KR101261662B1 - 항트롬빈 ⅲ의 친화성 크로마토그래피법 - Google Patents

항트롬빈 ⅲ의 친화성 크로마토그래피법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ATⅢ 단백질을 먼저 활성 종이 풍부한 비개질 저분자량 헤파린과 함께 인큐베이션시킴으로써 활성화시키고, 상기 단백질이 수화 수지 1 ㎖ 당 약 2 ㎎ 미만의 단백질 비율로 수지에 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 고체 지지체에 결합된 ATⅢ 단백질을 포함하는 친화성 크로마토그래피 칼럼에 관한 것이다.
항트롬빈 Ⅲ (ATⅢ), 친화성 크로마토그래피 칼럼, 저분자량 헤파린 (LMWH)

Description

항트롬빈 Ⅲ의 친화성 크로마토그래피법 {METHOD FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF ANTITHROMBIN Ⅲ}
본 발명은 고체 지지체에 결합된 ATⅢ 단백질을 포함하는 친화성 크로마토그래피 칼럼에 관한 것이다.
동물 기원의 황산화 뮤코다당류의 혼합물인 헤파린은 특히 유용한 항응고성을 갖는 글리코스아미노글리칸 족의 생물학적 활성제이다. 그들은 그들의 크기로 인하여 이질적인 황산화 선형 다당류 사슬로 구성된다. 헤파린의 평균 중량은 대략 15,000 Da이다 (기원: 돼지 점액).
저분자량 헤파린 (LMWH) 및 초저분자량 헤파린 (VLMWH)은 긴 헤파린 다당류 사슬을 더 짧은 저분자량의 사슬이 되도록 쪼개어 제조한다. 따라서, "LMWH" 및 "VLMWH"는 분자량이 각각 3000 내지 6500 Da 및 1500 내지 3000 Da인 사슬을 의미하기 위한 것이다.
항트롬빈 Ⅲ (ATⅢ) (문헌 [Chandra et al ., 1983, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 80: 1845-1848])는 응고를 제어하는 세린 프로테아제에 대하여 약한 억제 활성을 갖는 특정 세르핀(serpin)이다. 상기 작용은 ATⅢ에 결합하여 활성화시키는 헤파린의 존재 하에서 분명히 증가된다. 특히, 헤파린에 대한 결합은, 표적 세 린 프로테아제와의 상호작용에 매우 우호적인 형태의 채택에 이르게 되는, 단백질에서의 일련의 입체형태적 변화를 야기한다. ATⅢ가 활성화된 형태인 경우에는, 헤파린 분자 또는 입체형태적 변화를 개시한 유도체와의 상호작용이 확실히 강화된다.
헤파린과 ATⅢ 사이의 상호작용은 특정 5당류 서열에 기인한 것이다. 현재, 다당류 가닥 중 1/3만이 ATⅢ와의 안정한 상호작용을 허용하는 특정 서열을 갖는다. 따라서, 헤파린 제제 및 유도체는 ATⅢ에 대한 친화성에 관해서는 이질적이다. ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종 중 올리고당류 군을 보강시킬 수 있는 것이 중요하며, 이러한 보강은 상기 군의 항응고 활성을 유의하게 증가시킬 수 있다.
헤파린-친화성 및 헤파린-비-친화성 분획을 분리하기 위한 ATⅢ 친화성 크로마토그래피법은 문헌 [Hook et al . (1976, FEBS Lett ., 66: 90-93)]에 기재되어 있다. 다른 방법들이 공표되어 있지만, 후크(Hook) 등의 방법의 요지를 반복하고 있다 (문헌 [Hopwood et al ., 1976, FEBS Lett., 69: 51-54]; [Denton et al ., 1981, Anal. Biol ., 118: 388-391]; [Pixley ＆ Danishefsky, 1982, Thromb . Res., 26: 129-133]). 상기 방법에 따르면, ATⅢ는 아세틸화된 헤파린의 존재 하에 CNBr-활성화 세파로스(Sepharose) B 수지에 그래프팅된다. 헤파린의 사용 목적은 ATⅢ의 헤파린-결합 부위 수준에서의 임의의 그래프팅을 막기 위함이다.
상기 기술은 두 가지의 중대한 한계가 있다.
우선, ATⅢ에 결합하는데 사용되는 헤파린은 헥사민 NH2 잔기와의 경쟁 위험 성을 피하기 위해서 아세틸화된 헤파린이다. 현재, 헤파린의 아세틸화는 친화성의 상당한 감소 및 그에 따라서 결합 부위와 관련된 보호 용량의 상당한 감소로 나타나며, 따라서 친화성을 갖는 종에 결합할 수 있는 ATⅢ 분자 수의 감소로 나타난다.
