PT1613947E - Dispositivo óptico de detecção química com transdutor piroeléctrico ou piezoeléctrico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO «DISPOSITIVO ÓPTICO DE DETECÇÃO QUÍMICA COM TRANSDUTOR PIROELÉCTRICO OU PIEZOELÉCTRICO» [0001] A presente invenção refere-se a um dispositivo de detecção quimica que emprega um transdutor.

[0002] A monitorização de analitos em solução, por exemplo compostos biologicamente importantes em ensaios biológicos, tem uma ampla aplicação. Assim, está disponível uma ampla variedade de dispositivos de análise e diagnóstico. Muitos dispositivos empregam um reagente que sofre uma alteração da cor detectável a olho nu na presença das espécies a serem detectadas. 0 reagente é frequentemente usado numa tira de teste e podem ser fornecidos elementos ópticos para auxiliar na determinação da alteração da cor .

[0003] A publicação WO 90/13017 divulga um elemento piroeléctrico ou outro transdutor termoeléctrico sob a forma de uma tira. São fornecidos eléctrodos de película fina e um ou mais reagentes são depositados na superfície do transdutor. 0 reagente sofre uma alteração selectiva da cor quando entra em contacto com a espécie a ser detectada. 0 dispositivo é então tipicamente inserido num detector onde o transdutor é iluminado geralmente a partir de baixo pela fonte de luz LED e é detectada a absorção de luz pelo reagente como aquecimento microscópico na superfície do transdutor. A emissão de sinal eléctrico pelo transdutor é processada para obter a concentração das espécies a serem detectadas. 1 [0004] O si stema da publicação WO 90/13017 permite a análise das espécies que produzem uma alteração da cor no reagente em reacção ou combinação com o reagente. Por exemplo, os reagentes incluem pH e corantes indicadores de metais pesados, reagentes (e.g. o-cresol em solução de cobre amoniacal) para detectar aminofenol num ensaio de paracetamol, e um corante de tetrazólio para detectar uma enzima de oxidoreductase num ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Contudo, embora este sistema seja útil em determinadas aplicações, tem sido considerado adequado para análise apenas quando a espécie em análise gera uma alteração de cor no reagente, já que é o reagente que está localizado na superfície do transdutor. Assim, este sistema não pode ser aplicado à análise de espécies que não causam uma alteração de cor no reagente ou quando a alteração de cor não está na superfície do transdutor. No campo dos ensaios biológicos, isto dá ao sistema uma aplicabilidade limitada.

[0005] J.D. Wright et al, Sensors and Actuators B 51 (1998) 121-130 divulga um sistema de monitorização química ambiental e ocupacional baseado numa etiqueta de película polimérica piezoeléctrica. As alterações de cor em manchas de reagente na película polimérica são determinadas através da iluminação com um LED a piscar. 0 declínio não-radiante é convertido pela película de polímero piezoeléctrico numa carga que é medida usando um amplificador de lock-in. Um estudo mais aprofundado dos factores cinéticos deste sistema de monitorização é apresentado em C.A. Gibson et al, Sensors and Actuators B 51 (1998) 238-243.

[0006] A publicação FR 2 715 226 divulga um arranjo para a 2 análise fototérmica de um material com uma estrutura em camadas para determinar um parâmetro físico de uma destas camadas. 0 arranjo inclui um sensor piroeléctrico em contacto térmico com as camadas.

[0007] Deste modo, a presente invenção fornece um dispositivo para detectar a energia gerada pelo declínio não radiante num analito ou num complexo ou derivado do analito sob irradiação com radiação electromagnética gue compreende uma fonte de radiação adaptada para gerar uma série de impulsos de radiação electromagnética, um transdutor com um elemento piroeléctrico ou piezoeléctrico e eléctrodos, gue é capaz de converter a energia gerada pelo analito ou complexo ou derivado do analito num sinal eléctrico, pelo menos um reagente próximo da superfície do transdutor, o reagente tendo um local de ligação que é capaz de ligar o analito ou complexo ou derivado do analito, um poço para conter um líquido, tendo o analito ou complexo ou derivado do analito aí dissolvido ou suspenso em contacto com o transdutor, um detector que é capaz de detectar o sinal eléctrico gerado pelo transdutor, e um controlador para controlar a fonte de luz e o detector, em que o detector é adaptado para determinar o intervalo de tempo entre cada impulso de radiação electromagnética da fonte de radiação e a geração do sinal eléctrico e em que o detector é disposto de modo a detectar apenas o sinal eléctrico gerado pelo transdutor até a um intervalo de tempo seleccionado para discernir a concentração do analito ou complexo ou derivado do analito a diferentes distâncias da superfície do transdutor. 3 [0008] A presente invenção baseia-se na descoberta pelo requerente de que a enerqia, tipicamente calor, gerada pelo declínio não-radiativo numa substância sob irradiação com radiação electromaqnética, aqui denominada "luz", pode ser detectada por um transdutor mesmo quando a substância não está em contacto com o transdutor e além disso, que o intervalo de tempo entre a irradiação com radiação electromagnética e o sinal eléctrico produzido pelo transdutor é função da distância da substância em relação à superfície da película. Esta descoberta tem uma ampla aplicabilidade no campo dos ensaios e da monitorização.

