PT1960427E

PT1960427E - Polipéptidos receptores de fc multiméricos

Info

Publication number: PT1960427E
Application number: PT06828004T
Authority: PT
Inventors: Phillip Mark Hogarth; Bruce David Wines
Original assignee: Suppremol Gmbh
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2011-03-22
Also published as: PL1960427T3; EP1960427B1; EP1960427A1; ES2359218T3; ATE499384T1; DE602006020333D1; EP1960427A4; WO2007068047A1

Description

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DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS RECEPTORES DE FC MULTIMÉRICOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipéptidos receptores de Fc multiméricos solúveis capazes de inibir interacções de receptores de Fcy (FcyR) de leucócitos com imunoglobulina G (IgG). Tais polipéptidos são úteis no tratamento de doenças inflamatórias, particularmente doenças inflamatórias mediadas pelo complexo imunitário tais como artrite reumatóide (AR), púrpura trombocitopénica imunitária (PTI) e lúpus sistémico eritematoso (LSE).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O tratamento de doenças inflamatórias auto-imunes e outras tais como AR e LSE entrou numa nova e empolgante fase onde uma maior compreensão das moléculas envolvidas no sistema imunitário permitiu a inibição especifica de moléculas inflamatórias chave tais como o factor de necrose tumoral-a (TNFa) e a interleucina 1β (IL-Ιβ) . Por exemplo, em estudos recentes, mostrou-se que os anticorpos podem ter um poderoso papel na patogénese de AR e, em ensaio clínicos humanos, respostas positivas à utilização de terapia de anticorpos monoclonais (MAb) anti-CD20 para eliminar células B produtoras de anticorpos têm gerado fortes provas do papel significativo dos anticorpos em AR (Emery et ai., 2001) . Uma vez que os receptores de Fc (FcR) desempenham papéis cruciais em sistemas efectores baseados em imunoglobulina, a inibição da função de FcR pode proporcionar a base de uma terapia eficaz para uma variedade de doenças. Além disso, uma vez que os receptores de Fcy (FcyR) são cruciais para os sistemas efectores para IgG, atingir a interacção entre FcyRs de leucócitos e 2 anticorpos proporciona uma nova oportunidade para intervenção terapêutica em AR (Nabbe et al., 2003). Uma abordagem para alcançar uma tal intervenção que é de interesse para o presente requerente é a utilização de uma forma solúvel de um FcyR para actuar como "engodo" para prevenir a activação dos leucócitos pelos anticorpos.

Os receptores de Fc (FcR) são glicoproteinas da superfície dos leucócitos que se ligam especificamente à porção Fc dos anticorpos. Os receptores para IgG, isto é FcyR, são os mais disseminados e diversos, sendo os principais tipos FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16).

Os complexos imunitários (Cl) que se formam in vivo em respostas imunitárias normais, e os observados na patologia de doenças auto-imunes tais como AR, podem envolver simultaneamente muitos FcR. Por exemplo, em humanos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos activados podem expressar FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb e FcyRIII (Takai, 2002) . No entanto, destes, o FcyRIIa é o principal iniciador de inflamação mediada por Cl e, embora todos os tipos de FcyR envolvam a região charneira inferior do domínio Fc de IgG e os domínios CH2 de modo que qualquer polipéptido FcyR de engodo solúvel possa inibir a ligação de IgG a todas as classes de FcyR, o presente requerente percebeu que uma vez que FcyRIIa mostra a mais ampla especificidade de ligação e a mais elevada selectividade para ligação de complexos imunitários de IgG ávidos, o desenvolvimento e a investigação de um FcyRIIa solúvel oferece o maior potencial. WO-A2 2004/062619 e Li et al., 2001 divulgam proteínas de fusão homodiméricas de regiões de ligação a Fc cada uma 3 fundida com o domínio charneira de IgG2. A dimerização destas proteínas de fusão ocorre através de pontes dissulfureto entre os domínios charneira.

De facto, estudos anteriores mostraram que um simples polipéptido FcyRIIa solúvel recombinante (monómero rsFcyRIIa) , consistindo em ectodomínios de FcyRIIa (Ierino et al., 1993a), é claramente capaz de inibir inflamação mediada por Cl. Nestes estudos, o rsFcyRIIa foi testado utilizando a reacção de Arthus, em que complexos imunitários são formados na derme através da administração passiva de anticorpo e antigénio (Pflum et al., 1979), que é um modelo de vasculite (uma complicação extra-articular em artrite) e ocorre também em LSE. Verificou-se que enquanto o monómero rsFcyRIIa inibia a inflamação e a infiltração de neutrófilos quando co-administrado com o anticorpo e antigénio, foram necessárias grandes quantidades do monómero rsFcyRIIa devido a um nível relativamente baixo de selectividade para os complexos imunitários. Para superar este problema, o presente requerente propôs a utilização de uma forma multimérica do engodo rsFcyRIIa, e desde então verificou, surpreendentemente, que não só podia uma forma multimérica ser expressa com sucesso, como também exibir maior selectividade para os complexos imunitários. Tais polipéptidos rsFcyRIIa multiméricos mostram portanto uma promessa considerável para o tratamento de doença inflamatória mediada por Cl tal como AR e LSE.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel capaz de inibir a interacção de receptores de Fcy 4 (FcyR) de leucócitos com a imunoglobulina G (IgG), compreendendo a referida proteína ou polipéptido duas regiões de ligação a Fc ligadas, pelo menos uma das quais é derivada de um receptor de tipo FcyR.

De preferência, a proteína ou o polipéptido é um multímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRII, particularmente FcyRIIa. Uma tal molécula pode ser considerada como sendo um homomultímero, e uma molécula especialmente preferida deste tipo é um homodímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRII. No entanto, a presente invenção contempla também que a molécula possa ser um multímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyR (p.ex. um receptor de tipo FcyRII) e uma região de ligação a Fc de outra fonte (por exemplo uma região de ligação a Fc de outro tipo de receptor de Fc ou um polipéptido de ligação a Fc sintético). Uma molécula deste tipo pode ser considerada como sendo um heteromultímero, e uma molécula especialmente preferida deste tipo é um heterodímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRII e uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRIII.

As regiões de ligação a Fc são ligadas através de uma ligação peptídica ou através de uma curta sequência ligadora (por exemplo um único aminoácido ou um péptido curto, por exemplo, 2 a 20 aminoácidos de comprimento).

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto. 5 A molécula polinucleotídica pode consistir numa cassete de expressão ou vector de expressão (por exemplo um plasmideo para introdução numa célula hospedeira bacteriana, ou um vector virai tal como um vector de baculovirus para transfecção de uma célula hospedeira de insecto, ou um plasmideo ou vector virai tal como um lentivírus para transfecção de uma célula hospedeira de mamifero).

Assim, num terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira recombinante contendo uma molécula polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto.

Num quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para produção de uma proteína ou polipéptido, compreendendo o método os passos de: (i) proporcionar uma célula hospedeira recombinante contendo uma molécula polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto, (ii) cultura da referida célula hospedeira num meio de cultura adequado e sob condições adequadas para expressão da referida proteína ou polipéptido multimérico solúvel, e (iii) isolamento da referida proteína ou polipéptido multimérico solúvel a partir do meio de cultura.

