PT1909938E - Método de cromatografia de afinidade de antitrombina iii - Google Patents

Método de cromatografia de afinidade de antitrombina iii Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE ANTITROMBINA III" A presente invenção tem, como objectivo, uma coluna de cromatografia de afinidade compreendendo a proteína ATUI ligada a um suporte sólido.
As heparinas, misturas de mucopolissacáridos sulfatados de origem animal, são agentes biologicamente activos da família dos glicosaminoglicanos que têm propriedades anticoagulantes particularmente úteis. Estas são constituídas por cadeias lineares polissacarídicas sulfatadas muito heterogéneas nos seus tamanhos. 0 peso médio das heparinas é de cerca de 15000 Da (origem: muco de porco).
As heparinas de baixo peso molecular (HBPM) e as heparinas de muito baixo peso molecular (HTBPM) são preparadas por corte de cadeias polissacarídicas longas de heparina em cadeias mais curtas de baixo peso molecular. Por HBPM e HTBPM entende-se, deste modo, cadeias cujo peso molecular está compreendido, respectivamente, entre 3000 e 6500 Da e 1500 e 3000 Da. A antitrombina III (ATUI) (Chandra et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80: 1845-1848) é uma serpina específica, que tem uma actividade inibidora fraca de proteases de serina controlando a coagulação. Esta acção é francamente aumentada na presença de heparina que se liga e activa a ATUI. Em particular, a ligação à heparina envolve um conjunto de alterações conformacionais na proteína culminando na adopção de 1 uma conformação altamente favorável à interacção com as serinas proteases alvo. Quando a ATUI está na conformação activada, é francamente reforçada a interacção com a molécula da heparina ou derivado que iniciou a alteração da conformação. A interacção entre a heparina e a ATIII é devida a uma sequência pentassacaridica especifica. No entanto, apenas um terço das cadeias polissacaridicas possui as sequências especificas permitindo uma interacção estável com a ATIII. As preparações de heparina e derivados são, deste modo, heterogéneas no que se refere à afinidade para a ATIII. É significativo ser possível enriquecer uma população de oligossacáridos em espécies com afinidade para a ATIII, sendo esse enriquecimento susceptivel de aumentar significativamente a actividade anticoagulante desta população.
Em Hõõk et al. (1976, FEBS Lett., 66: 90-93) é descrito um método de cromatografia de afinidade ATIII para separar as fracções com afinidade e sem afinidade para a heparina. Foram publicados outros métodos mas retomam os pontos essenciais do método de Hoõk et al. (Hopwood et al., 1976, FEBS Lett., 69: 51-54; Denton et al., 1981, Anal. Biol., 118: 388-391; Pixley e Danishefsky, 1982, Thromb. Res., 26: 129-133). De acordo com este método, a ATIII é ligada, na presença de heparina acetilada, à resina Sepharose B activada com CNBr. A utilização da heparina tem, como objectivo, prevenir qualquer ligação ao nivel do local de ligação à heparina da ATIII.
Esta técnica tem duas limitações importantes.
Em primeiro lugar, a heparina utilizada para ligar ATIII é uma heparina acetilada, para evitar o risco de competição com 2 resíduos NH2 das hexaminas. No entanto, a acetilação da heparina traduz-se num abaixamento significativo da sua afinidade e, deste modo, da sua capacidade protectora no que se refere ao local de ligação, daí uma diminuição do número de moléculas ATIII capazes de se ligarem a espécies com afinidade.
Além disso, considerando a concentração de ATUI utilizada (cerca de 7 mg de proteína/mL de resina hidratada), existe um risco significativo de impedimento estérico entre as moléculas de polissacáridos susceptíveis de se ligarem a atui durante uma purificação de espécies com afinidade para ATUI. A presente invenção tem, como objectivo, uma coluna de cromatografia de afinidade compreendendo a proteína antitrombina III (ATUI) ligada a um suporte sólido caracterizada por: a. a proteína ATUI ser a proteína selvagem ou uma sua variante, b. a proteína ATUI ter sido activada previamente por incubação com uma heparina de baixo peso molecular (HBPM) não modificada e rica em espécies activas, c. a proteína ATUI estar ligada de uma forma covalente a uma resina numa proporção inferior a cerca de 2 mg de proteína por mL da resina hidratada.