다음으로, 사용되는 ATⅢ의 농도 (수화 수지 1 ㎖ 당 대략 7 ㎎의 단백질)의 관점에서, ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종의 정제 도중에 ATⅢ에 결합할 수 있는 다당류 분자 사이에서 입체 장애의 위험성이 높다.
본 발명의 주제는,
a. 항트롬빈 Ⅲ (ATⅢ) 단백질이 야생형 단백질 또는 그의 변이체이고,
b. ATⅢ 단백질을 먼저 활성 종이 풍부한 비개질 저분자량 헤파린 (LMWH)과 함께 인큐베이션됨으로써 활성화된 것이며,
c. ATⅢ 단백질이 수화 수지 1 ㎖ 당 대략 2 ㎎ 미만의 단백질 비율로 수지에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 하는, 고체 지지체에 결합된 ATⅢ 단백질을 포함하는 친화성 크로마토그래피 칼럼이다.
"비개질 LMWH"라는 용어는 제조 후에 화학적으로 또는 효소적으로 개질되지 않은, 특히 아세틸화되지 않은 LMWH를 의미하기 위한 것이다. "활성 종이 풍부한 LMWH"라는 표현은 ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 올리고당류가 풍부한 LMWH를 의미하기 위한 것이다.
"수지"라는 용어는, 본 발명에 따르면, ATⅢ가 그래프팅되는 화학적으로 비활성인 거대분자 지지체를 의미하기 위한 것이다. 상기 지지체는, 특히 그러나 비제한적인 방식으로, 제조사의 설명서 또는 특히 시아노겐 브로마이드와의 그래프팅법 및 히드라진과의 그래프팅법을 비롯하여 당업자에게 주지된 방법에 따라서 ATⅢ가 그래프팅되는, 아가로스 비즈, 폴리아크릴아미드-아가로스 비즈, 다공성 유리 비즈, 폴리비닐 비즈 또는 폴리메타크릴레이트 비즈를 포함한다. 미리 활성화시킨 수지도 사용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 가장 특히 유리한 실시양태에 따르면, 사용되는 수지는 세파로스이고, 사용되는 그래프팅 기술은 시아노겐 브로마이드 그래프팅 기술이다.
본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피 칼럼은 이중의 장점이 있다.
우선, ATⅢ의 결합 부위를 보호하기 위해서 비개질 LMWH를 사용하면 단백질을 활성화된 형태로 고정시킬 수 있다. 상기 형태에서, ATⅢ는 사전 활성화 없이 일차 아민을 통해서 결합된 ATⅢ보다 친화성을 갖는 종과 관련하여 유의하게 더 크고 더 선택적인 친화성을 나타낸다.
다음으로, 저농도의 ATⅢ는 그들 간에 입체 장애 없이 친화성을 갖는 종과 상호작용하도록 해 준다. 본 발명의 이러한 특성은 크기가 큰 종을 분리하고자 할 때 특히 유리하다.
모든 ATⅢ 분자를 활성화시키기 위해서, 친화성을 갖는 종이 풍부한 포화량의 비개질 LMWH를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 유리한 실시양태에 따르면, LMWH에 존재하는 ATⅢ-결합 부위의 양과 ATⅢ 분자의 양 사이의 비율은 대략 5 내지 대략 15이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 주제는 상기 비율이 대략 10인 것을 특징으로 하는, 앞서 정의된 바와 같은 친화성 크로마토그래피 칼럼이다.
본 발명의 주제는 가장 특히, 에녹사파린(등록상표)을 ATⅢ 결합 부위 보호용 LMWH로서 사용하는 것을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피 칼럼이다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 또한 수지에 그래프팅될 수 있는 단백질의 농도를 조정함으로써 ATⅢ에 대해 더 양호한 접근성을 허용한다는 장점이 있다.
또 다른 유리한 실시양태에 따르면, 본 발명의 주제는 ATⅢ/수지 비율이 수지 1 ㎖ 당 대략 0.5 내지 대략 1.5 ㎎의 단백질인 것을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피 칼럼이다. 예를 들어, 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로스 B 수지 (시그마(Sigma))의 경우에, 이는 건식 수지 1 g 당 대략 1.75 ㎎ 내지 5.25 ㎎ 범위의 단백질에 해당한다 (공급사의 데이터에 따르면, 건식 수지 1 g은 수화 이후에 대략 3.5 ㎖의 수지를 제공한다).
따라서, 본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피 칼럼은 종래 기술에 기재된 칼럼보다 더 우수한 용량 및 더 우수한 선택성을 갖는다.
ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종 및 친화성을 갖지 않는 종의 혼합물로부터 친화성을 갖는 종을 정제하는 것이 바람직할 수 있는 경우가 있다. "ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종"이라는 표현은 ATⅢ에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미하기 위한 것이다. 예를 들어, 친화성을 갖는 종 중 헤파린 올리고당류 군을 보강시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 예를 들어, ATⅢ에 대한 폴리클로날 항체 용액의 역가(titer)를 증가시키는 것이 유리할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피 칼럼은 혼합물로부터 ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종을 정제하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 주제는 또한,
a. ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종 및 친화성을 갖지 않는 종을 포함하는 샘플을, 먼저 적당한 염수 완충액 중에서 평형화된, ATⅢ 단백질에 대한 친화성 크로마토그래피 칼럼에 도입시키는 단계,
b. 특이적으로 잔류하지 않는 종을 상기 칼럼으로부터 적당한 염수 세척 완충액으로 세척하는 단계, 및
c. 특이적으로 잔류하는 종을 상기 칼럼으로부터 적당한 염수 용출 완충액으로 용출시키는 단계
를 포함하는, 상기 샘플 중 ATⅢ에 대해 친화성을 갖는 종을 정제하는 방법이다.
특히, 가장 특히 유리한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 정제되는, 친화성을 갖는 종은 헤파린 및 그의 유도체를 구성하는 올리고당류이다.
다양한 종의 용출에 이어서, 예를 들어, 분광광도계를 사용하여 다양한 분획에 대하여 흡광도를 측정할 수 있다. 사용되는 파장은 정제되는 종의 성질에 적합할 것이다. 예를 들어, 올리고당류를 정제하는 경우에는, 사용되는 파장은 232 ㎚일 것이며, 단백질을 정제하는 경우에는 280 ㎚일 것이다.
이후에, 용출 분획의 조성은 당업자에게 주지된 방법에 따라서 분석할 수 있다. 따라서, 분석되는 분획이 올리고당류를 포함하는 경우에는, 당업자는 종래 기술에 기재된 분석 방법, 예를 들되 비제한적인 방식으로, 모세관 전기영동, MALDI-TOF 질량 분광광도법, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 당업자는 또한 생물학적 검정법, 예컨대 인자 Xa 억제 검정법을 사용할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만, 한정하지는 않는다.
도　1:　ATⅢ 친화성 크로마토그래피에서 에녹사파린(등록상표)의 분리 크로마토그램.
도　2:　ATⅢ 친화성 크로마토그래피에서 에녹사파린(등록상표)의 분리 크로마토그램. 곡선 1은 칼럼 1 (에녹사파린(등록상표) 보호)에 대한 LMWH의 주입이고, 곡선 2는 칼럼　1 (에녹사파린(등록상표) 보호)에 대한 완충액의 주입이고, 곡선 3은 칼럼 2 (헤파린 보호)에 대한 LMWH의 주입이고, 곡선 4는 칼럼 2 (헤파린 보호)에 대한 완충액의 주입이다.
실시예 　1: 칼럼의 제법 및 용도
1. 칼럼의 제법
10 ㎎의 ATⅢ를 주사용 제제를 위한 2 ㎖의 물에 재구성시키고, 이어서 이것을 18 ㎖의 커플링 완충액 (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH = 8)에 0.5 ㎎/㎖ (8.6 μM)의 최종 농도로 녹였다. 34.4 ㎎의 에녹사파린(등록상표)을 상기 용액에 1.4 ㎎/㎖ (215 μM)의 최종 농도로 첨가하였다.
상기 용액을 제조사의 설명서에 따라서 제조한 CNBr-활성화 세파로스 B 수지 (시그마)와 1:2 비율로 혼합한 후, 저온에서 밤새 서서히 교반하였다. 이어서, 상기 전부를 차단 완충액에 옮기고 (부피 대 부피), 16 h 동안 교반하였다.
상기 수지를 2개의 피스톤이 장착되어 있는 온도조절 XK16 칼럼 (아머샴(Amersham))에 부었다. 디캔팅한 후, 차단 완충액과 세척 완충액을 번갈아가며 4 내지 5회 세척하였다.
세척 후, 상기 칼럼을 10 M Tris-HCl 완충액, pH = 7.4; 3 M NaCl로 완전히 세정하여 ATⅢ와 복합체를 형성한 에녹사파린(등록상표) 분자를 제거하였다.
마지막으로, 상기 칼럼을 10 mM Tris HCl 완충액, pH = 7.4; 0.4 M NaCl로 평형화시켰다.
