disposição não ordenada. 0 solvato pode compreender uma quantidade estequiométrica ou não estequiométrica quantidade das moléculas do solvente. Por exemplo, um solvato com a quantidade não estequiométrica de moléculas do solvente pode resultar da perda parcial de solvente do solvato.
Tal como utilizado na presente invenção, "amorfo" refere-se a uma forma sólida de uma molécula, átomo e/ou iões que não é cristalina. Um sólido amorfo não exibe um padrão definitivo por difracção de raios X. 36
Tal como utilizado na presente invenção, "substancialmente puro", quando usado em referência a uma forma cristalina, significa um composto com uma pureza superior a 90 % em peso, incluindo superior a 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99 % em peso e também incluindo igual a cerca de 100 % em peso do Composto I, com base no peso do composto. O material restante compreende outra(s) forma(s) do composto e/ou impurezas de reacção e/ou impurezas de processamento resultantes da sua preparação. Por exemplo, uma forma cristalina de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il) ciclohexil) acetamida, base livre ou sal, pode ser considerado substancialmente puro na medida em que tem uma pureza superior a 90 % em peso, conforme medição por meios actualmente conhecidos e geralmente aceites na técnica, em que os restantes menos de 10 % em peso de material compreendem outra (s) forma (s) da N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil (metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1- il)ciclohexil)acetamida, base livre ou sal e/ou impurezas de reacção e/ou impurezas de processamento. É possível fornecer amostras das formas cristalinas com homogeneidade de fase substancialmente pura, indicando a presença de uma quantidade dominante de uma forma cristalina individual e opcionalmente quantidades menores de uma ou mais formas cristalinas adicionais. A presença de mais do que uma forma cristalina numa amostra pode ser determinada por técnicas tais como difracção de raios X no pó (PXRD) ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear em fase sólida (SSNMR). Por exemplo, a presença de picos adicionais na comparação de um padrão PXRD medido 37 experimentalmente com um padrão PXRD simulado pode indicar mais do que uma forma cristalina na amostra. 0 PXRD simulado pode ser calculado a partir da dados de raios X de um cristal individual. Consultar Smith, D.K, "A FORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns," Lawrence Radiation Laboratory, Livermore, Califórnia, UCRL-7196 (Abril 1963).
De preferência, uma forma cristalina possui uma homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos de 10%, preferencialmente menos de 5% e mais preferencialmente menos de 2% da área total de pico no padrão PXRD medido experimentalmente, originário dos picos adicionais que estão ausentes no padrão PXRD simulado. Mais preferida é uma forma cristalina com uma homogeneidade de fase substancialmente pura com menos de 1 % da área total de pico no padrão PXRD medido experimentalmente, originário dos picos adicionais que estão ausentes no padrão PXRD simulado. Os procedimentos para a preparação de formas cristalinas são conhecidos na técnica. As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristalização a partir de um solvente adequado, sublimação, crescimento a partir da fusão, transformação do estado sólido a partir de outra fase, cristalização a partir de um fluido supercritico e pulverização de jacto. As técnicas der cristalização ou recristalização de formas cristalinas a partir de uma mistura de solventes incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura de solventes, sementeira do cristal numa mistura de solventes supersaturada da molécula e/ou sal, liofilização da mistura de solventes e adição de anti-solventes (contra-solventes) à mistura de solventes. 38
As formas podem ser caracterizadas e distinguidas utilizando a difracção de raios X do cristal individual, que é baseada nas medições da célula unitária de um cristal individual de uma forma a uma temperatura analítica fixa. Uma descrição detalhada das células unitárias é fornecida em Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co, New York (1968), Capitulo 3, que é incluída por referência neste documento. Em alternativa, a disposição única de átomos na relação espacial no interior da rede cristalina pode caracterizar-se de acordo com as coordenadas atómicas fraccionais observadas. Outra forma de caracterizar a estrutura cristalina é por análise por difracção de raios X no pó, na qual o perfil de difracção experimental ou observado é comparado com um perfil simulado representando o material em pó puro, ambas realizadas à mesma temperatura analítica e com as medições da forma em estudo caracterizadas como uma série de valores 2Θ. É possível utilizar outro meio de caracterizar a forma, tal como a ressonância magnética nuclear em fase sólida (SSNM R) , calorimetria exploratória diferencial e análise termogravimétrica. Estes parâmetros também podem ser utilizados em combinação para caracterizar a forma em estudo. 0 termo "perda de peso negligenciável", conforme empregue neste documento e caracterizada por TGA (análise térmica) indica a presença de uma forma pura (sem solvato) do cristal. 0 termo "captação % de água negligenciável", conforme empregue neste documento, caracterizada pela isotérmica de adsorção de água, indica que a forma testada não é higroscópica. 39
Numa concretização da invenção, uma forma cristalina de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre ou sal, é fornecida na forma substancialmente pura. Esta forma cristalina pode ser empregue em composições farmacêuticas que podem incluir opcionalmente um ou mais componentes adicionais seleccionados, por exemplo, a partir do grupo composto por excipientes, veículos e um dos outros ingredientes farmacêuticos activos ou entidades químicas activas de diferentes estruturas moleculares. De preferência, uma forma cristalina possui uma homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos de 10%, preferencialmente menos de 5% e mais preferencialmente menos de 2% da área total de pico no padrão PXRD medido experimentalmente, originário dos picos adicionais que estão ausentes no padrão PXRD simulado. Mais preferida é uma forma cristalina com uma homogeneidade de fase substancialmente pura com menos de 1 % da área total de pico no padrão PXRD medido experimentalmente, originário dos picos adicionais que estão ausentes no padrão PXRD simulado. Noutra forma de concretização, é fornecida uma composição consistindo essencialmente nas formas cristalinas de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-( (S)-2-OXO-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida, base livre ou sal. A composição desta concretização pode incluir pelo menos 90 % em peso da forma, com base no seu peso na composição. A presença de impurezas de reacção e/ou impurezas de processamento pode ser determinada por técnicas analíticas conhecidas na arte, tais como, por exemplo, cromatografia, 40 espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa ou espectroscopia por infravermelhos. As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristalização a partir de um solvente adequado, sublimação, crescimento a partir da fusão, transformação do estado sólido a partir de outra fase, cristalização a partir de um fluido supercritico e pulverização de jacto. As técnicas de cristalização ou recristalização de formas cristalinas a partir de uma mistura de solventes incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura de solventes, sementeira do cristal numa mistura de solventes supersaturada da molécula e/ou sal, liofilização da mistura de solventes e adição de anti-solventes (contra-solventes) à mistura de solventes. Podem ser empregues técnicas de cristalização de débito elevado para preparar formas cristalinas incluindo polimorfas.
Os cristais de medicamentos, incluindo polimorfos, os métodos de preparação e a caracterização de cristais de medicamentos são discutidos em Solid-State Chemistry de Drugs, S.R. Byrn, R.R. Pfeiffer e J.G. Stowell, 2nd Edition, SSCI, West Lafayette, Indiana (1999) .
Para técnicas de cristalização que empregam solvente, a escolha do solvente ou solventes está tipicamente dependente de um ou mais factores, tais como a solubilidade dos compostos, técnica de cristalização e pressão de vapor do solvente. Podem ser empregues combinações de solventes; por exemplo, o composto pode ser solubilizado num primeiro solvente para proporcionar uma solução, seguido da adição de um anti-solvente para diminuir a solubilidade do composto na solução e para proporcionar a formação de 41 cristais. Um "anti-solvente" é um solvente no qual o composto apresenta fraca solubilidade. Os solventes adequados para a preparação de cristais incluem solventes polares e apoiares.
Num método de preparação de cristais, a N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-((-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre ou sal, é suspensa e/ou agitada num solvente adequado para proporcionar uma suspensão, que pode ser aquecida para promover a dissolução. 0 termo "suspensão", tal como utilizado neste documento, significa uma solução saturada, que pode também conter uma quantidade adicional do sólido para proporcionar a mistura heterogénea a uma dada temperatura. Os solventes adequados a este respeito incluem, por exemplo, solventes apróticos polares e solventes próticos polares e misturas de dois ou mais destes, tal como apresentado neste documento. Cristais de sementeira podem ser adicionados a qualquer mistura de cristalização para promover a cristalização. Tal como é do conhecimento do técnico especializado, a sementeira é usada como um meio de controlar o crescimento de uma forma cristalina particular ou como um meio de controlar a distribuição da dimensão da partícula do produto cristalino. Consequentemente, o cálculo da quantidade de sementes necessária depende da dimensão da semente disponível e da dimensão desejada para a partícula média do produto, conforme descrito, por exemplo, em "Programmed cooling of batch crystallizes," J.W. Mullin e J. Nyvlt, Chemical Engineering Science (1971) 26:369-377. Em geral, são necessárias sementes de dimensão reduzida para controlar efectivamente o crescimento dos 42 cristais no lote. As sementes de dimensão reduzida podem ser geradas por crivagem, moagem ou micronização de cristais de maiores dimensões ou por micro-cristalização de soluções. Devem ser tomadas precauções para gue a moagem ou a micronização de cristais não resulte em gualquer alteração na cristalinidade da forma de cristal desejada (isto é, alteração para amorfo ou outro polimorfo).
Uma mistura arrefecida pode ser filtrada sob vácuo e os sólidos isolados podem ser lavados com um solvente adequado, tal como um solvente de recristalização a frio e submetida a secagem por purga por meio de azoto para proporcionar a forma cristalina desejada. Os sólidos isolados podem ser analisados por uma técnica espectroscópica ou analítica adequada, tal como SSNMR, DSC, PXRD, ou semelhante, para assegurar a formação da forma cristalina preferida do produto. A forma cristalina resultante é tipicamente produzida numa quantidade superior a cerca de 70 % em peso de rendimento isolado, mas preferencialmente superior a 90 % em peso com base no peso de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre ou sal, empregue originalmente no procedimento de cristalização. O produto pode ser co-moído ou passado através de um crivo para desgrumar o produto, se necessário.
As formas cristalinas podem ser preparadas directamente a partir do meio de reacção da fase final de processamento para preparação de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre ou sal. Este resultado pode ser conseguido, por exemplo, empregando na fase final 43 de processamento um solvente ou mistura de solventes a partir dos quais o composto pode ser cristalizado. Em alternativa, as formas cristalinas podem ser obtidas e por destilação ou técnicas de adição de solvente. Os solventes adequados para este efeito incluem qualquer dos solventes descritos neste documento, incluindo solventes próticos polares, tais como álcoois e solventes apróticos polares, tais como cetonas. Como orientação geral, a mistura de reacção pode ser filtrada para remover qualquer impurezas indesejadas, sais inorgânicos e semelhantes, segundo-se a lavagem com solvente de reacção ou cristalização. A solução resultante pode ser concentrada para remover solvente em excesso ou constituintes gasosos. Se for empregue destilação, a quantidade derradeira de destilado recolhida pode variar, dependendo de factores de processamento que incluem, por exemplo, dimensão do recipiente, capacidade de agitação e semelhantes. Como orientação geral, a solução de reacção pode ser destilada até cerca de 1/10 do volume original antes de ser levada a cabo a substituição do solvente. É possível recolher amostras da reacção e analisá-las para determinar a extensão da reacção e a % em peso do produto, de acordo com técnicas de processamento padrão. Se desejável, pode ser adicionado ou removido solvente de reacção adicional para optimizar a concentração da reacção. De preferência, a concentração final é ajustada para cerca de 50 % em peso, ponto em que tipicamente é originada uma suspensão.
Poderá ser preferível adicionar solventes directamente no recipiente de reacção sem destilar a mistura de reacção. Os solventes preferenciais para este efeito são os que, em última instância, participam na rede cristalina, conforme discutido anteriormente relativamente à troca de solvente. 44
Apesar de a concentração final pode variar dependendo da pureza desejada, recuperação e semelhantes, a concentração final da base livre em solução é preferencialmente cerca de 4% a cerca de 7%. A mistura de reacção pode ser agitada após a adição de solvente e aquecida simultaneamente. Para efeitos de ilustração, a mistura de reacção pode ser agitada durante cerca de 1 hora aquecida até cerca de 70°C. A reacção é preferencialmente filtrada quente e lavada com o solvente da reacção, o solvente adicionado ou a combinação dos mesmos. Cristais de sementeira podem ser adicionados a qualquer solução de cristalização para iniciar a cristalização.
As várias formas descritas neste documento pode ser distinguidas entre si através do uso de várias técnicas analíticas por qualquer técnico com formação ordinária na técnica. Tais técnicas incluem, entre outras, difracção de raios X no pó (PXRD), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e/ou análise termogravimétrica (TGA). Em alternativa, as formas podem ser caracterizadas e distinguidas utilizando a difracção de raios X do cristal individual, que é baseada nas medições da célula unitária de um cristal individual de uma dada forma a uma temperatura analítica fixa. Uma descrição detalhada das células unitárias é fornecida em Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co, New York (1968), Capítulo 3, que é incluída por referência neste documento. Especificamente, a disposição única de átomos na relação espacial no interior da rede cristalina pode caracterizar-se de acordo com as coordenadas atómicas fraccionais observadas. Outro meio de caracterizar a estrutura cristalina é por análise por difracção de raios X no pó, na qual o perfil de difracção observado é comparado com um 45 perfil simulado gerado a partir de dados da estrutura individual do cristal. As medições da difracção de raios X no pó para a forma em estudo caracterizam-se como uma série de valores 2Θ (normalmente quatro ou mais). É possível utilizar outro meio de caracterizar a forma, tal como espectroscopia de ressonância magnética nuclear em fase sólida (SSNMR), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termografia e exame macroscópico da morfologia cristalina ou amorfa. Estes parâmetros também podem ser utilizados em combinação para caracterizar a forma em estudo. Qualquer pessoa com formação ordinária na técnica irá concluir que um padrão de difracção de raios X pode ser obtido com um erro de medição que está dependente das condições de medição empregues. Em particular, é do conhecimento geral que as intensidades num padrão de difracção de raios X pode flutuar dependendo das condições de medição empregues e da forma ou morfologia do cristal. Deve também entender-se que as intensidades relativas também podem variar dependendo das condições experimentais e, consequentemente, a ordem exacta da intensidade não deve ser algo a ter em conta. Adicionalmente, um erro de medição do ângulo de difracção para um padrão convencional de difracção de raios X é tipicamente de cerca de 0,2° valores 2Θ ou inferior, preferencialmente cerca de 0,1 0 valores 2Θ (conforme discutido mais à frente) e tal grau de erro de medição deve ser algo a ter em conta como respeitante aos ângulos de difracção mencionados. Consequentemente, deve pressupor-se que as formas cristalinas da presente invenção não se limitam às formas cristalinas que proporcionam padrões de difracção de raios X completamente idênticos aos padrões de difracção de raios X representados na Figuras que acompanham este documento. Quaisquer formas cristalinas 46
que produzam padrões de difracção de raios X substancialmente idênticos aos apresentados nas Figuras anexas são abrangidas pelo âmbito da presente invenção. A capacidade para aferir identidades de substâncias dos padrões de difracção de raios X engloba-se no âmbito das capacidades de um técnico com formação ordinária na técnica.
EXEMPLO 0 Exemplo seguinte constitui uma concretização da invenção.
Como é apropriado, as reacções foram conduzidas sob uma atmosfera de azoto seco (ou árgon) . Para reacções anidricas, foram empregues solventes Dri-Solv da EM. Para as restantes reacções, foram utilizados solventes com grau de reagente ou com grau de HPLC. Excepto no caso de indicação em contrário, todos os reagentes obtidos comercialmente foram utilizados na forma em que foram recebidos.
As medições por CL/EM (cromatografia liquida/espectrometria de massa) foram obtidas utilizando sistema híbrido de Shimadzu HPLC/espectrómetro de massa quadripolar Waters ZQ. Os dados correspondentes ao pico de interesse são relatados a partir de ionização por electrospray em modo positivo. Os espectros de RMN (ressonância magnética nuclear) foram obtidos tipicamente em instrumentos Bruker ou JEOL 400 MHz e 500 MHz nos solventes indicados. Todas as deslocações químicas são relatadas em ppm de tetrametilsilano com a ressonância do 47 solvente como padrão interno, 'Os dados espectrais de H-RMN são tipicamente relatados do seguinte modo: deslocação quimica, multiplicidade (s = singleto, br s = singleto largo, d = dupleto, dd = dupleto de dupletos, t = tripleto, q = quarteto, sep = septeto, m = multipleto, app = aparente), constantes de acoplamento (Hz) e integração.
Uma pessoa com experiência na arte reconhecerá as abreviaturas padrão utilizadas neste documento. Para facilitar a referência, as abreviaturas incluem, entre outras: sat. = saturado, HPLC = cromatografia liquida de elevado rendimento, AP = área percentual, KF = Karl-Fischer, RT = temperatura ambiente (salvo especificação em contrário RT é uma temperatura de cerca de 22 °C) , mmol = milimoles, HRMS = espectroscopia de massa de alta resolução. TBTU = O-benzotriazol-2-il-N,N,N',N'-tetrametiluróniotetrafluoroborato, MTBE = TBME = éter tert-butilmetílico, EDAC = cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida, EDC = N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida, TEA = trietilamina, DPPA = difenil-fosforil-azida, IPA = álcool isopropilico, TFA = ácido trifluoroacético, DCM = diclorometano, THF = tetra-hidrofurano, DMF = N,N-dimetilformamida, BOP = hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfónio, EtOAc = Acetato de etilo, DMSO = dimetilsulfóxido. °C = graus Celsius, eq = equivalente ou equivalentes, g = grama ou gramas, mg = miligrama ou miligramas, mL (ou m) = mililitro ou mililitros, h = hora ou horas, M = molar, N = normal, min = minuto ou minutos, MHz = megahertz, tlc = cromatografia de camada fina, v/v = proporção volume:volume. "a", "p", "R" e "S" são designações estereoquimicas familiares para os peritos na especialidade. 48 EXEMPLO 1 N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-l-il)ciclohexil)acetamida
Exemplo 1
Etapa 1: (IR, 2S, 5R) -2 benziloxicarbonilamino-7-oxo-6-aza-biciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato de terc-Butilo (89,6 g, 0,24 mol, consultar: P. H. Cárter, et al. pedido de PCT WO 2005/021500) foi dissolvido em acetato de etilo (1,5 L) e a solução resultante foi lavada com sol. sat. de NaHC03 (2 x 0,45 L) e sol. sat. de NaCl (1 x 0,45 L) . A solução foi seca (Na2S04) e, em seguida, filtrada directamente num balão de fundo redondo de 3 L de 3 tubuladuras. A solução foi purgada com injecção directa de azoto antes de ser carregada com 10% Pd/C (13,65 g) sob uma atmosfera de azoto. 0 balão foi evacuado e submetido a retro-enchimento com hidrogénio; esta operação foi repetida por duas vezes mais. Fez-se borbulhar hidrogénio através da solução durante 30 min e, em seguida, a reacção foi agitada a 1 atm H2 durante 18 h. 0 balão foi evacuado, submetido a retro-enchimento com azoto e carregado com catalisador fresco (6 g de 10% Pd/C). Fez-se borbulhar hidrogénio através da 49 solução durante 30 min e, em seguida, a reacção foi agitada a 1 atm H2 durante 18 h. O balão foi evacuado e submetido a retro-enchimento com azoto. A mistura foi filtrada através de Celite; o bolo do filtro foi em seguida lavado com acetato de etilo. O filtrado (volume de EtOAc ~1,6 L) foi diluído com acetonitrilo (0,3 L) e carregado sequencialmente com L-iV-Cbz-metionina (68 g, 0,24 mol) , TBTU (77 g, 0,24 mol) e N, N-diisopropilet ilamina (42 mL, 0,24 mol). A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h, tempo durante o qual mudou de uma suspensão para uma solução transparente. A reacção foi temperada com adição de sol. sat. de NH4C1 (0,75 L) e água (0,15 L) ; a mistura foi diluída ainda mais com EtOAc (0,75 L). As fases foram misturadas e separadas e a fase orgânica foi lavada com sol. sat. de Na2C03 (2 x 0,9 L) e sol. sat. de NaCl (1 x 0,75 L) . A solução foi seca (Na2S04) , filtrada, e concentrada em vácuo para produzir (IR,25,5R)-2-((S) -2-(benziloxicarbonilamino)-4-(metiltio)butanamida)-7-oxo-6-aza-biciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato de terc-butilo na forma de óleo, que foi recolhido para a etapa seguinte sem mais purificação. CL/EM para o pico primário: [M-Boc+H]+ = 406, 3; [M+Na]+ = 528, 3. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : 5 7,36 (m, 5H) , 5, 11 (s, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,2 (m, 1H) , 4,0 (m, 1H) , 2,5- 2,7 (m, 3H) , 2,25 (m, 1H), 2 ,11 (s, 3H) , 2,05 (m, 4H) , 1,9 (m, 1H) , 1 ,7 (m, 2H), 1 ,54 (s, 9H) . Também presentes est ão EtOAc [1,26 (t), 2, 03 (s) , 4,12 (q) ] e
N,N,N,N-tetrametilureia [2,83 (s) ] . Exemplo 1, Etapa 2: A amostra de (IR, 2S,5R)-2-((S)-2-(benziloxicarbonilamino)-4-(metiltio)butanamida)-7-oxo-6-aza-biciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato de terc-butilo (0,24 mol assumidas; consultar procedimento anterior) foi dissolvida em iodometano (1,250 g) e agitada durante 48 h à temperatura ambiente. A reacção foi concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em 50 diclorometano e concentrado em vácuo. Esta operação foi repetida mais duas vezes. O depósito resultante foi dissolvido em diclorometano (0.4 L) e derramado para uma solução de MTBE (4,0 L) agitação rápida. Os sólidos amarelos resultantes foram recolhidos por meio de filtração de sucção e secadas sob alto vácuo para proporcionar o sal sulfónio (179 g) . Este material foi levado para a etapa seguinte sem mais purificação. CL/EM para o pico primário: [M-Me2S+H]+ = 458 ,4; [M] + 520,4 . 1H-RMN (400 MHz, d4- MeOH) : 5 7, 35 (m, 5H) , r 5, 09 , 2H) , 4,33 (m, 1H) , , 4,28 (m, 1H) , 3, 98 (m, 1H) , 3, 3 - 3, : (m, 2H) , 2 , 97 (s, 3H) , 2 , 94 (s, 3H) , 2, 78 (m, 1H) , r 2, 0 - - 2 , 3 (m , 4H) , 1,7 (m, 2H) , 1 , 52 (s, 9H). Também presentes estão MTBE [1,18 (s), 3,2 (s)] e vestígios de N,N,N,N-tetrametilureia [2,81 (s) ] .
Exemplo 1, Etapa 3: A totalidade do sal sulfónio da etapa anterior (0,24 mol assumidas) foi dissolvida em DMSO (2,0 L) . A solução resultante foi agitada sob azoto à temperatura ambiente e carregada com carbonato de césio (216 g) por porções. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h e, em seguida, filtrada para remover os sólidos. A solução foi dividida em porções de -0,22 L e processada do seguinte modo: a mistura de reacção (-0,22 L) foi diluída com acetato de etilo (1,5 L) e lavada sucessivamente com água (3 x 0,5 L) e salmoura (1 x 0,3 L) . A fase orgânica foi seca (Na2S04) , filtrada e concentrada em vácuo. O (lR,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)-7-oxo-6-azabiciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato de terc-butilo (90,8 g, 83%) pretendido foi obtido sob a forma de uma espuma microcristalina, isenta de impurezas de tetrametilureia. CL/EM para o pico primário: [M-Boc+H]+ = 358,4; [M+Na]+ = 480,4. 1H-RMN (400 MHz, d4-
MeOH) : 8 7,35 (m, 5H) . 5,12 (s, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,2 (m, 51 1Η), 3,6 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,28 -2,42 (m, 2H) , 2,15 (m, 1H) , 1,7 - 2,0 (m, 5H) , 1,55 (s, 9H) . Se desejável, este material pode ser isolado como um sólido por dissolução em MTBE (1 volume), adicionando a heptano (3,3 volumes) e recolhendo o precipitado resultante.
Exemplo 1, Etapa 4: Uma solução em agitação de (IR,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)-7-oxo-6-azabiciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato de terc-butilo (108 g, 0,236 mol) em THF (1 L) foi carregada com hidróxido de litio monoidrato (21,74 g, 0,519 mol). Foi adicionada água (0,3 L) lentamente, de modo que a temperatura não excedesse 20 °C. A reacção foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e os voláteis foram removidos em vácuo. O pH foi ajustado para ~4 através da adição de HC1 IN (450 mL) e NaH2P04. Os precipitados brancos resultantes foram recolhidos por filtração e lavados com água (2 X 1L) . 0 sólido foi dissolvido em diclorometano (1,5 L) e água (-1 L). A camada orgânica foi seca (Na2S04) , filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (0,7 L) e a solução resultante foi aquecida sob refluxo durante 1 h. Os sólidos foram separados após o arrefecimento até à RT e recolhidos via filtração. Estes sólidos foram purificados por recristalização em isopropanol para proporcionar o desejado ácido (IR,2S,5R)-2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)-5-(tert-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxílico sob a forma de um sólido branco (104,5 g, 93% de rendimento). CL/EM para o pico primário: [M-tBu+H]+ =420,2; [M-Boc+H]+ = 376,2; [M+H]+ = 476,2. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : 5 7,35 (m, 5H) , 5,11 (s, 2H) , 4,35 (m, 2H) , 3,71 (m, 1H) , 3,45 - 3,6 (m, 2H) , 52 2,99 (m, 1H) , 2,41 (m, 1H) , 2,15 (m, 1H) , 2,0 (m, 2H) , 1,6 -1,9 (m, 4H) , 1,46 (s, 9H) .
Exemplo 1, Etapa 5: Um balão de fundo redondo de 3 L foi carregado com ácido (IR, 2S, 5R)-2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)-5-(tert-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxílico (75,5 g, 0,158 mol) , EDC·HC1 (33,5 g, 0,175 mol), 1-hidroxibenzutriazole (23,6 g, 0,175 mol) e diclorometano (1L) . A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h, tempo durante o qual mudou de uma suspensão branca para uma solução transparente. Fez-se borbulhar amónia (gás) para a solução até o pH ficar fortemente básico (papel) e a reacção foi agitada durante 10 min; esta adição de amónia foi repetida e a reacção foi agitada por um período adicional de 10 min. Foi adicionada água. A fase orgânica foi lavada com sol. sat. de NaHC03, NaH2P04 e salmoura antes de ser concentrada em vácuo. O resíduo foi suspenso com acetonitrilo (0,5 L) e, em seguida, concentrado para produzir (IR,2S,5R)-2-( (S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)-5-(tert-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxamida sob a forma de um sólido branco (75,9 g, -100%), que foi utilizado na etapa seguinte sem mais purificação. CL/EM para o pico primário: [M-Boc+H]+ = 375,3; [M+H]+ = 475,4; [M-tBu+H]+ = 419,3. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,35 (m, 5H) , 5,11 (s, 2H), 4,25 (m, 2H), 3,70 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 3,45 (m, 1H), 2,91 (m, 1H) , 2,38 (m, 1H) , 2,12 (m, 1H) , 1,9-2,05 (m, 2H) , 1,65-1,9 (m, 4H), 1,46 (s, 9H).
Exemplo 1, Etapa 6: A reacção foi realizada em três porções iguais e combinada para processamento aquoso. Um balão de 5 L com fundo redondo e 3 tubuladuras foi carregado com (IR, 2S, 5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)-5-(tert- 53 butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxamida (25,3 g, 53 mmol), acetonitrilo (1,9 L) e 2,6 L de água/gelo. A mistura foi agitada e arrefecida até 0 °C. Foi adicionado diacetato de iodobenzeno (25,77 g, 80 mmol) e a reacção foi agitada durante 2 h; foram adicionados outros 0,5 eq de diacetato de iodobenzeno. A reacção foi agitada durante 9 h (temp de reacção < 10 °C). A mistura foi carregada com 8 eq de N,N-diisopropiletilamina e 2 eq de anidrido acético. Durante os trinta minutos seguintes, 4 eq de N, N-diisopropiletilamina e 2 eq de anidrido acético foram adicionados a cada dez minutos, até a reacção ter prosseguido até à conclusão (HPLC). O acetonitrilo foi removido em vácuo; parte do sólido foi separado do residuo e este foi recolhido por filtração. O residuo restante foi extraído com diclorometano (3 L e, em seguida, 1 L). A fase orgânica foi lavada sequencialmente com água, sol. sat. de NaHC03 e salmoura. Os sólidos recolhidos foram adicionados à fase orgânica, juntamente com carbono activado (15 g). A mistura foi agitada durante 30 minutos a 40 °C antes de ser filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (1 L) e a solução resultante foi agitada a 75 °C durante 1 h antes de ser deixada a arrefecer até à temperatura ambiente. Um sólido separou-se e foi recolhido por filtração. Este sólido foi ainda purificado por recristalização: foi primeiro dissolvido em 0,5 L CH2CI2 e, em seguida, concentrado em vácuo, sendo em seguida recristalizado a partir de 1 L EtOAc; este processo foi repetido três vezes. Os sólidos obtidos a partir das águas mães anteriores foram recristalizados três vezes utilizando o mesmo método. Os sólidos combinados foram recristalizados mais duas vezes a partir de acetonitrilo (0,7 L) para produzir 66 g (84%) de (lR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l- 54 il)ciclohexilcarbamato de terc-butilo (pureza >99,5% por HPLC) . CL/EM para o pico primário: [M+H]+ = 489, 4; [M- tBu+H]+ = 433, 3. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : 8 7,3 - 7,4 (m, 5H) , 5,11 (s, 2H) , 4,35 (m, 1H) , 4,15 (m, 1H) , 4,04 (m, 1H) , 3,8 (m, 1H) , 3,6 (m, 2H) , 2,44 (m, 1H) , 2,12 (m, 1H) , 1,87-2,05 (m, 4H), 1,87 (s, 3H), 1,55-1,7 (m, 2H), 1,46 (s, 9H) . A fidelidade estereoquímica do rearranjo de Hofmann foi confirmada através de análise da estrutura cristalina deste composto os raios X, tal como se mostra na Figura 1.
