PT1632561E - GRâNULOS CONTENDO PROTENAS E FORMULAÎES DE GRâNULOS - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "GRÂNULOS CONTENDO PROTEÍNAS E FORMULAÇÕES DE GRÂNULOS"

Este é um pedido divisionário do pedido EP 1220887 AI (publicado em 10 de Julho de 2002).

Campo da invenção

Esta invenção refere-se a processos para a produção de grânulos contendo proteínas, e. g., grânulos de enzimas.

Antecedentes da invenção A utilização de proteínas, tais como proteínas farmaceuticamente importantes, e. g., hormonas, e proteínas industrialmente importantes, e. g., enzimas, tem estado a crescer rapidamente nos últimos anos. Hoje, por exemplo, as enzimas encontram utilização frequente nas indústrias do amido, lacticínios e detergentes, entre outras.

Na indústria de detergentes, em especial, as enzimas são frequentemente configuradas em forma granular, com o objectivo de obter uma ou mais características de armazenagem e/ou desempenho desejáveis, dependendo da aplicação específica em causa. Nestes aspectos, a indústria tem oferecido inúmeros desenvolvimentos na granulação e revestimento de enzimas, alguns dos quais estão exemplificados nas seguintes patentes e 1 publicações : A patente US 4106991 descreve uma formulação melhorada de grânulos de enzima por inclusão, na composição submetida a granulação, de fibras de celulose finamente dividida numa quantidade de 2-40% p/p com base no peso seco da composição total. Além disso, esta patente descreve que podem ser utilizadas substâncias cerosas para revestir as partículas do granulado. A patente US 4689297 descreve partículas contendo enzima que compreendem um material em partículas, um núcleo dispersível em água que tem 150-2000 micrometros na sua dimensão maior, uma camada uniforme de enzima em torno da partícula do núcleo que equivale a 10%-35% em peso do peso, da partícula do núcleo, e uma camada de agente de revestimento macromolecular, filmogénio, solúvel ou dispersível em água que rodeia uniformemente a camada de enzima em que a combinação de enzima, e agente de revestimento é de 25-55% do peso da partícula do núcleo. 0 material do núcleo descrito nesta patente inclui argila, um cristal de açúcar encerrado em camadas de amido de milho que está revestido com uma camada de dextrina, fécula de batata aglomerada, sal em partículas, citrato trissódico aglomerado, flocos de NaCl cristalizado em tabuleiro, grânulos ou pérolas de bentonite, grânulos contendo bentonite, caulino e terra de diatomáceas ou cristais de citrato de sódio. O material filmogénio pode ser um éster de ácido gordo, um álcool alcoxilado, um álcool polivinílico ou um alquilfenol etoxilado. A patente US 4740469 descreve uma composição granulada de enzima consistindo essencialmente em 1-35% em peso, de uma 2 enzima e 0,5-30% em peso, de um material fibroso sintético tendo um comprimento médio de 100-500 micrometros e uma finura na gama de 0,05-0,7 denier, sendo o balanço um diluente ou enchimento. A composição granulada pode ainda compreender um material ceroso fundido, tal como polietilenoglicol e, opcionalmente, um corante, tal como dióxido de titânio. A patente US 5324649 descreve grânulos contendo enzima tendo um núcleo, uma camada de enzima e uma camada de revestimento externa. A camada de enzima e, opcionalmente, o núcleo e a camada de revestimento externa contém um polímero vinílico. O documento WO 91/09941 descreve uma preparação contendo enzima em que, pelo menos, 50% da actividade enzimática está presente na preparação como cristais da enzima. A preparação pode ser uma pasta ou um granulado. 0 documento WO 97/12958 descreve uma composição de enzima microgranulada. Os grânulos são feitos por aglomeração em leito fluidizado que resulta em grânulos com numerosas partículas transportadoras ou nucleares revestidas com enzima e ligadas umas às outras por um aglutinante. 0 documento WO 99/32613 descreve uma composição granulada incluindo um núcleo constituído por uma proteína ou enzima misturada com um açúcar ou álcool de açúcar e um agente estruturante, tal como um polissacárido ou polipéptido. A composição granulada pode ainda incluir uma camada de barreira formada sobre o núcleo, bem como um material de revestimento exterior. A camada de barreira pode ser composta, por exemplo, por sais inorgânicos ou ácidos orgânicos ou sais. Materiais de 3 revestimento exemplificativos incluem, por exemplo, materiais filmogénios solúveis ou dispersíveis em água, tais como álcool polivinilico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP) ou derivados de celulose, tal como metilcelulose. Tipicamente, o revestimento exterior ainda inclui um pigmento, tal como TÍO2, para conferir uma cor desejada à composição. 0 documento EP 0258068 descreve um método para a produção de um grânulo, compreendendo (i) proporcionar uma partícula que tem uma enzima liofilizada e (ii) revestir a partícula em três passos, como se segue: 5% de polietilenoglicol (PM 600), 11,25% de TiCú/silicato de Mg (4:1), 4% de polietilenoglicol (PM 600). Não obstante esses desenvolvimentos, existe uma necessidade continuada de grânulos de enzima que tenham características vantajosas adicionais ou melhoradas. Uma dessas características necessárias na indústria de granulação de enzimas são formulações de grânulos tendo boa estabilidade, principalmente a humidade e temperatura elevadas. São especialmente desejáveis grânulos de enzima com boa estabilidade durante a armazenagem, por exemplo, em formulações de detergentes contendo lixívia, tais como as que contêm lixívias de peroxigénio, e. g., perborato de sódio ou percarbonato de sódio. É um objecto da presente invenção proporcionar um método de preparação de grânulos de enzimas tendo boa estabilidade em armazenagem. 4