[0009] A presente invenção também fornece um método para detectar um analito ou um complexo ou derivado do analito dissolvido ou suspenso numa amostra líquida, compreendendo os passos de expor a amostra líquida a um transdutor com um elemento piroeléctrico ou piezoeléctrico e eléctrodos, que é capaz de converter uma alteração na energia num sinal eléctrico, o transdutor tendo pelo menos um reagente próximo deste, o reagente tendo um local de ligação que é capaz de ligação ao analito ou a um complexo ou derivado do analito, o analito ou o complexo ou derivado do analito sendo capaz de absorver a radiação electromagnética gerada pela fonte de radiação para gerar energia por declínio não-radiativo ; irradiar o reagente com uma série de impulsos de radiação electromagnética, convertendo a energia gerada num sinal eléctrico; detectar o sinal eléctrico e o intervalo de tempo entre cada impulso de radiação electromagnética da fonte de radiação e a geração do sinal eléctrico, em que o 4 intervalo de tempo entre cada um dos impulsos de radiação electromagnética e a produção do sinal eléctrico corresponde à posição do analito ou um complexo ou derivado do analito, em qualquer uma de uma ou mais posições em distâncias diferentes da superfície do transdutor e em que o intervalo de tempo é seleccionado para distinguir a concentração do analito ou um complexo ou derivado do analito a diferentes distâncias em relação à superfície do transdutor.

[0010] As modalidades preferidas da presente invenção serão agora descritas fazendo referência às figuras, nas quais A Fig. 1 mostra uma representação esquemática do dispositivo de detecção química da presente invenção; A Fig. 2 mostra um imunoensaio "em sanduíche" que usa o dispositivo da presente invenção; A Fig. 3 mostra um gráfico do valor do leitor versus tempo para (a) um anticorpo marcado numa película piezoeléctrica e (b) um anticorpo marcado em solução, ambos sendo reforçados pela deposição catalítica de prata metálica;,, A Fig. 4 mostra os resultados de um ensaio "em sanduíche" que usa um anticorpo marcado com ouro coloidal que é reforçado pela deposição catalítica de prata metálica na superficie da película piezoeléctrica; A Fig. 5 mostra os resultados de um ensaio "em sanduíche" que usa um anticorpo marcado com ouro seguido de deposição catalítica de prata metálica na superfície da película piezoeléctrica usando cinco concentrações de analito diferentes; A Fig. 6 mostra um gráfico de contagens versus 5 espessura da película, demonstrando a transferência de energia através de uma camada colorida acima de uma camada não colorida que transfere energia para uma película piezoeléctrica; e A Fig. 7 mostra um gráfico de contagens versus atraso de correlação demonstrando a transferência de energia através de uma camada colorida e uma camada não colorida que transfere energia para uma película piezoeléctrica.

[0011] A Fig. 1 mostra uma parte de um dispositivo de detecção química 1 de acordo com a presente invenção que se baseia na produção de calor numa substância 2, um analito ou um complexo ou derivado do analito (ver também a Fig. 2), mediante irradiação da substância 2 com radiação electromagnética. A Fig. 1 mostra o dispositivo de detecção química 1 na presença de uma substância 2. 0 dispositivo 1 compreende um transdutor piroeléctrico ou piezoeléctrico 3 com revestimentos de eléctrodo 4, 5.0 transdutor 3 é de preferência uma película polarizada de fluoreto de polivinilideno. Os revestimentos dos eléctrodos 4, 5 são de preferência compostos por óxido de índio e estanho com uma espessura de cerca de 35 nm, embora seja possível quase qualquer espessura desde o limite inferior de 1 nm, abaixo do qual a condutividade eléctrica é excessivamente baixa, até ao limite superior de 100 nm, acima do qual a transmissão óptica é muito baixa (e não deve ser inferior a 95%T). Uma substância 2 é mantida próxima do transdutor piezoeléctrico 3, aqui representado ligado ao revestimento do eléctrodo superior 4. Pode ser depositada uma pluralidade de substâncias. De preferência, a substância 2 é adsorvida no eléctrodo superior, e.g. covalentemente acoplada ou ligada através 6 de forças intermoleculares, tais como ligações iónicas, ligação de hidrogénio ou forças de Van der Waals. Uma caracteristica chave da presente invenção é que a substância 2 gera calor quando irradiada pela fonte de radiação electromagnética 6, como luz, de preferência luz visivel. A fonte de luz pode ser, por exemplo, um LED. A fonte de luz 6 ilumina a substância 2 com luz do comprimento de onda apropriado (e.g., uma cor complementar). Sem pretender ficar limitado por qualquer teoria particular, considera-se que a substância 2 absorve a luz para gerar um estado excitado que é então sujeito a declínio não-radiativo gerando assim energia, indicada pelas linhas curvas na Fig. 1. Esta energia está principalmente sob a forma de calor (i.e. movimento térmico no ambiente), embora possam também ser geradas outras formas de energia, e.g. um onda de choque. A energia é, contudo, detectada pelo transdutor e convertida num sinal eléctrico. 0 dispositivo da presente invenção é calibrado para a substância específica a ser medida e, como tal, não é preciso determinar a forma precisa da energia gerada pelo declínio não-radiativo. A menos que especificado de outra forma, o termo "calor" é usado aqui para indicar a energia gerada pelo declínio não-radiativo. A fonte de luz 6 é posicionada de modo a iluminar a substância 2. De preferência, a fonte de luz 6 é posicionada abaixo do transdutor 3 e eléctrodos 4, 5 e a substância 2 é iluminada através do transdutor 3 e eléctrodos 4. A fonte de luz pode ser uma fonte de luz interna dentro do transdutor no qual a fonte de luz é um sistema de ondas guiadas. 0 guia de ondas pode ser o próprio transdutor ou uma camada adicional ligada ao transdutor. 7

