PT1601826E - Implante de tecido de seda biocompatível - Google Patents

Description

Descrição

IMPLANTE DE TECIDO DE SEDA BIOCOMPATÍVEL

As doenças, idade, traumas ou desgaste crónico levam, muitas vezes, à falha de tecidos ou órgãos. No tratamento de tais falhas, o objectivo de muitos procedimentos clinicos é a restauração da função. Um paciente requer, muitas vezes, apoio adicional, além dos próprios meios de cura do corpo, tais como cirurgia ou implante de um dispositivo médico. Tais procedimentos são, muitas vezes, necessários para combater uma deficiência permanente e até mesmo a morte. Os campos dos biomateriais e engenharia de tecido estão a proporcionar novas opções para restaurar, de forma gradual, o tecido nativo e função dos órgãos através de pesquisa e desenvolvimento de suportes, matrizes e construções temporárias (isto é, dispositivos) que apoiam inicialmente um tecido ou órgão deficiente, mas que permite, eventualmente, o desenvolvimento e remodelação do próprio tecido de função biológica e mecânica do corpo.

As responsabilidades ou requisitos de concepção de tal suporte incluem: (i) a capacidade de providenciar estabilidades mecânicas imediatas ao tecido danificado ou doente, (ii) suporta o crescimento de células e tecido no dispositivo, (iii) comunica o ambiente mecânico do corpo ao tecido em desenvolvimento; tal é alcançado através da concepção mecânica e biológica adequada do dispositivo, (iv) degrada a uma tal taxa que as células e tecido de crescimento têm tempo suficiente para remodelar, deste modo, criando um tecido com nova função autóloga que pode sobreviver à vida do paciente. Em certos casos, o dispositivo deve imitar a estrutura tridimensional correcta (por exemplo, um suporte de osso) do tecido que 1/98 tenta suportar, em outros casos, o dispositivo pode servir como uma ligadura temporária (por exemplo, uma malha plana para a reparação de uma hérnia ou um hemostato para hemorragia) para um tecido tridimensional (músculo da parede abdominal no caso da hérnia). Independentemente da aplicação, a presente direcção do campo do dispositivo médico é a restauração completa da função corporal através do suporte do desenvolvimento do tecido autólogo.

Infelizmente, a maior parte dos biomateriais disponíveis hoje em dia não possui a integridade mecânica de aplicações com necessidade de alta carga (por ex. , ossos, ligamentos, tendões, músculo) ou a funcionalidade biológica adequada; a maior parte dos biomateriais ou se desgastam muito rapidamente (por ex., colagénio, PLA, PGA, ou copolímeros relacionados) ou não são biodegradáveis (por ex., poliésteres, metal), onde em cada caso, o tecido autólogo funcional não se desenvolve e o paciente sofre a incapacidade. Em certos casos, um biomaterial pode orientar de forma errada a diferenciação e desenvolvimento do tecido (por ex., formação espontânea do osso, tumores) porque lhe falta biocompatibilidade com as células e tecido circundantes. Também, um biomaterial que não se degrada normalmente é associado à inflamação crónica, onde tal resposta é actualmente prejudicial (isto é, enfraquece) para o tecido circundante.

Se concebida adequadamente, a seda pode oferecer novas opções clínicas para a concepção de uma nova classe de dispositivos médicos, suportes e matrizes. A seda tem mostrado possuir a maior força de todas as fibras naturais, e rivaliza com as propriedades mecânicas de fibras sintéticas de alto desempenho. As sedas são também estáveis a altas temperaturas fisiológicas e num amplo 2/98 intervalo de pH, e são insolúveis nos solventes mais aquosos e orgânicos. A seda é uma proteína, em vez de um polímero sintético, e produtos de degradação (por ex., péptidos, aminoácidos) são compatíveis. A seda não deriva de animais e transporta bem menos biocarga que outros biomateriais naturais comparáveis (por ex., colagénio proveniente de bovinos ou suínos).

Seda, termo como é normalmente conhecido na técnica, significa um produto com fibras filamentosas segregadas por um organismo, tal como um bicho-da-seda ou aranha. As sedas produzidas por insectos, nomeadamente (i) bichos-da-seda Bombyx mori, e (ii) as glândulas das aranhas, normalmente Nephila clavipes, são as formas mais frequentemente estudadas do material; contudo, existem centenas a milhares de variantes naturais de seda na natureza. A fibroína é produzida e segregada por duas glândulas de seda do bicho-da-seda. À medida que a fibroína deixa as glândulas, esta é revestida com sericina, uma substância tipo cola. Contudo, a seda proveniente da aranha é valorizada (e diferenciada da seda do bicho-da-seda) uma vez que é produzida como um único filamento, faltando quaisquer contaminantes imunogénicos, tal como a sericina.