Sumário da invenção A presente invenção proporciona um método para fazer um grânulo, compreendendo: (i) proporcionar uma partícula que transporta uma proteína, em que a referida partícula que transporta uma proteína é formada dispondo, em camadas, um material contendo enzima sobre um material de núcleo, (ii) formar uma camada de matriz de barreira em torno da partícula por aplicação de uma mistura que inclui (a) um agente desidratante finamente dividido, (b) um agente aglutinante e (c) um agente estruturante polimérico, e (iii) aplicar uma camada de revestimento de um polímero filmogénio em torno da referida camada de matriz de barreira, estando a camada de revestimento exterior substancialmente isenta de pigmentos.

Componentes da matriz exemplificativos incluem: (i) um pigmento ou argila como o agente desidratante, (ii) um açúcar ou álcool de açúcar como o agente aglutinante e (iii) um polissacárido ou polipéptido como o agente estruturante. Por exemplo, o agente desidratante pode ser TÍO2, o agente aglutinante pode ser sacarose e o agente estruturante pode ser amido.

Por exemplo, o revestimento é formado de material polimérico HPMC substancialmente isento de pigmentos. De acordo com uma forma de realização, a partícula que tem a proteína é formada por aplicação de uma enzima misturada com, pelo menos, um aglutinante seleccionado do grupo consistindo em hidratos de carbono, derivados de hidratos de carbono, sais e quaisquer suas misturas, sobre um material em partículas inerte. 5

Os grânulos aqui descritos são particularmente adequados para utilização em formulações de detergentes, tais como detergentes de roupa e/ou de louça.

As outras caracteristicas, aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição pormenorizada, em conjunto com as reivindicações anexas.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção proporciona uma composição adequada para utilização em ligação com grânulos transportadores de proteínas, e. g., grânulos de enzimas e semelhantes. Geralmente, a composição compreende uma mistura incluindo um agente desidratante finamente dividido, um agente aglutinante e um agente estruturante polimérico, conjuntamente definindo uma matriz. A matriz é aplicável como um revestimento ou camada em torno de uma partícula transportadora de proteína. De um modo preferido, a matriz é concebida para actuar como uma barreira ou divisória física, que torna mais lenta ou impede a difusão de substâncias, tais como humidade e lixívia, que podem afectar de forma adversa a proteína ou enzima na região contendo proteína do grânulo. Consequentemente, a matriz é geralmente aqui referida como uma "matriz de barreira". A invenção proporciona adicionalmente um revestimento ou camada polimérica para utilização num grânulo contendo proteína. 0 revestimento está substancialmente isento de pigmentos e semelhantes. Os revestimentos formulados de acordo com a invenção são aqui genericamente referidos como "revestimentos 6 transparentes" . Deve notar-se, a este respeito, que o termo "transparente", no contexto do termo "revestimento transparente", pretende indicar que o revestimento está isento de pigmentos e não necessariamente que o revestimento vai permitir que a luz passe através dele. Assim, deve entender-se que a expressão "revestimento transparente" inclui revestimentos transparentes, bem como revestimentos semitransparentes e opacos. A caracteristica chave aqui é que o revestimento está substancialmente isento de pigmentos.