[0012] A energia gerada pela substância 2 é detectada pelo transdutor 3 e convertida num sinal eléctrico. 0 sinal eléctrico é detectado por um detector 7. A fonte de luz 6 e o detector 7 estão ambos sob o controlo do controlador 8. A fonte de luz 6 gera uma série de impulsos de luz (o termo "luz" aqui usado designa qualquer forma de radiação electromagnética, excepto se indicado um comprimento de onda especifico) que é denominada " luz intermitente" . Em principio, um único feixe de luz, i.e. um impulso de radiação electromagnética, seria suficiente para gerar um sinal a partir do transdutor 3. Contudo, de modo a obter um sinal reprodutível, é usada uma pluralidade de feixes de luz, o que na prática requer luz intermitente. A frequência a que os impulsos de radiação electromagnética são aplicados pode ser variada. No limite inferior, o intervalo de tempo entre os impulsos deve ser suficiente para o intervalo de tempo entre cada impulso e a geração de um sinal eléctrico a ser determinado. No limite superior, o intervalo de tempo entre cada impulso não deve ser tão grande que o período que demora a registar os dados se torne despropositadamente prolongado. De preferência, a frequência dos impulsos é de 2-50 Hz, preferencialmente 5-15 Hz e, mais preferencialmente, 10 Hz. Isto corresponde a um intervalo de tempo entre impulsos de 20-500 ms, 66-200 ms e 100 ms, respectivamente. Adicionalmente, a denominada razão de "marcação", i.e. a razão de sinal ligado para sinal desligado, é, de preferência, um, embora possam ser usadas outras razões sem um efeito prejudicial. São conhecidas na arte fontes de radiação electromagnética que produzem luz intermitente com diferentes frequências de corte ou diferentes razões de marcação. O detector 7 determina o intervalo de tempo (ou "atraso de 8 correlação") entre cada impulso de luz da fonte de luz 6 e o sinal eléctrico correspondente detectado pelo detector 7 a partir do transdutor 3. 0 requerente descobriu que este intervalo de tempo é função da distância, d.

[0013] Dentro do âmbito das reivindicações 1 e 14, pode ser usado qualquer método para determinar o intervalo de tempo entre cada impulso de luz e o sinal eléctrico correspondente que oferece resultados reprodutíveis. De preferência, o intervalo de tempo é medido a partir do inicio de cada impulso de luz até ao ponto no qual um máximo no sinal eléctrico correspondente à absorção de calor é detectado pelo detector 7.

[0014] A descoberta de que a substância 2 pode ser separada da superfície do transdutor e que ainda pode ser detectado um sinal, é surpreendente já que um especialista esperaria que o calor dispersasse no meio envolvente e assim fosse indetectável pelo transdutor 3 ou pelo menos por um sinal relevante a ser recebido pelo transdutor. O requerente descobriu, surpreendentemente, que não apenas o sinal é detectável através de um meio interveniente capaz de transmitir energia para o transdutor 3, mas que diferentes distâncias, d, podem ser distinguidas (isto tem sido denominado "profundidade ") e que a intensidade do sinal recebido é proporcional à concentração da substância 2 na distância particular, d, a partir da superfície do transdutor 3. Além disso, o requerente descobriu que a natureza do próprio meio influencia o intervalo de tempo e a magnitude de um sinal num determinado intervalo de tempo. Estes achados fornecem uma ampla gama de novas aplicações para os dispositivos de 9 detecção química que empregam um transdutor.

[0015] Numa modalidade, a presente invenção fornece um dispositivo como definido na reivindicação 1 em que a substância é um analito ou complexo ou derivado do analito, o dispositivo sendo usado para detectar o analito numa amostra, o dispositivo compreendendo ainda pelo menos um reagente próximo do transdutor, o reagente tendo um local de ligação que é capaz de ligar o analito ou o complexo ou derivado do analito, em que o analito ou o complexo ou derivado do analito é capaz de absorver a radiação electromagnética gerada pela fonte de radiação para gerar energia, tipicamente calor, em que, em uso, a energia, tipicamente calor, gerada é convertida num sinal eléctrico pelo transdutor e é detectada pelo detector, e o intervalo de tempo entre cada um dos impulsos de radiação electromagnética e a produção do sinal eléctrico corresponde à posição do analito em qualquer uma de uma ou mais posições a diferentes distâncias da superfície do transdutor. A presente invenção também fornece um método definido na reivindicação 14 para detectar um analito numa amostra, compreendendo os passos de expor a amostra a um transdutor com um elemento piroeléctrico ou piezoeléctrico e eléctrodos, que é capaz de converter uma alteração na energia, tipicamente calor, num sinal eléctrico, o transdutor tendo pelo menos um reagente próximo deste, o reagente tendo um local de ligação que é capaz de ligação ao analito ou a um complexo ou derivado do analito, o analito ou o complexo ou derivado do analito sendo capaz de absorver a radiação electromagnética gerada pela fonte de radiação para gerar energia, tipicamente calor; irradiar o reagente com uma série de impulsos de radiação electromagnética, 10 convertendo a energia gerada, tipicamente calor, num sinal eléctrico; detectar o sinal eléctrico e o intervalo de tempo entre cada impulso de radiação electromagnética da fonte de radiação e a geração do sinal eléctrico, em que o intervalo de tempo entre cada um dos impulsos de radiação electromagnética e a produção do sinal eléctrico corresponde à posição do analito em qualquer uma de uma ou mais posições a distâncias diferentes da superfície do transdutor. Um tal dispositivo e método tem aplicabilidade em, por exemplo, imunoensaios e ensaios baseados em ácido nucleico. Num exemplo preferido de um imunoensaio, o reagente é um anticorpo e o analito é um antigénio.

[0016] Num imunoensaio típico, um anticorpo específico para um antigénio de interesse é ligado a um suporte polimérico, como uma folha de cloreto de polivinilo ou poliestireno. Uma gota de extracto celular ou uma amostra de soro ou urina é disposta na folha, que é lavada após a formação do complexo anticorpo-antigénio. São então adicionados anticorpos específicos para um local diferente no antigénio e a folha é novamente lavada. Este segundo anticorpo tem um marcador para poder ser detectado com elevada sensibilidade. A quantidade do segundo anticorpo ligado à folha é proporcional à quantidade de antigénio na amostra. Este ensaio e outras variações deste tipo de ensaio são bem conhecidas. Ver, por exemplo, "The Immunoassay Handbook, 2nd Ed." David Wild, Ed., Nature Publishing Group, 2001. 0 dispositivo da presente invenção pode ser usado em qualquer um destes ensaios.

