PT1663266E - Paredes celulares de leveduras para o tratamento ou a prevenção de hiperglicemia ou para a estabilização da glicemia - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PAREDES CELULARES DE LEVEDURAS PARA O TRATAMENTO OU A PREVENÇÃO DE HIPERGLICEMIA OU PARA A ESTABILIZAÇÃO DA GLICEMIA" 0 presente invento refere-se ao tratamento e à prevenção da hiperglicemia, assim como à estabilização da glicemia.

Um grande número de compostos foi já proposto para a prevenção da hiperglicemia, para o tratamento da hiperglicemia e/ou para a estabilização da glicemia, em particular no caso da diabetes.

Propuseram-se assim produtos à base de leveduras, como nomeadamente as leveduras tal e qual, produtos de extrato de levedura, um fator de tolerância à glucose à base de crómio (GTF) extraído de uma levedura enriquecida em crómio e também uma preparação celular de levedura de cerveja.

Assim, o documento JP-A-61-167622 propõe um agente para a luta contra a diabetes à base de uma fração celular da levedura de cerveja chamada de parede celular no documento e obtida por hidrólise da levedura de cerveja tratada para lhe retirar o sabor amargo durante, pelo 2 ΡΕ1663266 menos, 2 horas a uma temperatura de 50 a 70°C e extração aquosa de constituintes solúveis em água. A referida fração celular de levedura de cerveja apresenta nomeadamente um teor de glucanos de cerca de 14,8%, um teor de mananos de cerca de 13,9%. A referida fração celular apresenta igualmente um teor de glicogénio de cerca de 24,9%. O glicogénio ou amido do fígado (em inglês: "liver starch"; em alemão "Leberstarke") é um polissacárido de reserva igualmente presente nos músculos e, em particular, no fígado. Este glicogénio é igualmente uma substância de reserva da levedura, utilizada por esta como fonte de energia para assegurar a sua sobrevivência. Quando este é um dos compostos principais da fração celular descrita neste pedido de patente japonesa, este não faz parte da parede celular das leveduras.

Segundo o presente invento, foi agora constatado que é possível obter paredes celulares de leveduras eficazes como agentes para a prevenção e o tratamento da hiperglicemia e apresentando um teor baixo de glicogénio, podendo as referidas paredes celulares de levedura ser obtidas através de um processo de autólise ou de hidrólise enzimático simples. 0 termo "parede celular de levedura" refere-se à fração insolúvel das células de levedura, não enriquecidas em crómio, obtida após uma autólise ou uma hidrólise enzimática, essencialmente por proteases, conduzindo à solubilização de, pelo menos, 50% e preferencialmente, pelo 3 ΡΕ1663266 menos, 60% em massa de matérias secas de células de levadura inteiras e conservando os polissacáridos a estrutura da parede celular, ou seja os β-glucanos e os mananos, estando estes mananos sob a forma de manoproteinas.

Esta autólise ou hidrólise enzimática é conduzida de maneira a solubilizar o essencial dos açúcares de reserva da celulose da levedura que são o glicogénio e a trealose. As paredes celulares de levedura são obtidas por separação da fração solubilizada por autólise ou hidrólise enzimática, tendo esta uma duração, preferencialmente de, pelo menos, 18 horas. Os processos preferidos de autólise dos cremes de levedura são descritos nas páginas 370 a 377 na obra de referência "Yeast Technology", 2a edição, 1991, G. Reed e T. W. Nogodawithana, publicada pela Van Nostrand Reinhold, New York, ISBN 0-442-31892-8. As paredes celulares de levedura assim obtidas são em seguida tipicamente secas através de um processo clássico de secagem, como a secagem por atomização ou a secagem em tambores aquecidos.

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento são paredes celulares de levedura do género do tipo Saccharomyces pertencendo preferencialmente à espécie Saccharomyces cerevisiae.