Por hbpm não modificada, entende-se uma hbpm que não sofreu modificação química ou enzimática após preparação e, em particular, que não é acetilada. Entende-se por HBPM rica em 3 espécies activas, uma HBPM rica em oligossacáridos com afinidade para a ATUI.
Por resina, entende-se de acordo com a invenção, um suporte macromolecular quimicamente inerte sobre o qual a ATIII é ligada. Estes suportes compreendem entre outros e, de um modo, não limitante, esferas de agarose, poliacrilamida de agarose, vidro poroso, polivinilo ou polimetacrilato, sobre as quais a ATUI é ligada seguindo as indicações dos fabricantes ou os métodos bem conhecidos do especialista na técnica, dos quais, em particular, os métodos de ligação com brometo de cianogénio e hidrazina. É facilmente entendido que podem ser também utilizadas resinas pré-activadas.
De acordo com um modo particularmente vantajoso de realização da invenção, a resina utilizada é a Sepharose e a técnica de ligação utilizada é a da ligação com brometo de cianogénio. A coluna de cromatografia de afinidade, de acordo com a invenção, tem uma vantagem dupla.
Por um lado, a utilização de uma HBPM não modificada para proteger o local da ligação da ATIII permite fixar a proteína sob uma conformação activada. Sob esta conformação, a ATUI apresenta uma afinidade significativamente mais forte e mais selectiva no que respeita a espécies com afinidade do que as ATIII ligadas através das aminas primárias sem activação prévia.
Por outro lado, a baixa concentração em ATUI permite interacções com as espécies com afinidade sem impedimento estérico entre estas. Esta propriedade da invenção é 4 particularmente interessante quando se pretende separar espécies de grande tamanho. É preferido utilizar uma quantidade saturante de HBPM não modificada e rica em espécies com afinidade para que todas as moléculas atui sejam activadas.
De acordo com uma forma de realização vantajosa da invenção, a proporção entre as quantidades de locais que se ligam a atui presentes em HBPM e as moléculas atui situa-se entre cerca de 5 e cerca de 15. Mais precisamente, a invenção tem, como objectivo, uma coluna de cromatografia de afinidade tal como definido acima caracterizada por esta proporção ser de cerca de 10. A invenção tem particularmente como objectivo uma coluna de cromatografia de afinidade caracterizada por utilizar enoxaparina® como HBPM para proteger o local da ligação da ATUI.
Como explicado acima, a invenção apresenta, também, a vantagem de permitir uma melhor acessibilidade à ATUI variando a concentração da proteína ligável sobre a resina.
De acordo com outra forma vantajosa de realização, a invenção tem, como objectivo, uma coluna de cromatografia de afinidade caracterizada por a proporção ATIII/resina se situar entre cerca de 0,5 e cerca de 1,5 mg de proteína por mL de resina. Por exemplo, para uma resina do tipo Sepharose B activada com brometo de cianogénio (Sigma), esta corresponde a uma gama de cerca de 1,75 mg a 5,25 mg de proteína por g de 5 resina seca (de acordo com os dados do fornecedor, 1 g de resina seca origina cerca de 3,5 mL de resina após hidratação).
Deste modo, a coluna de cromatografia de afinidade de acordo com a invenção apresenta uma maior capacidade e uma maior selectividade do que as colunas descritas no estado da técnica.