Num quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um sujeito para uma doença inflamatória, compreendendo o referido método a administração ao referido sujeito de uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro 6 aspecto opcionalmente em combinação com um transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 proporciona a sequência nucleotídica (e a sequência de aminoácidos traduzida) para uma construção de um homodimero cabeça-com-cauda de duas regiões extracelulares de FcyRIIa compreendendo cada uma ambos os ectodominios de FcyRIIa, nomeadamente os ectodominios 1 e 2. Os ectodominios 1 e 2 de FcyRIIa consistem nos aminoácidos 1 a 174 da sequência polipeptidica de FcyRIIa com os aminoácidos 1 a 88 compreendendo o domínio 1 e os aminoácidos 89 a 174 compreendendo o domínio 2 (Hibbs et al., 1988; "Homo sapiens Fc fragment of IgG, low affinity lia receptor (CD32) (FCGR2A), mRNA", ENTRADA NM_021642; e Powell et al., 1999). Na Figura, os aminoácidos 1 a 182 são derivados da região extracelular de FcyRIIa, da qual os aminoácidos 1 a 174 constituem os ectodominios 1 e 2 de FcyRIIa e os aminoácidos 175 a 182 constituem o pedúnculo próximo membranar (que em FcyRIIa liga os ectodominios 1 e 2 à sequência transmembranar). A primeira das regiões extracelulares de FcyRIIa constituindo o dímero consiste portanto nos aminoácidos 1 a 182 e a segunda das regiões extracelulares de FcyRIIa consiste nos aminoácidos 184 a 362 (correspondendo aos aminoácidos 3 a 182 de FcyRIIa). 0 aminoácido sublinhado representa um resíduo de aminoácido não ligador de FcyRIIa, enquanto que os aminoácidos a negrito realçam um marcador His6 C-terminal. A Figura 2 mostra uma análise Western Blot das formas multiméricas recombinantes solúveis (rs) de FcyRIIa. 0 dímero de rsFcyRIIa era substancialmente estável com apenas 7 uma pequena quantidade do produto de degradação monómero de rsFcyRIIa evidente. Por outro lado, as formas triméricas e tetraméricas de rsFcyRIIa eram instáveis, sendo substancialmente degradadas na forma dimérica de rsFcyRIIa. Esta degradação pode ser evitada através da utilização de inibidores de proteases durante a produção ou de outro modo modificando a sequência das formas multiméricas para remover o local ou locais de clivagem. A Figura 3 mostra um SDS-PAGE corado com Coomassie (gel de acrilamida a 12%, sob condições não redutoras) de fracções colhidas a partir da purificação do monómero de rsFcyRIIa (expresso a partir de células de mamifero) possuindo o tamanho esperado de »30 kDa (a), e do dímero de rsFcyRIIa possuindo o tamanho esperado de »=50 kDa (b) . A Figura 4 mostra graficamente as respostas de ligação em equilíbrio do monómero de rsFcyRIIa ao (a) monómero de IgG (Sandoglobulin) imobilizado e ao (b) complexo imunitário modelo, IgG agregada por calor (HAGG). A Figura 5 mostra graficamente as respostas de ligação em equilíbrio do dímero de rsFcyRIIa ao (a) monómero de IgG (Sandoglobulin) imobilizado e ao (b) complexo imunitário modelo, HAGG. A Figura 6 proporciona um gráfico da ligação do monómero de rsFcyRIIa (a) e do dímero de rsFcyRIIa (b) ao monómero de IgG humana (Sandoglobulin) imobilizado após reacção prévia em solução com monómero de IgG humana (Sandoglobulin) e dímero-IgG (Wright et al., 1980), determinado utilizando um protocolo de ensaio padrão BIAcore. 8 A Figura 7 proporciona gráficos de (a) inibição da ligação de dímero-IgG (Wright et al., 1980) a neutrófilos humanos (voluntário V5) pelo monómero de rsFcyRIIa purificado e dimero de rsFcyRIIa calculada como uma percentagem da actividade de ligação de dímero-IgG não inibida e (b) inibição da ligação de dímero-IgG a neutrófilos humanos (voluntário VI) pelo dimero de rsFcyRIIa purificado calculada como uma percentagem do dimero de ligação a dímero-IgG. A Figura 8 proporciona em (a) um gráfico da secreção de TNF estimulada pelo complexo imunitário (dímero-IgG) a partir de MDMs humanos com 24 horas de diferenciação (voluntário V5) na ausência e na presença de dimero de rsFcyRIIa (em sobrenadante a 2,5 yg/ml); enquanto que em (b), proporciona um gráfico da secreção de TNF estimulada pelo complexo imunitário (dímero-IgG) a partir de MDMs humanos com 24 horas de diferenciação (voluntário VI) , na ausência e na presença de dimero de rsFcyRIIa (2,5 yg/ml). A Figura 9 proporciona um gráfico da activação de plaquetas humanas estimulada pelo complexo imunitário (HAGG), medida através da intensidade média da fluorescência (MFI) da expressão de P-selectina na ausência e na presença de dimero de rsFcyRIIa (30 yg/ml). A Figura 10 proporciona resultados da análise do dimero de rsFcyRIIa isolado a partir de células CHO-S estavelmente transfectadas através de SDS-PAGE sob condições (a) não redutoras e (b) redutoras, (c) Western blotting utilizando um anticorpo anti-FcyRIIa, e (d) HPLC. O dimero de rsFcyRIIa migra como uma banda única no peso molecular 9 esperado («50 kDa), reage com anticorpo anti-FcyRlla e era >96% puro, determinado através de análise de HPLC. A Figura 11 proporciona um gráfico da ligação do complexo imunitário (HAGG) ao FcyRIIb humano expresso na superfície celular (na linha celular de linfoma B de murídeo IIA1.6) na presença de monómero rsFcyRIIa ou dímero de rsFcyRIIa. A Figura 12 proporciona um gráfico de plaquetas activadas (positivas tanto para CD41 como para CD62P) após tratamento com HAGG na presença de monómero de rsFcyRIIa ou dímero de rsFcyRIIa, como uma percentagem das plaquetas activadas após tratamento apenas com HAGG. A Figura 13 proporciona um gráfico de libertação de TNF-α a partir de células MC/9 após incubação com complexos imunitários OVA na presença de monómero de rsFcyRIIa ou dímero de rsFcyRIIa, como uma percentagem de TNF-a libertado na presença de apenas complexos imunitários OVA. A Figura 14 mostra uma análise Western blot de proteínas de fusão de rsFcyRIIa. (1) monómero de rsFcyRIIa; (2) dímero de rsFcyRIIa; (3) monómero de rsFcyRIIa fundido com IgGi-Pcyl (L234A, L235A); (4) dímero de rsFcyRIIa fundido com IgGi-Fcyl (L234A, L235A); (5) monómero de rsFcyRIIa fundido com albumina do soro humano (HSA); (6) dímero de rsFcyRIIa fundido com HSA; (7) monómero padrão de rsFcyRIIa purificado; e (8) dímero padrão de rsFcyRIIa purificado. A Figura 15 proporciona os resultados de um ELISA de captura de HAGG com fusões do monómero de rsFcYRIIa e dímero de rsFcYRIIa. (a) monómero padrão de FcYRIIa (Powell 10 et al.r 1999) a partir de 0,75 yg/ml (pad. monómero); proteína de células transfectadas com a construção de monómero de rsFcYRIIa (transfecção 426 (monómero)); proteína de células transfectadas com a construção da fusão de monómero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) (monómero-Fc); e proteína de células transfectadas com a construção de fusão de monómero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-monómero); (b) dímero padrão de rsFcYRIIa a partir de 0,5 yg/ml (pad. dímero); sobrenadante de células transfectadas com dímero de rsFcYRIIa (transfecção 427 (dímero)); sobrenadante de células transfectadas com a fusão de dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) (dímero-Fc); e sobrenadante de células transfectadas com a fusão de dímero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-dímero). A Figura 16 proporciona resultados obtidos a partir de um ELISA CAPTURE-TAG nas proteínas de fusão de monómero de rsFcYRIIa e dímero de rsFcYRIIa para confirmar a presença de epitopos que estabelece que o receptor está correctamente dobrado. (A) monómero padrão de rsFcYRIIa a partir de 0,75 yg/ml (pad. monómero); sobrenadante de células transfectadas com monómero de rsFcYRIIa (transfecção 426 (monómero)); sobrenadante de células transfectadas com a fusão de monómero de rsFcYRIIa com IgG-FcyI (L234A, L235A) (monómero-Fc); e sobrenadante de células transfectadas com a fusão de monómero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-monomer); (B) dímero padrão de rsFcYRIIa (preparado no laboratório) a partir de 0,5 yg/ml); sobrenadante de células transfectadas com dímero de FcYRIIa (transfecção 427 (dímero)); sobrenadante de células transfectadas com a fusão de dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcyI (L234A, L235A) (dímero-Fc); e sobrenadante de células transfectadas com a fusão de dímero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-dímero). 11 A Figura 17 proporciona um diagrama esquemático de (a) monómero de rsFcYRIIa; (b) dimero de rsFcYRIIa; (c) um dimero de uma fusão de monómero de rsFcYRIIa com igG-FcYl (L234A, L235A), em que a dimerização é efectuada através de domínios Fc dos polipéptidos de fusão do monómero de rsFcYRIIa, proporcionando uma molécula possuindo duas regiões de ligação a Fc (i.e. uma proteína que é dimérica para a região de ligação a Fc ou, de outro modo, tem uma "valência de dois"); (d) um dimero da fusão de dimero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A), em que a dimerização é efectuada através dos dois domínios Fc do dimero dos polipéptidos de fusão de dimero de rsFcYRIIa, proporcionando uma molécula possuindo quatro regiões de ligação a Fc (i.e. uma proteína que é tetramérica para a região de ligação a Fc ou, de outro modo, tem uma "valência de quatro"); (e) fusão de monómero de rsFcYRIIa com HSA; e (f) fusão de dimero de rsFcYRIIa com HSA. Na Figura, Dl e D2 referem-se, respectivamente, aos ectodomínios 1 e 2, a barra a cheio mostrada adjacente a D2 representa uma sequência ligadora, a volta escura por cima dos domínios Fc dimerizados em (c) e (d) representa ligações dissulfureto, e Ηε refere-se a uma etiqueta His).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel capaz de inibir a interacção de receptores de Fcy de leucócitos (FcyR) com imunoglobulina G (IgG) que compreende duas regiões de ligação a Fc, uma das quais é essencialmente derivada de um receptor de tipo FcyR. Uma tal proteína ou polipéptido oferece um aumento na selectividade para complexos imunitários em relação à anteriormente observada com polipéptidos monoméricos solúveis tais como o monómero de 12 rsFcYRII, e proporciona deste modo uma promessa considerável como molécula de "engodo" para o tratamento de doença inflamatória mediada por Cl tal como AR e LSE.

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona portanto uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel capaz de inibir a interacção de receptores de Fcy (FcyR) de leucócitos com a imunoglobulina G (IgG), compreendendo a referida proteína ou polipéptido duas regiões de ligação a Fc ligadas, pelo menos uma das quais é derivada de um receptor de tipo FcyR.

Tal como aqui utilizado, o termo "solúvel" indica que a proteína ou o polipéptido não está ligado a uma membrana celular e é, concordantemente, caracterizado pela ausência ou perturbação funcional de todo ou de uma parte substancial do domínio transmembranar (i.e. lipofílico), para que o receptor solúvel fique desprovido de qualquer função de ancoramento membranar. Os domínios citoplasmáticos podem também estar ausentes.

Tal como aqui utilizado, o termo "região de ligação a Fc" refere-se a qualquer parte ou partes de um receptor de Fc que seja capaz de se ligar a um domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina (p.ex. um fragmento Fc produzido através de hidrólise com papaína de uma molécula de imunoglobulina) incluindo versões geneticamente modificadas desta, bem como polipéptidos de ligação a Fc sintéticos. A pelo menos uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyR pode ser derivada, por exemplo, de um FcyR possuindo baixa afinidade para IgG, que é uma afinidade para IgG de menos de 5χ107 M_1. Tais receptores de baixa afinidade incluem receptores de tipo FcyRII (p.ex. 13

FcYRlla, FcYRllb e FcyRIIc), receptores de tipo FcyRIII (p.ex. FcYRIIIa e FcYRIIIb), formas truncadas de receptores de tipo FcyRI (por exemplo FcyRIa e FcYRIb) tais como polipéptidos truncados compreendendo o primeiro e segundo dos três ectodominios de um receptor FcyRI (Hulett et al., 1991; Hulett et al., 1998), e versões geneticamente modificadas de FcyR que normalmente têm elevada afinidade para IgG mas em virtude das modificações (p.ex. uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos) mostram uma reduzida afinidade para IgG de menos de 5><107 M'1) .

De preferência, a proteína ou o polipéptido é um homomultímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor FcyR tal como um FcyR de baixa afinidade. Uma região de ligação a Fc adequada consiste em todo ou numa parte ou partes de ligação a Fc de um ou mais ectodominios de um receptor FcyR. Os peritos na arte serão capazes de identificar facilmente ectodominios de ligação a Fc dos receptores FcyR uma vez que estes domínios pertencem à superfamília de domínios de IgG (Hulett et al., 1994, Hulett et al., 1995, Hulett et al., 1998, e Tamm et aL, 1996) e são tipicamente caracterizados por "uma sanduíche de triptofano" (p.ex. resíduos W90 e W113 de FcYRlla) e outros resíduos (p.ex. em FcYRlla; resíduos do ligador do ectodomínio 1 e ectodomínio 2, e as voltas BC (W113-V119), C'E (F132-P137) e FG (G159-Y160) do ectodomínio 2 (Hulett et al., 1994)) .

De maior preferência, a proteína ou o polipéptido é um homomultímero de uma região de ligação a Fc de FcYRlla. Uma região de ligação a Fc de FcYRlla adequada consiste em todo ou numa parte ou partes de ligação a Fc dos ectodominios 1 e 2 de FcYRlla. Os ectodominios 1 e 2 de FcYRlla verificam- 14 se dentro dos aminoácidos 1 a 172 da sequência de aminoácidos de FcYRIIa (Hibbs et al., 1988, e ENTRADA NM_021642) . Um exemplo de uma parte de ligação a Fc dos ectodominios 1 e 2 de FcYRIIa é um fragmento compreendendo os aminoácidos 90 a 174 da sequência de aminoácidos de FcYRIIa, que inclui os resíduos do ligador do ectodomínio 1 e ectodomínio 2 e as voltas BC (W113-V119), C'E (F132-P137) e FG (G159-Y160) do ectodomínio 2. Estudos de cristalografia de raios X revelaram que dentro deste fragmento, os aminoácidos 113-116, 129, 131, 133, 134, 155, 156 e 158-160 dão importantes contribuições para a superfície do fragmento que é capaz de se ligar ao domínio Fc de IgG (Descrição da patente Internacional n°. WO 2005/075512) . A proteína ou o polipéptido pode também ser um heteromultímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRII e uma região de ligação a Fc de outra fonte (p.ex. uma região de ligação a Fc de outro tipo de receptor de Fc tal como outro tipo de FcyR ou uma região de ligação a Fc de outros receptores de imunoglobulina tais como receptores para IgA e IgE). Uma molécula especialmente preferida deste tipo é um heterodímero de uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRII (particularmente, FcYRIIa) e uma região de ligação a Fc derivada de um receptor de tipo FcyRIII.