Exemplo 1, Etapa 7: Uma solução em agitação de (IR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidina-l-il)ciclohexilcarbamato de terc-butilo (66 g, 0,135 mol) em diclorometano (216 mL) foi carregada com ácido trifluoroacético (216 mL) . A reacção foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em metanol e a solução resultante foi concentrada em vácuo; este processo foi repetido uma vez. 0 benzil (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4- aminociclohexil)-2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato foi obtido na forma de óleo e usado directamente na Etapa 8 em baixo. CL/EM detectou [M+H]+= 389, 4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : 8 7,3 - -7,4 (m, 5H) , 5,12 (s, 2H) , 4,41 (br. s, 1H) , 4, 15 (m, 1H) , 4,00 (t , J= 9,3 Hz, 1H) , 3,8 1 (t, J- = 9,1 Hz, 1H) , 3, 65 (g, J= 8 ,4 Hz, 1H) , 3 ,3 - 3,4 (m, 1H), 2, 45 (m, 1H) , 1 95 - 2,24 (m, 5H) , 2,00 (s, 3H) , 1,6 -1,8 (m, 2H) .
Exemplo 1, Etapa 8: Uma solução em agitação de benzil (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil) -2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato (-0,135 mol) em metanol (675 mL) foi carregada sequencialmente com acetona (37,8 g, 4 eq), acetato de sódio (33,2 g, 3 eq) e cianoboro-hidreto de sódio (16,9 g, 2 eq) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 6 h e filtrada. O filtrado foi dissolvido 55 em diclorometano (1 L); esta solução foi lavada com NaOH IN (1 L). Os sólidos recolhidos na filtração foram dissolvidos em NaOH IN (1L) a 0 °C e, em seguida, extraídos com diclorometano (1L). Os extractos orgânicos foram combinados e extraídos com solução aquosa de HC1 (200 mL HC1 IN + 800 mL de água). A fase aquosa foi tornada básica com sol. sat. de NaHC03 (500 mL) e, em seguida, NaOH IN (100 mL) até atingir um pH 11. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (2 L) . Os extractos orgânicos foram combinados, secos (Na3S04) , filtrados e concentrados em vácuo para produzir benzil (S)-1-( (IS,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato na forma de óleo. CL/EM detectou [M+H]+= 431, 45. 1H-RMN (400 MH z, d4- -MeOH) : 8 7,3 - 7, . 4 (m, 5H) , 5, 12 (s, 2H) , 4,31 (m, 1H) , 4,24 (t, J= 9, 4 Hz t 1H) , 4,11 (m f 1H) , 3, 61 (t, J=9, 1 Hz, 1H) , 3, 52 (q* J=8 , 6 Hz, 1H) , 3, 04 (br . s, 1H), 2 , 96 (sep, J=6, 3 Hz, 1H) , 2, 40 (m, 1H) , 2, 15 (m, 1H) , 1, 92 (s, 3H) , 1,7-1 , 9 (m, r 5H) , 1, 65 (m, 1H) , 1, 12 (app. dd , J= 6 ,3, 1,1 Hz, 6H) . Exemplo 1, Etapa 9 (consultar Etapa 9 alternativa, em baixo): Uma solução em agitação de benzil (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato (-115 mmol) em diclorometano (600 mL) foi arrefecida até 0 °C e carregada sequencialmente com formaldeído (18,6 g, 37 % em peso de solução) , trietilamina (23 mL) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (28,7 g) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos e diluída com diclorometano (até perfazer 1,2 L) . Esta solução foi lavada três vezes com 500 mL de sol. sat. de NaHC03 + NaOH (sol. sat. de NaHC03, pH até 11 c/ NaOH IN) . A camada orgânica foi extraída com sol. aq. de HC1 (200 mL HC1 IN + 600 mL de água). A fase aquosa foi tornada básica com sol. sat. de NaHC03 (500 mL) e, em seguida, NaOH IN (100 mL) até 56
atingir um pH 11. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (1,2 L) . Os extractos orgânicos foram combinados, secos (Na2S04) , filtrados e concentrados em vácuo para produzir benzil (S)-1-( (IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato na forma de óleo, que foi usado directamente na Etapa 10 em baixo. CL/EM detectou [M+H]+= 445,4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : 8 7,3 - 7,4 (m, 5H) , 5,12 (s, 2H) , 4,33 (br s, 1H) , 4,25 (t, J=9,2 Hz, 1H) , 4,11 (br s, 1H) , 3,5- 3,6 (m, 2H) , 2,77 (v br s, 2 H) , 2,41 (m, 1H) , 2,26 (s, 3H) , 2,0 - 2,1 (m, 2H), 1,92 (s, 3H) , 1,7-1,9 (m, 5H) , 1,10 (app. dd, J=17, 6,4 Hz, 6H) . Exemplo 1, Etapa 10: A uma solução de benzil (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)-ciclohexil)-2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato (-0,115 mol) em metanol (600 mL) foi adicionado 10% Pd/C (6 g de 50% catalisador húmido) . O balão foi evacuado e submetido a retro-enchimento com hidrogénio. A mistura foi agitada a 1 atm H2 durante 2 h e o catalisador foi removido por filtração através de Celite. O filtrado foi concentrado em vácuo para produzir N-((IR,2S,5R)-2-( (S)-3-amino-2-oxopirrolidina-l-il)-5- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida na forma de óleo, que foi transferido para a etapa seguinte sem mais purificação. CL/EM detectou [M+H]+= 311,47. 1H-RMN (400 MHz, d4- MeOH): 8 4 ,39 (br s, 1H) , 4,00 (m, 1H) , , 3,3 - 3,5 (m, 4H) # . 2,73 (m, 1H) , , 2,38 (m, 1H) , 2,25 (s, 3H) , 2,0 - 2,2 (m, 3H) , 1, 94 (s, 3H) , 1,6 -1,75 (m, 4H) , 1, 07 (app. dd, <J=21, 6.4 Hz, 6H) .
Exemplo 1, Etapa 11: A uma solução de N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidina-l-il) -5- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida (-35 g, 0,115 mol) em isopropanol (600 mL) foi adicionada 4-cloro-6- 57 (trifluorometil)quinazolina (32 g, 0,138 mol, 1,2 eq,
consultar: P.H. Cárter et al., pedido de PCT WO 2005/021500). A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro antes de ser carregada com trietilamina (46 g, 0,46 mol, 4 eq). A mistura foi agitada a 60 °C durante 10 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir um óleo. Foi realizada duas vezes destilação azeotrópica com isopropanol. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (600 mL) e extraído com água (250 mL, contendo 4 eq de ácido acético) . Foi adicionado diclorometano (600 mL) aos lavados aquosos combinados e a mistura foi arrefecida até 0 °C. Foi adicionada solução aquosa de NaOH (50% por peso) com agitação até o pH atingir 11. A camada de água foi extraída com diclorometano duas vezes (2 x 600 mL). Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentrados em vácuo para produzir a base livre amorfa do composto em epígrafe (99% pureza por HPLC) . CL/EM detectou [M+H]+= 507,3. 1H-RMN (400 MHz, d< i-MeOH) : 5 8,82 (s, 1H) , 8,59 (S, 1H) , 8,05 (dd, J= 8 ,8, 1,8 Hz, 1H) , 7,9 (d, J = 8,71 Hz, 1H), 5, 28 (t, J = 8, 6 Hz, 1H) , 4 , 58 (br s, 1H) , 4, ,06 (m, 1H), 3,52 - 3, 68 (m, 2H) , 3, 43 (m, 1H) , 2,76 (br s, 1H), 2 ,55 (m, 1H) , 2,28 (s, 3H) , 2, 1 - 2,3 (m, 3H) , 2, 0 (s, 3H) , 2 ,0 (m, 1H) , 1, 65 -1,8 (m, 3H) , 1,09 (app . dd, <J=24 , 6 ,4 Hz, 6 H) .
Exemplo 1, Etapa 9 alternativa
NH2'HOTs
Pd/C [HJ
EtOH i-PrOAc 58
Exemplo 1, Etapa alternativa 9a1: Num hidrogenador foram carregados etil(7R,8S-8-((S)-1-fenil-etilamino)-1,4-dioxi-spiro[4.5]decano-7-carboxilato 4-toluenossulfonato sal IA (1417 g, 2,8 moles, ver: W02004098516, preparado análogo à Pat. norte-americana 6,835,841), etanol (200 proof, 11,4 L) e 10% Pd/C catalisador (50% humidade, 284 g). A mistura foi colocada em estado inerte com azoto e, em seguida, pressurizada com hidrogénio gasoso (45 psig) e agitada vigorosamente a aprox. 40 °C até a matéria-prima ter sido consumida (HPLC). A suspensão foi arrefecida, purgada com azoto gasoso e o catalisador foi removido por filtração em estado inerte. O catalisador consumido foi lavado com etanol (4,3 L) . O filtrado e lavagens foram combinados e concentrados sob vácuo para um volume de 2-3 L enquanto se mantinha o lote entre 40°-60 °C. Foi carregado acetato de isopropilo (5 L) e a mistura foi concentrada até um volume de ~2 L até a maioria do etanol ter sido removido (<0,5%) e o teor residual de humidade ser <1.000 ppm. O volume do lote foi ajustado para ~7,5 L por adição de acetato de isopropilo. A mistura foi aquecida até 80 °C até ficar transparente e, em seguida, arrefecida 65°-70 °C.
Cristais de sementeira de 1 (5 g) foram adicionados e o
lote foi arrefecido até 50 °C durante 2 horas e, em seguida, arrefecida ainda mais até 20 °C durante 4 horas e mantido durante ~10 horas. A suspensão resultante foi filtrada e o bolo foi lavado com acetato de isopropilo (2 L) . O produto foi seco sob vácuo a ~35 °C até os voláteis terem sido reduzidos para menos de ~1% (LOQ) . O etil(7R,8S)-8-amino-l,4-dioxi-spiro[4.5]decano-7-
carboxilato 4-toluenossulfonato sal 1 foi obtido sob a forma de um sólido cristalino branco (936 g, 83% de rendimento, HPLC pureza: 99.8%) . 1H-RMN: : (300 MHz . CDC13) 8,14-7,89 (brs, 3H) , 7,75 (d, J 9,0Hz, 2H) , 7,15 (d, J 59 8,ΟΗζ. 2Η) , 4,22-4,04 (m, 2Η), 4,01-3,77 (m, 4Η), 3,55-3,43 (m, \—1 3,20-3,13 (m, \—1 2,40-2,27 (m, 4H) , «nT Oh 1-1 1 1-1 CM Chi (m, 2H) , 1,81 -1,51 (m, 3H) , 1,23 (t, J 7,0Hz, 3H); HPLC:
Waters Xterra MS C18 4,6 mm x 150 mm i.d, dimensão da partícula 3,5 pm, NH40H 0, 05% (5% ACN, 95% H20, solvente A) , a 0,05% NH4OH (95% ACN, 5% h2o, solvente B), 5% B a 20% B em 10 minutos, variou para 95% B em 25 minutos e, em seguida, variou para 5% B em 1 minuto; 11,1 minutos (aminoéster 1).
Exemplo 1, Etapa alternativa 9a11: Aminoéster 1 (63g, 0,16M, 1 eq.; o produto de desprotecção redutora de um composto conhecido - (Consultar, por exemplo, R. J. Cherney, WO 2004/098516 e G. V. Delucca & S. S. Ko, WO 2004/110993) foi colocado num balão de fundo redondo e MeCN (500 mL) foi adicionado. EDAC (33,1 g, 0,17M, 1,1 eq) , HOBt*H20 (21,2g, 0,16M, l,0eq) e iV-Cbz-L-metionina (46,7g,
0,17M, l,05eq) foram então adicionados, seguidos de TEA (48,0mL, 0,35M, 2,2eq). Observou-se uma reacção exotérmica até 38 °C. A massa de reacção foi deixada em agitação à RT. Após 30 mins, a HPLC indicou conversão completa. A massa de reacção foi diluida com EtOAc (2.5L) e lavada com KHC03 (4x500mL, 20% em peso em solução aq.) e salmoura (500 mL). A fase orgânica foi separada, seca sobre MgS04 e concentrada. O residuo foi dissolvido em TBME e reconcentrado para produzir etil (7R,8S)-8-{(2S)-2-benziloxicarbonilamino-4-metilsulfanil-butir-il-amino}-1,4-dioxi-spiro[4.5]decano-7-carboxilato 2 sob a forma de um 60 semi-sólido pegajoso (76,2g, 98% de rendimento, pureza 93AP) . 1H-RMN: (300 MHz, CDC13) 5 7,36-7,30 (m, 5H) , 7,03 (d, J9 ,0Hz, 1H) . 5 , 66 (d, J8, 0Hz,) ui 1—1 5, 10 (s, 2H) , 4 , 35- 4,25 ( m, 2H), 4 ,19 -4,04 (m, 2H,), 3, 98 -3,86 (m, 4H) , 2 ,87- 2,80 (m, 1H), 2, 55-2,45 (m, 2H) , 2, , 18 1 (dd, J 14, 0Hz, 7,0Hz, 1H), 2, 08 (s, 3H), 2,05- 1, 67 (m, 6H) , 1, , 2 6 (t, J7,0Hz , 3H) . HPLC : YMC-Pack Pro C18 5 (xm 4, 6 X 150 mm, 0,05% TFA (20% MeOH, 80% H20) a 0,05% TFA (20% MeOH, 80% MeCN), 0-100% gradiente de lOmin. 10,01 min (Composto 2,93.1 AP). HRMS: m/z 495,2166 [Cale: C24H35N2O7S 495,2165].
Exemplo 1, Etapa alternativa 9b: Metionina amida 2 (75,Og. 0,15M) foi dissolvida em Mel (225mL, 3mL/g) observou-se alguma libertação de gases mas nenhuma exotermia. A massa de reacção foi deixada em agitação às escuras durante 16,5h. Decorrido este tempo, havia-se formado um precipitado espesso amarelo claro. O balão foi então evacuado para 200 mmHg e removeu-se parte de Mel. O material restante foi suspenso em TBME (500 mL); após 30min de agitação a suspensão foi filtrada, o bolo lavada com TBME (500 mL). A análise por RMN deste material indicou uma pequena quantidade de Mel remanescente. O bolo foi suspenso novamente em TBME (500 mL) , filtrado, lavado com TBME (50 0 mL) e seco sob vácuo para produzir iodeto de [ (3S) —3 — benziloxicarbonilamino-3-{(7R,8S)-7-etoxicarbonil-l,4-di- 61 oxa-spiro[4.5]dec-8-ilcarbamoil}-propil]-dimetilsulfónio 3 sob a forma de um sólido quase branco de fluidez livre (93, 5g, 97%, 99% de pureza). , 1H-RMN: (300 MHz, CDC1 3) 5 7,75 (d, J9, 0Hz, 1H), 7,38-7, 27 (m, 5H) t 6, 40 (d , J1. OHZ, 1H) , 5, 10 (s , 2H) , 4,76-4,65 (m, 1H), 4, 48 -4,39 (m, 1H) , 4, 14 -3, 85 (m , 6H) , 3,84-7,73 (m, 1H), 3, 68 -3, 55 (m, 1H) , 3,21 (s, 3H) , 3, 1 -2 (s, 3H), 2,90-2,83 (s r 1H) , 2,52- 1,55 (m, 8H) , 1,24 (t, J7,0Hz, 3H) . HPLC: YMC-Pack Pro C18 5pm 4,6 X 150 mm, 0,05% TFA (20% MeOH, 80% H20) a 0,05% TFA (20% MeOH, 80% MeCN), 0-100% gradiente de lOmin. 2,45min (1 —) , 8,14min (Composto 3.43.6AP, 1“ 54.6AP), HRMS: m/z 509,2341 [Cale: C25H37N2O7S 509, 2321].
O O \—/
.NHCbZ
4
Exemplo 1, Etapa alternativa 9c: Cs2C03 (61,5g, 0,19M, l,5eq) foi colocado num balão de fundo redondo e adicionou-se DMSO anidro (2,4L) . O sal sulfónio 3 (80, Og, 0,13M, 1, Oeq) foi então adicionado por porções. Uma vez completada a adição a massa de reacção foi deixada em agitação às escuras durante 20h. A massa de reacção foi então dividida em metades e cada metade processada separadamente: a massa de reacção foi diluída com EtOAc (2,0L) e lavada com salmoura (2L), a fase orgânica foi lavada com salmoura (500 mL) . As camadas aquosas combinadas foram então lavadas com EtOAc (500 mL) . As fases orgânicas combinadas foram então lavadas com salmoura (3x750mL). A segunda metade da massa 62 de reacção foi tratada de uma forma idêntica e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04 e concentradas para produzir etil (7R,8S)-8-{(3S)-3-
Benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il}-1,4-dioxi-spiro [ 4.5 ] decano-7-carboxilato 4 sob a forma de um óleo de cor clara (56,5g, 0,13M, -100 % pureza) puro por análise por RMN. 1H-RMN: (300 MHz, CDC13) 5 7,38-7,30 (m, 5H) , 5,37 (br d, J4,0Hz, 1H) , 5,11 (s, 2H) , 4,27-4,18 (m, 1H) , 4,17- 3.82 (m, 8H) , , 3,32 (td, J 10,0Hz, 60,0Hz, 1H) , 3,23 (q J5,0Hz, 1H) , 2,63-2,57 (m, 1H) , 2,42-2,25 (m, 2H) , 1,94 1,68 (m, 5H), 1,25 (t, J7,0Hz, 3H). HPLC: YMC-Pack Pro C18 5pm 4,6 X 150 mm, 0,05% TFA (20% MeOH, 80% H20)a 0,05% TFA (20% MeOH, 80% MeCN), 0-100% gradiente de lOmin. 8,99min (Composto 5, produzido em coluna, 4.2AP), 9,48 (Composto 4, 74.3 AP) . HRMS: m/z 447.2127 [Cale: C23H31N2O7 447,2131].
acetone 1NHCI NHCbl 2^co2et
Exemplo 1, Etapa alternativa 9d: Pirrolidinona 4 (50,Og, 0,11M) foi dissolvida em acetona (500 mL) e HC1 IN (500 mL) foi adicionado. A massa de reacção foi então aquecida até 65°C. Após 20 mins, a HPLC indicou que a reacção estava completa. A massa de reacção foi deixada arrefecer até à TA e a acetona foi removida num evaporador rotativo. Durante esta destilação, o produto precipitou-se da solução sob a forma de um sólido branco. Este foi isolado por filtração e o bolo lavado com água. 0 bolo foi então seco azeotropicamente com tolueno (3x300mL) para produzir etil (IR,2S)-2-((3S)-3- 63 benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-5-οχο-ciclohexanocarboxilato 5 sob a forma de um sólido branco (39,8g, 88%, 97% pureza). 1H-RMN: (300 MHz, CDC13) 5 7,37-7,32 (m, 5H) , 6,65 (br d, J4,0Hz, 1H) , 5,12 (s, 2H) , 4,54-4,47 (m, 1H) , 4,34-4,26 (m, 1H) , 4,18 (dq, J 11,0Hz, 7,0Hz, 1H) , 4,09 (dq, Jll,0Hz, ,
7,0Hz, 1H), 3,36-3,20 (m, 3H), 2,70-2,35 (m, 6H) , 2,05-1,96 (m, 1H) , 1,81 (quin., J 1 1,0Hz, 1H) , 1,24 (t, J 7, 0Hz, 3H) . HPLC: YMC-Pack Pro C 18 5pm 4,6 X 150 mm, 0,05% TFA (20% MeOH, 80% H20) a 0,05% TFA (20% MeOH, 80% MeCN), 0-100% gradiente de lOmin. 8,95min (Composto 5). HRMS: m/z 403, 1864 [Cale: C2iH27N206 403, 1869]. .NHCtn >
MHCb2 o-
O n 0 Ti(OiPr)4
Jk^COaEt NaBHA
Φ
O 5
Exemplo 1, Etapa alternativa 9e: Ciclohexanona 5 (22,5g, 0,06M, 1 eq), DMSO (30mL) e Ti (O-iPr)4 (33,7mL, 0,11M, 2,04eq) foram colocados num balão de fundo redondo. N-isopropil-N-metilamina (ll,6mL, 0,1 1M, 2,0eq) foi então adicionada numa porção. A mistura foi deixada em agitação durante 30 mins à temperatura ambiente antes de ser arrefecida até <3°C em gelo/ água. MeOH (30mL) foi então adicionado, seguido pela adição por porções de NaBH4 (4,33g, 0,11 M, 2,04eq) -temperatura mantida <8°C. 30mins após a adição ter sido completada, a massa de reacção foi diluída com cloreto de metileno (300mL) e, em seguida, NaOH (IN, 40mL) . A suspensão resultante foi filtrada através de Celite e o 64 bolo lavado com cloreto de metileno (lOOmL) . 0 licor resultante foi concentrado sob pressão reduzida e o residuo dissolvido em EtOAc (500 mL) . Esta solução foi extraída com HC1 IN (2x400mL), sendo depois as camadas aquosas combinadas tornadas básicas com Na2C03. A extracção com EtOAc (4x250mL) produziu uma fase orgânica transparente e incolor que foi seca sobre Na2S04 e concentrada para produzir um pó branco (24,6g, 96%, 7:1 d.r.) . Este material foi então suspenso de um dia para o outro em hexano (670mL). O sólido foi isolado por filtração e seco sob pressão reduzida para produzir etil (IR,2S,5R)-2-( (3S)-3- benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-5-(isopropil-metil-amino)-ciclohexanocarboxilato 6 sob a forma de um sólido branco (20,9g, 81%, 24 :1 dr.). 1H- RMN: (300 MHz, CDCI3) 5 7,37-7,28 (m, 5H) , 5,55 (d, J4,5, 1H) , , 5,10 (s, 2H), 4,42 (q, J4,5, 1H) , 4,23-4,12 (m, 1H) , 4,08 (dq, J10,5, 7,0, 1H) , 4,02 (dq, J10,5, 7,0, 1H) , 3,84 (t, J9,0, 1H) , 3, 46-3, 36 (m, 1H) , 3,04 (septeto, J6,5, 1H) , 2,86-2,80 (m, 1H), 2, 63-2,48 (m, 2H) , 2,17 (s, 3H, Me) , 2,10-1,63 (m, 7H) , 1,22 (t, J 7,0, 3H) , 1,00 (d, J 6,5, 3H) , 0, 97 (d, J 6,5, 3H) . HPLC: YMC-Pack Pro C18 5pm 4,6 X 150 mm, 0,01 M NH4OAc (MeOH :água 20: 80) a 0,01 M NH4OAc (MeOH:água:MeCN 20:5: 75) 10 a 100% gradiente de 15min . 8,23 (Composto 6), 8.88 (5-epi-Composto 6). HRMS: 460,2798 [Cale: C25H38Na05 4 60,2811]. 65 NHCbz NHCbz
1-2N HCI 50 - 60 °C (84%)
nXxC02H
7
Exemplo 1, Etapa alternativa 9f: O aminoéster 6 (9,76 g, 2.12 mmol) foi dissolvido em HCI 2N (80 mL) e, em seguida, aquecido até ~55 °C. sob atmosfera inerte. A reacção foi agitada durante 20 h e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente. A solução de reacção foi lavada duas vezes com tolueno (porções de 25 mL) , neutralizada para um pH de 6 - 7 por adição de grânulos de KOH e, em seguida, extraídos oito vezes com cloreto de metileno (porções de 100 mL) . Os extractos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentrados sob pressão reduzida até um volume total de 50 mL. A solução concentrada foi então adicionada lentamente a éter metil-tert-butílico (300 mL) ao longo de 15 min num funil de adição com agitação vigorosa. A suspensão branca resultante foi agitada à temperatura ambiente durante lhe, em seguida, arrefecida até 0 °C e agitada durante 1 h. 0 produto foi filtrado e lavado duas vezes com éter metil-tert-butílico (porções de 25 mL) . A água do bolo húmido foi removida por destilação azeotrópica com acetonitrilo (300 mL) . O produto foi seco sob pressão reduzida para produzir ácido (IR,2S,5R)-2-( (3S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-5-(isopropil-metil-amino)-ciclohexanocarboxílico 7, (7,69 g, 84% de rendimento) sob a forma de uma espuma branca. 1H-RMN: (400 MHz, 50°C, CDC13) 5 7,44-7,32 (m, 5H) , 6,10 (broad s, 1H) , 5,19 (app s, 2H) , 4,42 (dd, J= 15,6, 7,8 Hz, 1H) , 4,29-4,23 (m, 1H) , 3, 68-3.60 (m, 2H) , 3,33-3,27 66 (m, 2H) , 3,20 (broad s, 1H) , 2,99 (broad s, 1H) , 2,51 (s, 3H) , 2,49-2,45 (m, 3H) , 2,33-2,31 (m, 1H) , 2,00 (ddd, J= 9,0, 8,6, 3,9 1H), 1, 95-1,78 (m, 2H) , 1,36-1,21 (m, 6H) . LCMS: m/z 432, 20 [Cale: C23H34N3O5 432,25]. NHCbz O- (1, = u DPPA x\'COiH -► N í 11 Ac20/AcOH <y A O NHAc NHCbz
Exemplo 1, Etapa alternativa 9g: Aminoácido 7 (6,3g, 14,7mmol, l,0eq) foi dissolvido em THF (80mL) sob N2 e NaH (584mg, 14,7mmol, l,0eq, 60% em peso dispersão em óleo mineral) foi adicionado por porções. Quando a adição ficou completa e a evolução de gás cessou, a massa de reacção foi concentrada sob pressão reduzida e o sólido resultante submetido a destilação azeotrópica com tolueno (50 mL) para produzir um sólido branco (KF 0,59% em peso). Este sólido foi suspenso em tolueno (100 mL) sob N2 e aquecido até 90°C. DPPA (3,32 mL, 15.3 mmol, 1,05 eq) foi adicionado gota a gota ao longo de 2 min. Após ~5min todos os sólidos se tinham dissolvido, observando a precipitação de um sólido branco após 10 mins. Após 30 mins, a análise por HPLC indicou reacção completa. A massa de reacção foi deixada arrefecer até à TA antes de ser filtrada, o bolo foi lavado com tolueno. Os licores foram então adicionados lentamente à solução de Ac0H/Ac20 (80/20,168mL) a 90°C. Após 45mins, a HPLC ainda indicava algum isocianato. Às 1, 15h , a massa de reacção foi arrefecida até à TA e
diluída com tolueno (lOOmL) e água (lOOmL). A camada orgânica foi removida e o tolueno lavado com HC1 IN 67 (lOOmL). As fases aquosas combinadas foram então tornadas básicas com K2CO3 (s) e o seu pH foi ajustado para 12 com NaOH (ION), mantendo a temperatura abaixo de 20°C. A camada aquosa foi então extraída com cloreto de metileno (4xl50mL), as camadas orqânicas combinadas seca sobre K2CO3 e concentradas para produzir benzil (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)ciclohexil) -2-oxopirrolidina-3-ilcarbamato 8 sob a forma de uma espuma branca (4,5g, 70%, 94AP pureza). A 1H-RMN foi idêntica à do material obtido pela via descrita anteriormente (Exemplo 1, Etapa 9). HPLC: YMC-Pack Pro C18 5pm 4.6 X 150 mm, 0.05% TFA (20% MeOH, 80% H20), to 0.05% TFA (20% MeOH, 80% MeCN), 0-100% lOmin gradient. 7,20min (Composto 8), 7,85min (dímero de ureia). HRMS: 445, 2809 [Cale: C24H37N4O4 4445,2815].
Preparação alternativa do Exemplo 1
2 3
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 1: 0 sal etil(7R,8S)-8-amino-l,4-dioxi-spiro[4.5]decano-7-carboxilato 4-toluenossulfonato 1 (450,1 g), foi combinado com cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil) carbo-diimida (236,3g), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (171,9g), N-carbobenziloxi-L-metionina (333,4g) e 68 acetonitrilo (3, 1 L) . À mistura agitada foi adicionada trietilamina (249,5g) a uma temperatura inferior a 30 °C.
Após a conclusão da reacção (HPLC) , a mistura foi diluída com acetato de etilo (8,2 L) e lavada com solução aguosa de bicarbonato de potássio a 25% (2x4,5 L) seguida de água (4,5 L) . A fase orgânica foi separada e concentrada sob pressão reduzida para obter uma solução de etil (7R, 8S)-8-( (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-metilsulfanil-butirilamino)-1,4-dioxi-spiro[4.5]decano-7-carboxilato 2 (1,4 L) . Iodeto de metilo (2,39 kg) foi adicionado, o recipiente foi isolado da luz e a mistura foi mantida sob agitação lenta durante aprox. 24 h. Ao precipitado espesso amarelo foi adicionado éter metil-tert-butílico (2,7 L) e a mistura foi mantida durante aprox. 1 h. 0 produto foi isolado por filtração e o bolo foi lavado com éter metil-tert-butí lico (2x1,4 L) e, em seguida, seco sob vácuo, produzindo iodeto de [ (S)-3-benziloxi-carbonilamino-3-((7R,8S)-7-etoxicarbonil-l,4-dioxi-spiro[4.5]dec-8-ilcarbamoil)-propil]-dimetilsulfónio 3 (671,4 g, -94% de rendimento) sob a forma de um sólido guase branco (HPLC pureza 99,9%).