Como aqui discutido de uma forma mais completa abaixo, a matriz e o revestimento da presente invenção são utilizados em combinação com uma formulação de grânulos de enzima, com os grânulos resultantes a apresentar boa estabilidade quando desafiados com certos factores e/ou eventos desestabilizadores. Pormenores da matriz e do revestimento são descritos a seguir.

Como mencionado anteriormente, a matriz de barreira da presente invenção compreende uma mistura de componentes, incluindo um agente desidratante, um agente aglutinante e um agente estruturante.

Os agentes desidratantes contemplados para utilização na matriz de barreira da invenção incluem materiais substancialmente insolúveis em água, dispersiveis em água. 0 agente desidratante está em forma finamente dividida, e. g. um material em partículas tendo um diâmetro médio não superior a cerca de 30 micrometros e, de um modo preferido, não superior a cerca de 10 micrometros e, de um modo preferido, compreende um material inorgânico. Numa dessas formas de realização, o material desidratante tem um diâmetro médio entre cerca de 1-5 micrometros. 7

Os agentes desidratantes exemplificativos incluem pigmentos e argilas. Por exemplo, o agente desidratante pode incluir um ou mais dos seguintes materiais: TÍO2, talco, carbonato de cálcio, bentonite, terra de diatomáceas e qualquer sua mistura. Numa forma de realização particularmente preferida, o agente desidratante é TÍO2.

Na matriz de barreira da invenção pode ser utilizado qualquer agente(s) aglutinante(s) adequado(s). Por exemplo, polissacáridos de cadeia curta, i. e., com não mais do que cerca de vinte subunidades de comprimento, podem ser utilizados como agentes aglutinantes. Numa forma de realização, o agente aglutinante é composto por hidrolisados de amido, tais como maltodextrina e sólidos de xarope de milho. Noutra forma de realização, o agente aglutinante é um açúcar ou álcool de açúcar. Agentes aglutinantes exemplificativos incluem glucose, frutose, rafinose, maltose, lactose, trealose, sacarose, manitol, sorbitol, inositol e quaisquer suas misturas. Numa forma de realização particularmente preferida, o agente aglutinante é sacarose. 0 agente estruturante da matriz é um material polimérico. Por exemplo, o agente estruturante pode compreender um polissacárido, polipéptido ou uma sua mistura. Numa forma de realização, o agente estruturante compreende um polissacárido seleccionado do grupo consistindo em amido, carragenina, celulose, goma-arábica, goma acácia, goma xantana, goma de alfarroba e goma de guar, e quaisquer suas misturas. Numa forma de realização particularmente preferida, o agente estruturante é um polissacárido substancialmente insolúvel em água, tal como amido (e. g., não modificado, em bruto ou amido não hidratado).

Noutra forma de realização, o agente estruturante é um polipéptido seleccionado do grupo consistindo em quitosana, gelatina, colagénio, caseína, ácido poliaspártico, ácido poliglutâmico e quaisquer suas misturas. Deve entender-se que o agente estruturante pode compreender um único tipo de polipéptido ou polissacárido ou pode ser utilizada uma combinação de dois ou mais desses nos grânulos da presente invenção.

Ainda em relação ao agente estruturante, deve notar-se que os polissacáridos e polipéptidos tipicamente têm as propriedades desejáveis simultâneas de alto peso molecular e elevada solubilidade em água. Sem querer ficar limitados pela teoria, crê-se que o alto peso molecular do agente estruturante contribui com duas propriedades importantes que uma matriz só de açúcar ou álcool de açúcar não teria: (1) proporcionar coesão e resistência à partícula, reduzindo muito a tendência da partícula para se transformar em pó; e (2) servir como uma barreira de difusão da água e pequenas moléculas devido a formar uma rede polimérica ou "gaiola" através de toda a estrutura da matriz. Isto melhora muito a estabilidade do grânulo.