As regiões de ligação a Fc consideradas como tendo sido "derivadas de" um determinado receptor de Fc incluem regiões de ligação a Fc possuindo uma sequência de aminoácidos que é equivalente à de um receptor de Fc bem como regiões de ligação a Fc que incluem uma ou mais modificações de aminoácidos da sequência da região de ligação a Fc tal como verificada num receptor de Fc. Tal 15 modificação ou modificações de aminoácidos podem incluir uma ou mais substituições, deleções, adições de aminoácidos ou uma combinação de qualquer uma destas modificações, e podem alterar a actividade biológica da região de ligação a Fc relativamente à de um receptor de Fc (p.ex. a modificação ou modificações de aminoácidos podem aumentar a selectividade ou afinidade para complexos imunitários; tais modificações nos aminoácidos 133, 134, 158-161 são descritas na descrição da patente Internacional n°. WO 96/08512). Por outro lado, regiões de ligação a Fc derivadas de um determinado receptor de Fc podem incluir uma ou mais modificações de aminoácidos que não alterem substancialmente a actividade biológica da região de ligação a Fc relativamente à de um receptor de Fc. Modificação ou modificações de aminoácidos deste tipo compreenderão tipicamente uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas. Substituições de aminoácidos conservativas exemplares são proporcionadas na Tabela 1 abaixo. As substituições de aminoácidos conservativas particulares consideradas são: G, A, V, I, L, M, D, E, N, Q, S, C, T, K, R, H e P, Να-alquilaminoácidos. Em geral, as substituições de aminoácidos conservativas serão seleccionadas com base em não terem qualquer efeito substancial (a) na estrutura do esqueleto polipeptidico da região de ligação a Fc no local da substituição, (b) na carga ou hidrofobicidade do polipéptido no local da substituição, e/ou (c) no volume da cadeia lateral de aminoácidos no local da substituição. Quando uma região de ligação a Fc incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas é preparada através de sintese, a região de ligação a Fc pode incluir também um aminoácido ou aminoácidos não codificados pelo código genético, tais como ácido γ-carboxiglutâmico e hidroxiprolina e D-aminoácidos. 16

Tabela 1 Substituições de aminoácidos conservativas exemplares

Substituições Conservativas Ala Vai*, Leu, Ile Arg Lys*, Gin, Asn Asn Gin*, His, Lys, Arg, Asp Asp Glu*, asn Cys Ser Gin Asn*, His, Lys, Glu Asp*, ácido γ-carboxiglutâmico (Gla) Gly Pro His Asn, Gin, Lys, Arg* Ile Leu*, Vai, Met, Ala, Phe, norleucina (Nle) Leu Nle, Ile*, Vai, Met, Ala, Phe Lys Arg*, Gin, Asn, ornitina (Orn) Met Leu*, Ile, Phe, Nle Phe Leu*, Vai, Ile, Ala Pro Gly*, hidroxiprolina (Hyp),Ser, Thr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe*, Thr, Ser Vai Ile, Leu*, Met, Phe, Ala, Nle *indica as substituições conservativas preferidas

As regiões de ligação a Fc são ligadas através de uma ligação peptidica ou através de uma curta sequência ligadora (p.ex. um único aminoácido ou um péptido curto, por exemplo, de 2 a 20 aminoácidos de comprimento).

De preferência, a proteina ou o polipéptido da presente invenção compreende um polipéptido em que as regiões de ligação a Fc são ligadas numa disposição "cabeça com cauda". Isto é, o terminal C ("cauda") de uma primeira região de ligação a Fc será ligado ao terminal N ("cabeça") de uma segunda região de ligação a Fc. Haverá duas regiões de ligação a Fc ligadas numa disposição cabeça com cauda. As regiões de ligação a Fc serão ligadas através de uma 17 ligação peptídica ou através de uma curta sequência ligadora (por exemplo um único aminoácido ou um curto péptido, por exemplo, de 2 a 20 aminoácidos de comprimento ou, de preferência, de 2 a 15 aminoácidos de comprimento, 2 a 10 aminoácidos de comprimento, 2 a 8 aminoácidos de comprimento, ou, de maior preferência, de 2 a 5 aminoácidos de comprimento). Sequências ligadoras curtas adequadas podem ser sequências curtas aleatórias ou podem compreender fragmentos curtos de uma região sem ligação a Fc de FcyR (p.ex. fragmentos curtos de 20 ou menos aminoácidos da região proximal do pedúnculo membranar de FcyR). A sequência ligadora pode ser uma sequência ligadora sintética tal como, por exemplo, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 4) que tem uma baixa susceptibilidade à proteólise. Uma tal sequência ligadora pode ser proporcionada na forma de 2 a 5 unidades "Gly4Ser" em cadeia. A ligação das regiões de ligação a Fc através de uma ligação peptídica ou de uma sequência ligadora curta permite a produção do polipéptido utilizando sistemas de expressão recombinante.

Numa forma de realização particularmente preferida de um polipéptido de acordo com a invenção, o polipéptido compreende duas regiões de ligação a Fc de FcYRIIa ligadas numa disposição cabeça com cauda. E numa outra forma de realização particularmente preferida de um polipéptido de acordo com a invenção, o polipéptido compreende duas regiões extracelulares de FcYRIIa compreendendo cada uma os ectodominios 1 e 2, em que as referidas regiões extracelulares estão ligadas numa disposição cabeça com cauda através de um ligador compreendendo 1 a 20 aminoácidos. 18 0 polipéptido da presente invenção pode ainda compreender uma proteína ou polipéptido transportador (i.e. de modo a que o polipéptido seja uma "fusão" da proteína ou polipéptido transportador com as referidas duas ou mais regiões de ligação a Fc ligadas). A proteína transportadora pode ser qualquer proteína ou polipéptido transportador bem conhecido dos peritos na arte, mas é, de preferência, albumina do soro humano (HSA) ou outra proteína transportadora vulgarmente utilizada para melhorar a biodisponibilidade (i.e. através de aumento da semi-vida sérica do polipéptido quando administrado a um sujeito). Convenientemente, a proteína transportadora pode ser fundida com o polipéptido através da expressão do polipéptido como uma proteína de fusão com a referida proteína transportadora de acordo com qualquer um dos métodos bem conhecidos dos peritos na arte. 0 polipéptido da presente invenção pode ainda compreender outras moléculas ligadas úteis, por exemplo, etilenoglicol (i.e. para produzir um polipéptido PEGuilado) para melhorar a biodisponibilidade, moléculas reguladoras do complemento tais como CD46, CD55 e CD59, citocinas (por exemplo para permitir a distribuição de citocinas a locais de inflamação) e receptores de citocinas.

Ainda, tal como mencionado acima, domínios polipeptídicos fundidos que sejam capazes de se ligar um ao outro, podem ser utilizados para produzir uma proteína ou um polipéptido de acordo com a invenção.

Assim, através da utilização, por exemplo, de um polipéptido compreendendo duas regiões de ligação a Fc fundidas com um domínio polipeptídico capaz de se ligar a outro domínio polipeptídico, que pode ser o mesmo ou 19 diferente e que está fundido com outro polipéptido compreendendo duas regiões de ligação a Fc, pode ser produzida uma proteína que compreenda quatro regiões de ligação a Fc (por outras palavras, uma proteína dimérica compreendendo quatro regiões de ligação a Fc ligadas). Convenientemente, isto pode ser alcançado através da utilização de um domínio Fc de uma imunoglobulina (p.ex. uma IgG tal como IgGi), uma vez que um tal domínio Fc é capaz de dimerizar (i.e. com outro domínio Fc) . De preferência, o domínio Fc é modificado (por exemplo através de substituição ou substituições de aminoácidos em resíduos críticos para a ligação com os receptores de Fc) para prevenir a "auto-ligação" do domínio Fc com regiões de ligação a Fc ligadas, bem como prevenir a ligação a receptores de Fc in vivo. Num domínio Fc modificado especialmente preferido para utilizar deste modo, o domínio Fc é derivado de IgGi (Wines et al., 2000) e compreende a modificação de aminoácidos no aminoácido 234 e/ou 235, nomeadamente Leu234 e/ou Leu235 . Estes resíduos de leucina estão dentro da região de charneira inferior de IgGi onde o receptor de Fc interage com o domínio Fc. Um ou ambos os resíduos de leucina podem ser substituídos ou suprimidos para impedir o envolvimento do receptor de Fc (i.e. a OO/l q i r ligação) ; por exemplo, um ou ambos de Leu e Leu podem ser substituídos com alanina (i.e. L234A e/ou L235A) ou outro ou outros aminoácidos adequados (Wines et al., 2000).

Semelhantemente, através da utilização de um polipéptido compreendendo duas ou mais regiões de ligação a Fc ligadas, por exemplo, numa disposição cabeça com cauda através de uma ligação peptídica, sequência ligadora curta ou outra ligação química cruzada, que esteja fundido com um domínio polipeptídico capaz de se ligar a outro domínio polipeptídico, que pode ser o mesmo ou diferente e que 20 esteja fundido com outro polipéptido compreendendo duas ou mais regiões de ligação a Fc ligadas, pode ser produzida uma proteina que compreenda pelo menos quatro regiões de ligação a Fc (por outras palavras, uma proteina multimérica compreendendo quatro regiões de ligação a Fc ligadas).

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula polinucleotidica compreendendo uma sequência nucleotidica codificando uma proteina ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto. A molécula polinucleotidica pode consistir numa cassete de expressão ou num vector de expressão (p.ex., um plasmideo para a introdução numa célula hospedeira bacteriana ou um vector virai tal como um vector de baculovirus para transfecção de uma célula hospedeira de insecto, ou um plasmideo ou vector virai tal como um lentivirus para transfecção de uma célula hospedeira de mamífero).