As referidas leveduras são, preferencialmente, os fermentos de padeiro. Um fermento de padeiro é uma levedura que pertence à espécie Saccharomyces cerevisiae, fabricado com o auxilio essencialmente de uma multiplicação ou cul- 4 ΡΕ1663266 tura aeróbia como ensinado na obra de referência "Yeast Technology" atrás citada e não tendo sido submetido antes da sua autólise ou hidrólise enzimática a nenhuma utilização, contrariamente, por exemplo, à levedura de cerveja que é um subproduto do fabrico da cerveja e que por isso serviu para fabricar cerveja antes da sua recuperação pela sua autólise ou hidrólise enzimática. Esta levedura de cerveja foi multiplicada essencialmente anaerobicamente (sendo o fabrico da cerveja um processo anaeróbico).

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento apresentam um teor total de glucanos e mananos da parede celular (sistematicamente expresso em massa equivalente de, respetivamente, glucose e manose - ver métodos de medição a seguir) de, pelo menos, 34,0% em massa de matéria seca, assim como um teor de glicogénio (sistematicamente expresso em massa equivalente de glucose - ver métodos de medição a seguir) inferior a 10,0% em massa de matéria seca.

Preferencialmente, as paredes celulares de levedura de acordo com o invento apresentam um teor total em glucanos e mananos de, pelo menos, 40,0% em massa de matéria seca, ainda mais preferencialmente de, pelo menos, 45,0% em massa de matéria seca.

Igualmente, preferencialmente, as paredes celulares de levedura de acordo com o invento apresentam um teor de glicogénio inferior a 8,0% em massa de matéria 5 ΡΕ1663266 seca, ainda mais preferencialmente inferior a 5,0% em massa de matéria seca e ainda mais preferencialmente inferior a 3,0% em massa de matéria seca.

De maneira útil, as paredes celulares de levedura de acordo com o invento apresentam um teor de proteinas de 17.0 a 35,0% em massa de matéria seca, preferencialmente de 18.0 a 26,0% em massa de matéria seca.

De maneira interessante, as paredes celulares de levedura de acordo com o invento, apresentam um teor de matéria seca de, pelo menos, 90% em massa, preferencialmente de, pelo menos, 94% em massa e ainda mais preferencialmente de, pelo menos, 96% em massa.

Em geral, o teor total em glucanos e mananos das paredes celulares de levedura de acordo com o invento é inferior ou igual a 70% em massa de matérias secas. Este pode, em particular, ser inferior ou igual a 65% em massa de matéria seca. Este pode também ser inferior ou igual a 55% em massa de matéria seca.

De acordo com uma variante do invento, com o fim de eliminar totalmente ou guase totalmente o glicogénio das paredes celulares de levedura, as paredes celulares de levedura de acordo com o invento obtidas como descrito atrás são colocadas em suspensão aguosa, aguecidas em meio alcalino entre 70°C e 100°C durante três horas no máximo, e a fração solubilizada por este tratamento é eliminada, 6 ΡΕ1663266 sendo a fração não solubilizada restante recuperada e gralmente seca. Por exemplo, uma suspensão de cerca de 12% de matéria seca de paredes celulares de levedura em meio aquoso alcalino com soda pode ser aquecida a 85°C durante duas horas. A fração solubilizada contendo todo o glico-génio, mas também uma grande parte, ou seja a totalidade, das manoproteinas é eliminada por centrifugação e lavagem.

Um tal tratamento permite produzir paredes celulares de levedura de acordo com o invento tendo um teor total de glucanos de 55% a 70% em massa de matérias secas, preferencialmente 60% a 70% de massa de matérias secas e ainda mais preferencialmente de 60 a 65% em massa de matéria seca. Um tal tratamento permite, nomeadamente produzir paredes celulares de levedura que contêm menos de 1,0% em massa de glicogénio das matérias secas, preferencialmente pelo menos 0,1% em massa de glicogénio das matérias secas. Estas paredes celulares de levedura podem não conter manano.

Estas paredes celulares de levedura com teor total elevado de glucanos e mananos correspondem a uma forma de execução de um agente de acordo com o invento para o tratamento ou a prevenção da hiperglicemia ou para a estabilização da glicemia.