2. 친화성 크로마토그래피에 의한 친화성을 갖는 에녹사파린 (등록상표) 종의 분리
10 mM Tris HCl 완충액, pH = 7.4; 0.4 M NaCl 중 1 ㎎/㎖의 에녹사파린(등록상표) 용액을 상기 칼럼에 주입하였다. 칼럼을 동일한 완충액으로 완전히 세척한 후, 10 mM Tris HCl 완충액, pH = 7.4; 3 M NaCl로 용출을 수행하였다.
친화성을 갖는 종의 거동 후, 다이오드 어레이 UV 검출기 (HP 1100)로 232 ㎚에서 분획의 흡광도를 측정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 친화성을 갖는 종은 칼럼에 특이적으로 잔류하며, 3 M NaCl의 존재 하에서만 용출되었다.
실시예 　2:　또 다른 친화성 크로마토그래피 칼럼과의 비교
1. 용량
보호제를 제외하고는, 동일한 그래프팅 프로토콜로 2개의 칼럼을 제조하였다.
ㆍ칼럼 1: 40 ㎎의 에녹사파린(등록상표)으로 그래프팅하는 동안의 보호
ㆍ칼럼 2: 120 ㎎의 헤파린으로 그래프팅하는 동안의 보호.
보호에 사용된 양의 차는 평균 분자 질량의 차로 인한 것이다 (대략 3.4의 비율).
칼럼의 용량을 측정하기 위해서, 국제 출원 WO 02/08295의 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조한 LMWH 400 ㎍을 각 칼럼에 10 mM Tris-HCl 완충액, pH = 7.4; 0.2 M NaCl 중 0.5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 용출은 3 M NaCl로 수행하였다.
다양한 다당류 종의 분리 후, 다이오드 어레이 UV 검출기 (HP 1100)로 232 ㎚에서 분획의 흡광도를 측정하였다.
상기 두 칼럼에서 분리가 관찰되었지만, 분리 프로파일은 상이하였다 (도 2). 특히, 잔류하지 않는 종의 피크는 칼럼 2 (보호: 헤파린)에서 광범위하게 길게 늘어졌다. 또한, 칼럼 2 (보호: 헤파린)로 용출된 양은 칼럼 1 (보호: 에녹사파린(등록상표))로 용출된 양보다 더 적은 것으로 나타났다.
상기의 정성적인 결과를 정량적으로 확인하기 위해서, 잔류하는 종의 백분율을 하기의 식에 따라서 에이치피 켐스테이션(HP Chemstation(등록상표)) 소프트웨어로 수행되는, 면적의 적분을 이용하여 계산하였다.
잔류하는 종 ％ = 용출 피크 면적/(잔류하지 않는 종의 피크 면적 + 잔류하는 종의 피크 면적).
사용되는 LMWH의 6당류 분획 중 친화성을 갖는 종의 백분율이 22-24％로 추정된다는 인식 하에, 주입량을 바꾸어서 상기 용량의 대략적인 측정을 수행하였다. 이때, 용출시 상기 22-24％의 백분율이 수득되는 용량은 LMWH의 최대 주입량에 해당하였다.
그 결과, 칼럼 1 (보호: 에녹사파린)의 용량은 115.8 ㎍이며, 칼럼 2 (보호: 헤파린)의 용량은 64 ㎍이라는 것을 알게 되었다.
선택성
"선택성"이라는 용어는 본원에서, 분리 도중에 친화성을 갖지 않는 다당류 종으로부터 친화성을 갖는 다당류 종을 구분하는 수지의 능력으로 정의된다.
상기 분석을 수행하기 위해서, 앞서 측정한 용량 미만의 양으로 LMWH의 주입을 수행하였다.
a. 칼럼 1 (보호: 에녹사파린(등록상표)),
427 ㎍의 LMWH를 수 회 주입한 후, 친화성을 갖는 분획 및 친화성을 갖지 않는 분획을 합치고, CTA-SAX HPLC로 분석하였다 (문헌 [MOURIER et al ., 2004, Anal. Biochem., 332: 299-313]). 친화성을 갖는 수득된 분획은, 친화성을 갖지 않는 어떠한 종도 함유하지 않는다는 점과 모두가 친화성을 갖는 6당류라는 점에서 순수하며 완전하였다. 친화성을 갖지 않는 분획은, 상보적으로, 친화성을 갖는 종이 전혀 없었다.
구조 분석을 보강하기 위해서, 칼럼 1 (보호: 에녹사파린(등록상표))에서 분리된, 친화성을 갖는 분획 및 친화성을 갖지 않는 분획의 항-Xa 활성을 측정하였 다.