Assim, num terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira recombinante contendo uma molécula polinucleotidica compreendendo uma sequência nucleotidica codificando uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto. A célula hospedeira recombinante pode ser seleccionada a partir de células bacterianas tais como E. coli, células de levedura tais como P. pastoris, células de insecto tais como células de Spodoptera Sf9, células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), de rim de macaco (COS), e células de rim embrionário humano 293 (HEK 293), e células vegetais. 21

Num quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de uma proteína ou um polipéptido, compreendendo o método os passos de: (i) proporcionar uma célula hospedeira recombinante contendo uma molécula polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto, (ii) cultura da referida célula hospedeira num meio de cultura adequado e sob condições adequadas para expressão da referida proteína ou polipéptido multimérico solúvel, e (iii) isolamento da referida proteína ou polipéptido multimérico solúvel a partir do meio de cultura. A proteína ou o polipéptido pode ser isolado utilizando qualquer um dos métodos bem conhecidos dos peritos na arte. Por exemplo, a proteína ou o polipéptido pode ser facilmente isolado utilizando técnicas de cromatografia de afinidade de metal ou utilizando técnicas de cromatografia de IgG ou IgG agregada pelo calor (HAGG) imobilizada.

Num quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um sujeito para uma doença inflamatória, compreendendo o referido método a administração ao referido sujeito de uma proteína ou polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto opcionalmente em combinação com um transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. 0 método é adequado para tratamento de doenças inflamatórias tais como doenças inflamatórias mediadas por Cl incluindo AR, PTI, LSE, glomerulonefrite e síndroma de trombose e trombocitopenia induzido por heparina (HITTS). 22 0 sujeito será tipicamente um humano, mas o método do quinto aspecto pode também ser adequado para utilizar com outros sujeitos animais tais como gado (por exemplo cavalos de corrida) e animais de companhia. 0 termo "transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável" pretende referir qualquer solvente, agente de suspensão ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável para distribuição da proteína ou do polipéptido da presente invenção ao sujeito. A proteína ou o polipéptido pode ser administrado ao sujeito através de qualquer uma das vias bem conhecidas dos peritos na arte, em particular administração intravenosa (iv) , administração intradérmica (id) e administração subcutânea (sc) e administração oral e nasal. Para administração subcutânea, a administração pode ser alcançada através de injecção ou através de um cateter inserido por baixo da pele. Alternativamente, a administração subcutânea pode ser alcançada através de composições de implante de libertação sustida ou de composições formadoras de depósito injectáveis.

Tipicamente, a proteína ou o polipéptido será administrado a uma dose no intervalo de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal do sujeito por dia. Os peritos na arte entenderão, no entanto, que a quantidade de uma "dose eficaz" (i.e. uma quantidade de dose que será eficaz no tratamento de uma doença inflamatória) variará de acordo com vários factores incluindo a idade e a saúde geral do sujeito e a gravidade da doença inflamatória a tratar. Está bem dentro da perícia dos peritos na arte identificar ou optimizar uma quantidade de dose eficaz apropriada para cada sujeito particular. 23

Noutros aspectos da presente invenção, é proporcionada uma composição compreendendo uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel de acordo com o primeiro aspecto opcionalmente em combinação com um transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e a utilização de uma proteína ou um polipéptido multimérico solúvel no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença inflamatória.

Mais, a proteína ou o polipéptido do primeiro aspecto é também útil em aplicações diferentes do tratamento de um sujeito para uma doença inflamatória. Isto é, a proteína ou o polipéptido pode ser utilizado em ensaios de diagnóstico para detecção de complexos imunitários (Cl) em circulação associados à patologia de doenças auto-imunes tais como AR e LSE, em que a proteína ou o polipéptido pode ser utilizado num passo de "captura" de Cl (por exemplo através de ligação da proteína ou do polipéptido a um substrato adequado tal como uma placa de ELISA) em vez do passo de precipitação típico (com polietilenoglicol) empregue em tais ensaios. Após captura de Cl de uma amostra (p.ex. um fluido sérico ou sinovial de um sujeito) a ensaiar, o Cl capturado pode ser detectado através da utilização da proteína ou do polipéptido numa forma por meio da qual está ligado a uma molécula que pode servir como marcador ou repórter (por exemplo moléculas marcadas radioactivamente, moléculas quimioluminescentes, moléculas bioluminescentes, moléculas fluorescentes ou enzimas tais como peroxidase de rábano que podem gerar sinais detectáveis). Alternativamente, o Cl capturado pode ser detectado ou "sondado" utilizando anticorpos específicos para certos auto-antigénios (p.ex. citruleno em AR, ADN em LSE, La/SS-B em síndroma de Sjogren, e ADN-topoisomerase I em esclerodermia) para permitir a determinação do nível de 24 auto-antigénios específicos em Cl em circulação, o que pode permitir o desenvolvimento de ensaios para doenças auto-imunes com melhores resultados de diagnóstico ou prognóstico. Além disso, de um modo semelhante, o Cl capturado pela proteína ou polipéptido da presente invenção ligado a um substrato adequado, pode ser detectado ou "sondado" utilizando anticorpos específicos para certos antigénios de patogénios infecciosos (por exemplo bactérias tais como Staphylococcus e Streptococcus, parasitas tais como P. falciparum (malária) e vírus tais como vírus da hepatite C (HCV), vírus de Epstein-Barr (EBV), vírus da imunodeficiência humana (HIV) e arbovírus causador de febre de Dengue), para proporcionar informação útil na identificação do patogénio causador de uma infecção, prognóstico de doença e/ou a gestão de uma infecção.

Mais ainda, a proteína ou o polipéptido da presente invenção é também útil em vários bioensaios em que pode inibir utilmente a libertação do factor de necrose tumoral (TNF) de células incluindo macrófagos, células dendríticas (DC) e neutrófilos. Além disso, quando ligado a uma molécula que pode servir como marcador ou repórter tal como as mencionadas acima, a proteína ou o polipéptido pode ser utilizado em imagiologia in vivo de locais de inflamação.

Mais ainda, a proteína ou o polipéptido da presente invenção é útil para a remoção de Cl em circulação associados a doenças inflamatórias mediadas por Cl, em que a proteína ou o polipéptido está ligado a um substrato adequado tal como uma conta inerte, fibra ou outra superfície e exposto a um fluido biológico (particularmente sangue) de um sujeito contendo complexos Cl de modo a que o Cl seja capturado e subsequentemente removido do fluido biológico. 0 fluido biológico tratado, que é 25 substancialmente esgotado de Cl, pode então ser devolvido ao sujeito do qual foi obtido.

Para que a natureza da presente invenção possa ser mais claramente compreendida, formas preferidas desta serão agora descritas com referência aos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Produção, purificação e caracterização de polipéptidos multimeros de FcR

Materiais e Métodos

Construção de vectores de expressão de multimeros de

FcyRlla A região de ligação a Fc compreendendo os ectodominios 1 e 2 do FcYRIIa humano foi amplificada através da utilização da polimerase termoestável Pwo (Roche), o clone Hu3.0 (Hibbs et al., 1988, ENTRADA NM_021642) como molde de ADNc e os iniciadores OBW10 GTAGCTCCCCCAAAGGCTG (SEQ ID N0:1) e oBWll CTACCCGGGTGAAGAGCTGCCCATG (SEQ ID NO: 2) . Os locais meio SnaBl (todas as enzimas modificadoras do ADN foram de New England Biolabs) e Smal estão sublinhados. 0 produto de PCR cego foi ligado utilizando ADN-ligase T4 no vector pPIC9 (Invitrogen, Life Technologies) no local EcoRI preenchido com fragmento Klenow da ADN-polimerase I produzindo o vector pBAR14. Para produzir o vector pBAR28 codificando os ectodominios em cadeia de FcYRIIa, pBARl4 foi digerido com SnaBl em cujo local o fragmento SnaBl/Smal de pBAR14 foi ligado.

Um vector de baculovirus para expressão de ectodominios multimerizados de FcYRIIa foi construído como se segue: 0 26 fragmento codificando a sequência lider de FcYRlla e os ectodominios 1 e 2 foram obtidos a partir de pVL-1392 (Powell et al., 1999, e Maxwell et al., 1999) através de digestão com EcoRI e Xbal, e depois ligados nos locais EcoRI/Xbal de pBACPAK9 modificado (Invitrogen Life Tech) nos quais o local BamHI no local de clonagem múltipla tinha sido primeiro eliminado através de digestão com BamHI, preenchimento utilizando fragmento Klenow da ADN-polimerase e re-ligação. Esta construção, vector pBAR69, foi digerida com BamHI à qual foi ligado o fragmento BamHI de pBAR28 produzindo os vectores pBAR71, pBAR72 e pBAR73 codificando o dimero, trimero e tetrâmero, respectivamente, de rsFcYRIIa. 0 tamanho das inserções foi definido por digestão com EcoRI/Xbal e a orientação correcta do fragmento BamHI de multimerização foi pesquisada através de digestão com PvuII utilizando protocolos padrão.

Os vectores de expressão de mamífero codificando o monómero e dimero de FcYRlla foram produzidos como se segue: 0 ADNc de FcYRlla clone Hu3.0 (Hibbs et al., 1988, e DEFINIÇÃO: receptor de baixa afinidade Ila do fragmento Fc de IgG de Homo sapiens (CD32)(FCGR2A), ARNm, ENTRADA NM_021642) foi amplificado utilizando accuprime Pfx PCR (Invitrogen, Life Technologies) e clonado no vector Gateway™ pDONR™221 (Invitrogen, Life Technologies) utilizando a reacção BP clonase™ de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen Life Tech) produzindo ρΝΒβ. A PCR utilizando polimerase accuprime Pfx de pNB6 com os iniciadores oBWll e OBW302 TCTCATCACCACCATCACCACGTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAG (SEQ ID NO: 3), digestão com Smal e ligação com ligase T4 produziu pBAR390 codificando o rsFcYRIIa com uma etiqueta C-terminal de hexa-histidina. A digestão de pBAR390 com BamHI e ligação do fragmento BamHI de pBAR28 produziu o vector pBAR397, codificando o dimero de rsFcYRIIa. A 27 digestão com PvuII foi então utilizada para pesquisar a orientação do fragmento BamEI de dimerização e a sequenciação com ABI BigDye3.1 (Applied Biosytems) confirmou a sequência alvo. A reacção de clonase Gateway LR (Invitrogen, Life Technologies) foi então utilizada para transferir o monómero de FcyRIIa (pBAR390) ou dimero (pBAR397) para o vector de expressão adaptado com uma cassete de enquadramento de leitura A Gateway™ (Invitrogen, Life Technologies) pAPEX3P (Evans et al., 1995, e Christiansen et al., 1996) para dar os vectores de expressão pBAR426 e pBAR427. Igualmente, a reacção de clonase Gateway LR foi utilizada para transferir o monómero (pBAR390) ou dimero (pBAR397) de FcyRIIa para o vector de expressão adaptado com a cassete de enquadramento de leitura A Gateway™ (Invitrogen, Life Technologies) pIRESneo (Clontech). A Figura 1 mostra a sequência polinucleotidica (e sequência de aminoácidos traduzida) para a construção do dimero "cabeça com cauda" de FcyRIIa dentro de pBAR397 utilizada para construir o vector de expressão pBAR427. As duas repetições são mostradas como aminoácidos 1 a 174 (i.e., a primeira região de ligação a Fc) e 184 a 362 (i.e., a segunda região de ligação a Fc) e são ligadas através de um curto fragmento (sequência de 8 aminoácidos; resíduos 175 a 182) do pedúnculo proximal membranar de FcyRIIa mais um resíduo de valina adicional (resíduo 183 mostrado sublinhado na Figura 1) . Os aminoácidos -31 a -1 da sequência mostrada na Figura 1 representam a sequência líder natural de FcyRIIa.