[0017] A título de exemplo, a Fig. 2 mostra um ensaio de anticorpo de captura típico que usa o dispositivo da 11 presente invenção. Um dispositivo inclui um transdutor 3 e um poço 9 para conter um liquido 10 com um analito 11 ai dissolvido ou suspenso. 0 transdutor 3 tem uma série de reagentes, i.e. anticorpo 12, ligados. O anticorpo 12 é representado ligado à película na Fig. 2 e esta ligação pode ser através de uma ligação covalente ou pela adsorção não covalente sobre a superfície, por exemplo por ligação de hidrogénio. O anticorpo é representado ligado ao transdutor.

[0018] Por exemplo, uma camada adicional pode separar o anticorpo 12 e o transdutor 3, por exemplo, uma camada de polímero de silicone, ou o anticorpo pode ser ligado a partículas inertes e as partículas inerte são então ligadas ao transdutor 3. Em alternativa, o anticorpo 12 pode ser aprisionado dentro de uma camada de gel que posta a revestir a superfície do transdutor 3.

[0019] Em uso, o poço é enchido com líquido 10 (ou quaisquer fluidos) contendo um antigénio 11. O antigénio 11 então liga-se ao anticorpo 12. O anticorpo adicional marcado 13 é adicionado ao líquido e um denominado complexo "em sanduíche" é formado entre o anticorpo ligado 12, o antigénio 11 e o anticorpo marcado 13. Um excesso de anticorpo marcado 13 é adicionado de modo a que todo o antigénio ligado 11 forme um complexo em sanduíche. A amostra contém, assim, antigénio marcado ligado 13a e antigénio marcado não ligado 13b livre na solução.

[0020] Durante ou após a formação do complexo em sanduíche, a amostra é irradiada usando uma série de 12 impulsos de radiação electromagnética, como luz. 0 intervalo de tempo entre cada impulso e a geração de um sinal eléctrico pelo transdutor 3 é detectado por um detector. 0 intervalo de tempo apropriado é seleccionado para medir apenas a energia (calor) gerada pelo antigénio marcado ligado 13a. Já que o intervalo de tempo é função da distância do marcador em relação ao transdutor 3, o anticorpo marcado ligado 13a pode ser distinguido do antigénio marcado não ligado 13b. Isto confere uma vantagem significativa em relação ao imunoensaio em sanduíche convencional, na medida em que elimina a necessidade de passos de lavagem. Num imunoensaio em sanduíche convencional, o anticorpo marcado não ligado deve ser separado do anticorpo marcado ligado antes da realização de qualquer medição, já que o antigénio marcado não ligado interfere com o sinal gerado pelo antigénio marcado ligado. Contudo, devido à "determinação da profundidade" fornecida pela presente invenção, é possível distinguir o antigénio marcado ligado do não ligado. De facto, a capacidade de distinguir entre substâncias próximas do transdutor e substâncias na solução em massa é uma vantagem particular da presente invenção.

[0021] 0 anticorpo marcado é de preferência marcado com um marcador seleccionado de entre: uma molécula de corante, uma partícula de ouro, uma partícula polimérica colorida (e.g., uma partícula de látex colorida), uma molécula fluorescente, uma enzima, um glóbulo vermelho, uma molécula de hemoglobina, uma partícula magnética e uma partícula de carbono. Contudo, qualquer marcador capaz de interagir com a radiação electromagnética para gerar calor seria aceitável. No caso de uma partícula magnética, a 13 radiação electromagnética é radiação de rádio-frequência. Todos os outros marcadores mencionados acima empregam luz. No caso de uma partícula de ouro, o marcador é realçado usando uma solução de iões de prata e um agente redutor. 0 ouro catalisa/activa a redução dos iões de prata para metal prata e é o metal prata que absorve a luz.

Todos estes marcadores são convencionais.

[0022] O anticorpo marcado ou, na realidade, qualquer um ou mais reagentes adicionais são de preferência guardados numa câmara incorporada no dispositivo da presente invenção.

[0023] 0 antigénio é habitualmente uma proteína, por exemplo uma hormona à base de proteína, embora possam ser detectadas moléculas menores tais como, por exemplo, fármacos. 0 antigénio pode também ser parte integrante de uma partícula maior, como um vírus, uma bactéria, uma célula (e.g. um glóbulo vermelho) ou um prião.

[0024] Noutro exemplo de imunoensaios conhecidos, a presente invenção pode ser aplicada a ensaios competitivos nos quais o sinal eléctrico detectado pelo detector é inversamente proporcional à presença de um antigénio não marcado na amostra. Neste caso, é a quantidade do antigénio não marcado na amostra que interessa.

[0025] Num imunoensaio competitivo, um anticorpo é ligado ao transdutor, tal como representado na Fig. 2. Uma amostra contendo o antigénio é então adicionada. Contudo, em vez de adicionar um anticorpo marcado, é adicionada à solução uma quantidade conhecida do 14 antigénio marcado. Os antigénios marcados e não marcados então competem pela ligação aos anticorpos ligados ao transdutor 3. A concentração do antigénio marcado ligado é então inversamente proporcional à concentração do antigénio não marcado ligado e, assim, já que a quantidade de antigénio marcado é conhecida, pode ser calculada a quantidade de antigénio não marcado na solução inicial. Os mesmos marcadores especificados em relação aos anticorpos podem também ser usados com os antigénios.