Inf elizmente, a seda proveniente da aranha não pode ser produzida em massa devido à incapacidade de domesticar aranhas; contudo, a seda proveniente de aranha, bem como as outras sedas, podem ser clonadas e produzidas recombinantemente, mas com resultados que variam extremamente.

Frequentemente, dispendiosos, estes processos não conseguem introduzem produzir biocargas, material sao em 3/98 quantidades significativas, resultam em propriedades de material altamente variável, e não são demasiado controlados ou reproduzíveis.

Como resultado, apenas o bicho-da-seda foi usado em aplicações médicas há mais de 1000 anos. A espécie Bombyx mori de bicho-da-seda produz uma fibra de seda (conhecida como um "fio") e usa a fibra para construir o seu casulo. O fio, como produzido, inclui dois filamentos de fibroína ou "broins", que são rodeados com um revestimento de goma, conhecida como sericina— o filamento de fibroína de seda possui uma integridade mecânica significativa. Quando as fibras de seda são colhidas para fios de produção ou têxteis, incluindo suturas, uma pluralidade de fibras pode ser alinhada em conjunto, e a sericina é parcialmente dissolvida e depois novamente solidificada para criar uma estrutura de fibra de seda maior com mais do que dois broins, mutuamente embebidos num revestimento de sericina.

Como aqui usado, a "fibroína" inclui fibroína de bicho-da-seda (isto é, de Bombyx mori) e fibras tipo fibroína proveniente de aranhas (isto é, de Nephila clavipes) . Alternativamente, a proteína de seda adequada ao uso na presente invenção pode ser obtida a partir de uma solução que contém uma seda geneticamente produzida, tal como a partir de uma bactéria, levedura, células mamíferas, animais transgénicos ou plantas transgénicas. Ver, por exemplo, WO 97/08315 e patente americana N° 5,245, 012 .

As fibras de seda provenientes do bicho-da-seda, tradicionalmente disponíveis no mercado comercial para aplicações de suturas e têxteis, são habitualmente 4/98 "degomadas" e consistem de múltiplos broins dobrados em conjunto para formar uma fibra única multi-filamento. A degomagem refere-se aqui ao afrouxamento do revestimento de sericina em redor dos dois broins através da lavagem ou extracção em água quente com sabão. Tal afrouxamento permite a dobragem de broins para criar fibras únicas multi-filamento. Contudo, a extracção completa não é, muitas vezes, atingida nem desejada. A seda degomada contém habitualmente, ou é revestida com sericina e/ou as impurezas de sericina são introduzidas durante a dobragem, de modo a solidificar a fibra única multi-filamento. 0 revestimento de sericina protege os filamentos de fibroína frágeis (apenas ~5 microns de diâmetro) para que não se desfiem durante as aplicações têxteis tradicionais onde é necessário um processamento de alto rendimento. Deste modo, a seda degomada, excepto se explicitamente declarada como livre de sericina, contém normalmente 10-26% (por peso) de sericina (ver Tabelas 1 e 2) .

Quando normalmente referindo a "seda" na literatura, é inferido que as informações são focadas na "seda" de ocorrência natural e apenas disponível (isto é, fibras de fibroína revestidas com sericina) que têm sido usadas durante séculos em têxteis e medicina. A seda do bicho-da-seda de utilização médica é tradicionalmente usada em apenas duas formas: (i) como sutura de seda virgem, onde a sericina não foi removida, e (ii) a sutura de seda tradicional mais popular, ou comummente referida como sutura de seda entrelaçada negra, onde a sericina foi completamente removida, mas substituída com um revestimento de cera ou silicone para providenciar uma barreira entre a fibroína de seda e o tecido e células do corpo. Actualmente, a aplicação apenas médica, para a 5/98 qual a seda é ainda usada, está na ligação da sutura, particularmente porque a seda ainda é valorizada pelas suas propriedades mecânicas na cirurgia (por ex., resistência do nó e maneabilidade).