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 2: Sal sulfónio 3 (619, 4 g) e carbonato de césio (416,8 g) e dimetilsulfóxido anidro (6.2 L) foram combinados num reactor eguipado com um purificador para neutralizar os 69 sulfuretos voláteis. Foi mantida uma agitação vigorosa até se atingir a conversão completa (HPLC). Acetato de etilo (12,4 L) foi adicionado, seguido por salmoura a 20% (3 L) . A fase orgânica foi separada, lavada duas vezes com salmoura (2x3 L) e evaporada para obter a solução de etil (7R,8S)-8-( (S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-1,4-dioxi-spiro[4.5]decano-7-carboxilato 4 em acetato de etilo ( — 0,8 L) . Acetona (2,55 L) foi adicionada, seguida por solução aquosa de ácido clorídrico 0,5 M (2,3 L). Com uma boa mistura, a solução foi aquecida até 50 a 60 °C até a conversão de 4 para etil (IR,2S)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-5-oxo-ciclohexanocarboxilato 5 estar concluída (HPLC). A mistura foi concentrada sob pressão reduzida a uma temperatura abaixo de 40 °C, arrefecida até ~30 °C e foi adicionada água (4,1 L). A suspensão resultante foi arrefecida até 5 a 10 °C e agitada durante ~1 hora. O produto foi filtrado e o bolo foi lavado com água (2x2,5 L) . Após a anulação do estado de licor, o bolo foi seco até um peso constante a uma temperatura abaixo de 40 °C num forno a vácuo. Obteve-se ciclohexanona 5 (272g, 70% de rendimento) (HPLC pureza 98,7%) .
Exemplo Ciclohexanona 1, Preparação alternativa, Etapa 3: 5 (206 g) foi dissolvida em diclorometano (1,1 L) e carregada num hidrogenador. Tetraisopropóxido de 70 titânio (218,2 g) e N-isopropil N-metilamina (63,64 g) foram adicionados e a mistura foi agitada à temperatura ambiente (23 a 25 °C) durante pelo menos 5 h. Catalisador Platinum (5% Pt/S/C, 15 g, aprox. 7,5 % em relação a 5) foi adicionado e a hidrogenação foi realizada a ~30 psig durante pelo menos 6 h, produzindo uma mistura de etil (IR,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo- pirrolidina-l-il)-5-(isopropil-metil-amino)- ciclohexanocarboxilato 6 e o seu 5-epi-isómero (~7%) . 0 catalisador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida até aprox. -600 mL.
Acetato de etilo hidratado (~3% água, 2,0 L) foi adicionado com agitação vigorosa durante um período de pelo menos 1,5 h. A agitação foi mantida durante pelo menos um período adicional de 6 h. A suspensão foi filtrada. O bolo de filtração foi lavado com acetato de etilo (1.0 L) e posto de lado. O filtrado e as lavagens combinados foram concentrados até -400 mL. Foi adicionado tolueno (2,0 L) e a solução foi lavada com solução aquosa de ácido clorídrico 2M (2 x 400 mL). A camada aquosa foi aquecida até 50° a 60 °C durante aprox. 20 h ou até a hidrólise de 6 ser considerada como completa (HPLC). Solução aquosa de hidróxido de sódio foi adicionada para ajustar o pH para ~10 e a mistura foi extraída com tolueno (3x600 mL). A fase orgânica foi posta de lado e o pH foi ajustado de novo para ~6 por adição de solução aquosa de ácido clorídrico. A fase aquosa foi concentrada até -600 mL sob pressão reduzida e extraída com cloreto de metileno (pelo menos 3x2,0 L) . As camadas combinadas de cloreto de metileno foram evaporadas sob pressão reduzida e substituídas continuamente por THF para obter uma solução de ácido (IR,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il) -5-(isopropil-metil-amino)-ciclohexano-carboxílico 7 (-14R g) 71 em THF (-4 L) . Cristais de sementeira de 8 foram adicionados, seguidos de uma solução de metóxido de sódio a 25% em metanol (81,24 g) a uma temperatura inferior a 25 °C. A suspensão foi mantida durante pelo menos mais 16h com agitação. 0 produto foi isolado por filtração e o bolo foi lavado com THF (4x200 mL) e seco até um peso constante em vácuo a uma temperatura inferior a 30 °C. Obteve sal de sódio seco de (IR,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-5-(isopropil-metil-amino)-ciclohexano-carboxilato 8 (139g, -60% de rendimento de 5).
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 4: Sal de sódio de aminoéster 8 (lOOg), fosfato de difenilo (3,86g), tert-BuOH (1275 mL) e tolueno (225 mL) foram combinados e aguecidos sob refluxo e pressão reduzida. Aprox. 500 mL de destilado foram recolhidos e postos de lado enquanto era substituído continuamente pela solução de tolueno em tert-BuOH. O vácuo foi removido e o destilado foi passado para percolato através de uma coluna preenchida com crivos moleculares e deixado regressar ao recipiente. Após a conclusão da secagem, foi adicionado DPPA (52,4mL; dissolvido em 60 mL de tolueno) lentamente a uma suspensão a 80 °C. Após a conversão completa (HPLC), o tert-BuOH foi removido por destilação por vácuo e substituído continuamente com tolueno. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e lavada duas vezes com solução aquosa de K2HP04 a 10% (lx800mL, 1x400 mL) e água (400mL). A fase 72 orgânica foi aquecida e concentrada em vácuo até aprox. 270mL). 0 vácuo foi removido e foi adicionado heptano (1,1 L) lentamente a aprox. 80°C, seguido por sementes de 9 (~lg). A suspensão foi arrefecida lentamente até à temperatura ambiente e o benzil{ (S)-1-[(IS,2R,4R)-2-tert-butoxicarbonilamino-4-(isopropil-metil-amino)-ciclo-hexil]-2-oxo-pirrolidina-3-il}-carbamato 9 foi isolado por filtração sob a forma de um sólido branco (86, 76g, 78% de rendimento).
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 5: O carbamato de terc-butilo 9 (50g) foi dissolvido em Tolueno (500mL) e i-PrOH (150mL). A solução resultante foi então aquecida até 60°C. Ácido metanossulfónico (19,6 mL) foi adicionado a uma temperatura inferior a 65°C. Após a conclusão da reacção (HPLC), a mistura foi arrefecida até à TA e trietilamina (69,4 mL) foi adicionada lentamente a uma temperatura inferior a 25°C. Anidrido acético foi então adicionado a uma temperatura inferior a 25°C. Após 1 h, ácido acético (250 mL) foi adicionado a uma temperatura inferior a 25°C. A fase de tolueno foi posta de lado e 2-metil-THF (500 mL) foi adicionado à fase aquosa. A mistura foi agitada vigorosamente e tornada básica com NaOH (solução aquosa a 25%) até um pH 12. A fase aquosa foi posta de lado e a camada orgânica foi lavada com salmoura (250 mL). A camada orgânica foi concentrada sob pressão 73 reduzida e substituída continuamente por i-PrOH. A solução foi arrefecida e filtrada para produzir benzil{ (S)-1-[(IS,2R,4R)-2-acetilamino-4-(iso-propil-metil-amino)-ciclohexil]-2-oxo-pirrolidina-3-il}-carbamato 10 em solução de i-PrOH que foi usada directamente na hidrogenação.
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 6: A uma solução contendo a acetamida 10 (—61 g) em i-PrOH (-625 mL) adicionou-se o catalizador húmido 10% Pd/C (2,5 g) e a suspensão foi hidrogenada a 30 psig e aprox. 25 °C durante pelo menos 2 h. Após reacção completa (HPLC), o catalizador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado até aprox. 550 mL. Foi adicionada água (8,8 mL) , seguida de ácido clorídrico 5,6 N em solução de i-PrOH (69,5 mL) . A suspensão resultante foi mantida à temperatura ambiente de um dia para o outro. O produto foi isolado por filtração e o bolo foi enxaguado com i-PrOH (2x100 mL) e seco em vácuo até um peso constante a ~50 °C para produzir N-[(IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxo-pirrolidina-l-il)-5-(isopropil-metil-amino)-ciclohexil]-acetamida 11 (55,6 g, 97% de rendimento) sob a forma do seu sal de ácido clorídrico (73,6% análise da base livre, HPLC). ’2 74
Ο
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 7: A 6- trifluorometil-quinazolina-4-ol 12 (20,1 g) em MeCN (400 mL) foi adicionada solução 5,5 M de metóxido de sódio em metanol (17,0 mL). A suspensão resultante foi destilada sob pressão reduzida e substituída continuamente por MeCN para remover o metanol. À suspensão foi adicionado DMF (1,4 g) , seguido de cloreto de oxalilo (13,0 mL) a uma temperatura inferior a 50 °C. Após a conclusão da reacção (HPLC), o reagente em excesso foi removido sob pressão reduzida para produzir -400 mL de suspensão. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e lavada com solução aquosa a 10% de K2HP04 (1x1,0 L, 1x0,5 L) para proporcionar 4-cloro-6-trifluorometil-quinazolina 13 (-21,2 g) em aprox. 450 mL de solução aquosa de MeCN, que foi usada directamente na reacção de acoplamento subsequente (HPLC pureza 99,8 %).
Exemplo 1, Preparação alternativa, Etapa 8: A uma mistura de acetamida 11 (28,5 g, sal cloridrato, 73,6%
análise da base livre), acetonitrilo (100 mL) , N,N,-di-isopropil-N-etilamina (61 mL) à temperatura ambiente foi adicionada a solução de 13 (-21,2 g) em MeCN (-450 mL) . A mistura homogénea foi mantida de um dia para o outro. Após a conclusão da reacção (HPLC), a mistura foi concentrada 75 em vácuo até aprox. 125 mL. Uma solução aquosa a 9,5% de ácido acético (240 mL) foi adicionada e a fase aquosa foi extraída com cloreto de metileno. A fase aquosa foi separada e éter metil-tert-butílico (450 mL) foi adicionado, seguido por solução aquosa 2N de hidróxido de lítio para ajustar o pH para >11,5. A camada orgânica foi separada, lavada com água e filtrada. Aprox. metade da fase de éter foi diluída com éter metil-tert-butílico (-250 mL) e concentrada em vácuo. Heptano (45 mL) foi adicionado lentamente a uma temperatura inferior a 60 °C, seguido por cristais semente do Exemplo 1 (0,4 g) . Heptano adicional (125 mL) foi adicionado e a mistura foi arrefecida lentamente até à temperatura ambiente e a suspensão resultante foi mantida de um dia para o outro. 0 produto foi isolado por filtração, o bolo foi lavado com heptano e seco em vácuo até atingir peso constante para produzir N-((lR,2S,5R)-5 - (isopropilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)-quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida 14 (15,0 g, 85% de rendimento).
Procedimentos de cristalização para o Exemplo 1
Exemplo 1, Produção do sal bis-BSA e purificação: A totalidade da base livre amorfa do Exemplo 1, Etapa 11, foi dissolvida em metanol (600 mL). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e carregada com ácido benzenossulfónico (2,5 eq). A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e o sólido branco resultante foi recolhido por filtração para produzir sal do ácido bis-benzenossulfónico do composto em epígrafe (95 g, 86%) . Este material apresentava uma pureza >99% por HPLC. Este material foi purificado adicionalmente por re-cristalização a partir de 76
Et0H/H20 80/20, que forneceu o sal livre de qualquer metanol residual. Pureza por HPLC = 99,8%. 2H RMN (500 MHz, d20) 5 ppm 8, 75 (1H , £ 3) , 8,66 (1H, s) , 8,25 (1H, d, J = 8, 80 Hz) , 7, 90 (1H , d. , J= =8, 80 Hz), 7,75 (4H# . d, J = 8, 25 Hz) t 7, 43 - 7, 57 (6 H, m) , 5, 42 (1H, t), 4,33- 4, 44 (1H , m i) , 4 , 09 - 4,19 (1H, m) , 3, 83- -3, 91 (1H, m) , 3 ,74- -3, 83 (2 H, m) t 3, 61 (1 H , t, J=1 1, 55 Hz ) , 2,75 (3 H, d, J=6, 60 Hz! I , 2, , 61 - 2, 70 d H, m) , 2 ,31 - 2, 44 (1 H, m) , 2 ,20 - 2, 27 d H , m 0 , 2, 17 (2 H, d, J= = 12,1 0 Hz), 1,94 - 2,' 04 (1 H, m, J= 12, 65 Hz) , 1,90 -1, 95 (3 H, m) , 1,72 -1, 91 (2 H, m) , , 1 ,37 (3 H, d, J=6,05 Hz), 1,29 (3 H, d, J=6, 60 Hz). A calorimetria exploratória diferencial utilizou uma taxa de aquecimento de 10 °C/min e revelou uma fusão / decomposição endotérmica com uma temperatura de actuação de 297, 6 °C e um pico de temperatura a 299,1 °C.
Exemplo 1, Cristalização da base livre: A amostra da base livre amorfa de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida (1 g) foi dissolvida em diclorometano (5 mL) . A solução foi carregada com heptano (30 mL) e, em seguida, aquecida para destilar o diclorometano. A solução foi arrefecida até 40 °C; um sólido branco precipitou. A suspensão foi aquecida até 90 °C e agitada durante 2 h. A suspensão foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada para produzir a base livre pura do composto em epígrafe. Não foi aparente qualquer solvente residual por 1H-RMN. EXEMPLO 2
Formas cristalinas de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- 77 (trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida Várias formas cristalinas de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, incluindo a base livre e formas de sal e solvatos das mesmas, foram preparadas e caracterizadas conforme descrito em baixo.
Procedimentos de caracterização das formas
Dados do cristal simples
Os dados foram recolhidos num difractómetro da série CAD4 da Bruker-Nonius (BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison. WI 53711 EUA). Foram obtidos parâmetros da célula unitária através de análise dos mínimos quadrados das definições experimentais do difractómetro a partir de 25 reflexões de ângulo elevado. As intensidades foram medidas utilizando radiação de Cu Κα (X = 1,5418 A) a uma temperatura constante com a técnica de análise variável Θ-2Θ e foram corrigidas apenas para os factores de polarização de Lorentz. As contagens de fundo foram recolhidas nos extremos da análise durante metade do tempo da análise. Em alternativa, foram recolhidos dados do cristal individual num sistema Bruker-Nonius Kappa CCD 2000 utilizando radiação de Cu Κα (λ = 1,5418 A) . A indexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram levados a cabo com o pacote de software HKL2000 (Otwinowski, Z. & Minor. W. (1997) em Macromolecular Crystallography, eds. Cárter, W.C. Jr & Sweet, R.M. 78 (Academic. NY), Vol. 276, pp. 307-326) no pacote de aplicações do programa Collect. (Interface do utilizador de recolha e processamento de dados Collect: Collect: Software de recolha de dados, R. Hooft, Nonius B.V, 1998.) Em alternativa, os dados do cristal individual foram recolhidos num sistema Bruker-AXS APEX2 CCD utilizando radiação de Cu Κα (X = 1,5418 Á) . A indexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram levados a cabo com o pacote de software/pacote de aplicações APEX2 (Interface do utilizador de recolha e processamento de dados APEX2: Manual do utilizador do APEX2, vl.27; BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway
Madison, WI 5371 EUA).
Quando indicado, os cristais foram arrefecidos na corrente fria de um sistema de criogenia Oxford (Oxford Cryosystems Cryostream cooler: J. Cosier e A.M. Glazer, J. Appl. Cryst, 1986, 19, 105) durante a recolha de dados. As estruturas foram calculadas por métodos directos e refinadas com base nas reflexões observadas utilizando o pacote de software SDP (SDP, Structure Determination Package, Enraf-Nonius, Bohemia NY 11716. Factores de dispersão, incluindo f' e f'', no software SDP foram retirados das "International Tables for Crystallography" [Quadros Internacionais de Cristalografia], Kynoch Press, Birmingham, Inglaterra, 1974; Vol. IV, Quadros 2.2A e 2.3.1) com modificações locais menores ou os pacotes cristalográficos MAXUS (pacote de software de cálculo e apuramento maXus: S. Mackay, C.J. Gilmore, C. Edwards, M. Tremayne, N. Stewart, K. Shankland. maXus: um programa de computador para o cálculo e apuramento de estruturas cristalinas a partir de dados de difracção ou SHELXTL4. Os parâmetros atómicos derivados (coordenadas e factores de 79 temperatura) foram aperfeiçoados através dos mínimos quadrados da matriz completa. A função minimizada nos aperfeiçoamentos foi EW(IF0I - IFCI)2· R é definido como Σ I IF0I - IFcll/Σ IF0I enquanto Rw = [SW(IF0I - IFCI)2/EW | F012]1/2 em que w é uma função de pesagem apropriada baseada nos erros das intensidades observadas. Os mapas de diferenças foram examinados em todas as fases do aperfeiçoamento. Os hidrogénios foram inseridos em posições idealizadas com factores isotrópicos de temperatura, mas não ocorreu variação de qualquer parâmetro de hidrogénio.
Dados de difracção de raios X no pó (PXRD)
Os dados de PXRD foram obtidos utilizando um Bruker C2 GADDS. A radiação foi Cu Ka (40 KV, 50mA) . A distância amostra-detector foi de 15 cm. As amostras de pó foram colocadas em capilares de vidro selados de 1 mm ou menos de diâmetro; a capilaridade foi rodada durante a recolha de dados. Os dados foram recolhidos para 3^20<35° com tempos de exposição da amostra de pelo menos 2000 segundos. Os arcos de difracção bidimensional resultantes foram integrados para criar um padrão tradicional PXRD unidimensional com uma tamanho de passo de 0,02 graus 20 no intervalo de 3 a 35 graus 20. Cerca de 200 mg foram embalados num suporte de amostra Philips de difracção de raios X no pó (PXRD) . A amostra foi transferida para uma unidade Philips MPD (45 KV, 40 mA, Cu Ka) . Os dados foram recolhidos à temperatura ambiente no intervalo de 2 a 32 2-teta (modo de análise contínua, taxa de análise 0,03 graus/seg, auto-divergência e fendas antidispersão, fenda de recepção: 0,2 mm, spinner da amostra: LIGADO) 80
Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
As experiências de DSC foram levadas a cabo num TA
Instruments™ modelo Q1000 ou 2920. A amostra (cerca de 2-6 mg) foi pesada num reservatório de alumínio e registada com exactidão até à centésima de miligrama e transferida para DSC. O instrumento foi purgado com azoto gasoso a 50 mL/min. Os dados foram recolhidos entre temperatura ambiente e 300°C a uma taxa de aquecimento de 10°C/min. O gráfico foi elaborado com os picos endodérmicos a apontar para baixo.
Análise térmica gravimétrica (TGA)
As experiências de TGA foram levadas a cabo num TA
Instruments™ modelo Q500 ou 2950. A amostra (cerca de 10-30 mg) foi colocada num reservatório de platina previamente tarado. 0 peso da amostra foi medido com exactidão e registado à milésima de miligrama pelo instrumento. A fornalha foi purgada com azoto gasoso a 100 mL/min. Os dados foram recolhidos entre a temperatura ambiente e 300°C a uma taxa de aquecimento de 10°C/min.
Preparação e análise das formas
Os dados da célula unitária data e outras propriedades destes exemplos são apresentados no quadro 1. Os parâmetros celulares unitários foram obtidos a partir da análise cristalográfica por raios X do cristal individual. Uma contagem detalhada de células unitárias pode ser encontrada 81 no Capítulo 3 de Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: a Practical Guide, (MacMillian, 1968).
As coordenadas atómicas fraccionais para os Exemplos 2a, b, c, d, e, f, g e h são apresentadas nas Quadros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9, respectivamente.
Adicionalmente, as posições características dos picos de difracção de raios X no pó (graus 2Θ±0,1)@ TA para os Exemplos 2a, b, d, e,f, g e h são apresentadas no quadro 10, todas elas baseadas em elevados padrões de qualidade recolhidos com um difractómetro (CuKa) com um capilar rotativo com 2Θ calibrado com outro padrão NIST adequado.
Finalmente, as Figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 apresentam os padrões de XRPD para os Exemplos 2a, b, d, e, f, g e h, respectivamente. As Figuras 8 e 9 apresentam as análises de DSC e TGA, respectivamente, do Exemplo 2a e as Figuras 10, 11 e 12 apresentam a DSC, TGA e os espectros da Isotérmica de Adsorção de Água do Exemplo 2f, respectivamente.
Preparação da forma, caracterização por XRD, DSC e TGA
Exemplo 2a, Forma N-l, dibesilato: N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, sal do ácido di-benzenossulfónico, foi cristalizada a partir de acetato de etilo, etanol, metanol e acetona. A Forma N-l, sal dibesilato, é a forma pura (sem moléculas de água ou solvente) forma de N-((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, sal do ácido di-benzenossulfónico. 82 A Forma N-l dibesilato foi caracterizada por um padrão XRD que corresponde ao padrão simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual. A Forma N-l dibesilato foi caracterizada por um termograma DSC apresentando uma fusão/decomposição endotérmica com uma temperatura de actuação tipicamente a cerca de 296 °C. A Forma N-l, dibesilato, foi caracterizada por uma curva térmica TGA possuindo uma perda de peso negligenciável (consistente com a forma sem solvato) até cerca de 280 °C.
Exemplo 2b, Forma DC-1:
Uma amostra da base livre tipo gel oleosa (amorfa) de N- ( (IR, 2S,5R) -5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida (aprox. 0,5 g) , após extracção de uma amostra do sal de BSA, foi dissolvida em diclorometano (aprox. 3 mL). A uma solução foram adicionados aprox. 5 ml de heptano e a mistura oleosa resultante foi agitada vigorosamente por uma barra de agitação magnética num copo aberto a 20-25°C. Obteve-se um sólido branco após a evaporação dos solventes. O sólido foi ressuspenso na mistura de aprox. 5 ml de heptano e 0,2 ml de diclorometano e agitada a 25°C durante 7 dias. A suspensão resultante foi filtrada e seca ao ar para produzir N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, Forma DC-1. A Forma DC-1 é caracterizada por uma mole de diclorometano por mole de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S) -2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre. A Forma DC-1 foi 83 caracterizada por um padrão XRD que corresponde ao padrão simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual.
Exemplo 2c, Forma TH00-1: N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S) -2-oxo-3- ( 6- (trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, 1 mg, foi dissolvida em 80 pL de TNF. O solvente foi removido por Speed-vac (SpeedVac Plus, SC250DDA, Savant/ThermoElectron Corp) sob alto vácuo a 22 °C durante 16 horas. Um total de 100 pL de MIBK/Heptano (1/2 por volume) foi carregado neste poço. Depois de aguardar durante 2 semanas à temperatura ambiente (20-25°C), os cristais foram observados neste poço. A Forma THOO é caracterizada por uma mole de THF por uma mole de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre.
Exemplo 2d, Forma E-l: N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre foi cristalizada a partir de uma solução de etanol e heptano. A Forma E-l é caracterizada por uma mole de etanol por uma mole de N-((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre. A Forma E-l foi caracterizada por um padrão XRD que corresponde ao padrão 84 simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual.
Exemplo 2e, Forma A-l: N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre, foi suspensa à concentração em excesso de 150 mg/ mL em acetona. A suspensão foi deixada até atingir o estado de equilíbrio à temperatura ambiente para produzir uma suspensão algo transparente. Parte da suspensão foi filtrada e tanto o filtrado como a suspensão foram refrigerados a 5 °C para produzir cristais do solvato de monoacetona (A-l). A Forma A-l é caracterizada por uma mole de acetona por uma mole de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre. A Forma A-l, base livre, foi caracterizada por um padrão XRD que corresponde ao padrão simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual.
Exemplo 2f, Forma N-2:
Uma amostra da base livre tipo gel oleosa (amorfa) de N-((lR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida (aprox. 0,5 g) , após extracção de uma amostra do sal de BSA, foi dissolvida em heptano (aprox. 5 mL) . O balão foi raspado com uma espátula de metal e a suspensão foi agitada vigorosamente por uma barra de agitação magnética a 25°C. Obteve-se uma suspensão branca de partículas cristalinas após 24 horas de agitação. 85 A suspensão foi filtrada e o bolo húmido seco em vácuo (40°C) para produzir a forma N-2 pura (confirmada por PXRD) da base livre. A Forma N-2 foi caracterizada por um padrão XRD que corresponde ao padrão simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual. A Forma N-2 é a forma pura (sem moléculas de solvato ou sem moléculas de água ou solvente) de N-((IR,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre. A Forma N-2 foi caracterizada por um termograma DSC apresentando uma fusão endotérmica com uma temperatura de actuação tipicamente a cerca de 158 °C a cerca de 162 °C. A Forma N-2 foi caracterizada por uma curva térmica TGA possuindo uma perda de peso negligenciável a uma temperatura de até cerca de 145 °C que correspondeu aos dados da estrutura do cristal individual. A perda de peso correspondeu ao solvente adventício. A isotérmica de sorção de humidade foi caracterizada por um ganho de peso de 0,15% no intervalo de ca. 25% a cerca de 75% de HR a 25 °C indicando que a forma N-2 foi ligeiramente higroscópica (dir-se-ia muito ligeiramente ou não higroscópica).
Exemplo 2g, Forma AN-3:
Uma suspensão de N-((IR,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il) ciclohexil) acetamida, base livre, a -200 mg/ mL foi preparada em acetonitrilo e deixada até atingir o estado de equilíbrio à temperatura ambiente para produzir uma suspensão algo transparente. Parte da suspensão foi filtrada e tanto o filtrado como a suspensão foram 86 refrigerados a 5 °C para produzir cristais do solvato de acetonitrilo (AN-3) . A Forma A-3 é caracterizada por uma mole de acetonitrilo por uma mole de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3- (6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, base livre. A Forma AN-3 foi caracterizada por um padrão XRD que corresponde ao padrão simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual.