Produção dos polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa

A expressão de polipéptidos monoméricos e diméricos de FcyRIIa (rsFcyRIIa) solúveis recombinantes em células HEK 293E foi efectuada através de transfecção com 5 yg de ADN 28 plasmídico (pBAR426, pBAR427) em poços de 10 cm2 e reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies) ou reagente Transit (BioRad Laboratories) de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 horas, as células transfectadas foram então seleccionadas através de incubação em 4 yg/mL de puromicina. As células seleccionadas em puromicina foram então criadas em meio CD293 suplementado com FCS a 1% (Invitrogen, Life Technologies) até à fase estacionária. O produto recombinante foi subsequentemente purificado através de cromatografia sobre colunas de Níquel (Qiagen) ou cobalto (Clontech) imobilizado e melhor purificadas utilizando cromatografia de exclusão de tamanho Superdex 200 ou Superdex G75 (Amersham/Pharmacia).

Comparação das medições de afinidade dos polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa

Utilizando um protocolo de ensaio BIAcore padrão (Wines et al., 2001; Wines et al., 2003), foram conduzidas medições de afinidade para o monómero e dímero de rsFcYRIIa purificados; o monómero ou dímero de rsFcYRIIa foi injectado a concentrações variáveis sobre monómero de IgG

humana imobilizado (Sandoglobulin, Novartis) ou IgG agregada pelo calor (HAGG, Wines et al., 1988; Wines et al., 2003) durante 60 minutos, tempo após o qual a superfície foi regenerada (Wines et al., 2003). A imobilização do monómero de IgG humana na superfície do biosensor faz com que seja um array multivalente que imita um complexo imunitário.

Comparação da actividade inibidora de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa O monómero e dímero de rsFcYRIIa purificados foram incubados com concentrações crescentes de uma solução de 29 monómero de IgG humana (Sandoglobulin) e dímero-IgG (Wright et al., 1985). A quantidade de polipéptido receptor livre foi então medida através de injecção sobre monómero de IgG humana imobilizado de acordo com um protocolo de ensaio BIAcore padrão.

Inibição da ligação do complexo imunitário a células humanas através de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa A ligação de pequenos complexos imunitários (representados por dímero-IgG) a neutrófilos humanos (voluntários VI e V5) foi determinada na ausência e na presença de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcYRIIa purificados através de análise de citometria de fluxo (Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience).

Inibição da secreção de TNF de MEMs (macrófagos derivados de monócitos) estimulados pelo complexo imunitário através de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa

Numa primeira experiência, células mononucleares periféricas foram extraídas de sangue humano (voluntário V5) , separadas positivamente para expressão de CD14 utilizando um separador automacs (Miltenyi Biotec) e deixadas diferenciar durante 24 horas na presença de M-CSF para MDMs (macrófagos derivados de monócitos) antes da estimulação com concentrações variáveis de pequenos complexos imunitários (representados por dímero-IgG), na ausência e na presença de dímero de rsFcyRIIa (no sobrenadante a 2,5 pg/mL). A secreção de TNF dos MDMs foi então medida através de ELISA de TNF humano de acordo com o protocolo do fabricante (BD Pharmingen). Numa segunda experiência, MDMs foram produzidos ex vivo de forma semelhante a partir de sangue humano (desta vez a partir do voluntário VI) e deixados diferenciar durante 24 horas 30 antes da estimulação com concentrações variáveis de pequenos complexos imunitários (i.e., dímero-IgG) , na ausência e na presença de dimero de rsFcYRIIa (em sobrenadante a 2,5 yg/mL).

Inibição da activação do complexo imunitário de plaquetas através de polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa

Plaquetas lavadas foram preparadas através de centrifugação a baixa velocidade de sangue completo (Thai et al., 2003) e estimuladas com IgG agregada pelo calor (HAGG). A activação de plaquetas foi medida através da maior expressão superficial de P-selectina (CD62P) através de citometria de fluxo (Lau et al., 2004).

Resultados

Expressão de polipéptidos monoméricos e multiméricos de rsFcyRIIa a partir de células de insecto A análise Western blot de sobrenadantes de células infectadas demonstrou a produção com sucesso de formas diméricas e triméricas de FcYRlla solúvel recombinante (Figura 2) . Embora tenha sido detectado algum polipéptido trimérico este foi grandemente clivado na forma dimérica e o tetrâmero não foi detectado sendo grandemente clivado produzindo uma forma dimérica. Uma vez que o dimero de FcYRlla era intrinsecamente o mais estável, isto foi ainda caracterizado e desenvolvido num sistema de expressão de mamífero (i.e., células HEK293E).

No entanto, uma vez que o FcYRlla nativo pode ser vertido da superfície celular de leucócitos através de proteólise (Astier et al., 1994), uma estratégia para a minimização da proteólise dos trímeros, tetrâmeros e multímeros maiores seria eliminar ou, de preferência, substituir a sequência ligadora do pedúnculo proximal membranar que liga as 31 regiões extracelulares de FcYRlla. Por exemplo, a susceptibilidade proteolítica da sequência ligadora do pedúnculo proximal membranar pode ser reduzida através de uma ou mais modificações de aminoácidos (p.ex. uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos) ou através da substituição de outro modo dessa sequência ligadora com uma sequência ligadora sintética tal como, por exemplo, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 4) que tem uma baixa susceptibilidade à proteólise.

Outra estratégia para a produção com sucesso de trimeros, tetrâmeros e multimeros maiores, seria ligar um polipéptido dimérico expresso a um ou mais monómeros ou outro ou outros polipéptidos diméricos através de ligação química cruzada. Multimeros de dímeros de FcYRlla podem também ser produzidos através de expressão do polipéptido dimérico como uma proteína de fusão com um domínio Fc (p.ex. um domínio Fc de IgG) que seja ele próprio dimérico e dimerizará assim qualquer parceiro de fusão.

Expressão de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa a partir de células de mamífero 0 rendimento proteico para o monómero de rsFcYRIIa purificado foi de 3 mg/L (construção pBAR426) e para o dimero de rsFcYRIIa, até »0,5 mg/L (construção pBAR427). A Figura 3 mostra SDS-PAGE corado com Coomassie (gel de acrilamida a 12%, sob condições não redutoras) de fracções colhidas a partir da purificação do monómero e dimero de rsFcYRIIa. O monómero de rsFcYRIIa teve o tamanho esperado de »30 kDa (a) , enquanto o dimero de rsFcYRIIa teve o tamanho esperado de »60 kDa (b) .

Comparação das medições de afinidade dos polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa 32

Os resultados dos ensaios são mostrados nas Figuras 4 e 5. Os ensaios indicaram que o monómero de rsFcYRIIa tem um único local de ligação com constante de dissociação de afinidade (KD) de 1,7 μΜ para o monómero de IgG humana e 1,05 μΜ para HAGG. No caso do dimero de rsFcYRIIa, os dados de ligação ajustaram-se melhor a um modelo de dois locais de ligação com constantes de dissociação de afinidade (KD) de 3,2 nM (KDi) e 100 nM (KD2) para o monómero de IgG humana imobilizado e 2,73 nM (KDi: aproximadamente 300 vezes menos que a KD do rsFcYRIIa monomérico) e 99 nM (KD2) para HAGG.

Comparação da actividade inibidora dos polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa

As experiências conduzidas para comparar a actividade inibidora dos polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcYRIIa mostrou que, em solução, o monómero de rsFcYRIIa (Figura 6a) não distingue entre monómero de IgG humana e pequenos complexos imunitários (i.e., representados pelo dímero-IgG). Em contraste, o dimero de rsFcYRIIa (Figura 6b) em solução, liga-se selectivamente a pequenos complexos imunitários (i.e., dímero-IgG) em relação ao monómero de IgG humana.

Inibição da ligação do complexo imunitário a células humanas através de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa

Os resultados dos ensaios de inibição são mostrados na Figura 7a e 7b, e indicam que o dimero de rsFcYRIIa (CI5o =1,1 pg/mL) é *10 vezes mais activo que o monómero de rsFcYRIIa (CI5o = 10,5 pg/mL) a inibir pequenos complexos imunitários (i.e., dímero-IgG) de se ligarem a neutrófilos humanos. Ainda, os resultados mostraram que a inibição de pequenos complexos imunitários (dímero-IgG) se ligarem a neutrófilos humanos através do dimero de rsFcYRIIa era 33 reprodutível com neutrófilos de dois indivíduos diferentes, com uma CI5o de 0,9-1,1 pg/mL.

Inibição da secreção de TNF a partir de MDMs (macrófagos derivados de monócitos) estimulada pelo complexo imunitário através de polipéptidos monoméricos e diméricos de rsFcyRIIa

Os resultados são mostrados nas Figuras 8a e 8b. O dímero de rsFcYRIIa pareceu inibir a secreção de TNF estimulada pelo complexo imunitário (i.e., dímero-IgG) a partir de MDMs humanos com 24 horas de diferenciação.

Inibição da activação de plaquetas pelo complexo imunitário através de polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa

Plaquetas humanas lavadas foram incubadas com HAGG (10 pg/mL) na presença e na ausência de dímero de rsFcYRIIa a 30 pg/mL durante 30 minutos. Tal como mostrado na Figura 9, verificou-se que a activação de plaquetas foi inibida na presença do dímero de rsFcYRIIa tal como evidenciado por menor expressão de P-selectina (CD62P).

Discussão

FcYRIIa solúvel recombinante na forma monomérica (monómero de rsFcYRIIa) e dimérica (dímero de rsFcYRIIa) foi expresso com sucesso em células HEK 293E. Ensaios de ligação em equilíbrio BIAcore demonstraram que o dímero de rsFcYRIIa tem uma avidez «300 vezes maior para a IgG imobilizada (Sandoglobulin) que o receptor monomérico (i.e., o monómero de rsFcYRIIa tem uma KD «1 pM enquanto o dímero de

rsFcYRIIa tem uma KD «3 nM na interacção com a IgG imobilizada). Experiências de competição utilizando BIAcore demonstraram também que o dimero de rsFcYRIIa se liga selectivamente a pequenos complexos imunitários, e a actividade inibidora selectiva foi confirmada em ensaios 34 baseados em células utilizando neutrófilos de dois dadores. Provou-se que o dímero de rsFcYRIIa é um inibidor cerca de 10 vezes mais potente da ligação do pequeno complexo imunitário de IgG que o monómero de rsFcYRIIa, e num ensaio de plaquetas padrão, observou-se que o dimero de rsFcYRIIa inibe completamente a activação pelo complexo imunitário de plaquetas (i.e., o dimero de rsFcYRIIa é um potente inibidor da activação celular). É portanto considerado que o dimero de rsFcYRIIa e outras proteínas e polipéptidos multiméricos solúveis de acordo com a invenção mostram uma considerável promessa para o tratamento de doença inflamatória mediada por Cl tal como AR e LSE.