[0026] Numa modalidade da presente invenção, o analito a detectar pode estar presente numa amostra de sangue total. Em muitos ensaios convencionais, a presença de outros componentes do sangue em solução ou suspensão, tais como eritrócitos, interfere com a detecção do analito particular em estudo. Contudo, no dispositivo da presente invenção, já que só é determinado o sinal a uma distância conhecida do transdutor 3, os outros componentes do sangue que estão livres na solução ou suspensão não interferem com a detecção. Isto simplifica a análise de uma amostra de sangue, já que dispensa um passo de separação à parte. Um aparelho para determinar os níveis de analito numa amostra de sangue compreende, de preferência, um leitor portátil e um dispositivo descartável que contém a película piezoeléctrica. Uma pequena amostra de sangue (cerca de 10 microlitros) é obtida e transferida para uma câmara dentro do dispositivo descartável. Um lado da câmara é composto pela película piezoeléctrica revestida com um anticorpo capaz de ligação ao analito de interesse. Uma solução adicional pode ser, então, adicionada contendo, por exemplo, anticorpo marcado ou uma concentração conhecida 15 de antigénio marcado, tal como descrito acima. A reacção prossegue e o dispositivo descartável é então inserido no leitor que activa o processo de medição. Os resultados do ensaio são então indicados num mostrador do leitor. 0 dispositivo descartável contendo a película piezoeléctrica é então removido e descartado.

[0027] Uma potencial fonte de interferência de fundo é o assentamento de partículas suspensas na superfície do transdutor piroeléctrico ou piezoeléctrico. Por exemplo, isto pode ocorrer nalguns dispositivos que usam a produção de partículas de prata. Esta fonte de interferência pode ser evitada posicionando o transdutor acima da solução em massa, e.g. na superfície superior da câmara de reacção. Assim, se ocorrer algum assentamento, este não irá interferir com o transdutor. Em alternativa, as partículas podem ser menos densas do que o meio e, assim, flutuar para a superfície da solução em massa, em vez de assentarem na superfície do transdutor. Esta e outras modificações estão incluídas no âmbito da presente invenção.

[0028] 0 dispositivo da presente invenção não se limita a detectar apenas um analito na solução. Já que o dispositivo permite a "caracterização da profundidade", podem ser detectados analitos diferentes empregando reagentes que ligam selectivamente cada analito a detectar, em que os reagentes estão a diferentes distâncias da superfície do transdutor 3. Por exemplo, podem ser detectados dois analitos usando dois reagentes, o primeiro reagente sendo posicionado a uma primeira distância da película e o segundo reagente sendo posicionado a uma segunda distância da película. O 16 intervalo de tempo entre cada impulso de radiação electromagnética e a produção de sinal eléctrico serão diferentes para os dois analitos ligados ao primeiro e segundo reagentes .

[0029] Para além de fornecerem diferentes profundidades, podem ser realizados múltiplos testes usando diferentes tipos de reagentes, e.g. diferentes anticorpos, em diferentes partes do transdutor. Em alternativa ou adicionalmente, podem ser realizados múltiplos testes usando reagentes/analitos que respondem a diferentes comprimentos de onda de radiação electromagnética.

[0030] A substância que gera a energia, tipicamente calor, pode estar na superfície da película, contudo, de preferência, a substância está a pelo menos 5 nm da superfície da película e, de preferência, a substância não está a mais de 500 mm da superfície da película.

[0031] Como alternativas às reacções anticorpo-antigénio, o reagente e o analito podem ser um primeiro e um segundo ácidos nucleicos que são complementares, ou um reagente contendo avidina ou derivados desta e um analito contendo biotina ou derivados desta, ou vice-versa. 0 sistema também não se limita a ensaios biológicos e pode ser aplicado, por exemplo, à detecção de metais pesados em água.

[0032] Como descrito acima, o requerente descobriu que o intervalo de tempo entre cada impulso de radiação 17 electromagnética na geração de um sinal eléctrico no transdutor é proporcional à distância da substância em relação à película. Além disso, o requerente descobriu que o intervalo de tempo depende da natureza do próprio meio. Inicialmente, foi surpreendente verificar que um meio liquido não humedece totalmente o sinal. Contudo, o requerente descobriu que alterações na natureza do meio podem alterar o intervalo de tempo (i.e. até o máximo do sinal ser atingido) , a magnitude do sinal e a forma de onda do sinal (i.e. a variação da resposta ao longo do tempo).

[0033] Estas alterações na natureza do meio podem dever-se, entre outros, às variações na espessura do meio, à elasticidade do meio, à rigidez do meio, à densidade do meio, à deformabilidade do meio, à capacidade de aquecimento do meio ou à velocidade na qual as ondas de som/choque podem ser propagadas pelo meio.

Exemplos [0034] Um bimorfo polarizado de fluoreto de polivinilideno, revestido de óxido de índio e estanho, foi usado como dispositivo de detecção nos exemplos que se seguem.

[0035] Nos Exemplos 1-4 e nos Exemplos Comparativos 1-3, o dispositivo de detecção foi revestido por imersão em solução de poliestireno para produzir uma camada de poliestireno em cima de óxido de indio e estanho. "Anilhas" circulares de poliestireno com diâmetro interno de 5 mm e 5 mm de altura foram ligadas à 18 superfície de poliestireno (usando adesivo sensível à pressão) para formar poços de reacção, que podem conter eficazmente líquidos acima da superfície do dispositivo de detecção. Os poços comportam um volume total até 100 mL de líquido. As anilhas de poliestireno tinham sido tratadas com uma solução de albumina de soro bovino (BSA) e Tween (RTM) 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano) para evitar a ligação não específica de moléculas proteicas às paredes do poço de reacção.