Exemplo 2h, Forma H4-1, HC1:
Uma amostra da base livre de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1- il)ciclohexil)acetamida (aprox. 0,2 g) foi dissolvida em etanol (aprox. 1 mL) . À SOluçãO da base livre foram adicionados aprox. 310 μΐ de solução de HC1 em etanol (concentração de aprox. 1,25 M). A solução foi semeada com uma pequena quantidade de suspensão de cristal do sal cloridrato. À solução turva resultante foram adicionados 3 ml de heptano. Desenvolveu-se gradualmente uma suspensão branca ao longo de 1 -2 horas enquanto agitada a 20-25°C. A suspensão foi agitada a 20°C durante outras 12 horas, filtrada e lavada com heptano. 0 bolo húmido foi seco em vácuo (40°C) para produzir o sal cloridrato tetraidrato, forma H4-1, HC1. A Forma H4-1, HC1, é caracterizada por possuir 4 moles de água por cada mole de N-( (IR, 2S, 5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il)ciclohexil)acetamida, sal cloridrato. A Forma H4-1 de sal cloridrato tetraidrato foi caracterizada por um padrão 87 SRD que corresponde ao padrão simulado gerado a partir dos dados da estrutura do cristal individual
Quadro 1 Parâmetros celulares unitários (N co CQ CQ NÍ1 Cd NÍ1 NÍ1 CQ co co co CQ co NÍ1 co Cd CQ Cd LT) OC OC !-1 OC Γ- > st1 !-1 Cd NÍ1 CQ LT) LT) co OC o OC OC co NÍ1 st1 !-1 Cd CQ Cd Cd Cd !-1 OC 0 O O o o o o o o > oc OC OC OC OC OC OC Cd Cd co o co LT) [-" o o o o Cd co !-1 [-" co o CQ- OC OC OC OC CQ OC CQ LT) o !-1 !-1 o o o o o o o o S OC OC OC o OC OC OC σ> CQ Cd Cd Cd st1 Cd Cd OC Cd !-1 OC CQ Cd OC Γ- Cd co Cd co NÍ1 !-1 st1 LT) U [-- o co o CQ CQ !-1 !-1 o Cd !-1 Cd NÍ1 co '.Ο CQ CQ CQ CQ !-1 [-- !-1 st1 Cd LT) LT) co Γ- Cd Cd b(Á) nÍ1 LT) <<0 OC Cd [-" [-" Cd LT) !-1 co co !-1 Cd LT) CQ [-" LT) CQ o LD !-1 NÍ1 !-1 LD !-1 OC CQ co Γ- o !-1 !-1 o co CQ !-1 !-1 !-1 !-1 !-1 !-1 CO Lf) co Lf) [~- CQ Cd a(Ã) Γ-CQ [-" !-1 co OC NÍ1 t— OC o OC t— o LT) o Cd CQ [-" [-- co Γ- Cd st1 co !-1 NÍ1 CQ U") !-1 OC CQ co LT) !-1 !-1 !-1 !-1 !-1 cd cd o LT) 1 cd cd cd cd cd +j -U -U -U -U -U -U 0 •rH ÍH t—1 1-1 !-1 !-1 1 1 o 1-1 1-1 Cd CQ 1 !-1 1 D £ s DC o E ω < s AN H4 u H 0 kA 0 ífd o c CQ (D (D (D (D (D (D CQ co co co co co co L) aa 1 cd cd cd cd cd cd 0 to TP CQ CQ CQ CQ CQ CQ 0 -U cd Λ u TS (D M-l Cd X! co 0 Cd Cd Cd Cd Cd Cd Cd Cd & a Qa Qa a Qa a Qa X ω a Ê X X X X X X X 0 L) ω ω ω ω ω ω ω 1 QUADRO 1 (continuação) Parâmetros celulares unitários
Composto Z ' Vm sg dcalc Exp 2 a 1 972 P21 1, 406 Exp 2b 1 728 P212121 1, 349 Exp 2c 1 756 P212121 1, 340 Exp 2d 1 737 P212121 1, 245 Exp 2e 1 735 P212121 1, 276 Exp 2f 2 663 P21 1,269 Exp 2g 1 730 P21 1,246 Exp 2h 1 791 P6122 1,292
As variáveis usadas no quadro 1 são definidas a uma temperatura inferior a: T = temperatura em graus centígrados para os dados cristalográficos (TA é a temperatura ambiente, que é de cerca de +22°C) V = volume de célula unitária Z' = número de moléculas de medicamento por unidade assimétrica
Vm = V(célula unitária) / (Z moléculas de medicamento por célula) sg = grupo espacial 2 dcalc = densidade calculada do cristal Quadro 2
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2a, Forma N-l, dibesilato Átomo X Y Z Átomo X Y Z SI 0,4296 0,3405 0,1278 H57 0,5146 0,6132 0,0473 02 0,3848 0,2640 0,1944 H58 0,4218 0,5168 0,2790 03 0,5075 0,2480 0,1097 H59 0,5591 0,9137 0,0886 04 0,3692 0,3687 0,0581 H60 0,5305 1,0179 0,2235 C5 0,4631 0,5514 0,1598 H61 0,4602 0,8229 0,3179 C6 0,5031 0,6610 0,1068 H62 -0,0921 0,0872 0,5134 C7 0,4500 0,6066 0,2360 H63 -0,0975 0,3507 0,7393 C8 0,5279 0,8279 0,1298 H64 -0,2621 0,3609 0,7274
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2a, Forma N-l, dibesilato Átomo X Y Z Átomo X Y Z C9 0,5113 0,8867 0,2054 H65 -0,2589 0,0940 0,5014 CIO 0,4744 0,7756 0,2590 H 6 6 -0,3412 0,2321 0,6040 Sll 0,0304 0,2103 0,6431 H67 0,2813 0,2966 0,2330 3 012 0,0580 0,0675 0,5918 H68 0,3163 0,2103 -0,0149 013 0,0507 0,1758 0,7265 H69 0,0931 0,1273 0,5084 014 0,0615 0,3788 0,6162 H70 0,0812 0,1334 -0,0296 Cl 5 -0,0863 0,2166 0,6296 H71 0,2494 0,4855 -0,0720 Cl 6 -0,1295 0,1458 0,5613 H72 0,2837 0,3700 -0,1556 Cl 7 -0,1335 0,2944 0,6877 H73 0,3692 0,2507 0,3208 Cl 8 -0,2249 0,3021 0,6795 H74 0,1718 0,1588 -0,1410 Cl 9 -0,2234 0,1541 0,5537 H75 0,1760 0,5937 0,0122 C20 -0,2690 0,2305 0,6124 H76 0,0713 0,5818 0,0518 N21 0,1351 0,3402 0,0394 H77 0,2388 0,1059 0,5751 N22 0,2122 0,3075 0,2421 H78 0,0144 0,2704 -0,1359 N23 0,2612 0,1387 -0,0417 H79 -0,0107 0,3948 -0,0519 N24 0,0979 0,2591 0,3211 H80 0,0877 0,3884 0,1993 025 0,1429 0,0840 0,1114 H81 0,1400 0,4103 -0,2251 N2 6 0,1222 0,1701 0,4545 H82 0, 1443 0,8789 -0,2785 027 0,2029 -0,1265 -0,0688 H83 0,1063 0,6705 -0,3097 N2 8 0,1897 0,6703 -0,2034 H84 0,0611 0,7736 -0,2276 C29 0,1114 0,2601 -0,0390 H85 0,3994 0,1229 0,5687 C30 0,2281 0,4006 -0,1212 H86 0,0212 0,5681 -0,1742 C31 0,3926 0,1870 0,4435 H87 0,0851 0,6247 -0,0863 4 C32 0,2482 0,2192 0,3790 Η88 -0,0003 0,2113 0,3972 C33 0, 1850 0,2609 0,3119 Η89 0,2528 0,5466 0,1402 C34 0,3395 0,2220 0,3762 Η90 0,1580 0,6514 0,1725 C35 0,1915 0,2339 -0,0878 Η91 0,3253 0,5947 -0,1972 C36 0,2131 0,1749 0,4516 Η92 0,3197 -0,2538 0,0275 C37 0,1374 0,5280 0,0550 Η93 0,3937 -0,0865 0,0040 C38 0,1447 0,2421 0,1065 Η94 0,3249 -0,0591 0,0839 C39 0,2678 0,1409 0,5195 Η95 0,3767 0,8481 -0,2754 C40 0, 0410 0,3593 -0,0898 Η96 0,2667 0,9209 -0,2913 C41 0,2593 -0,0327 -0,0318 Η97 0,3183 0,9202 -0,1940 C42 0,1523 0,3701 0,1769 Η98 0,3388 0,5477 -0,3381 C43 0,1572 0,4920 -0,1737 Η99 0,2541 0,4208 -0,3000 C44 0,1203 0,7566 -0,2584 Η100 0,2273 0,6084 -0,3576 C45 0,3559 0,1483 0,5161 Hl 01 0,2047 0,7544 -0,1523
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2a, Forma N-l, dibesilato Átomo X Y Z Átomo X Y Z C46 0,0730 0,5239 -0,1311 C47 0,0706 0,2135 0,3909 5 C48 0,1814 0,5399 0,1402 C49 0,2788 0,6660 -0,2381 C50 0,4909 0,1922 0,4387 C51 0,3294 -0,1139 0,0239 F52 0,5219 0,0514 0,4093 F53 0,5340 0,2113 0,5073 F54 0,5176 0,3178 0,3953 C55 0,3112 0,8512 -0,2507 C56 0,2765 0,5513 -0,3130
Quadro 3
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2b, Forma DC-1 Átomo X Y Z Átomo X Y Z 01 0,3874 0,5713 0,1042 H41 -0,1294 0,3465 0,2606 N2 0,6277 0,6481 0,1041 H42 -0,2461 0,1574 0,1324 C3 0,3731 0,6931 0,1987 H43 -0, 1481 0,1749 0,0586 04 0,3088 0,7902 0,1889 H44 0,1951 0,4379 0,0994 N5 0,5234 0,6709 0,1945 H45 0,2635 0,5336 0,1473 C6 0,0370 0,3707 0,1487 H46 0,4541 0,5194 0,2668 N7 0,9171 0,7535 0,0862 H47 0,4188 0,4033 0,2278 C8 0,5884 0,7673 0,1246 H48 0,5887 0,4873 0,1799 6 Ν9 0,2197 0,5147 0,1799 H49 0,6714 0,5483 0,2272 CIO 0,6819 0,8733 0,1041 H50 0,5969 0,8538 0,1868 Cll 0,0994 0,4380 0,1852 H51 0,8120 0,7421 0,2149 C12 0,5232 0,5593 0,0958 H52 0,8245 0,6564 0,1665 C13 0,0339 0,3042 0,0748 H53 0,4689 0,7873 0,1195 Cl 4 0,0966 0,3752 0,1068 H54 0,7443 0,6307 0,0952 NI 5 0,0413 0,4260 0,2242 H55 0,6606 0,8737 0,0699 Cl 6 -0,0879 0,2935 0,1577 H56 0,6450 0,9598 0,1181 NI 7 -0,1495 0,2843 0,1988 H57 0,9128 0,9427 0,1024 Cl 8 0,6213 0,7635 0,1729 H58 0,9994 0,8349 0,1664 Cl 9 0,2969 0,5749 0,2162 H59 0,8434 0,9363 0,1746 C20 0,8547 0,8596 0,1114 H60 1,1241 0,6556 0,0774 C21 -0,0807 0,3504 0,2284 H61 1,1465 0,8155 0,0889 C22 0,8829 0,8492 0,1601 H62 1,0949 0,7111 0,1303
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2b, Forma DC-1 Átomo X Y Z Átomo X Y Z C23 0,0961 0,3041 0,0303 H63 0,9541 0,8697 -0,0162 C24 0,7904 0,7443 0,1815 H64 0,9409 0,9581 0,0316 7 C25 -0,1519 0,2227 0,1243 H65 1,0997 0,8600 0,0230 C26 0,5854 0,4415 0,0762 H 6 6 0,9136 0,6679 -0,0189 C27 0,4325 0,5005 0,2333 H67 1,0529 0,6293 0, 0199 F28 0,2100 0,3820 0,0251 H68 0,8640 0,5745 0,0257 C29 0,5694 0,5442 0,2072 H69 0,7752 0,7851 0,0338 C30 0,8956 0,7650 0,0399 H70 0,7087 0,4513 0,0715 F31 -0,0040 0,3354 0,0005 H71 0,5635 0,3648 0,0972 C32 -0,0935 0,2269 0,0831 H72 0,5326 0,4265 0,0453 F33 0,1425 0,1946 0,0181 H73 0,2091 0,6032 0,2400 C34 1,0774 0,7297 0,0973 H75 -0,7132 -0,0216 0,1657 C35 0,9360 0,6480 0,0149 C36 0,9736 0,8757 0,0185 CL37 -0,6723 0,0636 0,0976 CL38 -0,6200 0,1776 0,1776 C39 -0,7292 0,0689 0,1511 CL4 0 -0,8261 0,1021 0,1984 CL41 -0,5719 0,1649 0,1533
Quadro 4
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2c, Forma TH00-1 8 Átomo X Y Z Átomo X Y Z NI 0,6241 0,6511 0,1036 H44 0,8469 0,6491 -0,0084 N2 0,5165 0,6586 0,1938 H45 1,0426 0,6769 -0,0009 N3 0,0409 0,4138 0,2209 H46 0,9420 0,5884 0,0369 N4 0,9119 0,7577 0,0893 H47 0,9710 0,8879 -0,0108 N5 0,2188 0,5080 0,1767 H48 0,9644 0,9636 0,0393 N 6 -0,1428 0,2821 0,1910 H49 1,1113 0,8600 0,0288 F7 0,2088 0,4068 0,0184 H50 1,1138 0,6612 0,0823 F8 0,1464 0,2269 0,0085 H51 1,1368 0,8124 0,0977 F 9 -0,0051 0,3616 -0,0061 H52 1,0715 0,7062 0,1357 010 0,3873 0,5694 0,1019 H53 0,8967 0,9395 0,1069 011 0,2971 0,7711 0,1928 H54 0,8364 0,9249 0,1799 C12 -0,0831 0,2960 0,1506 H55 0,9892 0,8264 0,1696 C13 0,0371 0,3738 0,1430 H56 0,6557 0,8698 0,0727 Cl 4 0,5812 0,7621 0,1256 H57 0,6337 0,9476 0,1221
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2c, Forma THOO-1 Átomo X Y Z Átomo X Y Z C15 0,0986 0,4345 0, 1815 H58 0,7936 0,7360 0,2193 9
Cl 6 -0,0886 0,2415 0,0746 H59 0,8150 0,6527 0,1711 C17 0,6739 0,8655 0,1071 H60 0,5860 0,8385 0,1901 Cl 8 0,0331 0,3225 0,0673 H61 0,4619 0,7796 0,1196 Cl 9 0,6111 0,7539 0,1748 H62 0,7430 0,6376 0,0952 C20 0,7789 0,7380 0,1846 H63 0,5034 0,3895 0,0665 C21 0,0953 0,3862 0,1014 H64 0,6466 0,4797 0,0433 C22 -0,1446 0,2303 0,1158 H65 0,6742 0,4155 0,0950 C23 0,8438 0,8556 0,1148 H66 0,5931 0,4838 0,1746 C24 0,3673 0,6754 0,2001 H67 0,6760 0,5373 0,2229 C25 -0,0810 0,3420 0,2233 H68 0,4199 0,3911 0,2235 C26 0,8681 0,8418 0,1645 H69 0,4543 0,4982 0,2644 C27 0,5709 0,5348 0,2038 H70 0,2110 0,5756 0,2404 C28 0,8975 0,7762 0,0422 H71 0,2578 0,5312 0,1447 C29 0,2923 0,5573 0,2150 H72 -0,1392 0,3344 0,2555 C30 0,4345 0,4867 0,2295 H73 0,1922 0,4468 0,0960 C31 0,0958 0,3306 0,0236 H74 -0,2394 0,1689 0,1216 C32 0,9346 0,6664 0,0161 H75 -0,1341 0,1904 0,0479 C33 0,9942 0,8828 0,0245 H76 0,7798 0,8064 0,0354 C34 1,0667 0,7324 0,1019 H77 -0,5859 0,2979 0,1468 C35 0,5239 0,5633 0,0937 H78 -0,6934 0,1865 0,0883 C36 0,5916 0,4548 0,0733 H79 -0,5532 0,0802 0,1023 037 -0,4684 0,1388 0,1701 H80 -0,7442 - 0,1228 10 0,0491 038 -0,4289 0,2122 0,2075 H81 -0,8828 0,0626 0,1139 039 -0,7214 0,1782 0,1852 H82 -0,7168 0,0010 0,1956 C40 -0,6079 0,2004 0,1513 H83 -0,8983 0,0662 0,1893 C41 -0,7805 0,0664 0,1760 H84 -0,3123 0,2450 0,2037 C42 -0,6561 0,1265 0,1151 C43 -0,7758 0,0381 0,1281
Quadro 5
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2d, Forma E-l Átomo X Y Z Átomo X Y Z NI 0,5556 0,6575 0,1971 H40 0,2903 0,5250 0,1486 N2 0,9580 0,7945 0,0952 H41 0,7902 0,6695 0,0980 N3 0,0504 0,4000 0,2167 H42 0,6121 0,8376 0,1960 N4 0,2466 0,4969 0,1788 H43 0,4802 0,7853 0,1289
Coordenadas atómicas paraExemplo 2d, Form E-l Átomo X Y z Átomo X Y z N5 0,6640 0,6706 0,1083 H44 -0,1345 0,3091 0,2471 06 0,4235 0,5727 0,1071 H45 0,2219 0,4518 0,0971 07 0,3141 0,7585 0,2020 H46 0,8518 0,7434 0,2205 C8 0,0563 0,3683 0,1425 H47 0,8769 0,6703 0,1722 11 C9 0,3945 0,6665 0,2051 H48 -0,2356 0,1657 0,1154 NI 0 -0,1464 0,2693 0,1855 H49 0,2468 0,5491 0,2421 Cll 0,1179 0,4244 0,1805 H50 -0,1137 0,1969 0,0471 C12 -0,0757 0,2900 0,1475 H51 0,9339 0,9678 0,1186 C13 0,5699 0,5796 0,0976 H52 0,6715 0,8931 0,0836 C14 0,6460 0,7574 0,1795 H53 0,6450 0,9623 0,1326 C15 0,6096 0,7741 0,1332 H54 0,5054 0,4773 0,2603 Cl 6 -0,0804 0,3256 0,2169 H55 0,4724 0,3825 0,2172 C17 0,1256 0,3867 0,1021 H56 0,8706 0,9373 0,1867 Cl 8 0,8278 0,7497 0,1874 H57 1,0434 0,8510 0,1741 Cl 9 -0,1350 0,2278 0,1118 H58 0,6429 0,4941 0,1737 C20 0,3307 0,5423 0,2161 H59 0,7309 0,5392 0,2214 C21 -0,0669 0,2438 0,0739 H60 0,5606 0,4154 0,0654 C22 0,8827 0,8818 0,1241 H61 0,6932 0,5215 0,0431 C23 0,6945 0,8866 0,1168 H62 0,7497 0,4462 0,0892 C24 0,4824 0,4737 0,2271 H63 1,1678 0,6903 0,0868 C25 0,0642 0,3239 0,0689 H64 1,2002 0,8299 0,1107 C26 0,9139 0,8598 0,1701 H65 1,1111 0,7125 0,1393 C27 0,6193 0,5376 0,2034 H66 0,8527 0,8919 0,0459 C28 0,1332 0,3426 0,0264 H67 0,9828 0,7726 -0,0103 C29 0,6490 0,4838 0,0720 H68 1,0893 0,6894 0,0276 F30 0,1426 0,2490 0,0048 H69 0,8751 0,6798 0,0245 12 F31 0,2603 0,4035 0,0246 H70 1,1045 0,9693 0,0155 C32 1,1203 0,7545 0,1087 H71 1,0868 1,0079 0,0687 C33 0,9653 0,8421 0,0525 H72 1,2197 0,8923 0,0534 C34 0,9802 0,7362 0,0215 H73 -0,3356 0,1901 0,1827 C35 1,1042 0,9365 0,0471 H74 -0,6100 0,2427 0,1853 F36 0,0282 0,4017 0,0020 H75 -0,5435 0,1919 0,1361 037 -0,4308 0,1231 0,1 R46 H76 -0,RI 01 0,1237 0,1519 C38 -0,5696 0,1669 0,1671 H77 -0,6709 0,0043 0,1485 C39 -0,7016 0,0870 0,1643 H78 -0,7374 0,0551 0,1977
Quadro 6
Coordenadas atómicas paraExemplo 2e, Form A-l Atomo X Y Z Atomo X Y z 01 0,3737 0,5677 0,1038 H34 -0,1640 0,1792 0,0657 N2 0,6127 0,6388 0,1027 Hl 6 0,1740 0,4180 0,1027 03 0,3132 0,7830 0,1897 H32 -0,2563 0,1746 0,1343 C4 0,5064 0,5520 0,0949 H24 -0,1168 0,3282 0,2594 N5 0,2190 0,5059 0,1814 H5 0,2557 0,5241 0,1532 C6 0,1016 0,4290 0,1870 H2 8A 0,4510 0,5073 0,2614 N7 0,9018 0,7409 0,0835 H28B 0,4099 0,3978 0,2297 N8 0,5246 0,6588 0,1932 H30A 0,5706 0,4800 0,1779 C9 0,3746 0,6827 0,1988 H30B 0,6614 0,5265 0,2179 13 NI 0 0,0495 0,4145 0,2272 Hl 5 0,2312 0,5873 0,2385 Cll 0,5829 0,7591 0,1239 Hl 7 0,5966 0,8294 0,1852 C12 0,0312 0,3644 0,1517 H2 0,7132 0,6191 0,0935 C13 -0,0936 0,2901 0,1617 H18A 0,6668 0,4348 0,0693 N14 -0,1492 0,2774 0,2023 H18B 0,5096 0,4227 0,0469 C15 0,3004 0,5650 0,2162 H18C 0,5363 0,3599 0,0916 Cl 6 0,0858 0,3691 0,1092 H22A 0,8097 0,7261 0,2084 C17 0,6197 0,7499 0,1719 H22B 0,8144 0,6500 0,1655 Cl 8 0,5600 0,4313 0,0739 Hl 1 0,4780 0,7781 0,1200 Cl 9 0,6747 0,8657 0,1038 H19A 0,6550 0,8673 0,0737 F20 0,1808 0,3831 0,0261 H19B 0,6472 0,9456 0,1161 C21 0,0143 0,3015 0,0775 H2 7A 0, 851 0,9136 0,1702 C22 0,7871 0,7290 0,1785 H27B 0,9840 0,8202 0,1605 C23 0,8454 0,8483 0,1091 H23 0,8972 0,9223 0,0991 C24 -0,0739 0,3401 0,2315 H33A 1,0920 0,6435 0,0741 F25 0,1345 0,1856 0,0238 H33B 1,0747 0,6924 0,1211 C26 0,0743 0,2971 0,0335 H33C 1,1211 0,7863 0,0846 C27 0,8780 0,8348 0,1570 H31 0,7694 0,7749 0,0364 C28 0,4326 0,4864 0,2320 H37A 0,9230 0,8700 -0,0130 F29 -0,0287 0,3175 0,0040 H37B 1,0541 0,8649 0,0205 C30 0,5653 0,5283 0,2038 H37C 0,9089 0,9442 0,0302 C31 0,8750 0,7554 0,0374 H36A 0,8874 0,6527 -0,0172 14 C32 -0,1674 0,2229 0,12R0 H36B 0,8419 0,5709 0,0225 C33 1,0612 0,7135 0,0915 H36C 1,0100 0,6124 0,0161 C34 -0,1156 0,2277 0,0877 H4 0A -0,7132 0,1528 0,2120 C35 -0,6607 0,1145 0,1509 H40B -0,7533 0,0132 0,1994 C36 0,9067 0,6372 0,0125 H40C -0,8560 0, 1249 0,1840 C37 0,9468 0,8688 0,0169 H38A -0,7948 0, 0004 0,1242
Coordenadas atómicas paraExemplo 2e, Form A-l Átomo X Y Z Átomo X Y Z C38 -0,7123 0,0511 0,1141 H38B -0,6331 -0,0032 0,1041 039 -0,5629 0,1869 0,1523 H38C -0,7461 0,1041 0,0912 C40 -0,7542 0,0996 0,1900
Quadro 7
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2f, Forma N-2 At orno X Y z At orno X Y z Cl -0,1614 0,2577 0,0383 F7 0,6225 0,2634 0,5011 C2 0,0133 0,3873 0,0895 F8 0,7150 0,2806 0,6609 C3 -0,0055 0,3310 -0,0010 F9 0,5345 0,2749 0,6173 C4 -0,0893 0,3603 -0,1048 F10 0,6186 0,2737 0,7242 C5 -0,0096 0,1977 -0,0307 Fll 0,7090 0,2767 0,6039 C6 0,1226 0,1850 -0,0004 F12 0,5230 0,2690 0,5624 15
Cl -0,0693 0,1244 -0,0205 Hl OA -0,0413 0,1190 0,1459 C8 0,1708 0,1498 0, 1106 Hl OB -0,0615 0, 0409 0,0911 C9 0,1075 0,0771 0,1147 Hll 0,0996 0,2283 0,1837 CIO -0,0234 0,0881 0,0905 H12 0,3217 -0,0767 0,3481 Cll 0,2617 0,0045 0,2339 H13A 0,1891 -0,0144 0,4538 C12 0,2925 -0,0262 0,3476 H13B 0,1378 -0,0726 0,3618 C13 0,1771 -0,0254 0,3775 H14A 0,0237 0, 0225 0,2848 C14 0,1062 0,0350 0,3075 H14B 0,1156 0, 0818 0,3457 C15 0,2367 0,2052 0,2942 H16A 0,1608 0,2374 0,4116 Cl 6 0,2078 0,2604 0,3702 H16B 0,1652 0,3007 0,3293 C17 0,5499 -0,0989 0,6085 H16C 0,2789 0,2786 0,4183 Cl 8 0,4630 -0,0041 0,5011 H17 0,5477 -0,1488 0,6244 C 19 0,5492 0,0453 0,5666 H1A -0,1774 0,3007 0,0757 C20 0,6362 0,0119 0,6505 H1B -0,1761 0,2143 0,0756 C21 0,5475 0,1213 0,5540 H1C -0,2111 0,2575 -0,0344 C22 0,7226 0,0568 0,7150 H21 0,4899 0,1433 0,4990 C23 0,7201 0,1309 0,7026 H22 0,7832 0,0354 0,7676 C24 0,6306 0,1640 0,6225 H23 0,7779 0,1599 0,7473 C25 0,6233 0,2457 0,6114 H2 6A 0,3405 0, 0047 -0,3327 C26 0,3178 0,0508 -0,3076 H26B 0,3247 0,0893 -0,3570 C27 0,3677 0,1429 -0,1554 H26C 0,2382 0,0477 -0,3035 C28 0,2847 -0,0135 -0,1112 H27A 0,2885 0,1420 -0,1496 16 C29 0,3985 0,0680 -0,1941 Η27Β 0,3753 0,1801 -0,2063 C30 0,4839 -0,0499 -0,1192 H27C 0,4198 0,1537 -0,0857
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2f, Forma N-2 Átomo X Y Z Átomo X Y Z C31 0,4689 -0,1207 -0,0596 H2 8A 0,2347 0,0287 -0,1160 C32 0,6120 -0,0241 -0,0769 H28B 0,2875 -0,0400 -0,0457 C33 0,6492 -0,0164 0,0464 H28C 0,2545 -0,0451 -0,1725 C34 0,6335 -0,0892 0,1001 H29 0,4782 0,0723 -0,2025 C35 0,5063 -0,1148 0,0626 H2A -0,0589 0,3951 0,1087 C36 0,6313 0,0922 0,1569 H2B 0,0389 0,4330 0,0656 C37 0,5494 0,1489 0,1804 H2C 0,0717 0,3696 0,1516 C38 0,7946 -0,0826 0,2650 H3 0,0704 0,3241 -0,0167 C39 0,6078 -0,0715 0,2941 H30 0,4704 -0,0619 -0,1962 C40 0,6937 -0,0843 0,4027 H31A 0,3871 -0,1351 -0,0819 C41 0,8124 -0,0650 0,3838 H31B 0,5139 -0,1595 -0,0817 C42 0,8969 0,0402 0,4994 H32A 0,6629 -0,0594 -0,0989 C43 0,9918 0,0223 0,6769 H32B 0,6212 0,0230 -0,1096 C44 0,9164 0,1178 0,5156 H33 0,7326 -0,0036 0,0683 C45 1,0010 0,2152 0,6420 H34 0,6810 -0,1261 0,0750 C46 0,9795 0,1403 0,6212 H35A 0,4983 -0,1624 0,0944 C47 0,9601 0,2664 0,5640 H35B 0,4564 -0,0799 0,0866 17 C48 0,8959 0,2447 0,4599 H37A 0,5607 0,1528 0,2573 C49 0,8756 0,1715 0,4360 H37B 0,4700 0,1346 0,1467 C50 0,8489 0,3015 0,3761 H37C 0,5650 0,1957 0,1521 NI 1,0171 0,0906 0,7037 H39A 0,5425 -0,1055 0,2823 N2 0,6368 -0,0622 0,6704 H39B 0,5781 -0,0214 0,2880 N3 0,9331 -0,0075 0,5810 H40A 0,6920 -0,1353 0,4251 N4 0,4627 -0,0749 0,5246 H40B 0,6765 -0,0527 0,4577 N5 0,8420 0,0126 0,4015 H41 0,8743 -0,0960 0,4288 N6 0,6777 -0,0849 0,2178 H43 1,0183 -0,0115 0,7327 N7 0,5849 0,0426 0,0803 H45 1,0440 0,2303 0,7105 N8 0,4025 0,0106 -0, 1105 H47 0,9746 0,3161 0,5795 N9 0,3818 0,0211 0,4149 H49 0,8344 0,1575 0,3664 NI 0 0,1561 0,0378 0,2158 H4A -0,1020 0,3231 -0,1600 NI 1 0,1599 0,2000 0,1967 H4B -0,0560 0,4033 -0,1288 N12 -0,0389 0,2585 0,0355 H4C -0,1627 0,373 -0,0908 01 0,8718 -0,0902 0,2185 H5 0,8235 0,0422 0,3470 02 0,7359 0,0910 0,2072 H5A -0,0340 0,2128 -0,1069 03 0,3220 0,0019 0,169R H6A 0,1414 0,1536 -0,0548 04 0,3257 0, 167 0,3217 H6B 0,1615 0,2319 -0,0017 F1 0,7539 0,2815 0,3030 H7 0,5113 0,0460 0,0488 Quadro 8
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2f, Forma N-2 18 Átomo X Y Z Átomo X Y Z F2 0,9209 0,3190 0,3146 H7A -0,1528 0,1327 -0,0337 F3 0,8233 0,3648 0,4151 H7B -0,0576 0,0910 -0,0759 F4 0,8500 0,2791 0,2840 H8 0,2540 0,1393 0,1202 F5 0,9132 0,3571 0,3931 H9 0,3825 0,0671 0,3986 F6 0,7377 0,3127 0,3710 H9A 0,1212 0,0462 0,0565
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2g, Forma AN-3 Átomo X Y Z Átomo X Y Z NI 0,3835 0,0757 0,0375 H21 -0,1570 0,4019 0,0806 N2 0,7286 -0,0185 0,1260 H6 0,2566 0,2184 0,1457 N3 0,2667 0,0953 -0,1106 Hl 5 -0,1768 0,3372 -0,0677 04 0,4406 0,1041 0,2348 H2 0 0,1322 0,1240 -0,2309 C6 0,1693 0,2426 0,1013 Hl 0,3709 0,0824 0,1036 N7 0,6875 0,0647 0,3206 Hl 7 0,4819 -0,0292 -0,0463 C8 0,0362 0,2388 -0,0548 H2 8A 0,7603 0,0328 -0,0600 09 0,5030 -0,1317 0,1098 H28B 0,6637 0,1325 -0,0383 CIO 0,5797 -0,0561 0,0855 H24A 0,7555 0,1274 0,1175 NI 1 0,9744 0,0244 0,4480 H24B 0,9167 0,0696 0,0774 C12 0,0569 0,3162 0,1260 Hl 9 0,8001 -0,1313 0,2000 C5 0,1605 0,2026 0,0109 H22A 1,0680 -0,0427 0,1790 C13 0,2745 0,1240 -0,0211 H22B 1,0006 0,0401 0,2458 19 NI 4 0,0255 0,2060 -0,1450 H2 9A 1,0737 -0,1556 0,3001 C15 -0,0858 0,3132 -0,0252 H2 9B 1,1889 -0,0637 0,3299 Cl 6 0,5624 0,1278 0,2890 H27 1,0060 -0,1224 0,4487 C17 0,5237 0,0103 0,0054 H23A 0,6964 -0,0882 0,4334 Cl 8 1,1544 0,0668 0,4534 H23B 0,7596 -0,1700 0,3643 Cl 9 0,8045 -0,0612 0,2107 H25 0,5708 -0,0620 0,2829 C20 0,1422 0,1402 -0,1658 H7 0,7807 0,0874 0,3623 C21 -0,0752 0,3517 0,0617 H34A 0,6865 0,2365 0,3642 C22 0,9970 -0,0294 0,2320 H34B 0,4795 0,2484 0,35R1 C23 0,7649 -0,1008 0,3793 H34C 0,5937 0,2759 0,2722 C24 0,7898 0,0709 0,0816 H36A 0,7774 -0,0065 0,5345 C25 0,6909 -0,0417 0,2964 H36B 0,8886 0,0871 0,5638 C26 0,6097 0,2153 0,6473 H36C 0,9671 -0,0190 0,5809 C27 0,9604 -0,0758 0,4035 Hl 8 1,1968 0,0630 0,3910 C28 0,6935 0,0679 -0,0147 H35A 1,4009 0,0440 0,5102
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2g, Forma AN-3 Átomo X Y Z Átomo X Y z C29 1,0708 -0,0864 0,3149 H35B 1,3030 -0,0555 0,4859 F30 0,1149 0,3018 0,2839 H35C 1,2530 0,0042 0,5751 C31 1,1447 0,1747 0,4843 H31A 1,2617 0,2028 0,4883 20 C32 0,06R1 0,3603 0,2194 H31B 1,0911 0,1790 0,5441 F33 -0,0775 0,3987 0,2482 H31C 1,0736 0,2106 0,4391 C34 0,5R29 0,2314 0,3240 H37A 0,5614 0,1191 0,7457 C35 1,2896 0,0095 0,5118 H37B 0,5364 0,2293 0,7767 C36 0,8948 0,0210 0,5396 H37C 0,7279 0,1858 0,7670 C37 0,6085 0,1849 0,7418 N38 0,6123 0,2421 0,5722 F39 0,1781 0,4283 0,2274
Quadro 9
Coordenadas atómicas para o Exemplo 2h, Forma H4-1, HC1 Átomo X Y Z Átomo X Y Z NI -0,1488 0,2098 -0,0343 H42 0,3077 0,3275 0,1257 02 0,3490 0,4972 0,0272 H43 0,1538 0,2201 0,0743 N3 0,2326 0,3477 0,0060 H44 0,5279 0,4347 0,1149 N4 0,2975 0,2676 0,0466 H45 0,7124 0,4674 0,0613 N5 0,0807 0,4627 0,0181 H46 0,4192 0,2973 0,0255 N6 0,5197 0,3793 0,0531 H47 0,2578 0,0900 0,0153 F7 -0,0010 0,2280 0,0989 H4 8 0,1288 0,1011 0,0254 08 0,1939 0,6851 0,0181 H49 0,0936 0,1554 -0,0028 C9 0,2189 0,4432 -0,0048 H50 0,2571 0,2098 -0,0092 CIO 0,3038 0,38R1 0,0205 H51 0,3036 0,5397 -0,0022 NI 1 0,5990 0,4425 0,0823 H52 0,2392 0,5114 -0,0309 21 C12 0,0927 0,4487 -0,0003 H53 0,2974 0,4009 -0,0274 C13 -0,0342 0,3317 -0,0074 H54 0,0792 0,2199 -0,0265 C14 0,3955 0,3262 0,0584 H55 0,1025 0,3114 -0,0456 C15 0,4700 0,3861 0,0880 H56 -0,0076 0,4161 -0,0330 Cl 6 0,3630 0,3248 0,0764 H57 -0,0551 0,2416 -0,0013 C17 0,1395 0,5810 0,0261 H58 -0,1201 0,3469 -0,0044 Cl 8 0,3194 0,2774 0,0280 H59 0,0964 0,5331 -0,0071 Cl 9 -0,1511 0,2151 -0,0542 H60 0,1837 0,6722 0,0512 C20 0,1983 0,2123 0,0011 H61 0,0338 0,5217 0,0502 C21 0,0952 0,3112 -0,0319 H62 0,1844 0,5224 0,0503 C22 -0,0230 0,3271 -0,0270 H63 -0,2772 0,1614 -0,0127
Coordenadas atómicas para Exemplo 2h, Form H4-1, HC1 Átomo X Y z Átomo X Y z C23 0,2130 0,2691 0,1003 H64 -0,2760 0,2805 -0,0267 C24 0,2222 0,4228 -0,0243 H65 -0,3579 0,1133 -0,0329 C25 0,2358 0,2673 0,0829 H66 -0,0504 0,2577 -0,0592 C26 0,4468 0,3881 0,1058 H67 -0,1794 0,3278 -0,0737 C27 0,3218 0,3305 0,1117 H68 -0,3053 0,2578 -0,0581 C28 0,1344 0,5769 0,0455 H69 -0,1526 0,3966 -0,0528 C29 -0,2730 0,1906 -0,0263 H70 -0,2410 0,0701 -0,0746 F30 0,0717 0,2300 0,1235 H71 -0,1946 0,0132 -0,0562 22 C31 0,2191 0,1567 0,0180 H72 -0,3347 0,0316 -0,0554 C32 0,6135 0,4326 0,0655 H73 -0,1530 0,1183 -0,0305 F33 0,0240 0,0760 0,1070 H74 0,0220 0,3750 0,0260 C34 0,0782 0,2012 0,1072 H75 0,1982 0,2109 0,0512 C35 -0,2346 0,0735 -0,0609 H76 0,2980 0,8016 0,0030 C36 -0,1999 0,3066 -0,0603 H77 0,4177 0,8365 -0,0131 CL37 0,0168 0,2311 0,0469 H78 -0,2680 0,2326 0,0385 038 -0,1364 0,0296 0,0183 H79 -0,2444 0,1328 0,0235 039 0,3598 0,8724 -0,0063 H80 -0,2485 0,2185 0,0683 040 -0,2980 0,1857 0,0261 H81 -0,1126 0,2683 0,0544 041 -0,1879 0,2915 0,0585 H82 -0,0947 0,0714 0,0059 H83 -0,0825 0,1005 0,0284
Posições características dos picos de difracção de raios X no pó (graus 2Θ±0,1)@ TA para os Exemplos 2a, b, d, e, f, g e h, com base num elevado padrão de qualidade recolhidos com um difractómetro (CuKa) com um capilar rotativo com 2Θ calibrado com outro padrão NIST adequado. QUADRO 10
Exp 2 a Exp 2b Exp 2d Exp 2e Exp 2f Exp 2g Exp 2h 8,1 10, 0 5,5 10, 1 7,2 6,3 6, 9 11,7 11,4 9, 6 11,3 8,7 9, 0 8,7 23 13, 0 11, 9 11,4 11, 9 9,7 11,7 9,8 13, 9 14,3 14,5 13, 3 12,5 15, 0 10,3 16, 6 15, 6 15, 8 14,2 12,8 17, 6 11, 8 17, 0 16, 5 16, 6 15, 6 13,3 18, 6 13, 5 17, 6 19, 1 18,4 16, 8 16, 0 19, 7 15, 0 21, 1 19, 4 19,2 19, 0 16, 6 20,7 18,8 23,2 20,2 20,0 19,5 18,2 21,4 21,4 23, 9 21,2 23, 6 20,4 18,8 23, 8 22,9
CARACTERÍSTICAS FARMACOLÓGICAS COMPARATIVAS
Análises e dados comparando as características farmacológicas do Exemplo 1 e os compostos encontrados em W02005021500 (correspondendo à patente norte-americana n.° 7,163,937 atribuída ao presente Requerente) são apresentados em baixo.