Exemplo 2 Produção, purificação e caracterização do polipéptido dimérico de rsFcyRIIa

Materiais e Métodos

Produção de polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa A construção do dimero de FcYRIIa descrita no Exemplo 1 foi clonada num vector de expressão de mamífero sob o controlo de um promotor de CMV modificado. Transfectantes CHO-S estáveis foram então estabelecidos como se segue: células CHO-S a 90% de confluência foram colhidas, lavadas três vezes, e 2χ107 células em 15 mL de meio foram dispensadas para caixas de petri de 10 cm. Complexos de ADN linearizado-lipofectamina 2000 (razão de 1:2,5) foram então incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente e adicionados gota-a-gota às células. Subsequentemente, as células foram incubadas a 37°C durante 48 horas, e depois plaqueadas em diluição limitante em placas de 96 poços em meio CD-CHO suplementado com 600 yg/mL de higromicina B, L-glutamina 8 mM, suplemento HT 1χ e 50 yg/mL de sulfato de dextrano. As células foram pesquisadas através de ELISA padrão para detectar proteína FcYRIIa solúvel, e as linhas 35 de maior expressão foram subclonadas novamente através de diluição limitante. Um clone (#6) segregou dimero de FcYRIIa a aproximadamente 40 mg/L e foi cultivado em balões de agitação a 30°C para uma expressão proteica óptima. O sobrenadante contendo dimero de rsFcYRIIa foi concentrado através de filtração de fluxo tangencial e mudado para tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4. A amostra foi então diluida quatro vezes em fosfato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 0,5 M e purificada sobre uma coluna HisTrap FF de 2x5 mL (GE Healthcare), eluindo em fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M pH 7,4 e imidazole 100 mM. O material eluido foi dialisado e purificado através de cromatografia de permuta iónica, utilizando uma coluna Q FF de 25 mL (GE Healthcare) e eluindo em cloreto de sódio 150 mM. O material purificado foi então dialisado para solução salina tamponada com fosfato.

Bloqueio da ligação de HAGG a FcyRIIb com polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa A capacidade do dimero de rsFcYRIIa purificado para bloquear a ligação do complexo imunitário a FcYRIIb da superfície celular foi ensaiado através de um ensaio citométrico de fluxo. IgG agregada pelo calor (HAGG) foi incubada com várias concentrações de dimero de rsFcYRIIa ou monómero de rsFcYRIIa (R&D Systems, Cat # 1330-CD/CF) durante 1 hora a 4°C. Estas misturas foram então adicionadas a placas de 96 poços contendo 105 células IIA1.6 transfectadas com FcYRllb humano (IIA1.6 é uma linha de linfoma B de ratinho sem expressão de FcyR endógenos) . As placas foram incubadas durante 1 hora a 4°C, lavadas e depois coradas com um conjugado anti-hlgG-FITC para detectar HAGG ligado. Após lavagem, as células foram 36 analisadas num citómetro de fluxo FACS Scan utilizando protocolos padrão.

Bloqueio da activação de plaquetas induzida por HAGG com polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa A exposição de plaquetas a HAGG resulta em activação através de FcYRIIa, conduzindo a sobre-regulação de P-selectina (CD62P). A capacidade do dimero de rsFcYRIIa ou do monómero de rsFcYRIIa para bloquear esta activação foi avaliada através de um ensaio citométrico de fluxo. IgG agregada pelo calor (HAGG) foi incubada com várias concentrações de dimero de rsFcYRIIa ou monómero de rsFcYRIIa (R&D Systems, Cat # 1330-CD/CF) durante 1 hora a 4°C. A mistura foi então adicionada a placas de 96 poços contendo 3><107 plaquetas humanas, que tinham sido previamente lavadas e ressuspensas em tampão Tyrodes/Hepes suplementado com EDTA 1 mM. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, as células foram lavadas, fixadas, e coradas para expressão de CD62P e GPIIb (CD41) através de métodos padrão e analisadas num citómetro de fluxo FACS Scan.

Os polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa bloqueiam a activação de MC/9 induzida pelo complexo imunitário MC/9 é uma linha de mastócitos de murideo positiva para FcyR que se torna activa e liberta TNF-α após exposição a complexos imunitários. A capacidade do dimero de rsFcyRIIa ou do monómero de rsFcyRIIa para bloquear esta activação foi avaliada utilizando complexos imunitários consistindo em ovalbumina e anticorpo anti-ovalbumina (CIs OVA) como estimulo. Os CIs OVA (10 yg) foram incubados com várias concentrações de dimero de rsFcyRIIa ou de monómero de rsFcyRIIa (R&D Systems, Cat # 1330-CD/CF) durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura foi então adicionada a 37 placas de 96 poços contendo 2χ105 células MC/9, e incubada de um dia para o outro a 37°C. O sobrenadante foi colhido e a quantidade de TNF-α medida utilizando um estojo comercial de ELISA (BD Biosciences).

Resultados

Produção de polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa A Figura 10 mostra a análise de material rsFcYRIla purificado, incluindo SDS-PAGE (sob condições redutoras e não redutoras); Western blotting utilizando um anticorpo anti-FcYRIIa (R&D systems, número de catálogo AF1875) e anti-IgG de cabra-peroxidase de coelho como anticorpo detector; e HPLC. O polipéptido migra como uma única banda no peso molecular esperado (»=50 kDa), reage com anticorpo anti-FcYRIIa e é >96% puro tal como determinado através de HPLC.

Polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa bloqueiam a ligação de HAGG a FcyRIIb

Os resultados do ensaio de ligação de HAGG são mostrados na Figura 11. Tanto o dímero de rsFcYRIla como o monómero de rsFcYRIla foram capazes de bloquear completamente a ligação de HAGG ao FcYRIIb da superfície celular. No entanto, o dímero de rsFcYRIla (CI5o=3,9 ng/mL) foi acima de 500 vezes mais potente que a proteína monomérica (CI5o=2082 ng/mL).

Polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa bloqueiam a activação de plaquetas induzida por HAGG

Os resultados do ensaio de activação de plaquetas são mostrados na Figura 12. A percentagem de plaquetas activadas (positivas tanto para CD41 como para CD62P) após tratamento apenas com HAGG foi definida como 100%. Tanto o dímero de rsFcYRIla como o monómero de rsFcYRIla foram capazes de reduzir significativamente a sobre-regulação de 38 CD62P induzida por HAGG. A titulação revelou que o dimero de rsFcYRIIa (Cl5o=3,9 yg/mL) era 5 vezes mais potente que o monómero de rsFcYRIIa (CI5o=20,9 yg/mL).

Polipéptidos diméricos de rsFcyRIIa bloqueiam a activação de MC/9 induzida pelo complexo imunitário

Os resultados do ensaio de activação de MC/9 são mostrados na Figura 13. A quantidade de TNF-α libertada após incubação apenas com CIs OVA foi definida como 100%. Tanto o dimero de rsFcYRIIa como o monómero de rsFcYRIIa são capazes de suprimir completamente a libertação de TNF-a induzida por complexos imunitários. A titulação revelou que o dimero de rsFcYRIIa (Cl5o=2,l yg/mL) era 8 vezes mais potente que o monómero de rsFcYRIIa (Cl5o=17,7 yg/mL).

Discussão O dimero de rsFcYRIIa foi expresso com sucesso em células CHO-S. SDS-PAGE redutor e não redutor mostrou que o dimero de rsFcYRIIa purificado tinha aproximadamente 50 kDa de tamanho, e o Western blotting mostrou que o dimero era especificamente ligado por anticorpos anti-FcYRIIa. O dimero de rsFcYRIIa foi determinado ser 96% puro através de HPLC.

Tanto o dimero de rsFcYRIIa como o monómero de rsFcYRIIa bloquearam completamente a ligação de HAGG ao FcYRllb da superfície celular, com o dimero de rsFcYRIIa possuindo aproximadamente 500 vezes maior eficiência de bloqueio que o monómero de rsFcYRIIa. Semelhantemente, tanto o dimero de rsFcYRIIa como o monómero de rsFcYRIIa reduziram significativamente a activação de plaquetas induzida por HAGG, com o dimero a mostrar uma eficácia aproximadamente 5 vezes mais elevada que o monómero de rsFcYRIIa. Ainda, tanto o dimero de rsFcYRIIa como o monómero de rsFcYRIIa 39 suprimiram a activação da linha de mastócitos de ratinho (MC/9), medida através da libertação de TNF-α, com o dimero a mostrar uma eficácia 8 vezes maior que o monómero.

Exemplo 3 Concepção e expressão de polipéptidos de fusão de rsFcyRIIa

Materiais e Métodos

Construção de vectores de expressão de fusão de rsFcyRIIa

Polinucleótidos codificando monómero de FcvRlla solúvel ou dimero de FcYRIIa solúvel foram independentemente fundidos com um polinucleótido codificando IgGi-FcYRl (L234A, L235A). 0 terminal C do polipéptido monomérico de FcYRIIa solúvel foi operativamente fundido com um polipéptido IgGi humano numa posição no lado N-terminal da ligação dissulfureto intercadeias na charneira inferior que une covalentemente as duas porções de Fc. A fusão nesta posição gera uma proteína de fusão monomérica FcYRIIa-IgGi-FcYRl (L234A, L235A) que dimerizará com um segundo domínio Fc devido a interacções presentes entre domínios Fc covalentemente associados. A região charneira de IgG é conhecida pela sua flexibilidade, e a fusão do polipéptido compreendendo a região de ligação a Fc ao lado N-terminal da ligação dissulfureto inter-cadeias na charneira inferior permite uma considerável liberdade de movimento da região de ligação a Fc.

Semelhantemente, o terminal C do polipéptido dimérico FcYRIIa solúvel foi operativamente fundido com um polipéptido IgGi humano numa posição no lado N-terminal da ligação dissulfureto inter-cadeias na charneira inferior que une covalentemente as duas porções Fc. 40

Polinucleótidos codificando FcYRIIa monomérico solúvel ou FcYRIIa dimérico solúvel foram independentemente fundidos com um polinucleótido codificando albumina do soro humano (HSA) de um modo equivalente ao anteriormente descrito na descrição da patente Internacional n°. WO 96/08512. Tal como divulgado nessa descrição, a HSA foi fundida com o terminal N do monómero de rsFcYRIIa. De um modo semelhante, a HSA foi fundida com o terminal N do dímero de rsFcYRIIa.

Polinucleótidos codificando os vários polipéptidos ou proteínas de fusão são operativamente inseridos em pAPEX 3P-xDEST utilizando técnicas de clonagem padrão.