Os agentes estruturantes específicos escolhidos - polissacáridos e polipéptidos - tipicamente também têm uma característica antiadesiva que é útil para reduzir a característica aglutinante do açúcar ou álcool de açúcar e permitir que as camadas da matriz para ser construídas, por exemplo, em revestimento em leito fluidizado, a velocidades grandes sem aglomeração.

Os açúcares e álcoois de açúcar e agentes estruturantes poliméricos também têm alta solubilidade ou dispersibilidade em 9 água. Pode ser facilmente preparada uma formulação de matriz que inclui um açúcar ou álcool de açúcar, um agente estruturante polimérico e um agente desidratante finamente dividido como uma solução ou suspensão com concentração de sólidos totais elevada. Podem ser formuladas concentrações de sólidos totais em solução ou em suspensão de 20-50% p/p ou mais. Estas misturas concentradas são altamente desejáveis na medida em que podem ser formadas em grânulos com uma necessidade minima de evaporação de água, uma vantagem em qualquer processo de granulação e secagem.

Opcionalmente, a matriz da presente invenção pode ainda incluir um tensoactivo ou agente molhante. O tensoactivo ou agente molhante pode ser útil, por exemplo, para ajudar a manter o agente desidratante da matriz, e. g., T1O2 em suspensão.

Materiais exemplificativos que podem ser incorporados na matriz incluem Neodol, álcoois de sebo, ácidos gordos, sais de ácidos gordos, tais como estearato de magnésio e ésteres de ácidos gordos. Numa forma de realização particularmente preferida, é utilizado Neodol na matriz. Vão ser agora descritos pormenores sobre o revestimento ou camada polimérica da presente invenção. O revestimento é constituído por um polímero filmogénio, tal como álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, derivados de celulose, tais como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxicelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, polietilenoglicol, óxido de polietileno, quitosana, gomaarábica, goma xantana, carragenina, ou quaisquer suas misturas. Tal como referido anteriormente, o revestimento polimérico está substancialmente isento de pigmentos e semelhantes. Numa forma de realização particularmente preferida, é formado um 10 revestimento transparente de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) ou uma combinação de HPMC e outros polímeros. Por exemplo, o Methocel E15, uma hidroxipropilmetilcelulose, está disponível comercialmente de Dow Chemical Co., Midland Mich. Opcionalmente, o revestimento transparente pode incluir um agente para aumentar a temperatura de solidificação, tal como um ou mais açúcares (e. g., sacarose), e um plasticizante. Os plasticizantes adequados incluem, por exemplo, polióis, tais como açúcares, álcoois de açúcares ou polietileno glicóis (PEG), ureia, glicol, propilenoglicol ou outros plasticizantes conhecidos, tais como citrato de trietilo, ftalato de dibutilo ou dimetilo ou água. Numa forma de realização preferida, o plasticizante é polietilenoglicol (e. g., PEG 400 e/ou PEG 600).

Como discutido acima, a matriz de barreira e o revestimento transparente da presente invenção podem ser utilizados em combinação numa formulação de grânulos de enzima. O revestimento transparente é colocado directamente adjacente à matriz de barreira, com o revestimento a ser o mais exterior dos dois. Deve-se notar, no entanto, que também ser podem ser incluídas uma ou mais camadas intermédias (i. e., entre a matriz e o revestimento).