Existem situações em que se pode pretender purificar a espécie com afinidade para ATUI a partir de uma mistura da espécie com afinidade e sem afinidade. Por espécie com afinidade para ATUI, entende-se qualquer molécula susceptivel de se ligar especif icamente à ATUI. Por exemplo, pode-se pretender enriquecer uma população de oligossacáridos heparinicos em espécies com afinidade. Também pode ser interessante, por exemplo, para aumentar o titulo de uma solução de anticorpos policlonais contra ATUI. A coluna de cromatografia de afinidade de acordo com a invenção pode ser, deste modo, utilizada para purificar espécies com afinidade para ATUI a partir de uma mistura. A invenção tem, consequentemente, também, como objectivo, um processo de purificação de espécies com afinidade para a ATUI numa amostra compreendendo espécies com afinidade e sem afinidade para a ATIII, compreendendo o referido processo: a. a introdução da referida amostra na coluna de cromatografia de afinidade para a proteína ATUI, sendo a referida coluna equilibrada previamente num tampão salino adequado; 6 b. a lavagem de espécies não retidas especificamente da referida coluna por um tampão salino de lavagem adequado e c. a eluição de espécies retidas especificamente da referida coluna por um tampão salino dos eluição adequado.
Em particular, de acordo com uma forma de realização particularmente vantajosa, as espécies com afinidade purificadas pelo processo de acordo com a invenção são oligossacáridos constituindo heparinas e seus derivados. A eluição das diferentes espécies poderá, por exemplo, ser seguida medindo a absorvência das diferentes fracções utilizando um espectrofotómetro. 0 comprimento de onda utilizado será adequado à natureza das espécies purificadas. Por exemplo, se forem purificados oligossacáridos o comprimento utilizado será 232 nm; se forem purificadas proteínas, será de 280 nm. A composição das fracções de eluição pode ser, de seguida, analisada de acordo com os métodos bem conhecidos do especialista na técnica. Deste modo, se as fracções analisadas compreenderem oligossacáridos, o especialista na técnica poderá utilizar os métodos da análise descritos na técnica anterior: por exemplo e de um modo não limitante, electroforese capilar, espectrofotometria de massa MALDI-TOF, cromatografia líquida de elevado desempenho. O especialista na técnica poderá também utilizar um teste biológico, como o teste de inibição do factor Xa. 7
Exemplos
Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem no entanto a limitar.
Legenda das figuras
Figura 1: cromatograma de uma separação de enoxaparina® em cromatografia de afinidade ATUI.
Figura 2: cromatograma de uma separação de enoxaparina® em cromatograf ia de afinidade ATUI. A curva 1 representa a injecção de HBPM na coluna 1 (protecção enoxaparina®), a curva 2 a injecção de tampão na coluna 1 (protecção enoxaparina®), a curva 3 a injecção de HBPM na coluna 2 (protecção heparina), a curva 4 a injecção de tampão na coluna 2 (protecção heparina).
Exemplo 1: Preparação e utilização da coluna 1. Preparação da coluna
Reconstituem-se 10 mg de ATUI em 2 mL da água ppi, que se retoma, de seguida, em 18 mL tampão de ligação (NaHC03 0, 2 M,
NaCl 0,5 M, pH=8) a uma concentração final de 0,5 mg/mL (8,6 μΜ) . Adicionam-se 34,4 mg de enoxaparina® à solução a uma concentração final de 1,4 mg/mL (215 μΜ). A solução é misturada na proporção de 1:2 com a resina
Sepharose B activada com CNBr (Sigma) preparada de acordo com as indicações do fabricante, depois, é agitada suavemente durante a noite no frio. 0 conjunto é, de seguida, transferido para tampão de bloqueio (volume para volume) e é agitado durante 16 h. A resina é vertida numa coluna XK16 termostatizada (Amersham) equipada com 2 pistões. Após decantação, esta é lavada 4 a 5 vezes alternando entre tampão de bloqueio e tampão de lavagem.
Após esta lavagem, a coluna é lavada abundantemente com tampão Tris-HCl 10 M, pH=7,4; NaCl 3 M, para eliminar as moléculas de enoxaparina® complexadas com a ATUI.