Apesar do uso de seda virgem como um material de sutura durante milhares de anos, a chegada de novos biomateriais (colagénio, sintéticos) permitiu comparações entre materiais e identificou problemas com sericina, seda, ou mais claramente definida como seda do bicho-da-seda Bombyx mori, não é biocompativel. A sericina é antigénica e obtém uma resposta substancial imune, alérgica ou hiper resposta da célula T (versus a resposta de "corpo estranho" suave normal). A sericina pode ser removida (lavada/extraida) da fibroina da seda; contudo, a remoção de sericina da seda altera a ultra-estrutura das fibras de fibroina, expondo-as, e resulta na perda da resistência mecânica, levando a uma estrutura frágil.

As estruturas de seda extraida (isto é, fios, matrizes) são especialmente susceptiveis de desfiar e falhas mecânicas durante os procedimentos têxteis padrão devido à natureza multi-filamento de filamentos de fibroina de diâmetro mais pequeno (~5 ym) . A fragilidade da fibroina extraida é a razão pela qual que quando se usa seda na concepção e desenvolvimento de dispositivos médicos, após a extracção, é normalmente ensinado (Perez-Rigueiro, J. Appl. Polymer Science, 70,2 439-2 447, 199 8) que deve dissolver e reconstituir a seda usando métodos padrão (patente americana N° 5,252,285) para obter um biomaterial passivel de ser trabalhado. A incapacidade para lidar com a fibroina de seda extraida com os métodos têxteis e maquinaria actuais evitou o uso de fibroina sem sericina 6/98 não dissolvida de ser utilizada como um dispositivo médico.

As limitações adicionais de fibroina de seda, quer extraída da seda de bicho-da-seda, dissolvida e reconstituída, ou produzida por aranhas ou insectos que não os bichos-da-seda, incluem (i) a natureza hidrofóbica da seda, um resultado directo da conformação do cristal folha-beta da proteína de fibroina central que dá à seda a sua resistência, (ii) a falta de domínios de ligação de células normalmente encontradas nas proteínas de matriz extracelular mamíferas (por ex., a sequência peptídica RGD) , e (iii) superfície suave de fibroina de seda. Como resultado, as células (por ex., macrófagos, neutrófilos) associadas a uma resposta de tecido inflamado e anfitrião não são capazes de reconhecer a fibroina de seda como um material capaz de degradação. Essas células optam desta forma por encapsular e impedir o corpo estranho (ver Fig. 18A) limitando deste modo (i) a degradação da fibroina de seda, (ii) o crescimento do tecido, e (iii) a remodelação do tecido. Deste modo, os filamentos de fibroina de seda induzem frequentemente uma forte resposta ao corpo estranho (FBR) que é associada a uma inflamação crónica, um granuloma periférico e encapsulamento de cicatrizes (Fig. 18A).

Adicionalmente às desvantagens biológicas da seda, a natureza da seda multi-filamento (por ex., as suturas), assim como a pequena dimensão dos filamentos de fibroina, pode originar uma estrutura bem unida. Assim, a seda pode degradar muito rapidamente. As proteases (enzimas) produzidas das células estimuladas, encontradas no encapsulamento periférico, podem penetrar na estrutura implantada (ver Fig. 11A e Fig. 11B) , mas 7/98 as células que depositam novos tecidos (por ex., fibroblastos), que podem reforçar o dispositivo (neste caso, uma sutura entrelaçada negra) durante a remodelação de tecido normal, não podem. Por conseguinte, o interior de dispositivos de fibroína não tratada ou não modificada não entram em contacto com a resposta e tecido do corpo estranho anfitrião (liderado e produzido por fibroblastos) e como resultado, a capacidade do dispositivo para remodelar o tecido directamente é limitada. 0 crescimento do tecido e célula anfitriã é limitado e a degradação não é normalmente possível.

No caso de suturas, é pensado que esses problemas podem ser geridos ao tratar as suturas de fibroína com os agentes de ligação ou ao revestir as suturas com cera, silicone ou polímeros sintéticos, protegendo, deste modo, o material do corpo. Revestimentos, tais como sericina, cera ou silicone, criados para adicionar estabilidade mecânica à fibroína (combatendo a sua fragilidade enquanto providencia uma barreira entre o corpo e a fibroína), limita a ligação de células, reconhecimento, infiltração e crescimento de tecido e degradação de fibroína. Como resultado, a seda é tradicionalmente considerada como um material não degradável. A classificação como não degradável pode ser desejável quando a seda se destina ao uso como um dispositivo de ligação de sutura tradicional, isto é, o crescimento de tecido e célula no dispositivo não são desejáveis. Por conseguinte, a ligação e crescimento de célula (que leva à degradação de matriz e remodelação de tecido activo) são tradicionalmente evitados pela natureza biológica da seda e o design mecânico da estrutura. De facto, uma 8/98 consideração geral de que a seda deve ser protegida do sistema imunológico e a percepção de que a seda não é biodegradável, limitaram o uso da seda na cirurgia. Mesmo no campo das suturas, a seda foi substituída na maioria das aplicações por materiais sintéticos, quer biodegradáveis ou permanentes.