Uma grande variedade de grânulos de proteína ou enzima podem incorporar a matriz e/ou revestimento da presente invenção. De um modo preferido, a camada de matriz está substancialmente isenta de enzimas. Por exemplo, a matriz de barreira e/ou revestimento transparente pode ser formados em pérolas, pepitas, extrudidos, grânulos revestidos em leito fluidizado (e. g. , grânulos Enzoguard ; Genencor International, Inc.) e/ou grânulos de matriz de alto cisalhamento (e. g., granulados T; Novo Nordisk), entre outros. O grânulo inclui uma 11 região que contém uma ou mais proteínas ou enzimas em torno dos quais a matriz pode ser aplicada. De um modo preferido, substancialmente toda a enzima incluída no grânulo está contida dentro da região contendo proteína. A região contendo proteína compreende um núcleo que tem uma ou mais proteínas ou enzimas nela revestidas ou aplicadas em camada. Alternativamente ou em complemento, a região contendo proteína ou enzima pode incluir uma partícula inerte em que é aplicada em camadas uma matriz de proteína ou enzima. Grânulos exemplificativos que podem ser modificados para incorporar a matriz de barreira e/ou revestimento transparente da presente invenção estão descritos nas Publicações PCT N° W099/32613, W099/32595 e W099/32612, bem como nas Pat US N° 5814501, 5324649, 4689297 e 4106991.

Proteínas que se encontram no âmbito da presente invenção incluem proteínas farmaceuticamente importantes tais como hormonas ou outras proteínas terapêuticas e proteínas industrialmente importantes, tais como enzimas.

Qualquer enzima ou combinação de enzimas pode ser utilizada na presente invenção. As enzimas preferidas incluem as enzimas capazes de hidrolisar substratos, e. g. nódoas. Essas enzimas, que são conhecidos como hidrolases, incluem, mas não estão limitadas a proteases (bacterianas, fúngicas, ácidas, neutras ou alcalinas), amilases (alfa ou beta), lipases, celulases e as suas misturas. Enzimas particularmente preferidas são subtilisinas e celulases. As mais preferidas são subtilisinas, tal como descrito na Patente U.S. 4760025, Patente EP 130756 BI e Pedido PCT WO91/06637 e celulases, tais como Multifect L250™ and Puradax™, disponíveis comercialmente de Genencor International. Outras enzimas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem oxidases, transferases, 12 desidratases, redutases, hemicelulases e isomerases.

Os grânulos da presente invenção também compreendem um ou mais revestimentos ou camadas adicionais, e. g. uma ou mais camadas intermédias e/ou um sobrerrevestimento. Estes podem servir qualquer de um sem número de funções numa composição granulada, dependendo da utilização final do grânulo. Por exemplo, os revestimentos podem tornar uma enzima resistente à oxidação por lixívia, produzir velocidades de dissolução desejáveis sobre por introdução do grânulo num meio aquoso e/ou reduzir as probabilidades de crescimento microbiano no seio do grânulo.

Os grânulos aqui descritos podem ser feitos por métodos conhecidos pelos peritos na técnica da granulação de enzimas, incluindo o revestimento em drageadeira, revestimento em leito fluidizado, atomização com fusão, granulação com disco, secagem por atomização, extrusão, extrusão centrífuga, esferificação, granulação em tambor, aglomeração com alto cisalhamento, ou combinações destas técnicas.

Um processo preferido, contemplado pela presente invenção, é um processo de pulverização de leito fluidizado. Numa forma de realização exemplificativa, o processo envolve carregar partículas fluidificáveis, tais como cristais de açúcar, num aparelho de pulverização de leito fluidizado, tal como uma máquina de revestimento de leito fluidizado Vector FL1. Com as partículas fluidificadas, pode ser aplicada uma primeira pulverização, de modo preferido, compreendendo uma solução aquosa de proteína ou enzima. A primeira pulverização pode ser, por exemplo, um concentrado fluido incluindo uma protease, um açúcar dissolvido e amido em suspensão. Desta forma, uma 13 primeira camada ou revestimento pode ser formada sobre as partículas fluidificadas. Em seguida, uma segunda pulverização pode ser aplicada, compreendendo a matriz de barreira da presente invenção. A segunda pulverização pode ser, por exemplo, uma mistura fluida incluindo um açúcar dissolvido em água e amido e dióxido de titânio suspensos. Esta suspensão também pode conter um tensoactivo/agente molhante, tal como Neodol, para ajudar a manter o dióxido de titânio em suspensão. Em seguida, pode ser aplicado uma terceira pulverização, formando um revestimento transparente em torno da matriz de barreira. A terceira pulverização pode ser, por exemplo, uma solução incluindo HPMC (ou uma combinação de HPMC e outros polímeros) e, opcionalmente, um açúcar (e. g., sacarose) para aumentar a temperatura de solidificação, e/ou um plasticizante, tal como PEG 400 ou PEG 600.