Finalmente, a coluna é equilibrada com tampão Tris HC1 10 mM, pH=7,4; NaCl 0,4 M. 2. Separação da espécie com afinidade para a enoxaparina® por cromatografia de afinidade
Injecta-se na coluna uma solução de enoxaparina® a 1 mg/mL em tampão Tris HC1 10 mM, pH=7,4; NaCl 0,4 Μ. A coluna é lavada abundantemente com o mesmo tampão depois a eluição é realizada com tampão Tris HC1 10 mM, pH=7,4; NaCl 3 M. O comportamento das espécies com afinidade é seguido com um detector UV com matriz de díodos (HP 1100) medindo a absorvência das fracções a 232 nm. Como o mostra a fig. 1, as espécies com afinidade são retidas especificamente na coluna e são eluídas apenas na presença de NaCl 3 M. 9
Exemplo 2: Comparação com uma outra coluna de cromatoqrafia de afinidade 1. Capacidade São preparadas duas colunas com um protocolo de enxerto idêntico, excepto pelo agente protector: • Coluna 1: Protecção durante a ligação com 40 mg de enoxaparina® • Coluna 2: Protecção durante ligação com 120 mg de heparina A diferença na quantidade utilizada na protecção é justificada pela diferença na massa molecular média (uma proporção de, aproximadamente, 3,4). São injectadas 400 pg de uma HBPM preparada como descrito no exemplo 7 do pedido internacional WO 02/08295 em cada coluna, num tampão Tris-HCl 10 mM, pH=7,4; NaCl 0,2 M com um fluxo =0,5 mL/minuto, para determinar a capacidade das colunas. A eluição é realizada com NaCl 3 M. A separação de diferentes espécies polissacaridicas é seguida com um detector UV com matriz de díodos (HP 1100) medindo a absorvência das fracções a 232 nm. É observada uma separação nas duas colunas mas o perfil da separação é diferente (Fig. 2). Em particular, o pico de espécies não retidas está francamente arrastado na coluna 2 (protecção: heparina). Além disso, a quantidade eluída com a 10 coluna 2 (protecção: heparina) parece ser mais baixa do que a eluída com a coluna 1 (protecção: enoxaparina®).
Para verificar quantitativamente este resultado qualitativo, a percentagem de espécies seleccionadas é calculada pela integração das áreas realizadas com o programa informático HP Chemstation® de acordo com a fórmula: % Espécies retidas = área do pico de eluição/ (área do pico das espécies não retidas + área do pico das espécies retidas)
Sabendo que a percentagem de espécies com afinidade numa fracção hexassacarídica da HBPM utilizada é estimada em 22-24%, realizou-se uma determinação aproximada da capacidade fazendo variar a quantidade injectada. A capacidade corresponde, então, à quantidade máxima de HBPM injectada para a qual se obtém esta percentagem de 22-24% na eluição.
Foi deste modo verificado que a capacidade da coluna 1 (protecção: enoxaparina) é de 115,8 pg e que a capacidade da coluna 2 (protecção: heparina) é de 64 pg.
Selectividade
Define-se aqui por selectividade a capacidade das resinas para distinguirem as espécies polissacarídicas com afinidade, das sem afinidade, durante a separação.
Foram realizadas injecções de HBPM de quantidade inferior à capacidade determinada anteriormente para realizar estas análises. 11 a. Coluna 1 (protecção: enoxaparina®),
Após várias injecções de 427 pg de HBPM as fracções com afinidade e sem afinidade foram reunidas e analisadas em CLHP CTA-SAX (MOURIER et al., 2004, Anal. Bíochem., 332: 299-313). A fracção com afinidade obtida é pura e completa, na medida em que esta não contém espécies sem afinidade e que esta apresenta a totalidade de hexassacáridos com afinidade. A fracção sem afinidade é, de um modo complementar completamente, esgotada de espécies com afinidade.
Foram determinadas as actividades anti-Xa das fracções com afinidade e sem afinidade separadas na coluna 1 (protecção: enoxaparina®) para corroborar a análise estrutural. A da fracção com afinidade é igual a 818 ± 10 UI/mg; para comparação, a actividade do hexassacárido AUA- (1—4) α-GlcNAc (6S) — (1—4) β-GlcA- (1—4) a-GlcNS (NS, 3, 6S) - (1-4) p-IdA2S- (1-4) a-GlcNS(NS,6S) é de cerca de 650-700 Ul/mg. Pelo contrário, foi totalmente impossível detectar uma actividade anti-Xa nas fracções sem afinidade.