Os documentos US 5849040 e US 6302922 descrevem um processo para a produção de um tecido ou malha para ser utilizado no vestuário têxtil usando sericina fixa em seda pura. O documento US 5598615 refere-se a um tecido formado por seda que é tratado para providenciar a viscosidade, por exemplo, ao usar vapor acima da temperatura na qual a proteína da seda desnatura. O documento US 6175053 descreve um material de curativo no qual as fibras de seda são dissolvidas e reconstituídas.

Por conseguinte, existe uma necessidade para que os implantes de tecido com fibras de fibroína de bichos-da-seda de onde foi extraída a sericina, e que são biocompatíveis, promovam o crescimento de células, e que sejam biodegradáveis.

SUMÁRIO A presente invenção providencia um implante de tecido biocompatível, como definido na reivindicação 1.

As construções de fibras de fibroína de seda natural, aqui descritas, oferecem uma combinação de alta resistência, 9/98 fadiga prolongada, e rigidez e alongamento em propriedades de ruptura que correspondem rigorosamente àquelas dos tecidos biológicos. As fibras na construção são alinhadas de forma não aleatória num ou mais fios. As construções de fibra são biocompativeis (devido à extracção de sericina das fibras de seda de bicho-da-seda) e substancialmente livres de sericina. As construções de fibra ainda não são imunogénicas; isto é, não provocam uma resposta substancial alérgica, antigénica ou de uma hiper resposta da célula T por parte do anfitrião, diminuindo o efeito nocivo nos tecidos biológicos circundantes, tais como aqueles que podem acompanhar as respostas do sistema imunitário em outros contextos. Adicionalmente, as construções de fibra promovem o crescimento de células em redor das ditas fibras de fibroina e são biodegradáveis.

As indicações de que a construção de fibra é "substancialmente livre" de sericina significam que a construção de fibra compreende menos de 20% de sericina por peso. Preferivelmente, a construção de fibra compreende menos de 10% de sericina por peso. Mais preferivelmente, a construção de fibra compreende menos de 1% de sericina por peso (ver Tabela 2). Além disso, "substancialmente livre" de sericina pode ser funcionalmente definido como um conteúdo de sericina que não provoca uma resposta substancial alérgica, antigénica ou hiper resposta de células T por parte do anfitrião. Do mesmo modo, a indicação de que existe menos de 3% de alteração na massa, após uma segunda extracção, vai implicar que a primeira extracção "remova substancialmente" a sericina da construção e que a construção resultante ficou "substancialmente livre" de sericina após a primeira extracção (ver Tabela 2 e Fig. 1F) . 10/98

Os métodos desta descrição extraem sericina da construção muito mais cuidadosamente do que os procedimentos de "degomagem" normais que caracterizam as práticas de processamento tradicional para a produção de têxteis de seda para aplicações não cirúrgicas (ver acima para definição) . A Figura IA mostra uma imagem de uma fibra degomada onde os filamentos de fibroina foram torcidos em conjunto formando uma fibra maior revestida com sericina. Esta fibra "degomada" contém -26%, por peso, de sericina. Numa forma de realização preferida, as fibras de fibroina de seda de onde foi extraida a sericina retêm a sua estrutura de proteína nativa e não foram dissolvidas e reconstituídas.