친화성을 갖는 분획에서의 상기 활성은 818 ± 10 IU/㎎이었으며, 그에 비하여 6당류 △UA-(1→4)α-GlcNAc(6S)-(1→4)β-GlcA-(1→4)α-GlcNS(NS,3,6S)-(1→4)β-IdA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)의 활성은 대략 650-700 IU/㎎이었다. 한편, 친화성을 갖지 않는 분획에서 항-Xa 활성을 검출하는 것은 완전히 불가능하였다.
생물학적 분석을 상기 분획에 대해 수행하였으며, 그 결과, 구조 분석과 완전히 일치하였다.
b. 칼럼 2 (보호: 헤파린)
유사한 연구를 칼럼 2 (보호: 헤파린)에 대해 수행하였다. 상기 수지의 기능을 최적화시키기 위해서, 주입량은 앞서 측정한 용량의 측면에서 역시 더 적었다 (60 ㎍).
친화성을 갖는 분획은 칼럼 1 (보호: 에녹사파린(등록상표))의 경우에 수득된 것만큼 순수하지는 않았다. 실제로, 친화성을 갖지 않는 6당류의 존재, 특히 유의한 양의 고도로 황산화된 6당류, 예컨대 △UA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)-(1→4)β-IdA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)-(1→4)β-IdA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S) 또는 △UA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)-(1→4)β-IdA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)-(1→4)β-GlcA-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)의 존재가 관찰되었다.
또한, 친화성을 갖는 종, 특히 친화성을 갖는 주된 종, 즉 △UA-(1→4)α-GlcNAc(6S)-(1→4)β-GlcA-(1→4)α-GlcNS(NS,3,6S)-(1→4)β-IdA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)이 친화성을 갖지 않는 분획에서 발견되었다.
친화성을 갖는 분획 및 친화성을 갖지 않는 분획의 항-Xa 활성의 역가는 구조 분석을 확인시켜 주었다. 실제로, 친화성을 갖는 분획은 불과 565 ± 45 IU/㎎인 항-Xa 활성을 나타내었다. 또한, 대략 15 IU/㎎의 유의한 잔류 활성이 친화성을 갖지 않는 분획에서 발견되었다. 상기 활성은 친화성을 갖지 않는 분획에 있는 친화성을 갖는 잔류 종의 반영이며, 구조 분석 도중에 입증된다.
따라서, 칼럼 1 (에녹사파린(등록상표))이 칼럼 2 (헤파린)보다 선택성이 더 우수하다는 것은 명백하다.

Claims (7)

  1. a. 항트롬빈 Ⅲ (ATⅢ) 단백질이 야생형 단백질 또는 그의 변이체이고,
    b. ATⅢ 단백질이 먼저 활성 종이 풍부한 비개질 저분자량 헤파린 (LMWH)과 함께 인큐베이션됨으로써 활성화된 것이며,
    c. ATⅢ 단백질이 수화 수지 1 ㎖ 당 2 ㎎ 미만의 단백질 비율로 수지에 공유결합되어 있는 것
    을 특징으로 하는, 고체 지지체에 결합된 ATⅢ 단백질을 포함하는 친화성 크로마토그래피 칼럼.
  2. 제1항에 있어서, LMWH에 존재하는 ATⅢ 단백질-결합 부위의 양과 ATⅢ 단백질 분자의 양 사이의 비율이 5 내지 15인 것을 특징으로 하는 칼럼.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비율이 10인 것을 특징으로 하는 칼럼.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, LMWH가 에녹사파린인 것을 특징으로 하는 칼럼.
  5. 제1항에 있어서, ATⅢ 단백질/수화 수지 비율이 수지 1 ㎖ 당 0.5 내지 1.5 ㎎의 단백질인 것을 특징으로 하는 칼럼.
  6. a. ATⅢ 단백질에 대해 친화성을 갖는 종 및 친화성을 갖지 않는 종을 포함하는 샘플을, 먼저 적당한 염수 완충액 중에서 평형화된, 제1항의 친화성 크로마토그래피 칼럼에 도입시키는 단계,
    b. 잔류하지 않는 종을 상기 칼럼으로부터 적당한 염수 세척 완충액으로 세척하는 단계, 및
    c. 잔류하는 종을 상기 칼럼으로부터 적당한 염수 용출 완충액으로 용출시키는 단계
    를 포함하는, 상기 샘플 중 ATⅢ 단백질에 대해 친화성을 갖는 종을 정제하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ATⅢ 단백질에 대해 친화성을 갖는 종이 올리고당류인 것을 특징으로 하는, ATⅢ 단백질에 대해 친화성을 갖는 종을 정제하는 방법.
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