Um grânulo particularmente preferido, que pode ser feito como acabado de descrever, consiste essencialmente em (i) um núcleo constituído por um cristal de açúcar que tem uma matriz de enzima disposta em camadas sobre ele; (ii) uma matriz de barreira disposta em camadas sobre a matriz da enzima, e (iii) um revestimento transparente formado sobre a matriz da barreira. Sem se comprometer com qualquer teoria particular, crê-se que a estabilidade melhorada desse grânulo é devida à presença, na camada da matriz de barreira, de um pigmento (e. g., dióxido de titânio) e amido não hidratado, que actuam como agentes desidratantes e protegem a enzima da humidade. Além disso, crê-se que o revestimento transparente proporciona um sobrerrevestimento semelhante a uma película substancialmente contínua. Os produtos de enzimas granuladas conhecidos tipicamente têm o pigmento na camada exterior, criando assim um sobrerrevestimento com uma estrutura mais fraca. 14

Os grânulos preferidos, construídos de acordo com a presente invenção, são caracterizados por uma baixa afinidade para a humidade. Assim, esses grânulos estão substancialmente isentos de camadas ou revestimentos tendo uma grande afinidade para a humidade (e. g., camadas de sais) . Como aqui utilizado, "baixa afinidade para a humidade" significa que um grânulo exposto a 50°C e 70% de humidade relativa vai absorver menos do que 10% e, de um modo preferido, menos do que 5% em peso de ganho de humidade "no equilíbrio", i. e., quando a absorção de humidade está genericamente estabilizada. Como se pode ser a partir dos resultados do Exemplo 5 (abaixo), formulações de grânulos exemplificativos que incorporam a matriz da presente invenção geralmente equilibram a cerca de 2 a 3% em peso de ganho de humidade. Crê-se que, como resultado dessa baixa afinidade para a humidade, a intrusão indesejável de humidade e substâncias inactivantes associadas na região contendo proteína desses grânulos é significativamente reduzida. Quando a matriz de barreira e/ou revestimento transparente da invenção são incorporados num grânulo de enzimas, as enzimas assim rodeadas tipicamente apresentam muito boa estabilidade.

EXEMPLOS

Exemplo 1:

Formulação de Grânulos de Enzimas

Uma formulação exemplificativa para um lote de grânulos, produzidos utilizando um processo de pulverização em leito fluidizado, está apresentada abaixo na Tabela 1. A pulverização inicial, neste exemplo, foi aplicada a 540,0 gramas de cristais 15 de sacarose carregados numa câmara de leito fluidizado e aí suspensos. A enzima utilizada foi Purafect OXP (Genencor

International, Inc.). Neste e nos exemplos seguintes, "pulverização 1" significa uma matriz de enzima formada numa partícula fluidificável, "pulverização 2" indica uma matriz de barreira da presente invenção e "pulverização 3" significa o revestimento transparente da presente invenção. Certos pormenores do processo em leito fluidizado foram substancialmente como descrito no Exemplo 2 do documento WO 99/32613.

Tabela 1

Pulverização 1: OxP conc. 14,3% de sólidos 1542,0 g Sacarose 393,0 g Amido 393,0 g Pulverização 2: Amido de milho 224,0 g Sacarose 224,0 g Ti02 125,0 g Neodol 28,0 g Pulverização 3: Methocel E15 56,0 g PEG 400 8,0 g 16

Exemplo 2

Formulação de Grânulos de Enzimas Várias formulações exemplificativas adicionais para grânulos de enzimas, também produzidas utilizando um processo de pulverização em leito fluidizado, estão apresentadas adiante nas Tabelas 2, 3 e 4. Como com o exemplo anterior, a pulverização inicial para cada uma das seguintes formulações foi aplicada em 540,0 gramas de cristais de sacarose carregados numa câmara de leito fluidizado e ai suspensos. A enzima utilizada nestas formulações foi Properase (Genencor International, Inc.).