Ligação às células mononucleares de sangue periférico humano ("Ligação do CCR2")
Consultar também: Yoshimura et al, J. Immunol. 1990, 145, 292. A análise da ligação do CCR2 humano foi estabelecida com células mononucleares de sangue periférico humano (hPBMCs) utilizando MCP-1 humana marcada com 125I como ligando do marcador. As hPBMCs foram isoladas a partir 24 de leukopak humano (Biological Specialty Inc.) utilizando um protocolo padrão com Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro). As hPBMCs isoladas foram lavadas e diluídas para 1 x 107/ml em tampão de ligação (RPMI-1640, 0,1 %BSA, 20 mM Hepes, pH 7,4) . 125I-MCP-1 (NEN/Perk Elmer) foi diluída para 0,45 nM em tampão de ligação. O composto foi diluído em tampão de ligação no triplo das concentrações finais usadas na análise de ligação. A análise de ligação foi realizada utilizando uma placa de filtro de 96 poços (Millipore). A ligação total da 125I-MCP-1 foi avaliada da seguinte forma: a cada reacção de um volume total de 150 μΐ foram adicionados 5xl05 células, 0,15 nM 125I-MCP-1 e composto, de modo que a concentração final variasse entre 0 e 100 nM. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutes seguido de três lavagens com RPMI-1640, 0,1% de BSA, 0,4 M de NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,4 utilizando um tubo de distribuição de filtração sob vácuo (Millipore). Após a lavagem, a placa foi seca ao ar durante 60 minutos à temperatura ambiente. A isto seguiu-se a adição de 25 μΐ de Microscint 20 a cada poço. A placa foi selada e submetida a contagem no Trilux durante 1 minuto. A ligação não específica foi determinada na presença de MCP-1 fria a 300 nM (PeproTech Inc.). A 125I-MCP-1 específica foi calculada a partir da diferença entre a ligação total e a não específica. Todas as condições foram testadas em duplicado. A CI50 é definida como a concentração de composto concorrente necessário para reduzir a ligação específica em 50%.
Fluxo de hERG 25 Células HEK293 a expressar de forma estável canais hERG foram cultivadas (37 °C, 5% C02) em meio Eagle de Dulbecco modificado, suplementado com 10% de soro fetal de bovino Sigma aminoácidos não essenciais, 2mM de L-glutamina e 500 (ig/ml G418, em incubadora. Foi utilizado tampão de dissocição celular para extrair as células dos frascos, os quais foram depois plateados em placas negras/transparentes revestidas com poli-D-lisina Corning de 384 poços a uma densidade de 2 x 104 células por poço (20 μΐ) em meio 10% soro e foram incubadas durante 15-24 horas a 37 °C numa incubadora 5% C02 até se obter uma monocamada confluente de células.
Foi preparada uma solução-padrão de 2 mM de corante BTC-AM (Molecular Probes, Eugene, OR) em 100% DMSO e depois foi adicionado 1:1 a 10% (p/v) de ácido plurónico em DMSO no dia da análise. O corante foi então diluído em tampão EP externo de hERG (140 mM NaCl, 4,0 mM KC1, 1,8 mM CaC12,l,0 mM MgC12) , 10 mM HEPES, pH 7,3 e 10 mM glucose; todos os componentes do tampão foram obtidos na Sigma Chemical) . Esta mistura de corante BTC (30 μΐ) foi adicionada às células e produziu uma concentração de carga final de 2,5 μΜ. As células foram incubadas a 21 °C durante 45 minutos.
Os compostos de teste foram diluídos para 10 mM DMSO em 60 μΐ. Estes compostos foram então diluídos em série numa proporção de 1:2 em DMSO nas colunas 1-10 e 11-20 de uma placa de 384 poços. As placas preparadas na análise foram geradas selando 2,5 μΐ da placa de DMSO diluída em série, que foi preparada no Velocity 11 BioCel. Placas aquosas foram criadas adicionando 48 μΐ de tampão EP e, em seguida, foram diluídas 30 - 45 minutos antes da leitura da análise no FLIPR. Após o carregamento do corante, compostos 26 diluídos em solução aquosa foram adicionados às células das placas de três réplicas (10 μΐ) produzindo a intervalo de concentração de dez pontos, entre 80 μΜ e 0,156 nM. A concentração final de DMSO na análise foi de 1%. Placas de solução aquosa prontas para análise foram preparadas e diluídas num processador de líquidos Cybio.
As células carregadas com corante foram submetidas a leitura no FLIPR384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), que excita o corante utilizando a linha de 488 nm de um laser de árgon. A emissão foi filtrada utilizando a filtro passa-banda de 540 ± 30 nm. A abertura dos canais hERG é estimulada por adição de 20 μΐ de tampão EP/poço, contendo 66 mM K2S04 e 1,3 mM ThS04 (Sigma/Aldrich) . Para cada placa, foram recolhidos dados a cada segundo durante um período de 12 segundos, altura em que o tampão de estimulação contendo TI+ foi adicionado. A recolha de dados prosseguiu a cada segundo durante 48 segundos e, em seguida, continuou a cada três segundos por um período adicional de 2 minutos. 0 intervalo dinâmico da análise foi determinado a partir dos poços brancos e totais . Os poços totais (colunas 21 e 22) definem activação hERG máxima para a placa (sem composto de ensaio presente) e os poços brancos (colunas 23 e 24) definem 100% de inibição hERG. Os poços brancos contêm 400 nM de um dos inibidores padrão de hERG, dofetilide (Ficker et al., 1998) ou E-4031. Os pontos de dados em bruto em cada poço de amostra foram primeiro corrigidos para a variação célula/sinal, antecedentes de controlo negativo (brancos) e normalizados para os controlos positivos (totais) utilizando o software FLIPR online. As curvas de resposta da concentração do composto em teste para os dados do fluxo de TI+ de hERG foram então ajustados utilizando o Excel Fit (ID Business Solutions 27
Limited, Surrey, UK) com uma equação logística de local simples, Y= A + ( (B-A)/1 + ( (C/X) AD) ) ) em que A= inibição máxima. Os dados foram analisados ajustando as amplitudes máximas de variação em fluorescência para o fluxo de TI+ para uma dada condição do composto em teste. As potências (valores da CI50) dos compostos foram calculadas a partir da média dos poços em triplicado.
Canal de sódio, análise de ligação do local 2
Consultar também: W. A. Catterall, et al. J. Biol. Chem. 1981, 256, 8922. 0 tampão de ligação padrão continha HEPES 50 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, Cloreto de colina 130 mM, KC1 5,4 mM, MgCl2 0,8 mM, glucose 5,5 mM, LqT 40 pg/mL. As reacções de ligação foram iniciadas adicionando sinaptossomas (preparados a partir de cérebro de rato Wistar) a uma mistura de reacção contendo 5 nM [ 3H ] — Batracotoxina num tampão de ligação padrão e o composto a testar na concentração desejada. As amostras foram em seguida misturadas e incubadas a 37 °C durante 60 minutos. As reacções foram interrompidas adicionando tampão de lavagem congelado contendo HEPES 50 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 0,8mM e albumina de soro bovino a 1 mg/mL. Os sinaptossomas foram recolhidos imediatamente para filtros de fibra de vidro e lavados 3 vezes com tampões de lavagem. A radioactividade da [3H]-Batracotoxina remanescente nos filtros foi submetida a contagem utilizando espectrómetros de cintilação líquida. 28
Análise da permeabilidade membranária artificial paralela (PAMPA) A Análise da permeabilidade membranária artificial paralela (PAMPA) consiste numa combinação de lipidos à base de lecitina formulada especialmente, referida como lipido do tracto gastrointestinal (GIT). 0 lipido GIT é usado para formar uma membrana num conjunto de placa em sandwich semelhante ao que é utilizado nas análises Caco-2. 0 lipido GIT assemelha-se de perto à composição in vivo da membrana e apresenta um desempenho idêntico ao que é medido por compostos padrão que são conhecidos por serem absorvidos passivamente em seres humanos. 0 PAMPA é amplamente utilizado como um modelo in vitro para a o rastreio da permeabilidade de compostos descobertos. A velocidade de passagem dos compostos através da membrana PAMPA é utilizada para determinar um coeficiente de permeabilidade (Pc), que pode ser relacionado com a permeabilidade passiva do composto in vivo. 0 coeficiente de permeabilidade (Pc) de um composto em particular é examinado numa configuração dependente do pH, com um pH apical e basolateral de 7,4. Todas as experiências são conduzidas com determinações em triplicado.
Os compostos (soluções-padrão 10 mM em 100% DMSO) foram diluídos 1:100 em tampão do poço dador pH 7,4 (pION CAT # 110151), para se obter a solução de ensaio de 100 μΜ em 1% DMSO. O composto diluído no tampão do poço dador foi transferido para uma placa Whatman Unifilter e filtrado antes da dispensação de 200 μΐ para a placa de análise do poço dador (pION CAT #110163). A membrana PAMPA foi formada pipetando 4 μΐ da solução de lipido (pION CAT #110169) para 29 a placa de filtragem (VWR CAT #13503) . A membrana foi então coberta com 200 μΐ de tampão do poço aceitador a um pH de 7,4 (pION CAT #110139). A placa de análise PAMPA (lado do dador e lado do aceitador) foi combinada deixada a incubar à temperatura ambiente durante 4 horas. A placa foi então desmontada e as placas espectrofotométricas (VWR CAT #655801) foram preenchidas (150 μΐ/poço). As placas de dador, aceitador, referência e branco foram submetidas a leitura no leitor de placas SpectraMax UV. Os dados foram recolhidos pelo software pION, que analisa os espectros e produz valores de Pc.
Quimiotaxia do CCR2 A análise da quimiotaxia do CCR2 humano foi conduzida com a linhagem celular monocitica humana, THP-1. As células THP-1 foram primeiro marcadas com corante fluorescente Calceína-AM em fenol livre de vermelho, RPMI-1640 livre de BSA (pH 7,4) a 37 °C durante 30 minutos com mistura suave a cada 15 minutos. As células marcadas foram depois lavadas e ressuspensas lxl05/ml em tampão de quimiotaxia (isento de vermelho de fenol RPMI-1640, 0,1% BSA, pH 7.4). O composto em teste foi diluído em tampão de quimiotaxia de modo que a concentração final para análise variasse entre 0,01 nM e 1 μΜ. O ligando de MCP-1 (PeproTech Inc.) foi diluído até 20 nM em tampão de quimiotaxia. Para realizar a análise, um volume igual de diluições do composto em teste foi misturado com um volume igual de células THP-1 marcadas (Mistura 1) e um volume igual de diluições do composto em teste foi misturado com um volume igual de ligando de MCP-1 diluído (Mistura 2) . Ambas as misturas foram incubadas independentemente a 37 °C durante 10 minutos, seguidos de mistura suave. A quimiotaxia induzida pela MCP-1 foi então 30 medida numa placa de quimiotaxia (Becton Dickinson) colocando 50 μΐ de Mistura 1 na câmara superior e 225 μΐ de Mistura 2 na câmara inferior. A placa foi coberta com uma tampa e incubada a 37°C durante 30 minutos. 30 minutos mais tarde, a placa submetida a leitura num Cytofluor. Todas as condições foram testadas em duplicado. Para determinação da proporção sinal-ruído, 50 μΐ de células THP-1 marcadas individuais (5xl04/poço) foram colocadas na câmara superior e 225 μΐ de MCP-1 do ligando individual foram colocados na câmara inferior (concentração final de 10 nM) . A inibição obtida por concentrações graduadas do composto em teste foi calculada sob a forma de uma percentagem do controlo de MCP-1 livre de composto. A CI50 é definida como a concentração do composto em teste necessária para atingir uma inibição de 50% da quimiotaxia celular.
Técnica de Patch Clamp hERG A técnica de patch-clamp da célula total foi usada para medir directamente as correntes do hERG em células HEK-293, expressando de forma estável a subunidade α do canal de potássio hERG clonada. 0 composto foi testado num tampão aquoso com pH 7,4 à temperatura ambiente. Impulsos de teste repetidos (0,05 Hz) foram aplicados a partir de um potencial de -80 mV a +20 mV durante 2 segundos e correntes de saída foram desencadeadas após os impulsos de teste por escalonamento da voltagem até -65 mV. Os efeitos do composto foram calculados medindo a inibição do pico de corrente de saída Técnica de Patch Clamp do canal de sódio A técnica de patch-clamp da célula total foi usada para medir directamente as correntes de entrada de sódio em 31 células HEK-293, expressando o canal de sódio cardíaco humano, SCN5A. 0 composto foi testado num tampão aquoso isento de proteína. Para determinação da inibição do estado de equilíbrio, foram desencadeadas correntes de sódio a cada 5 segundos utilizando o seguinte protocolo de voltagem: as células foram mantidas a um potencial de -90 mV e escalonadas para -20 mV durante 60 ms. Os efeitos foram calculados medindo a inibição da corrente de pico durante o impulso de teste a -20 mV. A dependência da inibição em relação à velocidade foi avaliada por estimulação a frequências de 1 Hz e 4 Hz.
Farmacocinética da dose única em ratos
Ratos Sprague-Dawley do sexo masculino (250-300 g) foram usados nos estudos farmacocinéticos. Os ratos foram mantidos em jejum de um dia para o outro antes da administração por via oral e alimentados 4 h após a administração. Foram colhidas amostras de sangue (—0,3 mL) a partir da veia jugular para tubos contendo K2EDTA que foram, em seguida, centrifugadas a 4°C (1500-2000xg) para obter plasma. Num estudo de biodisponibilidade oral, 2 grupos de animais (N=2-3 por grupo) receberam o composto em teste por meio de uma perfusão intravenosa (IV) (durante 10 min) através da veia jugular ou por sonda oral. Foram colhidas amostras seriadas de sangue às 0,17 (apenas para IV), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após a administração. Amostras de plasma, obtidas por centrifugação a 4°C (1500-2000xg), foram armazenadas a - 20°C até à análise por CL/EM/MS. 32
Farmacocinética da dose única em macacos
Os parâmetros farmacocinéticos dos vários compostos em teste foram avaliados em macacos Cynomolgus do sexo masculino num desenho cruzado. Os macacos foram mantidos em jejum de um dia para o outro antes da administração por via oral e alimentados 4 h após a administração. Um grupo de 1-3 animais (3 a 5 kg) recebeu o composto por perfusão IV (durante 10 min) através de uma veia femoral e por sonda oral, com um período de 1 semana de abstinência entre tratamentos. Foram colhidas amostras seriadas de sangue (~0,3 mL) a partir de uma veia femoral às 0,17 (IV apenas), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após a administração e centrifugadas a 4°C (1500-2000xg) para obter plasma. As amostras foram armazenadas a -20°C até à análise por CL/EM/MS.
Análise dos dados dos ensaios farmacocinéticos
Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos por análise não compartimentai da concentração plasmática vs. dados do tempo (software KINETICA™, Versão 4,2, InnaPhase Corporation, Philadelphia, PA) . A concentração máxima (Cmáx) e o tempo até à Cmáx foram registados directamente a partir das observações experimentais. A área sob a curva desde a hora zero até à última hora de colheita de amostras (AUC(O-T)) foi calculada utilizando uma combinação de somas lineares e trapezoidais logarítmicas. A depuração plasmática total (CLTp), volume de distribuição no estado de equilíbrio (Vss), semi-vida de eliminação aparente (Tl/2) e o tempo médio de residência (MRT) foram estimados após a administração por via IV. As estimativas de Tl/2 foram realizadas utilizando um mínimo de 3 pontos temporais com concentrações quantificáveis. A biodisponibilidade oral 33 absoluta (F) foi estimada em função da proporção dos valores da AUC normalizada para a dose, após as administrações por via oral e IV.
Quadro 11. Dados comparativos in vitro
Composto CCR2 Binding IC50 (nM) hERG FLUX IC5 0 (nM) Ligação do canal de Na+ (% de inibição) Permeabilida de PAMPA (nm/seg) Exemplo 12as, W0200502150 0 0.27 (1) 2,800 Não disponível Não disponível Exemplo 12a j W0200502150 0 0.43 ± 0.06 (2) 770 Não disponível Não disponível Exemplo 2k W0200502150 0 0.88 ± 0.60 (23) 51,000 97%, 10,000 nM 529 ± 157 (9) Exemplo 12bd W0200502150 0 1.15 ± 0.07 (2) >80,000 54%, 10,000 nM 392
Encontrará em baixo os dados relativo a cada composto, medidos nas análises descritas anteriormente. 34
Composto CCR2 Binding IC50 (nM) hERG FLUX IC50 (nM) Ligação do canal de Na+ (% de inibição) Permeabilida de PAMPA (nm/seg) Exemplo 8a W0200502150 0 1,83 ± 0.80 (12) >80,000 3%, 10,000 nM 33%, 30,000 nM 94 ± 58 (10) Exemplo 8e, W0200502150 0 2.20 ± 0.03 (2) >80,000 6%, 10,000 nM 2 ± 2 (2) Exemplo 9c, W0200502150 0 0.96 ± 0.26 (19) >80,000 48%, 10,000 nM 75%, 30,000 nM 145 ± 71 (8) Exemplo 1 Presente invenção 1.14 ± 0.69 (18) >80,000 0%, 10,000 nM 21%, 30,000 nM 443 ± 114 (8)
Quadro 12a. Dados adicionais comparativos in vitro
Composto CCR2 Técnica de Técnica de Chemotaxis IC50 Patch Clamp Patch Clamp no (nM) hERG (% de inibição) canal de Na+ (% de inibição) Exemplo 2k Pat 0.24 ± 0.16 83%, 10,000 nM 52%, 10.000 nM norte- (12) 90%, 30,000 nM 35 americana, 7,163,937 Exemplo 8a 2.63 ± 1.24 4%, 10,000 nM 22%, 10,000 nM W02005021500 (4) 49%, 30,000 nM Exemplo 9c, 0.21 4%, 10,000 nM 19%, 10,000 nM W02005021500 39%, 30,000 nM Exemplo 1, 0.67 ± 0.42 33%, 10,000 nM 17%, 10,000 nM Presente (22) 61%, 30,000 nM 19%, 30,000 nM invenção
Quadro 12b. Dados farmacocinéticos comparativos in vivo no rato
Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (mL/min/kg) F% AUC oral (nM*h) Exemplo 2k W02005021500 2.5 /25 40 68 9294 Exemplo 8a WO2005021500 6/72 42 1.4 690 Exemplo 9c, W02005021500 4/43 54 14 1855 Exemplo 1, Presente invenção 2/10 43 51 3794 36
Quadro 12c. Dados farmacocinéticos comparativos in vivo no macaco
Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (mL/min/kg) F% AUC oral (nM*h) Exemplo 2k W02005021500 1/1.4 25 4 6 862 Exemplo 8a W02005021500 1 /11 14 9.4 1896 Exemplo 9c, W02005021500 1/10 12 26 6763 Exemplo 1, Presente invenção 1/1.3 23 47 836
UTILIDADE
Compostos representativos dos exemplos revelam ser moduladores da actividade do receptor da quimiocina utilizando análises conhecidas dos técnicos experientes na arte. Nesta secção, descrevemos essas análises e apresentamos a sua literatura de referência. Mais análises são descritas neste documento na secção intitulada "Caracteristicas farmacológicas comparativas", supra. Por apresentarem actividade de antagonismo da MCP-1 nestas análises, prevê-se que os compostos dos exemplos sejam úteis no tratamento de doenças humanas associadas com quimiocinas e os respectivos receptores cognatos. A definição de actividade nestas análises é um composto que 37 demonstra uma CI50 de 30 μΜ ou inferior em concentração quando medida numa análise particular.
Antagonismo da ligação da MCP-1: a PBMC humanas (Yoshimura et al., J. Immunol. 1990, 145, 292)
Pelo menos um dos compostos descritos nos exemplos possui actividade no antagonismo da ligação da MCP-1 às PBMC humanas (células mononucleares de sangue periférico humano) aqui descrito.
Placas de filtragem Millipore(#MABVN1250) são tratadas com 100 μΐ de tampão de ligação (0,5% albumina de soro bovino, 20 mM tampão HEPES e 5 mM cloreto de magnésio em meio RPMI 1640) durante trinta minutos à temperatura ambiente. Para medir a ligação, 50 μΐ de tampão de ligação, com ou sem um composto de concentração conhecida, são combinados com 50 μΐ de MCP-1 humana marcada com 125I (para produzir a concentração final de 150 pM de radioligando) e 50 μΐ de tampão de ligação contendo 5xl05 células. As células usadas nessas análises de ligação podem incluir células mononucleares de sangue periférico humano isoladas por centrifugação de gradiente de Ficoll-Hypaque, monócitos humanos (Weiner et al., J. Immunol. Methods. 1980, 36, 89) ou a linhagem celular THP-1 que expressa o receptor endógeno. A mistura de composto, células e radioligando é incubada à temperatura ambiente durante trinta minutos. As placas são colocadas numa manga de vácuo, o vácuo é aplicado e as placas lavadas três vezes com tampão de ligação contendo 0,5M NaCl. A cobertura plástica é removida da placa, está é deixada a secar ao ar, os poços são 38 perfurados e submetidos a contagem. A inibição percentual da ligação é calculada utilizando as contagens totais obtidas na ausência de qualquer composto concorrente e a ligação de base é determinada por adição de 100 nM MCP-1 no lugar do composto em teste.