Estas são apropriadas para as preparações de acordo com o invento para o tratamento ou a prevenção da hiperglicemia ou para a estabilização da glicemia. Estas 7 ΡΕ1663266 podem, de acordo com o invento, ser utilizadas na preparação de uma composição terapêutica para o tratamento ou a prevenção da hiperglicemia ou para a estabilização da glicemia. Método para a medição do teor de glicogénio

Junta-se a uma amostra de 20 mg de paredes celulares de levedura secas, ou seja com um teor de matéria seca de, pelo menos, 90% em massa, 0,5 ml de Na2CC>3 0,25 M e mantém-se esta mistura a 95°C durante 4 horas. A mistura é em seguida levada a um pH de 5,2 por adição de 0,3 ml de ácido acético 1 Me de 1,2 ml de acetato de sódio 0,2 M e misturando os ingredientes. Junta-se água destilada até um volume total de 2 ml. 0,5 ml da suspensão assim obtida são incubados durante 15 horas na presença de um excesso de amil-glucosidase de Aspergillus niger, tal como o comercializado pela empresa ROCHE com o n° de catálogo 102 857, a 55°C.

Após centrifugação, doseia-se a glucose libertada por dosagem enzimática. A dosagem enzimática da glucose é descrita nomeadamente no manual "Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis - using Single Reagents", publicado pela BOEHRINGER MANNHEIM GmbH Biochemica, © 1989, páginas 50 a ΡΕ1663266 55, e é preferencialmente realizada utilizando o "Test-Combination D-Glucose/-Fructose", n° cat. 139 106 da filial da sociedade ROCHE: BOEHRINGER MANNHEIM GmbH / R-BIOPHARM GmbH em Darmstadt, Alemanha. A quantidade (em mg) de glucose assim doseada corresponde à quantidade de glicogénio presente na amostra expressa em massa equivalente de glucose. Método para a medição do teor total de glucanos e mamanos

Submete-se uma amostra de 20 mg de paredes celulares de levedura secas, ou sej a, com um teor de matérias secas de água de, pelo menos, 90% em massa, a uma hidrólise ácida e mistura-se com 20 ml de HC1 2 N e mantém-se a mistura num tubo roscado fechado durante 4 horas a 103°C em estufa com agitação a cada 15 min.

Em seguida neutraliza-se a solução ácida assim obtida e doseia-se por via enzimática a quantidade de glucose e, respetivamente, de manose na solução neutralizada .

Esta dosagem enzimática de glucose e manose é igualmente descrita nas páginas 50 a 55 do manual citado atrás e é, preferencialmente, realizado utilizando o "Test-

Combination" N° Cat. 139 106. 9 ΡΕ1663266

Faz-se a diferença entre uma parte da quantidade de glucose (expressa em mg) doseada de acordo com este método e a quantidade de glucose (igualmente expressa em mg) doseada para estas paredes celulares de levedura pelo método para a medição do teor de glicogénio atrás referido.

Esta diferença (em mg) entre as duas quantidades de glucose doseadas corresponde à quantidade total de glucanos presente na amostra, sendo esta quantidade expressa em massa equivalente de glucose. A quantidade (em mg) de manose doseada corresponde à quantidade total de mananos presente na amostra, sendo esta quantidade expressa em massa equivalente de manose. 0 presente invento refere-se, em primeiro lugar, a um agente para a utilização no tratamento da hiperglicemia constituído por paredes celulares de levedura tal como definidas atrás, ou seja, paredes celulares de levedura de acordo com o invento. 0 tratamento da hiperglicemia refere-se principalmente à redução da glicemia, ou seja à taxa de glucose no sangue.