Produção de fusões de monómero de rsFcyRIIa e dímero de rsFcyRIIa

Os vectores de expressão de fusão do monómero e dímero de rsFcYRIIa foram transientemente transfectados para células CHOP e estavelmente transfectados para células 293E utilizando métodos padrão. Os sobrenadantes das células CHOP transientemente transfectadas foram imunoprecipitados utilizando anticorpo anti-FcYRIIa 8.2 (Powell et al., 1999) e os imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE não redutor (12%) . A análise de Western blot foi então efectuada utilizando métodos padrão e utilizando anticorpo anti-FcYRIIa (Maxwell et al., 1999) como anticorpo primário e anti-Ig de coelho-HRP como anticorpo secundário. ELISA de captura de HAGG para detecção de fusões de rsFcyRIIa em sobrenadantes de células CHOP transfectadas ELISAs de captura de HAGG foram efectuados para medir a actividade de ligação a Fc das fusões de rsFcYRIIa. Para examinar a actividade de ligação das fusões do monómero de rsFcYRIIa, um monómero padrão de FcYRIIa conhecido (Powell 41 et al., 1999) (a começar em 0,75 pg) e proteína de uma célula transfectada com monómero de rsFcYRIIa (transfecção 426) foram titulados e comparados com a ligação da proteína de células transfectadas com a fusão do monómero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) (monómero-Fc) e da proteína de células transfectadas com a fusão do monómero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-monómero).

Para examinar a actividade de ligação das fusões do dímero de rsFcYRIIa, um dímero padrão de FcYRIIa conhecido (a começar em 0,5 pg/mL) e proteína de uma célula transfectada com dímero de rsFcYRIIa (transfecção 427) foram titulados e comparados com a ligação de proteína de células transfectadas com a fusão de dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcyI (L234A, L235A) (dímero-Fc) e proteína de células transfectadas com a fusão do dímero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-dímero). ELISA de Captura de Etiqueta para detecção de fusões de rsFcyRIIa em sobrenadantes de células CHOP transfectadas

Utilizando um método ELISA padrão, foram revestidas placas com anticorpo anti-FcYRIIa 8.2. As fusões de rsFcYRIIa foram adicionadas aos poços e colocadas em contacto com o anticorpo 8.2. O anticorpo secundário foi anticorpo anti-FcYRIIa 8.7-HRP (Powell et al., 1999; Ierino et al., 1993a), que é específico para um epitopo de FcYRIIa diferente do do anticorpo 8.2.

As amostras de rsFcYRIIa monomérico testadas incluíram um monómero de rsFcYRIIa conhecido (monómero padrão a começar em 0,75 pg/mL), o sobrenadante da célula transfectada com o monómero de rsFcYRIIa (transfecção 426), o sobrenadante de células transfectadas com a fusão do monómero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) (monómero-Fc) e o sobrenadante 42 de células transfectadas com a fusão do monómero de rsFcylIa com HSA (HSA-monómero).

As amostras de rsFcYRIIa dimérico testadas incluíram um dímero de FcYRIIa conhecido (dímero padrão a começar em 0,5 yg/mL) , o sobrenadante da célula transfectada com dímero de rsFcYRIIa (transfecção 427), o sobrenadante de células transfectadas com a fusão de dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcyI (L234A, L235A) (monómero-Fc) e o sobrenadante de células transfectadas com a fusão do dímero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-monomer).

Resultados

Expressão das fusões do monómero e do dímero de rsFcyRIIa

Com base na actividade do monómero de rsFcYRIIa e do dímero de rsFcYRIIa purificados, a fusão monómero de rsFcYRIIa-IgG-FcYl (L234A, L235A) foi segregada a níveis mais elevados (aproximadamente 12 yg/mL em células 293E) que a fusão dímero de rsFcYRIIa-IgG-FcYl (aproximadamente 4 yg/mL em células 293E).

Tal como mostrado na Figura 14, a análise de Western blot indicou que as proteínas de fusão estavam presentes no sobrenadante nos pesos moleculares esperados e que podiam ser produzidas com sucesso como proteínas distintas sem evidência de produtos de degradação. ELISA de Captura de HAGG para detecção de fusões de rsFcyRIIa em sobrenadantes de células CHOP transfectadas

Tal como mostrado na Figura 15 (a), a fusão do monómero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) (monómero-Fc) foi detectavelmente ligada no ensaio, enquanto se observou que a fusão do monómero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-monómero) se ligava fracamente. Este resultado pode ser explicado pelo 43 facto da fusão do monómero de rsFcYRIIa com igG-FcYl (L234A, L235A) ser um dímero (da região de ligação a Fc) como consequência da dimerização entre as cadeias pesadas dos domínios Fc fundidos enquanto a fusão do monómero de rsFcYRIIa com HSA permanece monomérica para a região de ligação a Fc.

Tal como mostrado na Figura 15(b), a fusão do dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) (dímero-Fc) purificada mostrou uma actividade de ligação semelhante à do dímero padrão, e a fusão do dímero de rsFcYRIIa com HSA (HSA-monómero) teve uma actividade de ligação detectável, mas inferior. Neste caso, a fusão do dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) foi, devido à dimerização entre as cadeias pesadas dos domínios Fc fundidos, tetramérica (ou "tetravalente") para a região de ligação a Fc, enquanto a fusão do dímero de rsFcYRIIa com HSA permanece dimérica para a região de ligação a Fc. ELISA de Captura de Etiqueta para a detecção de fusões de rsFcyRIIa em sobrenadantes de células CHOP transfectadas

Tal como mostrado na Figura 16 (a), a fusão do monómero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) e a fusão do monómero de rsFcYRIIa com HSA são ambas capturadas e detectáveis neste ensaio. Tal como mostrado na Figura 16 (b), a fusão do dímero de rsFcYRIIa com IgG-FcYl (L234A, L235A) e a fusão do dímero de rsFcYRIIa com HSA são também ambas capturadas e detectáveis neste ensaio. Claramente, tanto o epitopo de 8.2 utilizado para capturar estes receptores como o epitopo de 8.7 utilizado para detectar os receptores capturados estão intactos indicando uma dobragem correcta das fusões.

Discussão 44

As construções de fusão do monómero de rsFcYRlla e do dímero de rsFcYRlla foram expressas a partir do vector p-APEX 3P-xDST e expressas transientemente em células CHOP e estavelmente em células 293E. As fusões expressas apresentaram-se como proteínas distintas em Western blot sem evidência de produtos de degradação. A fusão do dimero de rsFcYRlla com IgG-FcYl (L234A, L235A) pode mostrar níveis de expressão inferiores à da sua equivalente monomérica. No entanto, o nível de expressão da fusão do dímero de rsFcYRlla com HSA foi quase equivalente ao nível de expressão da fusão do monómero de rsFcYRlla com HSA, tal como determinado através de Western blot (Figura 14), e mostra portanto uma considerável promessa como meio para a produção em grande escala de dímero de rsFcYRlla. De interesse, as fusões de dímero de rsFcYRlla mostraram uma actividade de ligação a HAGG e ao anticorpo anti-FcYRIIa 8.2 mais elevada que as equivalentes monoméricas. Tal como mencionado acima, isto pode ser explicado pelo facto das fusões do dímero de rsFcYRlla serem diméricas ou tetraméricas (no caso da fusão do dímero de rsFcYRlla com IgG-FcYl (L234A, L235A)) para a região de ligação a Fc, e como consequência, possuírem uma afinidade de ligação aparente (avidez) mais elevada devido a esta multi-valência. Antecipa-se que as moléculas tetraméricas se possam ligar a complexos imunitários com tal afinidade que a ligação será substancialmente irreversível.

Exemplo 4 Concepção e expressão de polipéptidos receptores de Fc heterodiméricos

Materiais e Métodos

Construção de vectores de expressão de FcYRIIa-FcyRIII heterodiméricos 45 A região de ligação a Fc de FcYRlIa e FcyRIII pode ser independentemente amplificada por PCR a partir do molde de ADNc utilizando iniciadores apropriados tal como descrito no Exemplo 1. As regiões amplificadas englobarão os resíduos e motivos característicos conhecidos de regiões de ligação a Fc tais como os resíduos do ligador do ectodomínio 1 e ectodomínio 2 (i.e. a junção D1/D2), e as voltas BC, C'E e FG. As sequências polinucleotídicas para estas regiões de ligação a Fc são bem conhecidas dos peritos na arte.

Os produtos de PCR de extremidades cegas cega podem ser ligados utilizando ADN-ligase T4 no vector pPIC9 (Invitrogen, Life Technologies) no local EcoRI preenchido com fragmento Klenow da ADN-polimerase I. Um polinucleótido FcYRIIa-FcYRIII heterodimérico operativamente fundido pode ser criado a partir destes produtos amplificados utilizando técnicas de PCR e clonagem semelhantes tais como as descritas no Exemplo 1. 0 tamanho e a orientação da inserção podem ser confirmados através de digestão analítica com enzimas de restrição ou sequenciação de ADN. 0 polinucleótido FcYRIIa-FcYRIII heterodimérico operativamente fundido pode ser clonado em vários vectores de expressão. Por exemplo, o polinucleótido FcYRIIa-FcYRIII heterodimérico pode ser ligado nos locais EcóRI/Xbal de pBACPAK9 modificado (Invitrogen Life Tech) no qual o local BamRI no local de clonagem múltipla tinha sido primeiro eliminado através de digestão com BamHI, preenchendo utilizando fragmento Klenow da ADN-polimerase e re-ligação. 0 tamanho das inserções pode ser definido através da digestão com EcoRI/Xbal e a orientação correcta do fragmento BamEI de multimerização pode ser pesquisada através de digestão com PvuII utilizando protocolos padrão. 46

Alternativamente, o polinucleótido FcYRIIa-FcYRIII heterodimérico pode ser clonado em vectores de expressão de mamífero. Por exemplo, a reacção de clonase Gateway LR (Invitrogen, Life Technologies) pode ser utilizada para transferir fragmentos polinucleotídicos de receptores de Fc multiméricos operacionalmente fundidos para o vector de expressão adaptado com uma cassete de enquadramento de leitura A Gateway™ (Invitrogen, Life Technologies) pAPEX3P (Evans et al., 1995, e Christiansen et al., 1996) para dar vectores de expressão de mamífero expressando os multímeros de receptores de Fc fundidos. Igualmente, a reacção de clonase Gateway LR pode ser utilizada para transferir os fragmentos polinucleotídicos de receptores de Fc multiméricos operacionalmente fundidos para o vector de expressão adaptado com uma cassete de enquadramento de leitura A Gateway™ (Invitrogen, Life Technologies) pIRESneo (Clontech).