Antagonismo do influxo de cálcio induzido pela MCP-1 (Sullivan, et al. Methods Mol. Biol., 114, 125-133 (1999)
Pelo menos um dos compostos descritos nos exemplos possui actividade no antagonismo da análise do influxo de cálcio induzida pela MCP-1 aqui descrito. A mobilização do cálcio é medida usando o indicador fluorescente de Ca2+, Fluo-3. As células são incubadas a 8 x 105 células/ml em solução salina com tampão fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovino, 20 mM de tampão HEPES, 5 mM de glucose, 1% de soro de feto bovino, 4 μΜ de Fluo-3 AM e 2,5 mM de probenecid durante 60 minutos a 37°C. As células usadas para estes ensaios de cálcio podem incluir monócitos humanos isolados da forma descrita em Weiner et al., J. Immunol. Methods, 36, 89-97 (1980) ou linhas celulares que expressem o CCR2 endógeno, tais como THP-1 e MonoMac-6. As células são então lavadas três vezes em solução salina com tampão fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovino, 20 mM de HEPES, 5 mM de glucose e 2,5 mM probenecid. As células são ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,5% albumina de soro bovino, 20 mM HEPES e 2,5 mM probenecid a uma concentração final de 2-4 x 106 células/ml. As células são colocadas em microplacas de 96 poços de parede preta (100 μΐ/poço) e e 39 as placas são centrifugadas a 200 x g durante 5 minutos. Várias concentrações do composto são adicionadas aos poços (50 μΐ/poço) e após 5 minutos, 50 μΐ/poço de MCP-1 são adicionados para produzir a concentração final de 10 nM. A mobilização do cálcio é detectada utilizando um leitor de placas por imagiologia fluorescente. A monocamada celular é excitada com um laser de árgon (488 nM) e a fluorescência associada às células é medida durante 3 minutos (a cada segundo durante os primeiros 90 segundos e a cada 10 segundos durante os 90 segundos seguintes). Os dados são produzidos sob a forma de unidades arbitrárias de fluorescência e a variação de fluorescência para cada poço é determinada como sendo o diferencial máximo-mínimo. A inibição dependente do composto é calculada relativamente à resposta da MCP-1 isolada.
Antagonismo da quimiotaxia das PBMC humanas induzida pela MCP-1 (Bacon et al., Brit, J. Pharmacol. 1988, 95, 966)
Pelo menos um dos compostos descritos nos exemplos possui actividade no antagonismo da análise da quimiotaxia das PBMC humanas induzida pela MCP-1, aqui descrito.
Uma câmara de quimiotaxia de 96 poços Neuroprobe MBA96, uma placa de 96 poços Polyfiltronics MPC e filtros de 8 micra PFD5 em policarbonato isento de polivinilpirrolidona Neuroprobe são aquecidos numa incubadora a 37 °C. Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) (Boyum et al., Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 1968, 97, 31), isoladas de fresco através do 40 método padrão de separação de densidade de Ficoll, são suspensas em DMEM a 1 x 107 c/ml e aquecidas a 37°C. Uma solu 60nM de MCP-1 humana é também aquecida a 37°C. São realizadas diluições dos compostos em teste até 2x a concentração necessária em DMEM. A suspensão de PBMC e a solução 60nm de MCP-1 são misturadas numa proporção de 1:1 em tubos de polipropileno com DMEM pré-aquecido com ou sem a diluição dos compostos em teste. Estas misturas são aquecidas num tubo aquecedor a 37°C. Para iniciar a análise, adicionar a mistura MCP-l/composto nos poços da placas de 96 poços Polyfiltronics MPC que foi colocada na parte inferior da câmara de quimiotaxia Neuroprobe. O volume aproximado é de 400 μΐ para cada poço e e deverá existir um menisco positivo após a dispensação. O filtro de 8 micra é colocado cuidadosamente na placa de 96 poços, é montado um suporte de borracha no fundo da câmara superior e a câmara é montada. Um volume de 200 μΐ da mistura de suspensão de células/composto é adicionado aos poços apropriados da câmara superior. A câmara coberta é coberta com o vedante da placa e a unidade montada é colocada numa incubadora a 37°C durante 45 minutos. Após a incubação, o vedante da placa é removido e a totalidade da suspensão de células remanescente é aspirada. A câmara é desmontada e o filtro é removido cuidadosamente. Sequrando no filtro num ânqulo de 90 graus, as células não migradas são lavadas utilizando um corrente suave de solução salina tamponada de fosfato e a parte superior do filtro é removida com a ponta de uma espátula de borracha. Repetir esta lavagem mais duas vezes. O filtro é seco ao ar e, em seguida, completamente submergido em corante de Wright Geimsa durante 45 segundos. 0 filtro é em seguida lavado por imbibição em água destilada durante 7 minutos e, em seguida, uma lavagem adicional de 15 segundos em água destilada nova. O filtro é 41 novamente seco ao ar. As células migradas no filtro são quantificadas por microscopia visual.
Os receptores de quimiocina de mamíferos proporcionam um alvo de interferência ou promovem a função das células imunitárias num mamífero, tal como o homem. Os compostos que inibem ou promovem a função do receptor da quimiocina são particularmente úteis na modulação da função das células imunitárias para fins terapêuticos. Consequentemente, a presente invenção é direccionada para compostos que são úteis na prevenção e/ou tratamento de uma ampla variedade distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorreguladoras, incluindo asma e doenças alérgicas, infecção por micróbios patogénicos (que, por definição, incluem vírus) , assim como patologias autoimunes, tais como a artrite reumatóide e a aterosclerose. Por exemplo, um dos compostos presentes que inibe uma ou mais funções de um receptor de quimiocina de mamífero (por exemplo, um receptor de quimiocina humano) pode ser administrado para inibir (isto é, reduz ou previne) a inflamação ou doenças infecciosas. Em resultado, um ou mais processos inflamatórios, tais como a emigração leucocitária, adesão, quimiotaxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou libertação de mediadores inflamatórios, são inibidos.
De modo semelhante, um dos compostos presentes que promova uma ou mais funções do receptor de quimiocina de mamífero (por exemplo, uma quimiocina humana) administrado para estimular (induzir ou melhorar) uma resposta imunitária ou inflamatória, tal como a emigração leucocitária, adesão, quimiotaxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou libertação de mediadores inflamatórios, resultando na estimulação benéfica de 42 processos inflamatórios. Por exemplo, podem ser recrutados eosinófilos para combater infecções parasiticas. Além disso, o tratamento das doenças inflamatórias, alérgicas e autoimunes mencionadas, pode também ser contemplado para um dos compostos presentes que promova uma ou mais funções do receptor de quimiocina de mamífero se contemplarmos a entrega de composto suficiente para causar a perda de expressão do receptor nas células, através da indução da internalização do receptor de quimiocina ou da entrega de composto de forma que resultem no extravio da migração de células.
Para além dos primatas, como o homem, uma variedade de outros mamíferos pode ser tratada de acordo com o método da presente invenção. Por exemplo, os mamíferos, incluindo, entre outros, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, porquinhos da índia, ratos ou outras espécies de bovinos, ovinos, equinos, caninos, felinos, roedores ou murinos podem ser tratados. Contudo, o método pode também ser praticado noutras espécies, tais como espécies de aves. 0 objecto tratado pelos métodos acima é um mamífero, do sexo masculino ou feminino, no qual a modulação de actividade do receptor da quimiocina é desejado. "Modulação", na acepção utilizada neste documento engloba o antagonismo, agonismo, antagonismo parcial e/ou agonismo parcial.
Ligação ao CCR5 e análises funcionais
Derivação celular e culturas de células: Um conjunto de células HT1080 expressando estavelmente o receptor CC endógeno de quimiocina 5 (CCR5) foi desenvolvido utilizando os métodos indicados por Harrington, Sherf e Rundlett 43 (consultar patentes norte-americanas US 6,361,972 e US 6,410,266) . Os clones de expressão mais elevada foram isolados utilizando citometria de fluxo repetitivo, seguida por subclonagem. Estas células foram então cultivadas em pratos de cultura de 6 poços a 3 x 105 células/poço e transfectadas com um vector de DNA contendo a proteína G Gqi5 marcada com HA quimérico (Molecular Devices; 5 microgramas de vector de DNA linearizado em 15 microL de Ex-Gen da Fermentes foram utilizados para a transfecção). Dois dias após a transfecção, os poços foram combinados e os conteúdos colocados em placas P 100. Sete dias após a colocação nas placas, foram colhidas colónias, expandidas e analisadas relativamente ao conteúdo em Gqi5 por meio de análise Western blot. Um clone (designado como 3559.1.6) com uma expressão elevada de Gqi5 (da transfecção) e de CCR5 (endógeno) foi seleccionado e usado nas experiências descritas abaixo. As células HT1080 (clone 3559.1.6) foram cultivadas com alfa-MEM suplementado com soro fetal de bovino dialisado a 10%, 2% penicilina/estreptomicina/glutamina e 500 microgramas/ mL de higromicina B (concentração final) a 37° C com 5% C02 numa atmosfera humidificada.
Preparação da membrana: Um aglomerado de células contendo 1 x 108 células HT 1080 (clone 3559.1.5) foi ressuspenso em 5 mL de Tampão de preparação membranária gelado (HEPES 50 mM, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) e homogeneizado a alta velocidade num homogeneizador Polytron durante 20 seg em gelo. O homogenato foi diluído com outros 25 mL de Tampão de preparação membranária e centrifugado durante 12 min (48, 000 x g a 4°C) . O aglomerado de células foi ressuspenso em 5 mL de Tampão de preparação membranária antes de ser novamente homogeneizado conforme descrito 44 anteriormente. 0 homogenato foi diluído com 5 mL de Tampão de preparação membranária e analisado relativamente à concentração de proteína CCR5.
Análise da ligação: 0 homogenato recém-preparado a partir da Preparação da membrana descrita acima, foi diluído em Tampão de ligação (HEPES 50 mM, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, BSA a 0,1%; um comprimido completo de inibidor da protease foi adicionado antes da análise) para obter uma concentração final de proteína de 10 microgramas/poço (placas de 96 poços brancos opacos da Corning, Inc.) . Esta preparação da membrana foi misturada com microesferas WGA-SPA (Amerhsam; pré-humedecido em Tampão de ligação) para produzir uma concentração de 200 microgramas/poço. A mistura membrana/microsfera SPA (100 microlitros/poço) foi então adicionada a uma placa que havia sido pré-ponteada com 2 microlitros de DMSO contendo várias concentrações dos artigos testados (DMSO puro para controlo negativo; várias concentrações de exemplos desta invenção para artigos de teste; 500 nM MIP-1 beta como controlo positivo). A análise de ligação foi iniciada através da adição de 50 microlitros de [125I]-MIP-1 beta (Perkin Elmer; material foi diluído em Tampão de ligação de modo que a adição de 50 microlitros/poço produza uma concentração final de 0,1 nM [1251]_Mip — i beta). A placa foi selada e deixada permanecer à temperatura ambiente durante 4 - 6 h antes de ser submetida a contagem num Packard TopCount. A percentagem ligada do artigo em teste foi calculada, utilizando controlos negativos e positivos para definir a janela para cada experiência.
Análise funcional baseada no leitor de placas por imagiologia fluorescente (FLIPR): células HT1080 (clone 3559.1.6) foram colocadas em placas a 10,000 células/poço 45 (30 microlitros) em placas de 384 poços (fundo preto/transparente Biocoat PDL, Beckton Dickinson) e carregada com 30 microlitros/poço de corante fluorescente Fluro-4 AM (preparado dissolvendo 1 mg Fluro-4 AM em 440 microlitros de DMSO e diluindo com 100 microlitros de solução de plurónico antes de diluir ainda mais com 10 mL de tampão de Hanks). As células foram incubadas a 37° C com 5% C02 durante 30 min antes de serem lavadas três vezes e suspensas em Tampão ensaio (20 mM HEPES, 1,2 mM CaCl2, 5mM MgCl2, 2,5 mM Probenecid, 0,5% BSA, lx Hanks). O artigo em teste foi diluído em série em DMSO e, em seguida, diluído a 1:10 com Tampão ensaio antes de ser adicionado às células (10 microlitros/poço) . Utilizando o FLIPR, as placas foram lidas (10 - 70 seg) para indução de fluxo (isto é, actividade agonista). As células foram então carregadas com Solução de agonista (30 microlitros/poço; preparada por diluição de 30 microlitros de 100 microMolar MIP-1 beta em 100 mL de Tampão ensaio; este protocolo proporciona uma concentração final de 5 nM MIP-1 beta na análise) e as placas foram lidas utilizando FLIPR durante um minuto. A actividade antagonista do artigo em teste foi determinada em relação ao controlo negativo de 0,4% DMSO/Tampão. As doenças ou condições humanas ou de outras espécies que podem ser tratadas com inibidores de função do receptor da quimiocina, incluem, entre outras: doenças e condições inflamatórias ou alérgicas, incluindo doenças respiratórias alérgicas tal como a asma, rinite alérgica, doenças de hipersensibilidade pulmonar, pneumonia de hipersensibilidade, celulite eosinofílica (por exemplo, síndrome de Well), pneumonia esosinofílica (por exemplo, síndrome de Loeffler, pneumonia crónica esosinofílica) , fasceíte eosinofílica (por exemplo, síndrome de Shulman), hipersensibilidade do tipo retardado, doenças pulmonares 46 intersticiais (ILD) (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática ou ILD associada com artrite reumatóide, lupus eritematoso sistémico, espondilite anquilosante, esclerose sistémica, sindrome de Sjogren, polimiosite ou dermatomiosite); anafilaxia sistémica ou respostas de hipersensibilidade, alergias medicamentosas (por exemplo, à penicilina, cefalosporinas), sindrome de eosinofilia-mialgia devido à ingestão de triptofano contaminado, alergias a picadas de insectos; doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, artrite psoriática, esclerose múltipla, lupus eritematoso sistémico, myasthenia gravis, diabetes juvenil; glomerulonefrite, tiroidite autoimune, doença de Behcet; rejeição de enxertos (por exemplo, em transplante), incluindo rejeição de enxerto alogénio ou doença enxerto contra hospedeiro; doenças intestinais inflamatórias, tal como a doença de Crohn e colite ulcerativa; espondiloartropatias; escleroderma; psoríase (incluindo psoríase mediada por células T) e dermatoses inflamatórias, tais como dermatite, eczema, dermatite atópica, dermatite alérgica por contacto, urticária; vasculite (por exemplo, necrosante, vasculite cutânea e de hipersensibilidade); miosite eosinofílica, fasceíte eosinofílica; cancros com infiltrações cutâneas ou orgânicas de leucócitos. Outras doenças ou condições nas guais as respostas inflamatórias indesejáveis devem ser inibidas para poderem ser tratadas, incluindo, entre outras, vasculite, placas vulneráveis, hiperplasia da neo-íntima venosa, lesão de reperfusão, hiperplasia da neo-íntima do enxerto para diálise, hiperplasia da íntima em shunt arteriovenoso, aterosclerose, certas neoplasias hematológicas, toxicidade induzida pela citocina (por exemplo, chogue séptico, chogue endotóxico), polimiosite, dermatomiosite. As doenças ou condições infecciosas humanas 47 ou de outras espécies que podem ser tratadas com inibidores de função do receptor da quimiocina, incluem, entre outras: As doenças ou condições humanas ou de outras espécies que podem ser tratadas com promotores da função do receptor da quimiocina, incluem, entre outras: imunossupressão, tal como nos indivíduos com síndromes de imunodeficiência como a SIDA ou outras infecções virais, indivíduos em terapia por radiação, quimioterapia, terapia de doença autoimune ou terapia medicamentosa (por exemplo, terapia com corticosteróides), que causa imunossupressão; imunossupressão devida a deficiência congénita na função do receptor ou outras causas; e doenças infecciosas, tais como doenças parasitárias, incluindo, entre outras, infecções helminticas, tais como nematodos (vermes redondos); (Trichuriasis, Enterobiasis, Ascariasis, ancilóstomo, Strongyloidiasis, Trichinosis, filariasis); trematodos (dactilogirose) (Schistosomiasis, Clonorchiasis), cestodos (vermes achatados) (Echinococcosis, Taeniasis saginata, Cysticercosis); vermes viscerais (por exemplo, Toxocara), gastroenterite eosinofílica (por exemplo, Anisaki sp., Phocanema sp.), larva migrans cutânea (Ancylostona braziliense, Ancylostoma caninum). Os compostos da presente invenção são consequentemente úteis na prevenção e tratamento de uma ampla variedade de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorreguladoras.
Além disso, o tratamento das doenças inflamatórias, alérgicas e autoimunes mencionadas anteriormente pode também ser contemplado para promotores da função do receptor da quimiocina se considerarmos a entrega de composto suficiente para causar a perda de expressão do receptor nas células através da indução da internalização 48 do receptor de quimiocina ou entrega de composto de forma que resulte no extravio da migração de células.
Num outro aspecto, a presente invenção pode ser usada para avaliar os agonistas ou antagonistas específicos de um receptor acoplado à proteína G. A presente invenção é direccionada para o uso destes compostos na preparação e execução de análises de rastreio de compostos que modulam a actividade de receptores da quimiocina. Além disso, os compostos desta invenção são úteis no estabelecimento ou determinação do local de ligação de outros compostos aos receptores da quimiocina, por exemplo, por inibição competitiva ou como uma referência numa análise para comparar a sua actividade conhecida com um composto com uma actividade desconhecida. No desenvolvimento de novas análises ou protocolos, os compostos de acordo com a presente invenção poderiam ser utilizados para testa a sua eficácia. Especificamente, tais compostos podem ser fornecidos num kit comercial, por exemplo, para uso em investigação farmacêutica envolvendo as doenças mencionadas anteriormente. Os compostos da presente invenção são também úteis para a avaliação de moduladores putativos específicos dos receptores da quimiocina. Além disso, seria possível utilizar os compostos desta invenção para examinar a especificidade dos receptores acoplados à proteína G que não se consideram como sendo receptores da quimiocina, tanto servindo como exemplos de compostos que não se ligam ou como variantes estruturais dos compostos activos nestes receptores, que podem ajudar a definir locais específicos de interacção.
Os compostos apresentados neste documento são úteis para tratar ou prevenir distúrbios seleccionados entre artrite reumatóide, osteoartrite, choque séptico, 49 aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, choque hemodinâmico, sindrome séptico, lesão de reperfusão pós-isquémica, malária, doença de Crohn, doenças intestinais inflamatórias, infecção micobacteriana, meninqite, psoriase, falência cardiaca conqestiva, doenças fibróticas, caquéxia, rejeição de enxertos, doenças autoimunes, doenças cutâneas inflamatórias, esclerose múltipla, danos por radiação, lesão alveolar hiperóxica, HIV, demência por HIV, diabetes mellitus não insulinodependente, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, fibrose pulmonar idiopática, penfigóide bolhosa, infecções parasíticas helminticas, colite alérgica, eczema, conjuntivite, transplante, eosinofilia familiar, celulite eosinofilica, pneumonias eosinofilicas, fasceite eosinofilica, gastroenterite eosinofilica, eosinofilia por indução medicamerntosa, fibrose cística, sindrome de Churg-Strauss, linfoma, doença de Hodgkin, carcinoma do cólon, sindrome de Felty, sarcoidose, uveíte, Alzheimer, glomerulonefrite e lupus eritematoso sistémico, carcinoma da células escamosas esofágicas, dor neuropática e obesidade.
Num outro aspecto, os compostos são úteis para tratar ou prevenir distúrbios inflamatórios seleccionados entre artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, doença de Crohn, doenças intestinais inflamatórias, psoriase, falência cardíaca congestiva, esclerose múltipla, doenças autoimunes, doenças cutâneas inflamatórias. Num outro aspecto, os compostos são usados para tratar ou prevenir distúrbios inflamatórios seleccionados entre artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose. doença de Crohn, doenças intestinais inflamatórias e esclerose múltipla. Num outro aspecto, os 50 exemplos apresentados neste documento podem ser úteis no tratamento de uma variedade de cancros, incluindo, entre outros, os seguintes: carcinoma incluindo da bexiga (incluindo cancro da bexiga acelerado e metastásico), da mama, do cólon (incluindo cancro colorectal), do rim , do fígado, do pulmão (incluindo cancro das células pequenas e não pequenas do pulmão e adenocarcinoma pulmonar), do ovário, da próstata, dos testículos, do tracto urogenital, do sistema linfático, do recto, da laringe, do pâncreas (incluindo carcinoma pancreático exócrino), do esófago, do estômago, da vesísula biliar, do cérvix, da tiróide e da pela (incluindo carcinoma das células escamosas); tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células B, linfoma das células T, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma das células pilosas, linfoma histiocítico e linfoma de Burketts; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide incluindo leucemias mielogénicas aguda e crónica, síndrome mielodisplástica, leucemia mielóide e leucemia promielocítica; tumores do sistema nervoso central e periférico incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; tumores de origem mesenquimal incluindo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma e osteosarcoma; e outros tumores incluindo melanoma, xenoderma pigmentosum, queratoactantoma, seminoma, cancro folicular da tiróide e teratocarcinoma. 51
Noutra forma de concretização, apresentados neste documento estão compostos para uso no tratamento de cancro, em que o cancro é seleccionado entre cancro da mama, cancro hepático, cancro da próstata e melanoma. Adicionalmente, compostos apresentados neste documento podem ser úteis no tratamento de cancro do ovário e mieloma múltiplo. A presente invenção proporciona compostos para uso no tratamento de uma variedade de doenças proliferativas não cancerosas. A terapêutica combinada para prevenir e tratar distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorreguladoras, incluindo asma e doenças alérgicas, assim como patologias autoimunes tais como artrite reumatóide e aterosclerose e as patologias assinaladas acima, é ilustrada pela combinação dos compostos desta invenção e outros compostos que são conhecidos para tais fins. Por exemplo, no tratamento ou prevenção de inflamação, os presentes compostos podem ser usados em conjunto com um anti-inflamatório ou um analgésico como um agonista opiáceo, um inibidor da lipoxigenase, um inibidor da ciclooxigenase-2, um inibidor da interleuquina, tal como um inibidor da interleuquina-1, um inibidor do factor da necrose do tumor, um antagonista de NMDA, um inibidor ou óxido nitrico ou um inibidor da síntese de óxido nítrico, um agente anti-inflamatório não esteróide, a inibidor da fosfodiesterase ou um agente anti-inflamatório supressor da citocina, por exemplo com um composto como o acetaminofeno, aspirina, codeína, fentanil, ibuprofeno, indometacina, cetorolac, morfina, naproxeno, fenacetina, piroxicam, um analgésico esteróide, sufentanil, sunlindac, interferão alfa e semelhantes. De modo semelhante, os presentes compostos podem ser administrados com um analgésico; um 52 potenciador como a cafeína, um antagonista H2, simeticona, hidróxido de alumínio ou magnésio; um descongestionante como a fenilefrina, fenilpropanolamina, pesudoefedrina, oximetazolina, efinefrina, nafazolina, xilometazolina, propilhexedrina ou levodesoxiefedrina; e anti-tússicos como a codeína, hidrocodona, caramifeno, carbetapentano ou dextrametorfano; um diurético; e uma anti-histamina sedativa ou não sedativa. Do mesmo modo, os compostos apresentados neste documento podem ser usados em combinação com outros medicamentos que são usados no tratamento/prevenção/supressão ou melhoria das doenças ou condições para as quais os compostos da presente invenção são úteis. Esses outros medicamentos podem ser administrados por uma via e numa quantidade utilizadas normalmente e, portanto, contemporaneamente ou sequencialmente com um composto da presente invenção. Quando um composto é usado contemporaneamente com um ou mais de outros medicamentos, a composição farmacêutica que contém esses outros medicamentos em adição com o composto da presente invenção pode ser usada. Consequentemente, as composições farmacêuticas incluem as que também contêm um ou mais de outros ingredientes activos, em adição a um composto da presente apresentação. Exemplos de outros ingredientes activos que podem ser combinados com um composto da presente invenção, tanto administrado separadamente ou nas mesmas composições farmacêuticas, incluem, entre outros: (a) antagonistas da integrina tais como os das selectinas, ICAMs e VLA-4; (b) esteróides como a beclometasona, metilprednisolona, betametasona, prednisona, dexametasona e hidrocortisona; (c) imunossupressores como a ciclosporina, tacrolimus, rapamicina e outros imunossupressores do tipo FK-506; (d) anti-histaminas (antagonistas da Hl-histamina) tais como a 53 bromofeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, triprolidina, clemastina, difenidramina, difenilpiralina, tripelenamina, hidroxizina, metdilazina, prometazina, trimeprazina, azatadina, ciproheptadina, antazolina, feniramina pirilamina, astemizole, terfenadina, loratadina, cetirizina, fexofenadina, descarboetoxiloratadina e semelhantes; (e) anti-asmáticos não esteróides como os b2-agonistas (terbutalina, metaproterenol, fenoterol, isoetarina, albuteral, bitolterol e pirbuterol), teofilina, cromolina de sódio, atropina, brometo de ipratrópio, antagonistas do leucotrieno (zafirlukast, montelukast, pranlukast, iralukast, pobilukast, SKB-102,203), inibidores da biosintese do leucotrieno (zileuton, BAY-1005); (f) agentes anti-inflamatórios não esteróides (ΑΙΝΕ) como derivados do ácido propiónico (alminoprofeno, benxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico e tioxaprofeno), derivados do ácido acético (indometacina, acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, ácido fenclózico, fentiazac, furofenac, ibufenac, isoxepac, oxpinac, sulindac, tiopinac, tolmetin, zidometacina e zomepirac), derivados do ácido fenâmico (ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados do ácido bifenilcarboxilico (diflunisal e flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam e tenoxican), salicilatos (ácido acetilsalisilico, sulfasalazina) e a pirazolonas (apazona, bezpiperilona, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona); (g) inibidores da ciclooxigenase-2 (COX-2); (h) inibidores da fosfodiesterase tipo IV (PDE-IV); (i) outros antagonistas dos receptores da quimiocina; (j) 54 agentes redutores do colesterol, tais como inibidores da HMG-COA reductase (lovastatina, simvastatina e pravastatina, fluvastatina, atorvastatina e outras estatinas), sequestrantes (colestiramina e colestipol), ácido nicotónico, derivados do ácido fenofibrico (gemfibrozil, clofibrat, fenofibrato e benzafibrato) e probucol; (k) agentes antidiabéticos tais como a insulina, sulfonilureias, biguanidas (metformina) , inibidores da a-glucosidase (acarbose) e glitazonas (troglitazona e pioglitazona); (1) preparações de interferões (interferão alfa-2a, interferão-2B, interferão alfa-N3, interferão beta-la, interferão beta-lb, interferão gamma-lb); (m) compostops antivirais como efavirenz, nevirapine, indinavir, ganciclovir, lamivudine, famciclovir e zalcitabine; (o) outro composto como o ácido 5-aminosalicílico e pró-fármacos, antimetabolitos como a azatioprina e β-mercaptopurina e agentes quimioterapêuticos de cancro citotóxicos. 0 rácio de peso do composto da presente invenção para o segundo ingrediente activo pode ser variado e dependerá das doses eficazes de cada ingrediente.
Em geral, será utilizada uma dose eficaz de cada. Assim, por exemplo, quando um composto é combinado com um ΑΙΝΕ, o rácio de peso do composto da presente invenção com ο ΑΙΝΕ variará geralmente entre cerca de 1000:1 e cerca de 1:1000 ou, alternativamente, entre cerca de 200:1 e cerca de 1:200. Combinações de um composto da presente invenção e outros ingredientes activos geralmente também se situarão dentro do intervalo mencionado, mas em cada caso deve utilizar-se uma dose eficaz de cada ingrediente activo.
No tratamento de cancro, uma combinação de agentes quimioterapêuticos e/ou outros tratamentos (por exemplo, 55 terapia por radiação) é frequentemente vantajosa. 0 segundo (ou terceiro) agente pode possuir um mecanismo de actuação idêntico ou diferente do agente terapêutico principal. Pode ser especialmente útil empregar combinações citotóxicas do medicamento em que dois ou mais medicamentos administrados actuam de diferentes formas ou em diferentes fases do ciclo celular e/ou em que dois ou mais medicamentos sobrepõem as citotoxicidades ou efeitos secundários e/ou em que os medicamentos que estão a ser combinados demonstraram eficácia no tratamento do estado de doença manifestado em particular pelo paciente.
Consequentemente, compostos apresentados neste documento (ou outras fórmulas apresentadas neste documento) podem ser administrados em combinação com outros agentes anti-cancro e citotóxicos e em tratamentos de utilidade no cancro ou outras doenças proliferativas. A invenção neste documento compreende ainda o uso dos compostos neste documento (ou outras fórmulas apresentadas neste documento), na preparação de medicamentos para o tratamento de cancro e/ou compreende a embalagem dos compostos deste documento juntamente com instruções no sentido de os compostos serem usados em combinação com outros agentes anti-cancro ou citotóxicos e no tratamento de cancro. A presente invenção compreende ainda combinações dos compostos de um ou mais agentes adicionais na forma de kit, por exemplo, quando são embalados em conjunto ou em embalagens separadas para venda em conjunto num kit, ou quando são embalados para serem formulados em conjunto. 0 segundo (ou mais) agente anti-cancro pode ser seleccionado entre qualquer um ou mais dos seguintes: agentes alquilantes (incluindo mostardas de azoto, sulfonatos de alquilo, nitrosureias, derivados da 56 etilenimina e triazenos); anti-angiogénicos (incluindo inibidores da metaloproteinase da matriz); antimetabolitos (incluindo inibidores da adenosina-desaminase, antagonistas do ácido fócilo, análogos puros e análogos da pirimidina); antibióticos ou anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos CTLA-4, antraciclinas); inibidores da aromatase; modificadores da resposta do ciclo celular; enzimas; inibidores da transferase da proteína enzimática farnesil; agentes hormonais e anti-hormonais e esteróides (incluindo análogos sintéticos, glucocorticóides, estrogénios/anti-estrogénios [por exemplo, SERM], androgénios/anti-androgénios, progestinas, agonistas do receptor da progesterona e agonistas e antagonistas da libertação da hormona luteinizante [LHRH]; moduladores do sistema do factor de crescimento do tipo insulina (IGF)/receptor do factor de crescimento do tipo insulina (IGFR) (incluindo inibidores do IGFR1 I) ; inibidores de sinalização da integrina; inibidores da cinase (incluindo inibidores multi-cinase e/ou inibidores da Src cinase ou Src/abl, inibidores da cinase dependente da ciclina [CDK], anticorpos panHer, Her-1 e Her-2, inibidores de VEGF, incluindo anticorpos anti-VEGF, inibidores de EGFR, inibidores da proteína activada pelo mitogénio [MAP], inibidors de MEP, inibidores da aurora cinase, inibidores de PDGF e outros inibidores da tirosina cinase ou inibidors da serina/treonina cinase; agentes disruptores dos microtúbulos, tais como as ecteinascidinas ou seus análogos e derivados; agentes estabilizadores dos microtúbulos tais como taxanos e epotilonas de ocorrência natural e seus análogos sintéticos e semi-sintéticos; agemtes de ligação 57 desestabilização de microtúbulos (incluindo alcaloides de vinca); e inibidores da topoisomerase; inibidores da prenil-proteina transferase; complexos de coordenação de platina; inibidores da transdução de sinal; e outros agentes usados como agentes anti-cancro e citotóxicos, tais como modificadores da resposta biológica, factores de crescimento e moduladores imunológicos.