As fibras de fibroina de seda "natural" são produzidas por um insecto, tal como um bicho-da-seda ou uma aranha, e possuem a sua estrutura de proteína nativa, como formada. Preferivelmente, as construções de fibra de fibroina de seda não são recombinantes (isto é, não geneticamente criadas) e não foram dissolvidas e reconstituídas. Numa forma de realização preferida, as fibras de fibroina de seda de onde foi extraída a sericina compreenderam fibras de fibroina obtidas do bicho-da-seda Bombyx mori. Adicionalmente, o termo "biodegradável" é aqui usado para significar que as fibras são degradadas no espaço de um ano quando em contacto contínuo com um tecido corporal. Adicionalmente, os nossos dados sugerem (Fig. 13 A-E, Fig. 18 A-C e Fig. 19 A-D) que a taxa de degradação pode ser influenciada e melhorada por modificação da superfície da fibroina (Fig. 13 A-D e Fig. 18 A-C), assim como a configuração geométrica do fio e/ou tecido (Fig. 19 A-D). Numa forma de realização, o fio de fibroina de seda perde 50% da sua resistência à tracção 11/98 no espaço de duas semanas após a implantação in vivo (Fig.12) e 50% da sua massa em aproximadamente 30 a 90 dias in vivo, dependendo do local de implantação (Fig. 13 A-D) . A escolha do local de implantação in vivo (por ex., intra-muscular versus subcutâneo) mostrou influenciar significativamente a taxa de degradação (Fig. 13 A-D). A "seda para têxteis" é uma seda que ocorre naturalmente, que inclui um revestimento de sericina superior a 19%-28% por peso da fibra. A "seda de sutura" é seda que contém sericina ("sutura de seda virgem") ou é revestida com uma composição hidrofóbica, tal como cera de abelha, cera de parafina, silicone, ou um revestimento polimérico sintético ("sutura de seda entrançada negra"). A composição hidrofóbica repele as células ou inibe as células de se anexarem à fibra revestida. A seda entrançada negra é uma seda de sutura na qual a sericina foi extraída e substituída com revestimento adicional. A seda de sutura normalmente não é biodegradável.

Devido à ausência de uma cera protectora ou outro revestimento hidrofóbico nas fibras, as construções de fibroína de seda descritas são biologicamente (união de domínios de ligação de células) e/ou mecanicamente (aumento da área da superfície da seda e diminuição da densidade de embalagem) criadas para promover infiltração de célula aumentada comparada com a seda para têxteis ou seda de sutura quando implantada em tecido humano. Como resultado, as construções de fibroína de seda suportam o crescimento/infiltração da célula e união e difusão da célula melhorada, o que leva à degradação das construções de fibroína de seda, 12/98 criando deste modo, essencialmente, um novo biomaterial biodegradável para utilização num dispositivo médico e aplicações de engenharia de tecido. A capacidade da construção da fibra em suportar a união da célula e crescimento/infiltração da célula e tecido na construção, que por sua vez apoia a degradação, pode ser ainda melhorada através da modificação da superfície da fibroína (união de péptidos usando RGD, modificação de espécies químicas e aumentando a hidrofilicidade através do tratamento de plasma de gás) e/ou o design mecânico da construção, aumentando deste modo a área da superfície do material, aumentando assim a sua susceptibilidade para aquelas células e enzimas que possuem a capacidade de degradar a seda. As fibras de seda são opcionalmente revestidas com uma composição hidrofílica, por ex., colagénio ou uma composição peptídica, ou mecanicamente combinada com um biomaterial que suporta o crescimento da célula e tecido para formar uma estrutura de composto. A escolha de biomaterial, quantidade e interacção mecânica (por ex., enrolado ou entrelaçado sobre um núcleo de fibroína de seda) pode ser usada para alterar e/ou melhorar as taxas do crescimento da célula e degradação da construção.

As fibras na construção são alinhadas de forma não aleatória umas com as outras em um ou mais fios. Tal estrutura pode ser em paralelo, entrelaçada, texturizada, organizada helicamente (torcida, cablada (por ex., um cabo)) disposta para formar um fio. Um fio pode ser definido como consistindo pelo menos de uma fibra de fibroína. Preferivelmente, um fio consiste de pelo menos três fibras de fibroína alinhadas. Um fio é um conjunto de fibras torcidas ou, de outro modo, mantidas em conjunto num filamento contínuo. Um número 13/98 quase infinito de fios pode ser gerado através de vários meios de produção e combinação de fibras. Uma fibra de seda é acima descrita; contudo, o termo fibra é um termo genérico que indica que a estrutura tem um comprimento 100 vezes superior ao seu diâmetro.