Exemplo 1 [0036] A Fig. 4 mostra os resultados de duas experiências de demonstração de princípio que detectaram a presença de (a) um anticorpo marcado ligado a uma película piezoeléctrica e (b) um anticorpo marcado em solução. As duas experiências foram realizadas em poços de reacção na superfície da película piezoeléctrica revestida a poliestireno. Na primeira experiência (a) foram adicionados 50 mL de solução de anti-peroxidase de rábano-silvestre (HRP) marcada a ouro (5 mg/mL, 250 ng total) em tampão fosfato (pH 7,2, 100 mM) ao poço de reacção e incubados durante 1 hora, depois eliminados por lavagem e secos. Na segunda experiência (b) , a superfície da película de poliestireno foi bloqueada por incubação com uma solução de albumina de soro bovino (1%) e Tween (RTM) 20 (0,5%), que depois foi lavada e seca.

[0037] Foram adicionados 50 mL de solução pré-misturada de potenciador de prata (Sigma SE-100) ao primeiro poço de reacção para iniciar a reacção de potenciação. 50 mL de solução pré-misturada de potenciador de prata contendo 250 ng de anti-HRP marcado a ouro foi adicionado ao 19 segundo poço para iniciar a reacção de potenciação.

[0038] Os poços foram então irradiados com luz intermitente de comprimento de onda 654 nm com uma frequência de corte de 10 Hz. Foi determinada a magnitude do sinal máximo detectado pela pelicula piezoeléctrica num atraso de correlação de cerca de 10-15 ms. 0 sinal foi exibido num conversor analógico-digital. A Fig. 4 mostra os resultados destas reacções de reforço. 0 eixo y mostra o sinal recebido pelo detector, denominado "Valor do leitor (contagens ADC)" e o eixo x mostra o tempo em segundos.

[0039] Na primeira experiência (a) , o anti-HRP marcado a ouro ligado à superfície medeia a reacção entre os iões de prata e o agente redutor à superfície da película, levando à deposição de prata metálica na superfície do transdutor. Na segunda experiência (b), o anti-HRP marcado a ouro em solução medeia a reacção entre os iões de prata e o agente redutor em solução, conduzindo à precipitação de partículas de prata. O perfil cinético destas reacções pode ser monitorizado ao longo do tempo, sendo as medições realizadas a cada 10 segundos. Como a solução em massa está a uma distância superior da película piezoeléct rica do que o marcador ligado, o sinal detectado é pouco ou nenhum, com um atraso de correlação de cerca de 10-15 ms. As quantidades de anti-HRP usado asseguram que a quantidade de anti-HRP na superfície na primeira experiência (a) deve ser igual ou inferior à quantidade de anti-HRP em solução na segunda experiência (b) .

[0040] Incidentalmente, se for detectado um sinal num atraso de correlação em torno de 50-60 ms, o sinal para o 20 anticorpo na solução em massa será medido em vez do anticorpo ligado na superfície do transdutor, embora a força do sinal possa ser reduzida pelo amortecimento do sinal pelo meio.

Exemplo 2 [0041] 30 mL de uma diluição 1:30 em fosfato tampão de 100 mM, pH 7,2 de imunoglobulina G (cat. Sigma N.° P7899) (IgG) de coelho anti-peroxidase de rábano-silvestre (HRP) foram incubados no poço de reacção durante uma hora à temperatura ambiente para permitir a adsorção de anticorpo na superfície do poliestireno. A solução foi então eliminada por lavagem e seca e tratada com albumina de soro bovino (1%) e Tween (RTM) 20 (0,05%) num tampão fosfato (30 mL) para bloquear quaisquer locais de adsorção remanescentes na superfície de poliestireno. O poço foi lavado com água desionizada e seco. Foram então adicionados 30 mL de solução de peroxidase de rábano-silvestre (125 mg/mL em tampão fosfato 100 mM) ao poço de reacção e incubados durante 1 hora e depois eliminados por lavagem. 30 mL de anti-peroxidase de rábano-silvestre caprino (Fab')2 marcado com ouro (British Biocell) (diluição 1:10 em tampão fosfato 100 mM) foram adicionados durante uma hora à temperatura ambiente. 0 poço foi então lavado com água desionizada. Solução de potenciador de prata (Sigma SE-100, composta por 20 mL de solução A e 20 mL de solução B, que foram pré-misturadas imediatamente antes do uso) foi então adicionada ao poço de reacção e o desenvolvimento de coloração de prata metálica na superfície do sensor foi monitorizado através de iluminação da película de detecção usando luz intermitente (10 Hz) de um LED azul de alta 21 potência (emitindo a 470 nm) . É gerada uma tensão no sensor que é medida usando um amplificador lock-in, e depois convertida num sinal digital arbitrário que é guardado num PC.

Exemplo comparativo 1 [0042] A reacçao foi realizada exactamente como descrito no Exemplo 2 acima, exceptuando que foi omitido o passo inicial de adsorver anti-HRP de coelho sobre a superfície do sensor.

Exemplo comparativo 2 [0043] A reacção foi realizada exactamente como descrito no Exemplo 2 acima, exceptuando que foi omitido o passo de incubação com peroxidase de rábano-silvestre.

Exemplo comparativo 3 [0043] A reacção foi realizada exactamente como descrito no Exemplo 2 acima, exceptuando que foi omitido o passo de incubação com anticorpo anti-peroxidase de rábano-silvestre caprino (Fab')2 marcado com ouro [0045] A Fig. 5 mostra os resultados do Exemplo 2 e dos exemplos comparativos 1 a 3 (4 análises de cada). As quatro séries de dados que originam um sinal rápido são devidas à sobreposição de camadas anti-HRP de coelho/HRP/anti-HRP caprino marcado com ouro, na superfície do sensor (Exemplo 2). Todos os outros dados da série são devidos a reacções de controlo (exemplos 22 comparativos 1 a 3).