Tabela 2- "Lote 80"

Pulverização 1: Properase conc. (17,3% de sólidos) 1200,0 mL Sacarose 396,0 g Amido 396,0 g Pulverização 2: Amido de milho 224, 0 g Sacarose 224, 0 g Ti02 125,0 g Neodol 28,0 g Pulverização 3: HPMC (Methocel E15) 48, 0 g PEG 600 8,0 g 17

Tabela 3 "Lote 81"

Pulverização 1: Properase conc. (17,3% de sólidos) 1200,0 mL Sacarose 396,0 g Amido 396,0 g Pulverização 2: Amido de milho 224, 0 g Sacarose 224, 0 g Ti02 125,0 g Neodol 28,0 g Pulverização 3: HPMC (Methocel E15) 2 4,0 g Amido modificado (Pure Cole (50/50)) 24,0 g PEG 600 8,0 g

Tabela 4 - "Lote 82"

Pulverização 1: Properase conc. (17,3% de sólidos) 1200,0 mL Sacarose 396,0 g Amido 396,0 g Pulverização 2: Amido de milho 224, 0 g Sacarose 224, 0 g Ti02 125,0 g Neodol 28,0 g Pulverização 3: HPMC (Methocel E15) 48,0 g Sacarose 8,0 g PEG 600 8,0 g 18

Exemplo 3:

Ensaios de Estabilidade Acelerados utilizando uma Base para Detergente de Máquina da Roupa

Os grânulos do Exemplo 2 (Lotes 80, 81 e 82) foram analisados para determinar a sua estabilidade em ensaios de estabilidade forçada de três dias. Os métodos para estes processos foram substancialmente como descrito no Exemplo 3 do documento W099/32613. Neste exemplo, contudo, foi utilizada uma base registada para detergentes de roupa.

Como discutido no documento WO 99/32613, o ensaio de estabilidade acelerada é concebido para auxiliar no desenvolvimento e na triagem de formulações granuladas, uma vez que proporciona um meio acelerado de determinação da estabilidade relativa dos grânulos. As condições do ensaio de estabilidade acelerada (AST) são muito mais exigentes do que as que grânulos de enzima ou detergentes encontrariam na armazenagem ou transporte realista. O AST é um "ensaio de esforço" concebido para discriminar diferenças entre formulações que outra forma não seriam evidentes durante semanas ou meses.

Os resultados do AST apresentados na Tabela 5, abaixo, mostram a actividade percentual remanescente para cada dos Lotes 80, 81 e 82, ao longo de um período de três dias. 19

Tabela 5 Actividade percentual do original

Dia 0 Dia 1 Dia 3 Lote 80 100,0 88,8 49, 7 Lote 81 100,0 91,4 41,0 Lote 82 100,0 85, 4 39, 7 74-A 100,0 89, 7 32,0 87-B 100,0 75,5 27, 0

Os resultados de estabilidade para dois Lotes adicionais, denominados 74-A e 87-B, também estão apresentados na Tabela 5. Estes lotes adicionais têm as formulações gerais apresentadas na Tabela 6, abaixo. Deve notar-se que estas formulações adicionais foram preparadas num aparelho de pulverização de leito fluidizado, como acima, por aplicação das pulverizações em cristais de sacarose fluidificados numa câmara do aparelho.

Tabela 6 74-A 87-B

Pulverização 1: Properase conc. (17,3% de sólidos) Properase conc. (17,3% de sólidos) Sacarose Sacarose Amido Amido Pulverização 2: Amido de milho Nenhuma Sacarose Ti02 Neodol 20

Tabela 6 (continuação)

Pulverização 3: Nenhuma HPMC (Methocel E15) Sacarose (opcional) PEG 600

Como se pode ver a partir da Tabela 6, os Lotes 74-A e 87-B são constituídos por grânulos, semelhantes aos apresentados nos Exemplos 1 e 2, acima, excepto que os grânulos de Lote 74-A não têm revestimento transparente e os grânulos do Lote 87-B não têm uma camada de matriz de barreira.