Quando as fibras são torcidas ou, de outro modo, entrelaçadas para formar um fio, estas são torcidas/entrelaçadas o suficiente para prender essencialmente nas posições de fibra relativa e remover a folga, mas não tanto de forma a deformar plasticamente as fibras (isto é, não excede o limite de elasticidade do material), o que compreende a sua fadiga (isto é, reduz o número de ciclos de tensão antes da falha) . As construções de fibra de fibroína sem sericina podem ter uma resistência à tracção seca (UTS) de pelo menos 0,52 N/fibra (Tabela 1,4), e uma rigidez entre cerca de 0,27 e cerca de 0,5 N/mm por fibra. Dependendo da organização e hierarquia da fibra, mostrámos que a construção de fibroina UTS pode variar desde 0,52 N/fibra para cerca de 0,9 N/fibra. As construções de fibroina aqui descritas retêm cerca de 80% da sua UTS seca e cerca de 38% da sua rigidez seca, quando testada húmida (Tabela 5) . Os alongamentos em ruptura entre cerca de 10% e cerca de 50% foram normalmente para a construção de fibroina testada nos estados seco e húmido. A construção de fibroina produzida, normalmente a cerca de 40 a 50% das suas UTS e com uma vida de fadiga de, pelo menos, 1 milhão de ciclos numa carga de cerca de 20% da resistência a tracção dos fios.

Numa forma de realização da presente invenção, as fibras de fibroina do bicho-da-seda de onde foi extraída a 14/98 sericina sao torcidas umas em relação às outras entre 0 a 11,8 torções por cm (ver Tabela 6 e 7) . 0 número de hierarquias na estrutura geométrica da construção da fibroina, assim como o número de fibras/grupos/conjuntos/fios/cordas dentro de um nível hierárquico, a forma de entrelaçamento a níveis diferentes, o número de níveis e o número de fibras em cada nível podem todos ser variados para alterar as propriedades mecânicas da construção da fibroina (isto é, fio) e por conseguinte, do tecido (Tabela 4 e 8) . Numa forma de realização da presente invenção, a construção da fibra (isto é, fio) é organizada numa organização hierárquica de nivel único, a dita organização hierárquica de nível único que compreende um grupo de fios paralelos ou entrelaçados. Alternativamente, a construção da fibra (isto é, fio) organizada na organização hierárquica de dois níveis, a dita organização hierárquica de dois níveis compreende um conjunto de grupos entrelaçados. Noutra forma de realização da presente invenção, a construção da fibra (isto é, fio) é organizada numa organização hierárquica de três níveis, a dita organização hierárquica de três níveis compreendendo um filamento de conjuntos entrelaçados. Finalmente, outra forma de realização da presente invenção, a construção da fibra (isto é, fio) é organizada numa organização hierárquica de quatro níveis, a dita organização hierárquica de quatro níveis compreendendo uma corda dos filamentos entrelaçados. A sericina pode ser removida das fibras de fibroina antes do alinhamento num fio ou num nivel superior na geometria hierárquica da construção da fibra. 0 fio é manuseado em baixa tensão (isto é, a força aplicada na 15/98 construção nunca vai exceder o limite de elasticidade do material durante qualquer passo de processamento) e com cuidado geral após a sericina ser removida. 0 equipamento de processamento é igualmente configurado para reduzir abrasividade e ângulos agudos nos dispositivos de fixação guia que estão em contacto e orientam o fio durante o processamento para proteger as frágeis fibras de fibroina de danos; os tempos de residência de extracção de 1 hora são suficientes para extrair sericina mas lentos o suficiente para não danificar os filamentos expostos. Curiosamente, quando uma construção de fibra de seda consistindo de fibras múltiplas organizadas em paralelo tenha sido extraída sob estas condições, resultou num "único" fio sem sericina maior (isto é, as fibras individuais não podem ser separadas da construção devido à interacção mecânica entre os filamentos de fibroina mais pequenos, uma vez expostos durante a extracção) . Além disso, como resultado da interacção mecânica entre os micro-filamentos livres de sericina, extracção de fios torcidos ou cablados resultou, normalmente, em menos fios e estruturas "activas". Como resultado deste fenómeno, existiu um maior grau de flexibilidade na criação de fios e tecidos resultantes; por exemplo, maiores níveis de torção por polegada (TPI) podem ser usados, o que normalmente cria fios activos que seriam difíceis de formar em tecidos. 0 benefício acrescentado de TPI mais elevado foi a redução na rigidez do fio e tecido (isto é, a elasticidade da matriz pode ser aumentada) (Tabelas 6 e 7; Fig. 6A e Fig. 6B). Vários fios são entrelaçados para formar um implante de tecido. Os implantes de tecido são criados através da união de um ou mais fios individuais em que os fios 16/98 individuais são transformados em tecidos de dispositivo médico têxtil. Numa forma de realização da presente invenção, o fio é torcido em ou abaixo das 30 torções por polegada. Os tecidos são produzidos ou formados por fios combinados de forma não aleatória: união ao tecer, tricotar, ou costurar para produzir tecidos completos. Numa forma de realização, esta combinação de fios para formar um tecido é feita numa máquina. Contudo, é muito importante notar que o produto implante de tecido final é distinto baseado no tipo de fio usado para que, deste modo, providencie tremenda energia através do design do fio para ir ao encontro das necessidades clínicas. Um implante de tecido pode ser, mas não é limitado a, tecido, malha, malha-urdidura, ligado, revestido, de maquineta, laminado, rede, ou combinações dos mesmos.