Exemplo 3 [0046] Imunoglobulina G (Sigma cat. N.° P7899) (IgG) anti- peroxidase de rábano-silvestre (HRP) de coelho (30 mL de uma diluição 1:30 em tampão fosfato 100 mM, pH 7,2) foi incubada em dois poços de reacção durante uma hora à temperatura ambiente para permitir a adsorção de anticorpo sobre a superfície do poliestireno. As soluções foram então eliminadas por lavagem e tratadas com albumina de soro bovino (1%) e Tween (RTM) 20 (0,05%) em tampão fosfato (30 mL) para bloquear quaisquer locais de adsorção remanescentes na superfície de poliestireno. Os poços foram lavados com água desionizada e secos. 10 mL de solução de peroxidase de rábano-silvestre (125 mg/mL em tampão fosfato 100 mM) foram então adicionados ao poço de reacção 1, ao passo que só foram adicionados 10 mL de tampão fosfato isoladamente ao poço de reacção 2. Estes foram deixados incubar durante 15 minutos, depois foram adicionados 30 mL de anti-peroxidase de rábano-silvestre caprino (Fab') g marcado com ouro (British

Biocell) (diluição 1:10 em tampão fosfato 100 mM) a ambos os poços 1 e 2 durante 15 minutos à temperatura ambiente. Solução de potenciador de prata (Sigma SE-100, composta por 20 mL de solução A e 20 mL de solução B, que foram pré-misturadas imediatamente antes do uso) foi então adicionada a ambos os poços de reacção e o desenvolvimento de coloração de prata metálica na superfície do sensor foi monitorizado usando a técnica anteriormente descrita.

[0047] A presença de HRP no poço 1 como analito modelo, permite a formação de um complexo em sanduíche na 23 superfície do transdutor (anti-HRP de coelho/ HRP / anti-HRP caprino marcado a ouro), localizando assim algum do marcador ouro na superfície no poço 1. A ausência de HRP no poço 2 significa gue o anticorpo caprino marcado com ouro permanece na solução no poço 2.

[0048] 0 desenvolvimento do sinal ao longo do tempo para os poços 1 e 2 foi similar ao apresentado na Fig. 4, ilustrando que a detecção do analito pode ocorrer sem passos de lavagem.

Exemplo 4 [0049] Uma série de experiências foram realizadas exactamente como descrito no Exemplo 2, usando IgG anti-HRP de coelho adsorvida na superfície do transdutor como anticorpo de captura, HRP como analito alvo e IgG anti-HRP caprino marcado a ouro como anticorpo indicador. Foram usadas cinco concentrações de HRP diferentes (100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL e 1 pg/mL). Isto corresponde a quantidades totais de HRP iguais a 3 ng, 300 pg, 30 pg, 3 pg e 30 fg. O passo de potenciação da prata foi realizado como descrito acima. A Fig. 6 mostra que o sinal depende d a quantidade de analito usado na reacção.

Exemplo 5 [0050] Neste exemplo, que nao faz parte da invenção mas representa a arte anterior, que é útil para a compreensão da invenção, o transdutor é revestido com uma camada de silicone. O sinal detectado pelo transdutor depende tanto da espessura como da 24 elasticidade da camada de silicone. Foram preparadas camadas de silicone de várias espessuras, com manchas de corante negro de Sudão B colocadas por cima das camadas de silicone por adição da solução corante (em etanol) por pipeta. Foram usadas três camadas de espessuras diferentes (200, 133 e 79 mm) e três quantidades totais de corante diferentes (através da adição de 0,1, 1,0 ou 2,5 mL de solução corante 10 mmol dm-3), perfazendo um total de nove medições. A Fig. 7 mostra que o sinal sobe significativamente à medida que se reduz a espessura da camada (para as três quantidades de corante) onde o atraso de correlação é 10 ms.

[0051] Adicionalmente, a espessura da camada de silicone interveniente afecta o tempo que o sinal demora a atingir um máximo (i.e., o atraso de correlação). Isto é ilustrado na Fig. 8, onde a espessura de uma camada de silicone interveniente entre uma mancha corante e o transdutor vai de 100 a 500 mm. 0 eixo y dá as contagens (em milhares) , ao passo que o eixo X apresenta o atraso de correlação (atraso de correlação 1 = 5 ms, 2 = 10 ms, 3 = 15 ms, etc) . 0 sinal mais elevado é observado para uma camada de silicone de 100 mm com um atraso de correlação de 15 ms para atingir este máximo. À medida que a espessura da camada de silicone aumenta, observa-se que o sinal cai e, ao mesmo tempo, o tempo necessário para atingir o máximo também aumenta, para 50 ms numa espessura de camada de silicone de 500 mm.

Lisboa, 25

Claims (22)