Este agente de acordo com o invento pode ser útil em vários casos de hiperglicemia, como nomeadamente nos casos enumerados a seguir: (a) para o tratamento da hiperglicemia em caso de 10 ΡΕ1663266 diabetes do tipo 2 (sendo a diabetes do tipo 2 designada aqui a seguir por "condição (a)"); (b) para o tratamento da hiperglicemia em caso de diabetes de gestação ou gravidez (sendo a diabetes de gestação ou gravidez designada aqui a seguir por "condição (b)") ; (c) para o tratamento da hiperglicemia em caso de pré-diabetes (sendo a pré-diabetes designada aqui a seguir por "condição (c)"); (d) para o tratamento da hiperglicemia pós-pran-dial (sendo o estado pós-prandial designado aqui a seguir por "condição (d)"). O presente invento refere-se igualmente a um agente para a utilização na prevenção da hiperglicemia, sendo o referido agente constituído por paredes celulares de levedura de acordo com o invento. A prevenção da hiperglicemia refere-se principalmente à manutenção da glicemia em níveis inferiores à hiperglicemia. O referido agente pode, em particular, ser um agente para utilização na prevenção da hiperglicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a), (b) , (c) ou (d) tal como definidas atrás. 0 presente invento refere-se também a um agente 11 ΡΕ1663266 para a estabilização da glicemia, sendo o referido agente constituído por paredes celulares de levedura de acordo com o invento. A estabilização da glicemia refere-se, principalmente, à manutenção da glicemia a niveis inferiores à hiperglicemia e superiores à hipoglicemia. 0 referido agente pode, em particular, ser um agente para a utilização na estabilização da glicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a) , (b) , (c) ou (d) . 0 agente de acordo com o invento, nestas diferentes formas de concretização, pode ser administrado sob diferentes normas ou apresentações, só ou em combinação com outros ingredientes, como, por exemplo, um ou vários outros ingredientes terapeuticamente ativos e/ou um ou vários excipientes.

Assim, o presente invento refere-se a uma preparação para utilização no tratamento da hiperglicemia que compreende paredes celulares de levedura de acordo com o invento, tal como definidas atrás. A referida preparação compreende, por outras palavras, um agente de acordo com o invento. A referida preparação de acordo com o invento pode, em particular, ser uma preparação para utilização no tratamento da hiperglicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a), (b), (c) ou (d). 12 ΡΕ1663266 0 presente invento refere-se igualmente a uma preparação para utilização na prevenção da hiperglicemia que compreende paredes celulares de levedura de acordo com o invento. A referida preparação pode, em particular, ser uma preparação para utilização na prevenção da hiperglicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a) , (b) , (c) ou (d) . 0 presente invento refere-se também a uma preparação para utilização na estabilização da glicemia que compreende paredes celulares de levedura de acordo com o invento. A referida preparação pode, em particular, ser uma preparação para utilização na estabilização da glicemia hiperglicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a) , (b) , (c) ou (d) . A prepraração de acordo com qualquer uma das formas de concretização atrás referidas é geralmente uma preparação para administração por via oral. A preparação pode nomeadamente apresentar-se sob a forma de comprimido, de cápsula, de pílula, de pó, de granulado ou de suspensão. 13 ΡΕ1663266 A preparação de acordo com o invento pode igualmente compreender um ou vários agentes terapeuti-camente ativos e nomeadamente um ou vários agentes hipo-glicemiantes. A preparação pode assim compreender uma ou várias vitaminas, um ou vários minerais alimentares, etc. A preparação pode igualmente compreender um ou vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A preparação de acordo com o invento pode, em particular, apresentar-se sob a forma de uma dose de ingestão correspondente a uma quantidade de matéria seca das paredes celulares de levedura de acordo com o invento inferior a 10 g, preferencialmente de 1 a 8 g, ainda mais preferencialmente de 1 a 7 g. O presente invento refere-se igualmente à utilização na preparação de uma composição terapêutica ou medicamento de paredes celulares de levedura de acordo com o invento, cujas diferentes formas de concretização são definidas atrás. O invento refere-se nomeadamente à utilização destas paredes celulares de levedura na produção de uma das composições de acordo com o invento tal como definido atrás. O presente invento refere-se assim à utilização de paredes celulares de levedura de acordo com o invento na 14 ΡΕ1663266 preparação de uma composição terapêutica para o tratamento da hiperglicemia.

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento podem, em particular, ser utilizadas na preparação de uma composição terapêutica para o tratamento da hiperglicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a) , (b) , (c) ou (d) . 0 presente invento refere-se igualmente à utilização de paredes celulares de levedura de acordo com o invento na preparação de uma composição terapêutica para a prevenção da hiperglicemia.