De notar, os métodos têxteis de entrançar, em adição em criar fios, podem também ser usados para fazer tecidos, tais como um tecido entrançado plano ou um entrelaçado circular maior (Fig. 4A) . Inversamente, tecer e tricotar dois tecidos que formam métodos, apesar de não serem comummente usados, podem também ser usados para fazer fios. Em tais condições, a diferenciação entre um "fio" e um "tecido" não é inteiramente aparente, e a homogeneidade deve ser usada para fazer distinções claras, isto é, um fio é normalmente mais homogéneo em composição e estrutura do que um tecido.

Numa forma de realização da presente invenção, múltiplas fibras de seda de bicho-da-seda podem ser organizadas helicamente (por ex., torcidas ou cabladas) ou em paralelo, num único nível hierárquico ou em múltiplos níveis, extraídas, e usadas para criar uma sutura entrelaçada para ligação de tecido. Noutra forma de 17/98 realização, a interacção mecânica de filamentos de fibroina extraídos numa configuração torcida ou cablada após a extracção, pode ser usada como uma sutura médica.

Os implantes de tecido não tecido podem ser formados ao organizar de forma aleatória uma pluralidade de fios, ou um único fio cortado em muitas pequenas peças. Exemplos não limitativos incluem um implante de tecido para hemostato ou suporte de osso.

Todos os implantes de tecido podem derivar de uma única construção de fio (homogénea) ou várias construções de fios (heterogénea). A capacidade de conceber uma variedade de estruturas de fio de fibroina de seda, como descrita com mais pormenor mais adiante, aumenta dramaticamente o potencial de design do tecido quando considerando uma estrutura de tecido heterogénea.

Numa forma de realização da presente invenção, o implante de tecido é um composto das fibras de fibroina de seda de onde foi extraída a sericina ou fios e um ou mais polímeros degradáveis seleccionados do grupo que consiste de colagénios, ácido poliláctico ou seus copolímeros, ácido poligricólico ou seus copolímeros, polianidridos, elastina, glicosaminoglicanos e polissacarídeos. Além disso, o implante de tecido da presente invenção pode ser modificado para compreender um fármaco associado ou factor de união de célula associado com tecido (isto é, RGD). Numa forma de realização da presente invenção, o implante de tecido é tratado com plasma de gás ou inoculado com células biológicas.

Aspectos adicionais desta descrição relacionam-se com a reparação de tecidos corporais específicos, tal como a 18/98 reparação de hérnia, tecidos da bexiga e suportes, reconstrução do chão pélvico, tecidos da parede peritoneal, vasos (por ex., artérias), tecido muscular (músculo liso abdominal, cardíaco), hemostatos, e ligamentos e tendões do joelho e/ou ombro, assim como outras estruturas frequentemente danificadas devido a trauma e desgaste crónico. Exemplos de ligamentos ou tendões que podem ser produzidos incluem ligamentos cruzados anteriores, ligamentos cruzados posteriores, tendões do manguito rotador, ligamentos colaterais médios do cotovelo e joelho, tendões flexores da mão, ligamentos laterais do tornozelo e tendões e ligamentos do maxilar ou articulação temporomandibular. Outros tecidos que podem ser produzidos por métodos desta descrição incluem a cartilagem (articular e meniscal), osso, pele, vasos sanguíneos, stents para suporte e/ou reparação de vasos, e tecido conectivo mole geral.