Adicionalmente, os compostos da presente invenção podem ser formulados ou co-administrados com outros agentes terapêuticos que são seleccionados pela sua utilidade particular na abordagem de efeitos secundários associados com as condições supramencionadas. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser formulados com agentes para prevenir náusea, hipersensibilidade e irritação gástrica, tais como anti-eméticos e anti-histamínicos Ηχ e H2. os outros agentes terapêuticos acima, quando empregues em combinação com os compostos da presente invenção, podem ser usados, por exemplo, nas quantidades indicadas Prontuário médico ou tal como determinado por um técnico qualificado na arte.
Os compostos são administrados a um mamifero na quantidade terapeuticamente eficaz. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" entende-se uma quantidade de um composto da presente apresentação que, quando administrado isoladamente ou em combinação com um agente terapêutico adicional a um mamifero, é eficaz para prevenir ou melhorar a condição da doença ou a progressão da doença.
DOSAGEM E FORMULAÇÃO 58
Os compostos desta descrição podem ser administrados em formas farmacêuticas orais como comprimidos, cápsulas (cada uma das quais inclui formulações de libertação prolongada ou controlada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Podem também ser administradas nas formas intravenosa (bólus ou perfusão), intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular, todas utilizando formas farmacêuticas bem conhecidas de qualquer técnico com formação ordinária na arte farmacêutica. Podem ser administrados isoladamente, mas serão normalmente administrados com um veículo farmacêutico seleccionado com base na via de administração escolhida e prática farmacêutica padrão. 0 regime de dosagem para os compostos da presente invenção irá, claro, variar dependendo de factores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente particular e o seu modo e via de administração; a espécie, idade, sexo, estado de saúde, condição médica e peso do receptor; a natureza e extensão dos sintomas; o tipo de tratamento concomitante; a frequência de tratamento; a via de administração, a função renal e hepática do paciente e o efeito desejado. Um médico ou veterinário podem determinar e prescrever a quantidade eficaz do medicamento necessária para prevenir, contrariar ou interromper a evolução da patologia.
Como orientação geral, a dose oral diária de cada ingrediente activo, quando usado para os efeitos indicados efeitos, variará entre cerca de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, ou entre cerca de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por dia, ou alternativamente, entre cerca de 1,0 a 20 mg/kg/dia. Por via intravenosa, as doses variarão entre cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg/minuto durante uma perfusão 59 a velocidade constante. Os compostos desta invenção podem ser administrados numa dose diária única, ou a dose diária total pode ser administrada em doses divididas por duas, três ou quatro vezes por dia. Numa concretização, a dose oral diária do ingrediente activo situa-se entre 3 e 600 mg administrados uma vez por dia ou em doses divididas administradas duas vezes por dia. Em alternativa, o ingrediente activo pode ser administrado em doses de 10-20 mg administradas duas vezes por dia ou 40 a 100 mg administradas uma vez por dia. Em alternativa, o ingrediente activo pode ser administrado numa dose de 12,5 mg duas vezes por dia ou 75 mg uma vez por dia. Em alternativa, o ingrediente activo pode ser administrado em doses de 3, 10, 30, 100, 300 e 600 mg administradas uma ou duas vezes por dia.
Os compostos desta invenção podem ser administrados na forma intranasal através do uso tópico de veículos intranasais adequados, ou através de vias transdérmicas, utilizando pensos cutâneos transdérmicos. Quando administrado na forma de um sistema de administração transdérmica, a administração da dose será, claro, contínua em vez de ser intermitente ao longo do regime de dosagem.
Os compostos são administrados tipicamente em mistura com diluentes farmacêuticos adequados, excipientes ou veículos (colectivamente referidos neste documento como veículos farmacêuticos) seleccionados adequadamente respeitando a forma de administração pretendida, ou seja, comprimidos, cápsulas, elixires, xaropes e semelhantes e de modo consistente com as práticas farmacêuticas convencionais.
Por exemplo, para a administração por via oral na forma de um comprimido ou cápsula, o componente activo do 60 medicamento pode ser combinado com um veiculo inerte farmaceuticamente aceitável, não tóxico, para administração por via oral, tal como lactose, amido, sucrose, glucose, metilcelulose, estearato de magnésio, fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, manitol, sorbitol e semelhantes; para a administração por via oral na forma liquida, os componentes do medicamento para via oral podem ser combinados com qualquer veiculo inerte farmaceuticamente aceitável, não tóxico, para administração por via oral, tal como etanol, glicerol, água e semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, também podem ser incorporados na mistura aglutinantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes corantes. Aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açucares naturais como a glucose ou a beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas como a de acácia, de tragacanta ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, ceras e semelhantes. Os lubrificantes usados nestas formas farmacêuticas incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metilcelulose, agar, bentonite, goma de xantano e semelhantes.
Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de entrega de lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolípidos, tal como colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas.
Os compostos da presente invenção podem também ser acoplados com polímeros solúveis como veículos do 61 medicamento desejáveis. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidafenol ou polietileneoxido-polilisina substituídos com resíduos de palmitoil. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para conseguir a libertação controlada de um medicamento, por exemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros do ácido poliláctico e poliglicólico, polis(caprolactona), ácido polihidroxibutírico, poli-orto-ésteres, poliacetais, polidiidropiranos, policianoacilatos e copolímeros de bloco cruzado ou amfipático de hidrogéis.
As formas de dosagem (composições farmacêuticas) adequadas para a administração podem conter desde cerca de 1 miligrama a cerca de 100 miligramas de ingrediente activo por dose unitária. Nestas composições farmacêuticas, o ingrediente activo estará ordinariamente presente numa quantidade de cerca de 0,5-95% por peso com base no peso total da composição. As cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente activo e veículos em pó, tais como lactose, amido, derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico e semelhantes. Podem ser utilizados diluentes semelhantes para preparar comprimidos prensados. Ambos os comprimidos e cápsulas podem ser produzidos como produtos de libertação sustentada para proporcionar uma libertação contínua do medicamento ao longo de um período de horas. Os comprimidos prensados podem ser revestidos a açúcar ou com película para ocultar qualquer sabor desagradável e para proteger o comprimido, ou com revestimento entérico para permitir a desintegração selectiva do comprimido no tracto gastrointestinal. As formas de dosagem líquidas destinadas 62 a administração oral podem conter agentes corantes ou aromatizantes para melhorar a aceitação do paciente. Em geral, água, um óleo adequado, soro fisiológico, dextrose aquosa (glucose) e soluções de açúcar e glicóis relacionadas, tal como propilenoglicol ou polietilenoglicol são veiculos adequados para soluções parentéricas. As soluções para administração parentérica podem conter de preferência um sal hidrossolúvel do ingrediente activo, agentes estabilizantes adequados e, se necessário, substâncias à base de manteiga. Agentes antioxidantes, tais como bissulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico, seja isoladamente ou em combinação com agentes estabilizantes adequados. São também utilizados ácido cítrico e respectivos sais e EDTA sódico. Além disso, as soluções parentéricas podem conter conservantes tal como cloreto de benzalcónio, metilparabeno ou propilparabeno e clorobutanol. Veículos farmacêuticos adequados encontram-se descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, um texto de referência padrão neste domínio.
As formas de dosagem ou de administração farmacêuticas úteis representativas dos compostos da presente invenção podem ser ilustradas da seguinte forma: Cápsulas
Um grande número de unidades cápsula é preparado por meio de enchimento de cápsulas de gelatina rígida em duas partes, normalizadas, cada uma com 100 mg de ingrediente activo em pó, 150 mg de lactose, 50 mg de celulose e 6 mg de estearato de magnésio. 63 Cápsulas moles de gelatina É preparada uma mistura do ingrediente activo num óleo digerível, tal como óleo de soja, óleo de semente de algodão ou azeite e é injectada por meio de um deslocamento positivo, bombeada para dentro da gelatina para formar cápsulas de gelatina mole contendo 100 mg do ingrediente activo. As cápsulas devem ser lavadas e secas.
Comprimidos
Os comprimidos podem ser preparados por meio de procedimentos convencionais, de forma que a unidade de dosagem contenha 100 mg de ingrediente activo, 0,2 mg de dióxido de silício coloidal, 5 mg de estearato de magnésio, 275 mg de celulose microcristalina, 11 mg de amido e 98,8 mg de lactose. Podem ser aplicados revestimentos apropriados para melhorar o sabor ou atrasar a absorção.
Injectável
Uma composição parentérica adequada para administração mediante injecção pode ser preparada agitando 1,5 % em peso do ingrediente activo em 10% em volume de propilenoglicol e água. A solução deve ser tornada isotónica com cloreto de sódio e esterilizada.
Suspensão
Uma suspensão aquosa pode ser preparada para administração por via oral de modo que cada 5 mL contenha 64 100 mg de ingrediente activo finamente dividido, 200 mg de carboximetilcelulose de sódio, 5 mg de benzoato de sódio, 1,0 g de solução de sorbitol, USP e 0,025 mL de vanilina.
Nos casos em que os compostos desta invenção são combinados com outros agentes anticoagulantes, por exemplo, uma dose diária pode ser de cerca de 0,1 a 100 miligramas do composto da Fórmula 1 e de cerca de 1 a 7,5 miligramas do segundo anticoagulante, por quilograma de peso corporal do paciente. Para uma forma de dosagem do comprimido, os compostos desta invenção geralmente podem estar presentes numa quantidade de cerca de 5 a 10 miligramas por dose unitária e o segundo anti-coagulante numa quantidade de cerca de 1 a 5 miligramas por dose unitária.
Quando são administrados dois ou mais dos segundos agentes terapêuticos mencionados acima com o composto dos exemplos, geralmente a quantidade de cada componente numa dose diária típica e forma de dosagem típica pode ser reduzida relativamente à dose usual do agente quando é administrado isoladamente, em vista do efeito aditivo ou sinergético dos agentes terapêuticos quando administrado em combinação.
Particularmente quando fornecido como uma única dose unitária, existe o potencial de interacção química entre os ingredientes activos combinados. Por esta razão, quando o composto dos exemplos e um segundo agente terapêutico são combinados numa única dose unitária são formulados de modo que, apesar de os ingredientes activos serem combinados numa única dose unitária, o contacto físico entre os ingredientes activos é minimizado (ou seja, reduzido). Por exemplo, um ingrediente activo pode receber um revestimento entérico. Mediante o revestimento entérico de um dos ingredientes activos, é possível não só minimizar o 65 contacto entre os ingredientes activos combinados, como também é possível controlar a libertação de um destes componentes no tracto gastrointestinal, de modo que um destes componentes não seja libertado no estômago mas sim libertado nos intestinos. Um dos ingredientes activos pode também ser revestido com um material com efeitos de libertação controlada ao longo do tracto gastrointestinal e serve também para minimizar o contacto físico entre os ingredientes activos combinados. Além disso, o componente de de libertação controlada pode adicionalmente receber um revestimento entérico de modo que a libertação deste componente ocorra apenas no intestino. Ainda outra abordagem envolveria a formulação de um produto de combinação no qual um componente é revestido com um polímero de libertação controlada e/ou entérica e o outro componente é também revestido com um polímero como uma hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) de baixo grau de viscosidade ou outros materiais apropriados conhecidos na arte, por forma a separar ainda mais os componentes activos. 0 revestimento de polímero serve para formar uma barreira adicional à interacção com o outro componente.
Estas, assim como outras formas de minimizar o contacto entre os componentes de produtos de combinação da presente invenção, quer sejam administrados numa forma de dosagem única ou administrados em formas separadas mas ao mesmo tempo pela mesma via, são prontamente aparentes para os peritos na especialidade, uma vez dispondo da presente apresentação. Adicionalmente, certos compostos apresentados neste documento podem ser úteis como metabolitos de outros compostos. Por conseguinte, numa concretização, os compostos pode ser úteis como um composto substancialmente puro, que pode também ser incorporado numa composição 66 farmacêutica, ou pode ser útil como metabolito que é gerado após a administração do pró-fármaco desse composto. Numa concretização, um composto pode ser útil como um metabolito por ser útil no tratamento de distúrbios conforme descrito neste documento. "Substancialmente puro" tal como utilizado neste documento destina-se a incluir um composto com uma pureza superior a cerca de 90 porcento em peso, incluindo cerca de 90, 91, 92 00 06 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 porcento. Como um exemplo, um composto apresentado neste documento pode ser substancialmente puro possuindo uma pureza superior a cerca de 90 porcento (em peso), enquanto os restantes cerca de 10 porcento de material compreendem outro metabolito do composto, um pró-fármaco do composto e/ou reacção e/ou impurezas de processamento originárias da sua preparação. Obviamente, numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos anteriores. Deverá portanto ter-se em conta que no âmbito das reivindicações anexas, a invenção pode ser praticada de modo diferente do que que é descrito especificamente neste documento.
ANÁLISES IN VIVO E EFICÁCIA N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-(S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolina-4-ilamino)pirrolidina-1-il) ciclohexil)acetamida (também referida como "Exemplo 1") foi avaliada nas seguintes análises in vivo conforme descrito em baixo.
Secção 1. Modelo de inoculação intradérmica (ID) de MCP-1 em métodos em macaco cynomolgus 67
Injecção intradérmica de MCP-1 resulta na infiltração de células mononucleares no local de injecção. Este modelo foi inicialmente desenvolvido para avaliar o efeito inibitório dos antagonistas de CCR2 na infiltração de células mononucleares no tecido cutâneo injectado com MCP-1 humana.
Conforme descrito em baixo, cada macaco recebeu uma dose do Exemplo 1 ou do seu controlo com veiculo (0,5% [p/v] carboximet ilcelulose) uma vez por dia durante três dias. Imediatamente após a administração no Dia 3, todos os animais receberam pelo menos 2 injecções intradérmicas de 10 pg (50 pL/injecção) de MCP-1 humana (R&D Systems) e pelo menos 2 injecções intradérmicas do seu controlo de DPBS (50 pl/injecção) em locais separados da região dorsal do tórax. Biopsias dérmicas de todos os locais foram obtidas aproximadamente 18 horas após a inoculação com MCP-1 (ou DPBS). As biopsias foram processadas para avaliação histológica semiquantitativa. Secções representativas de amostras de pele foram examinadas ao microscópio óptico, tendo sido registadas as lesões microscópicas e a infiltração celular, assim como as suas incidências, numo quadro.
No Estudo 1, o Exemplo 1 foi administrado por via oral em doses de 0, 6,5, 13 ou 26 mg/kg a grupos de de 3 macacos cynomolgus (1 ou 2 por sexo por grupo) . No Estudo 2, animais não tratados foram usados para avaliar o Exemplo 1 a doses de 0, 10 ou 30 mg/kg em grupos de 2 ou 4 animais (1/sexo por grupo de veículo administrado; 2/sexo para o grupo tratado com Exemplo 1) . Para ambos os estudos, além da análise por biopsia, foi colhido sangue e que foi avaliado em contagens celulares completas e diferenciais celulares. Foram também avaliadas amostras plasmáticas para 68 determinar as concentrações do composto e amostras de soro para avaliação dos níveis de mediador inflamatório sistémico.
Resultados
No primeiro estudo, o recrutamento induzido pela MCP-1 nas células mononucleares da pele dos animais tratados com o veículo foi de 2,7 ± 0,3 (numa escala de 0 a 4, Quadro 13) . A 26 mg/kg, o Exemplo 1 inibiu a infiltração (56%) . Duas doses inferiores de 13 e 6,5 mg/kg atingiram níveis de inibição inferiores. O composto também inibiu a infiltração de outros tipos de células, tais como eosinófilos e neutrófilos. As concentrações plasmáticas do composto as 18 horas e a sua relação com os níveis de inibição e os valores de CI90 da quimiotaxia Cyno encontram-se resumidos no quadro 13.
Dois métodos foram usados para determinar a potência inibitória do Exemplo 1 na análise de quimiotaxia in vitro. QUADRO 13
Resumo dos efeitos células mononucleares à inoculação do Exemplo 1 sobre a infiltração de e outros tipos de células em resposta de MCP-1 em macacos Cynomolgus Doses Cone Fold Fold índice índice índice Contage (mg/kg ) plasmá tica livre (nM) CTX Cl 90a CTX Cl 90b MNC (inh%) PMN Eos m celular total 0 0 0 0 2,7±0, 3 (0%) 0,8±0,3 1,83±0, 3 5,3±0,6 69 6, 5 53 00 1—1 0,5 2,2±0, 0,8±0,3 1,3±0,8 4,3±1,6 6 (19%) 0 primeiro emprega PBMC de macaco enquanto o segundo usa células Ll.2 transfectadas estavelmente com Cyno CCR2. 0 primeiro revelou-se altamente variável (CI50 = 5,5 ± 10 nM), tendo o segundo produzido um valor médio mais elevado, mas foi mais consistente (CI50 = 11,4 ± 8 nM) . Com base neste segundo valor, a dose de 2 6 mg/kg resultou numa concentração plasmática livre às 18 horas após a administração de 2X a CI90 da quimiotaxia (Quadro 13).
Resumo dos efeitos do Exemplo 1 sobre a infiltração de células mononucleares e outros tipos de células em resposta à inoculação de MCP-1 em macacos Cynomolgus Doses (mg/kg) Cone plasmát ica livre (nM) Fold CTX Cl90a Fold CTX Cl90b índice MNC (inh%) índice PMN índice Eos Contagem celular total 13 101 3,4 0, 9 2,2±0,3 (19%) 0,7±0,3 1,2±0,6 4,0±0,5 26 238 7,9 2,2 1,2±0,6 (56%) 0,2±0,3 0,5±0 1,8±0,8 aQuimiotaxia com base nas PBMC de Cynomolgus bQuimiotaxia com células L 1.2 expressando estavelmente CCP.2 de Cynomolgus 70
Um segundo estudo foi levado a cabo em macacos não tratados. Comparado com o primeiro estudo, o Exemplo 1 inibiu a infiltração de células mononucleares num grau mais acentuado (91%) a 30 mg/kg (dose alta) e produziu inibição de 87% a 10 mg/kg (Quadro 14). QUADRO 14
Resumo dos efeitos do Exemplo 1 sobre a infiltração de células mononucleares e outros tipos de células em resposta à inoculação de MCP-1 em macacos Cynomolgus Doses (mg/kg) Cone plasmát ica livre (nM) Fold CTX Cl90a Fold CTX Cl90b índice MNC (inh%) índice PMN índice Eos Contagem celular total 0 0 0 0 1,5 (0%) 1,3 0,4 3,2 10 34 1,1 0,37 0,2 ± 0,2 (87%) 0 0,3 ± 0,1 0,5±0,2 30 83 2,8 0, 91 0,1 ±0,3 (91%) 0,1 ±0,3 0,6±0,7 0,8±0,8 a Análise da quimiotaxia com base nas PBMC de Cynomolgus bAnálise da quimiotaxia com células Ll.2 expressando estavelmente CCR2 de Cynomolgus
Em ambos os estudos, a avaliação das alterações nos mediadores inflamatórios séricos mostrou um aumento (~3 vezes) no nível de MCP-1 nos grupos tratados com Exemplo 1 em relação com o controlo com veículo. Além disso, a análise da contagem total do sangue (CBC) mostrou um aumento (~3 vezes) nos neutrófilos nos grupos tratados com o Exemplo 1 em relação ao controlo com veículo.
Um estudo em ratinhos hCCR2 Kl foi conduzido para avaliar o efeito do Exemplo 1 sobre a infiltração de 71 monócitos/macrófagos num modelo de peritonite de tioglicolato (TG) com metodologias baseadas na contagem diferencial de células e em citometria de fluxo.
Secção 2. Métodos de caracterização de CCR2 humano em ratinhos knockin (hCCR2 Kl) 0 ratinho hCCR2 Kl foi geneticamente modificado por substituição do gene do CCR2 do ratinho por uma sequência de codificação do CCR2 humano. 0 ratinho foi obtido no Gladstone Institute de Cardiovascular Diseases na University of Califórnia San Francisco.
Foram utilizados métodos padrão de PCR (especifico do gene e quantitativo) para distinguir o tipo selvagem (gene CCR2 de ratinho) dos alelos alvo (gene CCR2 humano) e para determinar o número de cópias de gene CCR2 humano e o número de cópias de gene CCR2 de ratinho com amostras de ouvido ou cauda. A análise TA-PCR do RNA total isolado do leucócito sanguíneo foi também conduzida para determinar o nível de expressão do RN Am do CCR2 humano e de ratinho. A análise por citometria de fluxo foi usada para determinar a expressão superficial de proteínas de CCR2 humano ou de ratinho nos monócitos sanguíneos. A análise FACS da acumulação de monócitos/macrófagos na cavidade peritoneal em modelos de peritonite induzida por TG (consultar Secção 3) foi usada para determinar a funcionalidade do CCR2 humano nestes ratinhos.
Resultados 72 0 ratinho hCCR2 Kl foi geneticamente modificado por substituição do gene do CCR2 do ratinho por uma sequência de codificação do CCR2 humano. Antes da utilização destes animais para a avaliação in vivo do Exemplo 1, foi conduzida uma caracterização genotípica e fenotipica destes ratinhos. Os estudos genotipicos baseados na PCR (especifico do gene e quantitativo) de amostras de ouvido ou cauda detectaram duas cópias de gene CCR2 humano e quantidades variáveis de produto de PCR, sugerindo a presença de 0 to 2 cópias do gene CCR2 de ratinho. Com o RN A celular total isolado de leucócitos do sangue destes ratinhos Kl, a análise ΤΑ-PCR quantitativa relativa detectou RN Am de CCR2 humano e níveis marginais de produto de PCR com o conjunto inicial designado para detectar RNAm de CCR2 de ratinho. Quando a análise por citometria de fluxo foi usada para detectar a expressão de proteína nos ratinhos CCR2 Kl, foi detectado CCR2 humano, mas não CCR2 de ratinho, tendo sido detectada proteína superficial por coloração de isolados de células de sangue total anticorpos específicos anti-CCR2 humano e anti-CCR2 de ratinho, respectivamente.
Os antagonistas selectivos de hCCR2 bloqueiam a infiltração de monócitos nestes ratinhos hCCR2 Kl, mas não nos ratinhos do tipo selvagem, quando os níveis plasmáticos no estado de equilíbrio abrangem a CI90 da quimiotaxia de CCR2 humano, mas se encontram a uma temperatura inferior aos níveis necessários para inibir a quimiotaxia do CCR2 de ratinho. Além disso, nas análises in vitro que simulam a configuração hCCR2 Kl (MCP-1 de ratinho/CCR2 humano), o Exemplo 1 inibe a ligação da MCP-1 de ratinho ao CCR2 humano expressando hPBMC (CI50 = 2,2 ± 1,2 nM) e 73 quimiotaxia de MCP-1 de ratinho induzida/CCR2 humano mediado de células THP-1 (CI50 = 0,6 ± 0,3 nM) .
Secção 3. Modelo peritonite induzida por tioglicolato (TG) 48 horas em ratinho hCCR2 Kl Métodos
Os ratinhos hCCR2 Kl (C57BL/(-SVJ129) foram injectados por via intraperitoneal com 1 ml de tioglicolato (TG) (Hardy Diagnostics). Para cada estudo foram utilizados oito ratinhos macho por grupo. Exemplo 1 foi doseado por via oral 1 hora antes da injecção de TG. O veiculo utilizado foi 0,01 N HC1 em água. Quarenta e oito horas depois da injecção TG, foram executadas lavagens peritoneais mediante injecção de 5 ml de PBS/10 mM de EDTA/10% BSA na cavidade peritoneal.
Para o estudo de peritonite TG 48 horas, doseou-se exemplo 1 por duas vezes ao dia, sendo a primeira dose administrada uma hora antes da injecção de TG. As contagens celulares peritoneais foram obtidas em células isoladas com um contador de células. Foram realizadas citocentrifugas para determinar as contagens diferenciais de leucócitos. As células foram coloridas durante 3 minutos com Wright-Giemsa Stain (Sigma-Aldrich) e depois foram enxaguadas com água desionizada durante 5 minutos. As contagens diferenciais foram calculadas com base num total de 200 células contadas por amostra. Foi também colhido sangue do seio retro-orbital, ao fim de cada estudo, em EDTA para a determinação da concentração do fármaco.
Para análise de citometria de fluxo, foram lavadas células de exsudado peritoneal (lxlO6) uma vez com tampão 74 FACS (PBS/0,5% BSA) e foram ressuspensas em tampão FACS. As células foram incubadas com um anticorpo de bloqueio Fc (BD Pharmingen) em gelo durante 15 min seguido da adição dos anticorpos seguintes (BD Pharmingen): Conjugado PE anti-F4/80, conjugado FITC anti-Ly6C, e conjugado Alexa 647 anti-hCCR2. Passados 45 min em gelo, as células foram fixas por BD Cytofix durante 15 min em gelo, lavadas por duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 200 μΐ de tampão FACS. Foram adquiridos eventos celulares (40.000) para cada amostra e foram analisados so dados utilizando FloJo software (TreeStar). Um FSC/SSC gate foi preparado para incluir todos os monócitos (SSC baixo, FSC elevado), excluindo simultaneamente granulócitos da análise. Esta população foi depois analisada para detectar expressão de Ly6C (FITC), F4/80 (PE). Os números de monócitos/macrófagos peritoneais foram determinados mediante multiplicação das contagens celulares peritoneais totais, obtidas pelo contador de células e a percentagem dos monócitos/macrófagos identificados pelas células F4/80+ da citometria de fluxo. A significância estatístico das diferenças entre as médias foi analisado utilizando o ensaio t bilateral com significância definida para valores p abaixo de 0,05.
Resultados O exemplo 1 foi avaliado no modelo da peritonite TG em ratinho hCCR2 Kl para determinar o respectivo EC50 na inibição da infiltração de monócitos/macrófagos. Foi administrado tioglicolato aos ratinhos em doses orais com exemplo 1 a 1,5 ou 25 mg/kg BID. Quarenta e oito horas após o tratamento TG obteve-se lavagem peritoneal para análise do infiltrado celular. O exemplo 1 revelou uma redução 75 dependente da dose no número total de leucócitos peritoneais obtido pelo contador de células (figura 15) . Com base nas contagens diferenciais de leucócitos por avaliação morfológica das amostras de lavagens, o exemplo 1 demonstrou uma inibição dependente da dose do influxo de monócitos/macrófagos. As doses de 1,5, 25 mg/kg produziram uma inibição de 20%, 62% e 69% respectivamente. Atingiu-se uma inibição estatisticamente significativa a 5 e 25 mg/kg (figura 15). Em dois estuidos separados, o EC50 médio para inibição da infiltração de monócitos/macrófagos foi estimada como sendo 3,0 ± 0,9 nM. O infiltrado de monócitos/macrófagos recrutado foi também quantificado por citometria de fluxo. Para distinguir entre os monócitos/macrófagos recrutados em comparação com os macrófagos e granulócitos residentes, utilizou-se a coloração de ambos os marcadores de superfície de monócitos/macrófagos F4/80 e Ly6C para definir os monócitos/macrófagos recrutados. Foi observada uma inibição dependente da dose similar na infiltração de monócitos/macrófagos com este método, revelando todas as três doses uma inibição com significado estatístico (figura 16) . As doses de 1,5, 25 mg/kg produziram uma inibição de 38%, 71 % e 86% respectivamente. Em dois estudos separados, o EC50 médio para inibição da inibição de monócitos/macrófagos foi estimada como sendo 2,2 ± 0,5 nM por esta análise.