Discussão A multimerização de regiões de ligação a Fc gera moléculas possuindo interacções de avidez mais elevada com os domínios Fc. Cada monómero no multímero é capaz de interagir separadamente com o domínio Fc de imunoglobulinas para dar maiores avidezes. Podem ser gerados multímeros contendo domínios de ligação a Fc derivados de diferentes receptores de Fc. Por exemplo, os multímeros podem ser formados a partir de combinações das regiões de ligação a Fc de FcyRI, FgyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcYRIIIb, FcaRI e FcsRI. Podem também ser formados heterodímeros a partir de combinações destas regiões de ligação a Fc. Por exemplo, podem ser formados heterodímeros FcYRIIa-FcYRIII, FcyRIIa-FcyRI, e FcyRI-FcyRIII, bem como heterodímeros consistindo noutras combinações de regiões de ligação a Fc. 47

Os domínios de ligação a Fc de vários receptores de Fc foram definidos através de mutagénese ou cristalografia (interacções IgG e FcyR: Maxwell et al. 1999, Radaev et al., 2001, Sondermann et al., 2000, Hulett et al., 1988, Hulett et al., 1991, Hulett et al., 1994, Hulett et al., 1995; IgE e FctRI: Garman et al., 2000; IgA e FcaRI: Wines et al., 2001, Herr et al., 2003). Ainda, foram feitas comparações de sequências de FcR semelhantes e análise comparativa das estruturas do receptor de Fc (Sondermann et al., 2001). Estas análises mostram que segmentos aparentados, claramente definidos de diferentes receptores de Fc are capazes de interagir com os seus ligandos. Além disso, a análise cristalográfica demonstrou isto claramente para a interacção de FcYRIIa e IgG no pedido de patente Internacional n°. PCT/AU2006/000813 em comparação com as análises cristalográficas de FcyRIII e IgG (Radaev et al. 2001, Sonderman et al., 2001).

É claro que estes dados juntamente com experiências de mutagénese de outros receptores de Fc indicam que os segmentos da região ligadora entre o ectodomínio 1 e o ectodomínio 2 destes receptores de Fc aparentados, bem como os segmentos das voltas BC, C'E e FG dos segundos domínios de diferentes receptores, interagem com os seus respectivos ligandos. A incorporação de tais regiões de ligação a Fc noutros polipéptidos pode conferir especificidade para esse tipo de imunoglobulina no novo polipéptido. Para este fim, Hulett et al., 1991, Hulett et al., 1995, e Maxwell et al., 1999 demonstraram que a adição de regiões de ligação a IgG em proteínas que eram de outro modo incapazes de se ligar a IgG adquiriria especificidade para IgG. Semelhantemente, foi observado que a inserção de uma série de sequências de ligação a IgE em proteínas incapazes de se ligar a IgE 48 resultou em quimeras proteicas com especificidade para igE tal como anteriormente descrito em WO 96/08512. Pode-se portanto prever que de um modo semelhante, a inclusão de regiões de ligação a Fc que interagem com IgG de FcyRI ou FcyRIII numa proteína pode conferir função de ligação a IgG a essa proteína, ou semelhantemente, a inclusão de regiões de ligação a Fc que interajam com IgA de CD89 ou FcaRI numa proteína pode conferir função de ligação a IgA a essa proteína. Tais sequências podem incluir as voltas do primeiro domínio extracelular de FcaRI de CD89 que se sabe interagir com IgA, tais voltas incluirão as voltas BC, C'E e FG do domínio 1. Resíduos importantes incluem os aminoácidos 35, 52 e 81-86 (Wines et al., 2001, Herr et al., 2003). Deste modo, são possíveis proteínas ou péptidos receptores contendo segmentos capazes de interagir com diferentes classes de imunoglobulina.

Ao longo desta descrição a palavra "compreendem", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um elemento, inteiro ou passo, ou grupo de elementos, inteiros ou passos afirmados, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou passo, ou grupo de elementos, inteiros ou passos.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Trillium Therapeutics Inc

<120> POLIPÉPTIDOS RECEPTORES DE FC MULTIMÉRICOS <130> 30109PCT <160> 6 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens 53 <4 Ο 0> 1 gtagctcccc caaaggctg 19

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Lisboa, 15 de Março de 2011

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Ô9VHeo|Ôe6|| % FIGURA 11 13/18 C0 110η·<««-{ j «Dímero de FcyRlla QC s ÍmÍhm Φ "Q O In* ΦE Ό coS 1—MHH

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-Hh~ monómero pad, 42$ (monómero) —ir- monómero Fc HSA-monómero Diluição Titulação de "dímero" de rsFcgRHa de células CHOP

—Φ~ dimsrepâd -Hl·- 42? jdmicfoi -Tk™ dímero-Fc —X""· HSA-dimeto Diluição 17/18 FIGURA 16 A Titulação de "monómero" de rsFcgRíia de células CHOP

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína ou polipéptido multimérico solúvel capaz de inibir a interacção de receptores de Fcy (FcyR) de leucócitos com imunoglobulina G (IgG), compreendendo a referida proteína ou polipéptido duas regiões de ligação a Fc ligadas, pelo menos uma das quais é derivada de um receptor de tipo FcyR, em que as referidas regiões de ligação a Fc são ligadas através de uma ligação peptídica ou através de uma curta sequência ligadora numa disposição cabeça com cauda e em que a referida proteína ou polipéptido compreende apenas duas regiões de ligação a Fc ligadas.

2. Proteína ou polipéptido da reivindicação 1, em que a referida pelo menos uma região de ligação a Fc de um receptor de tipo FcyR é derivada de um receptor de tipo FcyRII, de preferência FcYRIIa.

3. Proteína ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que cada uma das referidas regiões de ligação a Fc ligadas é derivada de um receptor de tipo FcyR, de preferência do mesmo receptor de tipo FcyRII.

4. Polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a referidas regiões de ligação a Fc são ligadas através de um ligador compreendendo 1 a 20 aminoácidos.

5. Polipéptido da reivindicação 3 ou 4, compreendendo ainda uma proteína transportadora. 2

6. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo ainda um dominio polipeptidico capaz de se ligar a outro dominio polipeptidico.

7. Polipéptido da reivindicação 6, em que o referido dominio polipeptidico é um dominio Fc de uma imunoglobulina.

8. Polipéptido da reivindicação 7, em que o referido dominio Fc é derivado de IgGi e foi modificado através O O /1 n q r da substituição de Leu e/ou Leu

9. Molécula polinucleotidica compreendendo uma sequência nucleotidica codificando a proteína ou o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Célula hospedeira recombinante compreendendo a molécula polinucleotidica da reivindicação 9.

11. Método de produção de uma proteína ou polipéptido, compreendendo o referido método os seguintes passos: (i) proporcionar uma célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 10, (ii) cultura da referida célula hospedeira num meio de cultura adequado e sob condições adequadas para expressão da referida proteína ou polipéptido multimérico solúvel, e (iii) isolamento da referida proteína ou polipéptido multimérico solúvel a partir do meio de cultura.

12. Proteína ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para utilização no tratamento de uma doença inflamatória. 3

13. Proteína ou polipéptido para utilização no tratamento de uma doença inflamatória de acordo com a reivindicação 12, em que a referida doença inflamatória é seleccionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatóide (AR), púrpura trombocitopénica imunitária (PTI), lúpus sistémico eritematoso (LSE) , glomerulonefrite e sindroma de trombose e trombocitopenia induzida por heparina (HITTS). Lisboa, 15 de Março de 2011 1/18 F10QRA 1 -31-30 -20 âtç[gâgacccaeatgtctcag&atgtAtgtcccagaaâcctgtCí9ctgcttcaacc.attg &' S t Q M 5 S S V C P R N 0 » 1 £> Q F L -10 -1 +1 acagttttgctgctgctggcttGfcgcagacagtcaagctgcagctcccccaaaggctgtg T V i. L li L A § R S s Q R ÍV A p B K A V 10 20 çtgaaâcttgagiíCGOcgtggatcasçgtgctcssggBggactctgtgaGítstgacafcsc l κ ε s. b i? « i * v i< o » b s v *. %' τ è 38 4C1 caçggçgcfecgcagccctgagagcqactccattoagtggttccaeaatggwaatcfccâtt Q G S R 5 F -S S D S I Q W F K K G S h X 50 60 Si3càoccac.scgçagcccagçtaGa&gttcaágge<sàscâacSíatgácágcggggagtáé PTHTQPSY R F K A N N N D S G E Y 00 80 acgtgccagactggccagaccagcctcagcgaccctgtgcatctgactgtgctttccgaa TCQTGQTSLSDPVHLTVLSE 90 100 tggctggtgctccagacccctcacctggagttccaggagggagaaaccatcatgctgagg WLVLQTPHL EFQEGETIMLR 110 120 tgccacagctggaaggacaagcctctggtcaaggtcacattcttccagaatggaaaatcc CHSWKDKPLVKVTFFQNGKS 130 140 . cagaaattctcccatttGGftTÇÇcaccttctccatcccacaagcaaaccacagtcacagt QKFSHLDPTFSIPQANHSHS 150 160 ggtgattaccactgcacaggaaacataggctacacgctgttctcatccaagcctgtgacc GDYHCTGNIGYTLFSSKPVT 170 180 atcactgtccaagtgcccagcatgggcagctcttcacccgtagctcccccaaaggctgtg ITVQVPSMGS3 SPVAPPKAV 190 200 ctgaaacttgagcccccgtggatcaacgtgctccaggaggactctgtgactctgacatgc lklepfwinvlqedsvtltc 210 · 220 cagggggctcgcagccctgagagcgactccattcagtggttccacaatgggaatctcatt QGARSPESD SIQWFHNGNLI 230 240 cccacccacacgcagcceagctacaggttcaaggccaacaacaatgacagcggggagtac PTHTQESYRFKANNNDSGEY 250 260 acgtgccagactggccagaccagcctcagcgaccctgtgcatctgactgtgctttccgaa TCQTGQTSLSDPVHLTVLSE 270 280 tggctggtgctccagacccctcacctggagttccaggagggagaaaccatcàtgctgagg WLVLQTPHLEFQEGETIMLR 290 300 tgccacagctggaaggacaagcctctggtcaaggtcacattcttccagaatggaaaatcc CHSWKDK PLVKVTFFQNGKS 310 320 cagaaattctcccatttGGATCCcaccttctccatcccacaagcaaaccacagtcacagt QKFSHLDPTFSIPQANHSHS 330 340 ggtgattaccactgcacaggaaacataggctaoacgctgttctcatccaagcctgtgacc GDYHCTGNIGYTLFS SKPVT 350 360 atcactgtccaagtgcccagcatgggcagctcttcaccctctcatcaccaccatcaccac ITVQVPSMGSS SPSHHHBHH 370 gtctag (SEQ ID NO: 5) V - (SEQ ID NO: 6) 2/18 Figura 2

ε φ £ r 0 i» Φ Caracterização de muitímeros rsFcyrlIa

—4— monómero pad. -Ί"" 426 ((«onómeroj —roonómero-Fc -~X~~ HSA-monomero Diluição ® Titulação de "dimero" de rsFcgRila de células CHOP

Diluição 18/18 FIGURA 17A B

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