1. Reivindicações 1. Um dispositivo (1) para detectar a energia gerada pelo declínio não-radiativo num analito ou um complexo ou derivado do analito (2, 11) mediante irradiação com radiação electromagnética compreendendo uma fonte de radiação (6) adaptada para gerar uma série de impulsos de radiação electromagnética, um transdutor tendo um elemento piroeléctrico ou piezoeléct rico (3) e eléctrodos (4, 5), que é capaz de converter a energia gerada pelo analito ou um complexo ou derivado do analito (2, 11) num sinal eléctrico, pelo menos um reagente (2, 12) próximo da (3) superfície do transdutor; o reagente (2, 12) tendo um local de ligação que é passível de ligação ao analito ou complexo ou derivado do analito (2, 11), um poço (9) para conter um líquido (10) tendo o analito ou um complexo ou derivado do analito (2, 11) aí dissolvido ou suspenso em contacto com o transdutor (3), um detector (7) que é capaz de detectar o sinal eléctrico gerado pelo transdutor (3), e um controlador (8) para controlar a fonte de luz (6) e o detector (7), em que o detector (7) está adaptado para determinar o intervalo de tempo entre cada impulso de radiação electromagnética a partir da fonte de radiação (6) e a geração do sinal eléctrico e em que o detector (7) está disposto de modo a detectar apenas o sinal eléctrico gerado pelo transdutor (3) até o intervalo de tempo seleccionado para distinguir a concentração do analito ou um complexo ou derivado do analito (2, 11) a distâncias diferentes em relação à superfície do transdutor (3) .
2. 2. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 1, 1 em que o reagente é um anticorpo (12) e o analito é um antigénio (11) .
3. 3. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 2, em que o complexo ou derivado do analito (2, 11) é um complexo com um anticorpo marcado (13a).
4. 4. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 2, em que o analito (2, 11) é um antigénio marcado e o sinal eléctrico detectado pelo detector (7) é inversamente proporcional à presença de um antigénio não marcado na amostra.
5. 5. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 3 ou 4, em que o anticorpo marcado (13a, 13b) ou antigénio é marcado com um marcador seleccionado de entre uma molécula corante, uma partícula de ouro, uma partícula polimérica colorida, uma molécula fluorescente, uma enzima, um eritrócito, uma molécula de hemoglobina, uma partícula magnética e uma particula de carbono.
6. 6. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 1, em que o reagente (2, 12) é um primeiro ácido nucleico e o analito (2, 11) é um segundo ácido nucleico e o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são complementares.
7. 7. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 1, em que o reagente (2, 12) contém avidina ou derivados desta e o analito (2, 11) contém biotina ou derivados desta ou vice-versa.
8. 8. Um dispositivo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o intervalo de tempo é 2 pelo menos de 5 milissegundos, de preferência 10 milissegundos .
9. 9. Um dispositivo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a radiação electromagnética é luz, de preferência luz visivel.
10. 10. Um dispositivo como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores, em que o reagente (2, 12) é adsorvido sobre o transdutor (3).
11. 11. Um dispositivo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda uma câmara para armazenamento de um ou mais reagentes adicionais.
12. 12. Um dispositivo como reivindicado na reivindicação 11, em que o reagente adicional é um anticorpo marcado para produzir o complexo subsequentemente formado ou derivado do analito.
13. 13. Um dispositivo como reivindicado em qualquer reivindicação anterior, em que a frequência dos impulsos de radiação electromagnética é 2-50 Hz.
14. 14. Um método para detectar um analito ou um complexo ou derivado do analito (2, 11) dissolvido ou suspenso numa amostra líquida, compreendendo os passos de expor a amostra líquida a um transdutor (3) com um elemento piroeléctrico ou piezoeléctrico e eléctrodos (4, 5) que é capaz de converter uma alteração na energia num sinal eléctrico, a superfície do transdutor (3) tendo pelo menos um reagente (2,12) próximo, o reagente (2, 12) tendo um 3 local de ligação que é capaz de ligação ao analito ou um complexo derivado do analito (2, 11), o analito ou o complexo ou derivado do analito (2,11) sendo capaz de absorver a radiação electromagnética gerada por uma fonte de radiação (6) para gerar energia por declínio não radiativo; irradiar o reagente (2, 12) com uma série de impulsos de radiação electromagnética, converter a energia gerada num sinal eléctrico; detectar o sinal eléctrico e o intervalo de tempo entre cada impulso de radiação electromagnética da fonte de radiação (6) e a geração do sinal eléctrico, em que o intervalo de tempo entre cada um dos impulsos de radiação electromagnética e a produção do sinal eléctrico corresponde à posição do analito ou um complexo ou derivado do analito (2, 11) em qualquer uma de uma ou mais posições em distâncias diferentes da superfície do transdutor ( 3) e em que o intervalo de tempo é seleccionado para distinguir a concentração do analito ou um complexo ou derivado do analito (2 , 11) a diferentes distâncias em relação à superfície do transdutor (3) .
15. 15. Um método como reivindicado na reivindicação 14, em que o reagente é um anticorpo (12) e o analito é um antigénio (11) .
16. 16. Um método como reivindicado na reivindicação 15, em que o complexo ou derivado do analito (2, 11) é um complexo com um anticorpo marcado (13a).
17. 17. Um método como reivindicado na reivindicação 15, em que o analito (2, 11) é um antigénio marcado e o sinal eléctrico detectado pelo detector (7) é inversamente 4 proporcional à presença de um antigénio nao marcado na amostra.
18. 18. Um método como reivindicado na reivindicação 16 ou 17, em que o anticorpo marcado (13a, 13b) ou antigénio é marcado com um marcador seleccionado de entre uma molécula corante, uma partícula de ouro, uma partícula polimérica colorida, uma molécula fluorescente, uma enzima, um eritrócito, uma molécula de hemoglobina, uma partícula magnética e uma partícula de carbono.
19. 19. Um método como reivindicado na reivindicação 14, em que o reaqente (2, 12) é um primeiro ácido nucleico e o analito é um segundo ácido nucleico e o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são complementares.
20. 20. Um método como reivindicado na reivindicação 14, em que o reagente (2, 12) contém avidina ou derivados desta e o analito (2, 11) contém biotina ou derivados desta, ou vice-versa.
21. 21. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 14 a 20, em que o método é realizado sem remover a amostra do transdutor (3) entre os passos de expor a amostra ao transdutor (3) e irradiar o reagente.
22. 22. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 14 a 20, em que a frequência dos impulsos de radiação electromagnética é de 2-50 Hz. Lisboa 5