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento podem, em particular, ser utilizadas na preparação de uma composição terapêutica para a prevenção da hiperglicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a) , (b) , (c) ou (d) . 0 presente invento refere-se também à utilização de paredes celulares de levedura de acordo com o invento na preparação de uma composição terapêutica para a estabilização da glicemia.

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento podem, em particular, ser utilizadas na preparação de uma composição terapêutica para a estabilização da glicemia no caso de, pelo menos, uma das condições (a) , (b) , (c) ou (d) . 15 ΡΕ1663266 A composição farmacêutica é em regra geral uma composição para administração por via oral. A composição farmacêutica pode, nomeadamente, apresentar-se sob a forma de comprimido, de cápsula, de pilula,de pó, de granulados ou de suspensão.

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento podem, nomeadamente, ser utilizados na preparação de uma composição farmacêutica compreendendo igualmente: • um ou vários agentes terapeuticamente ativos e, nomeadamente, um ou vários agentes hipoglicemiantes, e/ou • uma ou várias vitaminas, um ou vários minerais alimentares, etc. A composição farmacêutica pode igualmente compreender um ou vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis .

As paredes celulares de levedura de acordo com o invento podem, em particular ser utilizadas para a preparação de uma composição farmacêutica sob a forma de uma dose de ingestão correspondente a uma quantidade de matéria seca de paredes celulares de acordo com o invento inferior a 10 g, preferencialmente de 1 a 8 g, ainda mais preferencialmente de 1 a 7 g. ΡΕ1663266 16

Exemplos A. Método de obtenção de paredes celulares de levedura de acordo com o invento

Um creme aquoso (ou seja, uma suspensão de células de levedura em água) de Sacharomyces cerevisiae, tendo um teor de matéria seca entre 12 e 18% em massa é submetido a uma hidrólise com o auxilio de enzimas endógenos às referidas células de levedura, eventualmente com adição de proteases exógenas às células de levedura, tal como por exemplo, a papaina. A hidrólise é efetuada a 50°C, durante 24 horas, de maneira a solubilizar, pelo menos, 60% em massa de matéria seca de células de levedura.

De maneira prática, em geral, as autólises ou as hidrólises enzimáticas de acordo com o invento são realizadas entre 45°C e 55°C, durante 18 a 36 horas, sem emprego de nenhum enzima podendo solubilizar os glucanos ou as manoproteinas.

Separa-se a fração solubilizada da fração insolúvel através de várias etapas sucessivas de centrifugação e de lavagem com água. A fração insolúvel é seca em tambores aquecidos até um teor de matéria seca de 95% em massa. Os aglomerados formados são eliminados por peneiração. 17 ΡΕ1663266

As paredes celulares de levedura assim obtidas apresentam: • um teor de matéria seca de 95% em massa, • um teor de proteínas Nx6,25 de 20,2% em massa da matéria seca • um teor total de glucanos e mananos de 43% da matéria seca • um teor de glicogénio de 8% em massa da matéria seca B. Prevenção e tratamento da hiperglicemia através de uma preparação de acordo com o invento

Uma doente inválida de 82 anos estava diagnosticada como sofrendo de diabetes do tipo 2. Não podendo participar em exercícios físicos exigentes, o tratamento inicial estava limitado a um regime com baixo teor de matérias gordas e de açúcares digeríveis. O efeito obtido graças a este regime era limitado. Observava-se em particular que a glicemia da doente correspondia a um teor em glucose sanguínea de 10,0 a 12,0 mmol/litro, sabendo que era pretendido um teor em glucose sanguíneo entre 4,0 e 7,0 mmol/litro, preferencialmente entre 4,2 e 6,0 mmol/litro. 18 ΡΕ1663266

Em seguida, o regime atrás mencionado foi complementado com adição de 3 a 4 g de paredes celulares de levedura tal como descrito no ponto A atrás, aos cereais do pequeno-almoço. 12 Horas após a primeira ingestão das referidas paredes celulares da levedura, a glicemia da doente tinha descido para 6 mmol de glucose sanguinea/litro.