Enquanto que os grânulos tendo um núcleo de enzima rodeado só pela matriz de barreira (e. g., Lote 74-A) ou o revestimento transparente (e. g., Lote 87-B) da presente invenção mostram uma boa estabilidade nos ensaios de estabilidade acelerada (ver Tabela 5, acima), os grânulos que incluem ambas essas camadas sobre um núcleo de enzima (e. g., Lotes 80, 81 e 82) apresentam estabilidade ainda melhor.

Exemplo 4:

Ensaios de Estabilidade Acelerados utilizando uma Base para Detergente de Máquina da Louça

Os grânulos do Exemplo 2 (Lotes 80, 81 e 82) foram adicionalmente analisados em ensaios de estabilidade forçados de três dias para determinar a estabilidade numa base para detergente de máquina de louça registada. Como aconteceu com o exemplo anterior, os métodos para estes processos foram

substancialmente como descrito no Exemplo 3 do documento WO 21 99/32613. Aqui, no entanto, os estudos foram realizados a 40 °C e 70% de humidade relativa. A Tabela 7, abaixo, mostra a actividade percentual remanescente para cada um dos Lotes 80, 81 e 82 ao longo de um período de três dias. Também são apresentados os resultados de um grânulo de protease disponível comercialmente nas mesmas condições.

Tabela 7 - Actividade percentual do original

Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Lote 80 100,0 87 51 32 Lote 81 100,0 71 44 27 Lote 82 100,0 86 51 37 Grânulo de Protease Comercial 100,0 55 25 19

Exemplo 5:

Ensaios de Estabilidade Acelerados utilizando uma Base para Detergente de Máquina da Louça

Como discutido anteriormente, os grânulos preferidos da presente invenção tem uma baixa afinidade para a humidade. Assim, esses grânulos (e. g., os grânulos dos Lotes 80, 81, 82, 74-A, 87-B) estão substancialmente isentos de camadas ou revestimentos tendo uma grande afinidade para a humidade (e. g., camadas de sais) . Como aqui utilizado, "baixa afinidade para a humidade" significa que um grânulo exposto a 50 °C e 70% de humidade relativa vai absorver menos do que 10% e, de um modo 22 preferido, menos do que 5% em peso de, ganho de humidade "no equilíbrio", i. e., quando a absorção de humidade de um modo geral estabilizou. Como se pode ver a partir dos dados da Tabela 8, adiante, a formulação de grânulos exemplificativa do Lote 81 geralmente nivelou até um ganho de peso de humidade inferior a cerca de 2 a 3%. 0 grânulo de protease comercial, por outro lado, apresentou um ganho de peso de humidade no equilíbrio de, pelo menos, 17%.

Tabela 8 - Ganho de peso percentual

Dia 0 Dia 5 Dia 12 Grânulo do Lote 81 100,0 101,631 101,4609 Grânulo de Protease 100,0 107,0899 117,2339 Ccomercial

Lisboa, 22 de Julho de 2010 23

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para fazer um grânulo, compreendendo: (i) proporcionar uma partícula que transporta uma proteína, em que a referida partícula que transporta uma proteína é formada dispondo em camadas um material contendo enzima sobre um material de núcleo, (ii) formar uma camada de matriz de barreira em torno da partícula por aplicação de uma mistura que inclui (a) um agente desidratante finamente dividido, (b) um agente aglutinante e (c) um agente estruturante polimérico, e (iii) aplicar uma camada de revestimento constituída por um polímero filmogénio em torno da referida camada de matriz de barreira, estando a camada de revestimento exterior substancialmente isenta de pigmentos.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a referida partícula que transporta uma proteína é formada por aplicação de uma enzima misturada com, pelo menos, um aglutinante seleccionado do grupo consistindo em hidratos de carbono, derivados de hidratos de carbono, sais e quaisquer suas misturas, num material em partículas inerte. 1
3. 3. Método da reivindicação 1, em que o referido agente desidratante compreende um pigmento ou argila, o referido agente aglutinante compreende um açúcar ou álcool de açúcar e o referido agente estruturante compreende um polissacárido ou polipéptido.
4. 4. Método da reivindicação 3, em que o referido agente desidratante compreende TÍO2, o referido agente aglutinante compreende sacarose e o referido agente estruturante compreende amido. Lisboa, 22 de Julho de 2010 2