As análises biológicas realizadas nas fracções estão, consequentemente, perfeitamente de acordo com as análises estruturais. b. Coluna 2 (protecção: heparina)
Foi realizado um estudo semelhante para a coluna 2 (protecção: heparina). Para optimizar o funcionamento desta 12 resina, as quantidades injectadas foram, no entanto, mais baixas (60 p.g), em comparação com a capacidade determinada anteriormente. A fracção com afinidade não é tão pura como a obtida com a coluna 1 (protecção: enoxaparina®) . Observa-se, de facto, a presença de hexassacáridos sem afinidade, em particular hexassacáridos muito sulfatados como AUA2S-(1->4)oí-G1cNS (NS, 6S) -(l->4) p-IdA2S- (l->4 ) α-GlcNS (NS, 6S) - (l-»4) p-IdA2S-(l-»4)a-GlcNS (NS, 6S) OU AUA2S- (l->4) a-GlcNS (NS, 6S) - (l-*4) p-IdA2S- (l->4 ) a-GlcNS (NS, 6S) - (l->4) β-GlcA- (14)a-GlcNS (NS, 6S), em quantidade não negligenciável.
Além disso, encontram-se espécies com afinidade na fracção sem afinidade, em particular, a espécie com afinidade
maioritária: AUA- (1->4)oí-G1cNAc(6S)-(1->4) β-GlcA- (l-»4) a-GlcNS (NS, 3, 6S) — (l->4) p-IdA2S- (l->4)a-GlcNS (NS, 6S) .
Os titulos das actividades anti-Xa das fracções com afinidade e sem-afinidade confirmam as análises estruturais. De facto, as fracções com afinidade apresentam uma actividade anti-Xa que é apenas de 565 ± 45 Ul/mg. Além disso, observa-se uma actividade residual não negligenciável, de cerca de 15 Ul/mg, na fracção sem afinidade. Esta actividade é o reflexo de espécies com afinidade residuais na fracção sem afinidade detectadas durante a análise estrutural. É consequentemente evidente que a selectividade da coluna 1 (enoxaparina®) é mais elevada do que a da coluna 2 (heparina).
Lisboa, 24 de Fevereiro de 2011 13

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Coluna de cromatografia de afinidade compreendendo a proteína antitrombina III (ATUI) ligada a um suporte sólido caracterizada por: a. a proteína ATUI ser a proteína selvagem ou uma sua variante, b. a proteína ATUI ter sido previamente activada por incubação com um heparina de baixo peso molecular (HBPM) não modificada e rica em espécies activas, c. a proteína ATUI estar ligada de uma forma covalente a uma resina num proporção inferior a cerca de 2 mg de proteína por mL de resina hidratada.
  2. 2. Coluna como definida na reivindicação 1, caracterizada por a proporção entre as quantidades de locais que se ligam a ATI II presentes na HBPM e as moléculas de ATI II estar compreendida entre cerca de 5 e cerca de 15.
  3. 3. Coluna como definida na reivindicação 2, caracterizada por esta proporção ser de cerca de 10.
  4. 4. Coluna como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a HBPM ser a enoxaparina®.
  5. 5. Coluna como definida na reivindicação 1, caracterizada por a proporção ATIII/resina estar compreendida entre 0,5 e 1,5 mg de proteína por mL da resina. 1
  6. 6. Processo de purificação de espécie com afinidade para a ATIII numa amostra compreendendo espécies com afinidade e sem afinidade para a ATUI, compreendendo o referido processo: a. a introdução da referida amostra na coluna de cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, sendo a referida coluna equilibrada previamente num tampão salino adequado; b. a lavagem de espécies não retidas especificamente da coluna referida por um tampão salino de lavagem adequado e c. a eluição das espécies retidas especificamente da coluna referida por um tampão salino de eluição adequado.
  7. 7. Processo de purificação de espécies com afinidade para a ATUI de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por as referidas espécies serem oligossacáridos. Lisboa, 24 de Fevereiro de 2011 2 1/2
    Figura 1 2/2
    Ο 10 20 3D 40 50 60 70 Β0 πίπ Figura 2
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