Para avaliar o nível in vivo de ocupação do receptor pelo exemplo 1 no modelo de peritonite com tioglicolato 48 horas, utilizando o ratinho knock-in hCCR2, mediram-se os níveis de plasma de ligando de MCP-1 tanto do exemplo 1 como de ratinho CCR2. O aviso para esta estimativa consiste em que apenas CCR2 e o respectivo principal ligando MCP-1 76 foram tidos em consideração. A ocupação do receptor de um ligando na presença de um inibidor competitivo encontra-se definida pela equação de Gaddum: IEU = _1_ [R] 1 + (Kd / [L]) (1 + [I] / Kj)
Uma vez que exemplo 1 é um inibidor competitivo da ligação de MCP-1 a CCR2, as quantidades de complexo receptor de MCP-1 de ratinho/CCR2 e complexo receptor de exemplo 1/CCR2 podem ser determinadas utilizando niveis de soro de MCP-1 e exemplo 1 desligado da proteína no plasma. 0 Kd para MCP-1 de ratinho que se liga a hCCR2 é 0, 91 +/-0,08 nM (n=8) que foi determinado em experiências de ligação do ligando de competição a frio, utilizando MCP-1 125I-humano. O Ki médio para a ligação de exemplo 1 que se liga a hCCRl é 1,2 nM. A fracção de complexos receptores de MCP-1 de ratinho/CCR2 é determinada utilizando a forma da equação descrita anteriormente. Para determinar a fracção de complexos de exemplo 1/CCR2 foi redefinida a equação da seguinte forma: mil = _!_ [R] 1 -t-(KLi/[I])(l + [L]/K^)
Finalmente, a quantidade de CCR2 livre foi determinada a partir de: [CCR2] total = [CCR2] livre + [MCP-1 de ratinho/CCR2 ] + (exemplo 1/CCR2]
Como se mostra no quadro 15, a inibição percentual da infiltração de monócitos/macrófagos no peritoneu ao fim de 48 h reflecte a percentagem de complexo receptor exemplo 1/CCR2. 77
Determinação da ocupaçao do receptor in vivo em sangue de ratinhos Hccr2 Kl no modelo peritonite TH 48 horas Dose (mg/kg) Concentração de MCP-1 de rato no plasma (nM) Concentração de exemplo 1 livre no plasma (nM) (vezes ligação de CCCR2 IC90) % de MCP-1 de rato ligado a CCR2 % de exemplo 1 ligado a CCR2 % de CCR2 livre % de inibição da infiltração de monócitos/macrófagosa 25 0,041 24 (1,4) 0,2 95, 0 4,8 86 5 0,043 4 (0,2) 1,1 76, 1 22,8 71 1 0, 027 1 (0,05) 1, 6 44,7 53, 7 38 0 (veiculo) 0, 03 0 3, 2 0 96, 8 0 ° Análise baseada em FACS de monócitos/macrófagos totais
Quadro 15
Secção 4. Métodos dos estudos sobre eficácia crónica
Para estudar o efeito do exemplo 1 em EAE (encefalomielosite autoimune experimental) foi utilizado um modelo de esclerose múltipla, 10 ratinhos por grupo. No dia 0, ratinho hCCR K2 foram imunizados por via subcutânea com um total de 200 μΐ de 300 pg de glicoproteína mielina do oligodendrócito (myelin oligodendrocyte glycoprotein - MOG) 35-55 (Genemed Synthesis) em mistura de 1:1 com 300 pg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) (Becton-Dickinson) em adjuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma-Aldrich). No dia 0 (duas horas pós-imunização) e no dia 2 os ratinhos foram injectados por via intraperitoneal com 100 pl de 400 ng de toxina pertussis. A Classificação clinica teve inicio no dia 10, prosseguiu três vezes por semana ao longo do estudo e baseou-se numa escala 0-5: 0, ausência de sinais de doença, 0,5 fraqueza parcial da cauda, 1 cauda fraca ou andar vacilante com tonicidade da cauda, 1,5 andar vacilante com fraqueza parcial da cauda, 2 andar vacilante 78 com cauda fraca (ataxia), 2,5 (ataxia com paralisia parcial dos membros, 3 paralisia completa de um membro, 3,5 paralisia completa de um membro com paralisia parcial de um segundo membro, 4 paralisia total de dois membros, 4,5 moribundo, 5 morte. A dosagem oral do exemplo 1 a 55 mg/kg (BID) foi iniciada no dia 1.
Resultados
Em dois dos estudos conduzidos o exemplo 1 reduziu significativamente a pontuação clinica (p <0,05) (figura 17) . O IC50 de 2,2 nM para o exemplo 1 na MCP-1 de 1251-ratinho lignado a células expressoras de hCCR2, hPBMC (simulando ambiente hCCR2 Kl) . Com base neste valor de IC50, as doses de 55 mg/kg tiveram como resultado uma concentração no plasma livre igual a ~2 vezes a ligação IC90. A avaliação histológica da medula espinal no dia 22 não demonstrou uma diferença significativa no infiltrado celular inflamatório total entre os ratinhos tratados com exemplo 1 em comparação com os tratados com o veiculo. Foi observado um infiltrado neutrófilo marcado em ratinhos tratados com o composto 79
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
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Documentos de patente citados na descrição: US 0069123 A, M. Xia [0006] WO 2006013427 A2, P Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian [0008] WO 110376 A, C. Abbadie, J. A. Lindia, and H. Wang [0022] WO 9946991 A [0024] WO 2005021500 AI [0028] [0050] US 7163937 B [0050] [0179] [0196] WO 2005021500 A, P. H. Carter[0128] [0138] [0179] [0196] WO 2004098516 A [0140] US 6835841 B [0140] WO 2004110993 A, G. V. Delucca & S. S. Ko [0140] US 6361972 B [0208] US 6410266 B [0208]
Literatura, não relacionada com patentes, citada na descrição:
Charo ; Rasonhoff. New Eng. J. Med., 2006, vol. 354, 610-621 [0002] [0005] 80
Luster. New Eng. J. Med., 1998, vol. 338, 436-445 [0003] [0027]
Rollins. Blood, 1997, vol. 90, 909-928 [0002]
Horuk. Trends Pharm. Sei., 1994, vol. 15, 159-165
Zlotnik ; Oshie. Immunity, 2000, vol. 12,121 [0003]
Ben-Barruch et al. Cell, 1993, vol. 72, 415-425 [0003]
Luster. New Eng. J. Med, 1998, vol. 338, 436-445 [0003]
Charo et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, vol. 91, 2752-2756 [0003]
Combadiere et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 16491-16494 [0003]
Power et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 19495- 19500 [0003]
Sanson et al. Biochemistry, 1996, vol. 35, 3362-3367 [0003]
Baba et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 14893-14898 [0003]
Yoshie et al. J. Leukoc. Biol., 1997, vol. 62, 634-644 [0003]
Napolitano et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 2759- 2763 [0003]
Bonini et al. DNA and Cell Biol., 1997, vol. 16, 1249- 1256 [0003]
Schweickert et al. J. Biol. Chem., 2000, vol. 275, 90550 [0003]
Wells ; Schwartz. Curr. Opin. Biotech., 1997, vol. 8, 741 -748 [0004] 81 Z. Gao ; W. A. [0005] P. H. Cárter. 2002, vol. 6, 510 [ Trivedi et al.
Metz. Chem. Rev., Current Opinion 0005] Ann. Reports Med. 2003, vol. 103, 3733 in Chemical Biology,
Chem., 2000, vol. 35, 191 [0005]
Sanders ; Tarby. Drug Disc. Today, 1999, vol. 4, 80
Premack; Schall. Nature Medicine, 1996, vol. 2, 1174 [0005]
Bao Lu etal. J. Exp. Med., 1998, vol. 187,601 [0005] [0012]
William A. Kuziel et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, vol. 94, 12053 [0005]
Takao Kurihara et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 1757 [0005] M. Feria; F. Diaz-Gonzalez. Exp. Opin . Ther. Patents, 2006, vol. 16, 49 [0005] J. Dawson ; W. Miltz ; C. Wiessner. C. Exp. Opin. Ther. Targets, 2003, vol .7,35 [0005]
Alisa Koch et al. J. Clin. Invest., 1992, vol. 90, 772-779 [0006]
Sawsan Youssef et al. J. Clin. Invest., 2000, vol. 106, 361 [0006]
Hiroomi Ogata et al. J. Pathol., 1997, vol. 182,106
Ralph C. Schimmer et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 1466 [0006] 82
Jiang-Hong Gong et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 131 [0006] C. M. Brodmerkel et al. J. Immunol., 2005, vol. 175, 5370 [0006] [0010] H. Bruhl et al. J. Immunol., 2004, vol. 172, 890 [0006] Μ. P. Quinones et al. J. Clin. Invest., 2004, vol. 113, 856 [0006] Μ. P. Quinones et al. J. Mol. Med., 2006, vol. 84, 503 [0006]
Abdolreza Rezaie-Majd et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2002, vol. 22, 1194-1199 [0007]
Long Gu et al. Mol. Cell, 1998, vol. 2, 275 [0007]
Jennifa Gosling etal. J Clin. Invest., 1999, vol. 103, 773 [0007]
Landin Boring et al. Nature, 1998, vol. 394, 894 [0007] T. C. Dawson et al. Atherosclerosis, 1999, vol. 143, 205 [0007] W. Ni et al. Circulation, 2001, vol. 103, 2096-2101 J. Guo et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2003, vol. 23, 447 [0007] J. Guo et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2005, vol.25, 1014 [0007]
Eckel et al. Lancet, 2005, vol. 365, 1415 [0008]
Chen. Pharmacological Research, 2006, vol. 53,469
Neels ; Olefsky. J. Clin. Invest., 2006, vol. 116, 33 [0008] 83
Danadona ; Aljada. Am J Cardiol., 2002, vol. 90, 27G- 33G [0008]
Pickup; Crook. Diabetologia, 1998, vol. 41, 1241 [0008] Gerhardt. Mol. Cell. Endocrinology, 2001, vol. 175, 81 [0008] P. Sartipy ; D. Loskutoff. Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1999, vol. 96, 6902 [0008] S. Nomura etal. Clin. Exp. Immunol. ,2000, vol. 121, 437 [0008] J. M. Bruun et al. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2005, vol. 90, 2282 [0008]
Sartipy; Loskutoff. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2003, vol. 100, 7265 [0008] H. Xu et al. J. Clin. Invest., 2003, vol. 112, 1821 [0008]
Weisberg et al. J. Clin. Invest., 2003, vol. 112,1796 [0008] H. Kanda et al. J. Clin. Invest., 2006, vol. 116, 1494 [0008] N. Kamei et al. J. Biol. Chem., 2006, vol. 281,26602 [0008] F. Y. Chow et al. Diabetologia, 2007, vol. 50, 471 [0008] C. L. Tsou et al. J. Clin. Invest., 2007, vol. 117, 902 [0008] F. Tacke et al. J. Clin. Invest., 2007, vol. 117, 185 C. N. Lumeng et al. Diabetes, 2007, vol. 56, 16 [0008] [0008] 84 C. N. Lumeng et al. J. Clin. Invest., 2007, vol. 117, 175 [0008] S. P. Weisberg et al. J. Clin. Invest., 2006, vol. 116, 115 [0008] A. Chen etal. Obes. Res., 2005, vol. 13,1311 [0008] E Bush etal. Hypertension, 2000, vol. 36,360 [0009] M Ishibashi et al. Circ. Res., 2004, vol. 94, 1203 [0009]
Carla larlori et al. J. Neuroimmunol. , 2002, vol. 123, 170-179 [0010] K. J. Kennedy et al. J. Neuroimmunol., 1998, vol. 92, 98 [0010] B. T. Fife et al. J. Exp. Med., 2000, vol. 192, 899 [0010] L. Izikson et al. J. Exp. Med., 2000, vol. 192, 1075 [0010] S. Gaupp et al. Am. J. Pathol., 2003, vol. 162, 139 [0010]
Marti ne Reynaud-Gaubert et al. J. of Heart and Lung Transplant, 2002, vol. 21, 721-730 [0011]
John Belperio et al. J. Clin. Invest., 2001, vol. 108, 547-556 [0011] I Lee et al. J. Immunol, 2003, vol. 171, 6929 [0011 ] R Abdi et al. J Immunol, 2004, vol. 172, 767 [0011 ] K Horiguchi et al. J Heart Lung Transplant, 2002, vol. 21, 1090 [0011] A Saiuraetal. Artherioscler Thromb Vase Biol, 2004, vol. 24, 1886 [0011] 85 H Tatewaki et al. J Vase Surg., 2007, vol. 45, [0011]
Jose-Angel Gonzalo et al. J. Exp. Med., 1998, vol. 157 [0012]
Nicholas W. Lukacs et al. J. Immunol., 1997, vol. 4398 [0012]
Clare M. Lloyd et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 1371 [0013]
Gregory H. Tesch et al. J. Clin. Invest., 1999, 103, 73 [0013] G. Perez de Lema et al. J. Am. Soc. Neph., 2005, 16, 3592 [0014] S. Shimizu et al. Rheumatology (Oxford), 2004, vol 1121 [0014]
Gregory H. Tesch et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 1813 [0014] H. Hasegawa et al. Arthritis & Rheumatism, 2003, 48, 2555 [0014] S. J. Connor et al. Gut, 2004, vol. 53, 1287 [0015
Pietro G. Andrés et al. J. Immunol., 2000, vol. 6303 [0015] H.Tokuyamaetal. Int. Immunol.,2005, vol. 17,1023 [ W. I. Khan et al. Ant. J. Physiol. Gastrointest. Physiol., 2006, vol. 291, G803 [0015] H. C. Reinecker et al. Gastroenterology, 1995, 108, 40 [0016]
Michael C. Grimm et al. J. Leukoc. Biol., 1996, 59, 804 [0016] 1236 188, 158, 185, vol. vol. . 43, 190, vol. ] 164, 0015] Liver vol. vol.
[0017] 86 S Karrer et al. J Invest Dermatol., 2005, vol. 124, 92 T Yamamoto ; K Nishioka. J Invest Dermatol, 2003, vol. 121, 510 [0017] AM Ferreira etal. J Invest Dermatol., 2006, vol. 126, 1900 [0017] T Okuma et al. J Pathol., 2004, vol. 204, 594 [0017] M Gharaee-Kermani et al. Cytokine, 2003, vol. 24, 266 [0017] K Kitagawa et al. Am J Patho/., 2004, vol. 165, 237 [0017] T Wada et al. J Am Soc Nephrol, 2004, vol. 15, 940 [0017] S Hayashidani et al. Circulation, 2003, vol. 108, 2134 [0017] [0023] S Tsuruta et al. Int J Mol Med., 2004, vol. 14, 837 [0017]
Michael L. Jones et al. J. Immunol., 1992, vol. 149, 2147 [0018] M. J. Craig ; R. D. Loberg. Câncer Metastasis Rev., 2006, vol. 25, 611 [0019] I. Conti; B. Rollins. Seminars in Câncer Biology, 2004, vol. 14, 149 [0019] R. Giles ; R. D. Loberg. Curr. Câncer Drug Targets, 2006, vol. 6, 659 [0019]
Rosalba Salcedo et al. Blood, 2000, vol. 96, 34-40 [0019] Y. Lu et al. J. Cell. Biochem., 2007, vol. 101, 676 87 Y. Lu et al. Prostate, 2006, vol. 66, 1311 [0019] Y. Lu et al. Câncer Res., 2007, vol. 67, 3646 [0019] F. Cipollone et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., vol. 21, 327 [0020]
Merce Roque et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2002, vol. 22, 554 [0020] A. Schober et al. Circ. Res., 2004, vol. 95, 1125 W. J. Kim et al. Biochem Biophys Res Commun, 2003, vol. 310, 936 [0020] K. Egashira et al. Circ. Res., 2002, vol. 90, 1167 [0020] c. Horvath et al. Circ . Res., 2002, vol. 90,488 [0020] J. S. King et al. J. Neuroimmunol., . 1994 , vol. 56, 127 [0021] Joan W. Berman et al. J. Immunol., 1996, vol. 156, 3017 [0021] 0. B. Dimitrijevic et al. Stroke, 2007, vol. 38, 1345 [0021] P . M. Hughes et al. J. Cereb. Blood Flow Metab., vol . 22, 308 [0021] C. Abbadie et al. Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 2003, vol. 100, 7947 [0022] N. G. Frangogiannis et al. Circulation, 2007, vol. 115, 584 [0023] 88
Mary E. Russell et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, vol. 90, 6086 [0024]
Harry N. Antoniades et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, vol. 89, 5371 [0024] M. Deleuran et al. J. Dermatol. Sei., 1996, vol. 13, 228 [0024] R. Gillitzeret al. J. Invest. Dermatol., 1993, vol. 101, 127 [0024] C. Vestergaard et al. Acta Derm. Venerol., 2004, vol. 84, 353 [0024] P. Spagnolo et al. Am JRespirCrit Care Med., 2003, vol. 168, 1162 [0025] B. J. Doranz et al. Cell, 1996, vol. 85, 1149 [0026]
Ruth I. Connor et al. J. Exp. Med, 1997, vol. 185, 621 [0026]
Michael W. Smith et al. Science, 1997, vol. 277, 959 [0026] G.K. Dresser ; J.D. Spence ; D.G. Bailey. Clin. Pharmacokinet, 2000, vol. 38, 41-57 [0029]
Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1985, 1418 [0090]
Smith, D.K. A FORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns. Lawrence Radiation Laboratory, April 1963 [0099]
Stout ; Jensen. X-Ray Structure Determination: A Practical Guide. Macmillan Co, 1968 [0102] [0119] S. R. Byrn ; R.R. Pfeiffer ; J.G. Stowell. Solid-State
Chemistry of Drugs. West Lafayette, 1999 [0111] 89 J.W. Mullin ; J. Nyvlt. Programmed cooling of batch crystallizes. Chemical Engineering Science, 1971, vol. 26, 369-377 [0114]
Otwinowski, Z. ; Minor. W. Macromolecular Crystallography. Academic, 1997, vol. 276, 307-326 [0159] J. Cosier ; A.M. Glazer. J. Appl. Cryst., 1986, vol. 19, 105 [0160]
Yoshimura et al. J. Immunol., 1990, vol. 145, 292 [0180] W. A. Catterall et al. J. Biol. Chem., 1981, vol. 256, 8922 [0186]
Weiner et al. J. Immunol. Methods, 1980, vol. 36, 89 [0199]
Weiner et al. J. Immunol. Methods, 1980, vol. 36, 89-97 [0201]
Boyum et al. Scand. J. Clin. Lab Invest., 1968, vol. 97, 31 [0203]

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S) - 2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-l-il)ciclohexil)acetamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Composto da reivindicação 1 que é uma forma cristalina de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo- 3- (6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida ou um seu sal f armaceut icamente aceitável.
3. Forma cristalina da reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada por parâmetros de unidade celular substancialmente iguais aos seguintes: Dimensões das células: a= 11,8427 (3) b= 18, 1503 (7) c= 12,7923 (4) a=9 0 β = 105,362(2) γ= 9 0 Grupo espacial Ρ2λ Moléculas/célula unitária 2 em que o referido cristal se encontra a uma temperatura de cerca de +22°C.
4. Forma cristalina de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por um padrão de difracção de raios-x do pó compreendendo três ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1,541 Â) seleccionado de 7,2, 8,7, 9,7, 12,5, 12,8, 13,3, 16,0, 16,6, 18,2 e 18,8 a uma temperatura de cerca de 22°C. 2
5. Forma cristalina de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por um padrão de difracção de raios-x do pó compreendendo quatro ou mais valores 2Θ (CuKa λ=1,541 Â) seleccionado de 7,2, 8,7, 9,7, 12,5, 12,8, 13,3, 16,0, 16,6, 18,2 e 18,8 a uma temperatura de cerca de 22°C.
6. Forma cristalina de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por coordenadas atómicas fraccionais substancialmente iguais às listadas no quadro 7.
7. Composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
8. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização em terapia.
9. Composto de acordo com a reivindicação 8 destinado a utilização no tratamento de uma doença seleccionada de entre diabetes, obesidade, síndroma metabólico, acidente vascular, dor neuropática, cardiomiopatia isquémica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças autominunes, infecção por HIV, demência associada a HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, traumatismo cerebral induzido fisicamente ou quimicamente, doença inflamatória do intestino, alveolite, colite, lúpus sistémico eritematoso, nefrite sérica nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia da neoíntima venosa, hiperplasia da neoíntima do enxerto para diálise, hiperplasia da íntima em shunt arteriovenoso, 3 transplantes de órgãos, nefropatia aloenxerto crónica e cancro.
10. Composto de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, destinado a utilização no tratamento de uma doença seleccionada de entre diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus sistémico eritematoso, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, restenose e transplantes de órgãos.
11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 destinado a utilização no tratamento de uma doença seleccionada de entre esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn e diabetes. 1/16 FIG. 1 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5 (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma sal do ácido di-benzenossulfónico N 1 (Exemplo 2a)
2-Ttieta C) 2/16 FIG. 2 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma base livre N-2 (Exemplo 2f)
3/16 FIG. 3 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma base livre E-l (mono-etanolato), (Exemplo 2d)
4/16 FIG. 4 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma sal HC1 H4-1 (tetra-hidrato), (Exemplo 2h)
5/16 FIG. 5 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5 (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, forma base livre A-l (solvato mono acetona), (exemplo 2e)
6/16 FIG. 6 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma base livre DC-1 (solvato mono-diclorometano) (Exemplo 2b)
7/16 FIG. 7 Padrões de pó experimentais e simulados de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-3-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma base livre AN-3 (solvato mono-acetonitrilo) (Exemplo 2g)
8/16 FIG. 8 DSC de N-((IR, 2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclo-hexil) acetamida, Forma sal di-besilato N-l (Exemplo 2a) 295.97*C 1^5.2^ '7^xj
297.WC Amp so 150 200 Temperatura (°C) —r— 250 300 350 Instrumentos Universal V4 OCTA 9/16 FIG 9 TGA de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-( (S)-2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclo-hexil) acetamida, Forma sal di-besilato N-l (Exemplo 2a) 0 05388% @2«Γ0 ] |0,003349mg) [
'í)-l-'-1--1-1-----1---1-1-1-'-'---1-1-1---1-1-1-'-1--'-'-í 0 30 100 150 200 230 300 350 Temperatura (°C) Instrumentos Universal V4 OCTA 10/16 FIG 10 DSC de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-( (S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclo-hexil) acetamida, Forma base livre N-2 (Exemplo 2f) 161.02¾ 53 29J/g Fluxo térmico (W/g) < •?.vj 163.77¾ ?.·:? *r~ 25 i 75 r 125 Amp Temperatura (°C) 225 275 Instrumentos Universal V4 OCTA 11/16 FIG 11 TGA de N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-( (S)-2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclo-hexil) acetamida, Forma base livre N-2 (Exemplo 2f) 0.02354% @ U&C ij(0.0030i6mg) V. \ -Ι Ο 50 100 iso Temperatura (°C) 250 300 Instrumentos Universal V4 OCTA 12/16 FIG 12 Isotérmica de sorção húmida de N- ( (IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclo-hexil)acetamida, Forma base livre N-2 (Exemplo 2f) % ESC
%RH 13/16 FIG 13 Estrutura cristalina de raios-X de (1R,3R, AS) -3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)ciclo-hexilcarbamato de de terc-butilo
14/16 FIG. 14 Modelo de peritonite TG 48 horas em ratinhos hCCR2 Kl Exemplo 1 inibição da infiltração de monócitos/macrófago na cavidade peritoneal (contagem celular diferencial) Macrófagos Neutrófilos
veh 1 5 25 * p<0.05
veh 1 5 25 Leucócitos totais Contagem celular (x 106)
Exemplo 1 mg/kg p.o. BID Í4‘ 12' !0‘ 18' 16' 14' 12' 10-β' 6-4' 2 0 FIG. 15 15/16 Modelo de peritonite Exemplo 1 inibição da na cavidade peritoneal TG 48 horas em ratinhos hCCR2 Kl infiltração de monócitos/macrófago (análise FACS) A Veículo Exemplo 1 5 mg/kg
B Número de monócitos/macrófagos na Γ cavidade peritoneal
imnlú d ímπ/ίπί Exemplo 1 (mg/kg) + TG 16/16 FIG 16 EAE em ratinhos hCCR2 Kl: Pontuação clínica do tratamento do exemplo 1
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7687508B2 (en) * 2006-07-28 2010-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US8383812B2 (en) * 2009-10-13 2013-02-26 Bristol-Myers Squibb Company N-((1R,2S,5R)-5-(tert-butylamino)-2-((S)-3-(7-tert-butylpyrazolo[1,5-A][1,3,5]triazin-4-ylamino)-2-oxopyrrolidin-1-yl)cyclohexyl)acetamide, a dual modulator of chemokine receptor activity, crystalline forms and processes
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
SI3297438T1 (sl) * 2015-05-21 2022-03-31 Chemocentryx, Inc. CCR2 modulatorji
CA3070423A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of n-((1r,2s,5r)-5-(tert-butylamino)-2-((s)-3-(7-tert-butylpyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ylamino)-2-oxopyrrolidin-1-yl)cyclohexyl)acetamide
CA3075638A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Chemocentryx, Inc. Combination therapy using a chemokine receptor 2 (ccr2) antagonist and a pd-1/pd-l1 inhibitor
US20190269664A1 (en) 2018-01-08 2019-09-05 Chemocentryx, Inc. Methods of treating solid tumors with ccr2 antagonists
WO2019136368A2 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Chemocentryx, Inc. Methods of treating solid tumors with ccr2 antagonists
CN115494184B (zh) * 2022-05-09 2023-07-28 浙江海正药业股份有限公司 一种同时检测药物中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6383082A (ja) 1986-09-26 1988-04-13 Takeda Chem Ind Ltd テトラヒドロフランカルボン酸誘導体の製造法
CA2084800A1 (en) 1991-12-16 1993-06-17 Joseph P. Vacca Hiv protease inhibitors with an internal lactam ring
GB9515411D0 (en) 1995-07-27 1995-09-27 Pharmacia Spa N-(4-substituted-benzyl)-2-aminolactam derivatives
US5827875A (en) 1996-05-10 1998-10-27 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of microsomal triglyceride transfer protein and method
UA51716C2 (uk) 1996-07-08 2002-12-16 Авентіс Фармасьютікалз Продактс Інк. Сполуки, що мають гіпотензивну, кардіопротекторну, анти-ішемічну та антиліполітичну властивості, фармацевтична композиція та способи лікування
US6054579A (en) 1997-06-26 2000-04-25 Leukosite, Inc. Synthesis of substituted lactams
GB9716656D0 (en) 1997-08-07 1997-10-15 Zeneca Ltd Chemical compounds
UA59433C2 (uk) 1998-01-27 2003-09-15 Авентіс Фармасьютікалс Продактс Інк. ЗАМІЩЕНІ ОКСОАЗАГЕТЕРОЦИКЛІЧНІ ІНГІБІТОРИ ФАКТОРА Хa ТА ПРОМІЖНІ СПОЛУКИ ДЛЯ ЇХ ОТРИМАННЯ
US6492553B1 (en) 1998-01-29 2002-12-10 Aventis Pharamaceuticals Inc. Methods for preparing N-[(aliphatic or aromatic)carbonyl)]-2-aminoaetamide compounds and for cyclizing such compounds
EP1051397B1 (en) 1998-01-29 2008-12-31 Aventis Pharmaceuticals Inc. Method for preparing an n- (aliphatic or aromatic)carbonyl -2-aminoacetamide compound and a cyclyzed compound
GB9803228D0 (en) 1998-02-17 1998-04-08 Zeneca Ltd Chemical compounds
US6541208B1 (en) 1998-03-17 2003-04-01 University Of Maryland Biotechnology Institute Diagnostic method for distinguishing HIV-associated dementia from other forms of dementia
AU7354900A (en) 1999-09-09 2001-04-10 Merck & Co., Inc. Inhibitors of prenyl-protein transferase
US6620823B2 (en) 2000-07-11 2003-09-16 Bristol-Myers Squibb Pharme Company Lactam metalloprotease inhibitors
CA2432369A1 (en) 2000-12-20 2002-08-08 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
JP2005506949A (ja) * 2000-12-20 2005-03-10 ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・ファーマ・カンパニー ケモカイン受容体の調節剤としてのジアミン
EP1373494B1 (en) 2001-03-29 2006-03-01 Topo Target A/S Succinimide and maleimide derivatives and their use as topoisomerase ii catalytic inhibitors
GB0114867D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
DE10135043A1 (de) * 2001-07-11 2003-01-30 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte 3-Heteroaryl(amino- oder oxy)-pyrrolidin-2-one, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung als Herbizide oder als Pflanzenwachstumsregulatoren
WO2003075853A2 (en) 2002-03-08 2003-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
TW200307667A (en) * 2002-05-06 2003-12-16 Bristol Myers Squibb Co Sulfonylaminovalerolactams and derivatives thereof as factor Xa inhibitors
AU2003263393A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Glenmark Pharmaceuticals Limited New heterocyclic amide compounds useful for the treatment of inflammatory and allergic disorders: process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
TW200508224A (en) * 2003-02-12 2005-03-01 Bristol Myers Squibb Co Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US7338975B2 (en) * 2003-02-12 2008-03-04 Bristol-Myers Squibb Co. Lactams as modulators of chemokine receptor activity
US7230133B2 (en) * 2003-05-01 2007-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Malonamides and malonamide derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US7291615B2 (en) 2003-05-01 2007-11-06 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US20060205761A1 (en) 2003-06-06 2006-09-14 Catherine Abbadie Ccr-2 antagonists for treatment of neuropathic pain
US7378409B2 (en) * 2003-08-21 2008-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Substituted cycloalkylamine derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US7317019B2 (en) * 2003-08-21 2008-01-08 Bristol Myers Squibb Co. N-alkylated diaminopropane derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US7863317B2 (en) * 2003-08-21 2011-01-04 Bristol-Myers Squibb Company Lactams of alkylated acyclic diamine derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US20050043392A1 (en) * 2003-08-21 2005-02-24 Carter Percy H. Lactams of alkylated acyclic diamine derivatives as modulators of chemokine receptor activity
US7163937B2 (en) 2003-08-21 2007-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
MX2007001204A (es) 2004-07-30 2007-03-23 Pfizer Prod Inc Procedimientos para tratar las enfermedades o trastornos mediados por ccr2.
BRPI0516166A (pt) * 2004-09-28 2008-08-26 Janssen Pharmaceutica Nv antagonista do ccr2 de dipiperidina substituìda

Also Published As

Publication number Publication date
AR062114A1 (es) 2008-10-15
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US20080027083A1 (en) 2008-01-31
CL2007002194A1 (es) 2008-02-08
IL196518A0 (en) 2009-11-18
CY1110785T1 (el) 2015-06-10

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