Nenhuma hiperglicemia pós-prandial se produziu durante estes 4 meses, mesmo após infrações do regime alimentar prescrito, como o consumo de chocolate.

Nenhum efeito secundário negativo foi observado.

Lisboa, 19 de abril de 2013

Claims (11)

1. ΡΕ1663266 1 REIVINDICAÇÕES 1. Agente para utilização no tratamento da hiperglicemia, sendo o agente constituído por paredes celulares de levedura do género Saccharomyces cerevisiae, tendo as referidas paredes celulares: • um teor total de glucanos e mananos de, pelo menos, 34% em massa da matéria seca, preferencialmente pelo menos, 40,0% em massa da matéria seca e ainda mais preferencialmente, pelo menos, 45,0% em massa da matéria seca, e • um teor em glicogénio inferior a 10,0% em massa da matéria seca, preferencialmente inferior a 8,0% em massa da matéria seca, ainda mais preferencialmente inferior a 5,0% em massa da matéria seca e, muito preferencialmente ainda inferior a 3,0% em massa da matéria seca.
2. 2. Agente para utilização de acordo com a reivindicação 1, na qual as paredes celulares de levedura têm um teor total em glucanos e mananos inferior ou igual a 70% em massa da matéria seca.
3. 3. Agente para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, no qual as paredes celulares de levedura têm um teor total em glucanos e mananos de 55% a 70% em massa da matéria seca, preferencialmente de 60% a 70% em massa e ainda mais preferencialmente de 60% a 65% em massa da matéria seca. 2 ΡΕ1663266
4. 4. Agente para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, no qual as paredes celulares de levedura têm um teor em glicogénio inferior a 1,0% em massa da matéria seca, preferencialmente inferior a 0,1% em massa da matéria seca.
5. 5. Agente para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, no qual as paredes celulares de levedura apresentam um teor de matéria seca superior ou igual a 90%, preferencialmente superior ou igual a 94% e ainda mais preferencialmente superior ou igual a 96% em massa.
6. 6. Agente para utilização na prevenção da hiperglicemia, sendo o agente constituído por paredes celulares de levedura tal como definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes.
7. 7. Agente para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a hiperglicemia ser uma hiperglicemia em caso de diabetes do tipo 2.
8. 8. Agente para utilização na estabilização da glicemia, sendo o agente constituído por paredes celulares tal como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 5. 9. Agente para utilizaçãode acordo com a 3 ΡΕ1663266 reivindicação 8 para a estabilização da glicemia em caso de diabetes do tipo 2. 10 . hiperglicemia, de levedura, reivindicações 11. hiperglicemia, de levedura, reivindicações Agente para utilização no tratamento da compreendendo a preparação paredes celulares tal como definidas em qualquer uma das 1 a 5. Agente para utilização na prevenção da compreendendo a preparação paredes celulares tal como definidas em qualquer uma das 1 a 5.
9. 12. Agente para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizada por a hiperglicemia ser uma hiperglicemia em caso de diabetes do tipo 2.
10. 13. Agente para utilização na estabilização da glicemia, compreendendo a preparação paredes celulares de levedura tal como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
11. 14. Agente para utilização de acordo com a reivindicação 13 para a estabilização da glicemia em caso de diabetes do tipo 2. Lisboa, 19 de abril de 2013 1 ΡΕ1663266 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição - JP 811678227 Literatura que não é de patentes citada na Descrição « <5. REEO; T.W. NOGQDASWTHAfsiA. YsaaS Tech· * Methods of Bioeher»icai Anaiysis anã Food Anatysis noSagy, Vsn Ncsiraíid Reinhofd. 1991, 370-377 - ueiog SsngSe Résgssits. BOEHRj^GERMAfíNHE- m GmbH SiafihefRsxa. 1889, 50-55 [8S24j * Tesi-Combinstkín D- GtocoseAFrctctose. Test-Com* fcètsfion D-GkxxsseFFiriiciose