Em outros aspectos, as fibras de fibroína do bicho-da-seda, na forma de um fio ou de uma grande construção de fios, agora chamado de dispositivo, ficam sem sericina, e feitas (por ex., tecido, tricotado, não tecido obtido via húmida, entrelaçado, costurado, etc.) num tecido, esterilizadas e usadas como um material de suporte ou reparação implantável que oferece um tempo útil controlável de vida (isto é, taxa de degradação) e um grau controlável de colagénio e/ou deposição de matriz extracelular. 0 material de suporte ou reparação pode ser usado para qualquer dito propósito no corpo, e em particular, pode ser usado para reparação de hérnia, reconstrução de paredes corporais, particularmente no tórax e cavidade abdominal, e suporte, posicionamento ou imobilização de órgãos internos, incluindo, sem limitação, a bexiga, o útero, os intestinos, a uretra e ureteres. 19/98

Alternativamente, pode ser retirada sericina às fibras de fibroina de bichos-da-seda e organizadas num tecido não tecido como um material de suporte ou reparação implantável como acima, mas mais especificamente para aplicações onde uma formação de esponja pode ser útil. A seda purificada pode ser purificada por qualquer uma das variedades de tratamentos que removem as proteínas de sericina encontradas nas fibrilhas nativas. A sericina tem sido suficientemente removida quando os implantes de seda purificada provocam apenas uma reacção de corpo estranho transiente na ausência de uma resposta antigénica (célula B, célula T) , isto é, são biocompatíveis. Uma reacção de corpo estranho é caracterizada por uma camada interna de macrófagos e/ou células gigantes com uma zona secundária de fibroblastos e tecido conectiva. 0 grau de resposta de corpo estranho mostrou ser controlável através de modificação de fibroina (Fig. 13 A-D e Fig. 18 A-C) e design do fio (Fig. 19 A-D) . A sericina pode ser removida de fibras de fibroina de bicho-da-seda individual, um grupo de fibras de fibroina de bicho-da-seda (por ex., paralelo ou torcido), ou forma um tecido que compreende uma pluralidade de fios. 0 implante pode ser esterilizado e implantado num organismo como um dispositivo médico.

Outras características e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes na seguinte descrição de formas de realização preferidas do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. IA é uma imagem de um microscópio electrónico de varrimento (SEM) de uma única fibra de seda nativa com 20/98 denier 20/22, degomada e dobrada com um revestimento de sericina. A Fig. 1B ilustra SEM da fibra de seda da Fig. IA, extraída durante 60 minutos a 37 °C. A Fig. 1C ilustra SEM da fibra de seda da Fig. IA, extraída durante 60 minutos a 90 °c, e ilustrando uma remoção completa do revestimento de sericina. A Fig. 1D é um gráfico que mostra uma resistência à tracção (UTS) e rigidez (N/mm para uma matriz de 3 cm de comprimento) como uma função de condições de extracção. A Fig. 1E ilustra SEM de uma fibroina de seda pura. A Fig. 1F ilustra uma primeira extracção a 90° durante 60 minutos. A Fig. 1G ilustra uma segunda extracção sob condições idênticas. Estas figuras mostram danos mecânicos aos filamentos que resultam numa perda típica de 3% de massa após a segunda extracção. Por conseguinte, desde que a % de perda de massa não altere mais de 3% da primeira à segunda extracção (90 °C, 1 hora, detergente normal e sal), é assumido que foi atingida a extracção completa. A utilidade de uma perda de 3% na perda total de massa reflecte a variabilidade nas medições, ensaios e danos mecânicos resultantes na perda de massa do fio após a segunda extracção. A Fig. 2A é um modelo 3D representativo de um fio (cablado ou torcido) representando os seus 5 níveis de hierarquia (nível único de fibra não mostrado). Dependendo do número de fibras usado em cada nível, a corda pode servir como um fio para criar uma rede de reparação de hérnia ou como uma 21/98 corda a ser usada em paralelo com outras cordas para formar uma matriz ACL. A Fig. 2B é um esquema que representa a geração de fio torcido ou em cabo hierárquico de dois níveis, contendo 36 fibras antes de ser torcido em paralelo, para formar uma matriz ACL, ou usado para gerar um ligamento do tecido ou tricotado para fabrico de tecido e reparação de tecido (por ex., rede de hérnia). As representações esquemáticas definem visualmente duas formas muito populares de formações de tecido: "tecer" e "tricotar." A Fig. 2C ilustra uma única corda de fio com uma geometria que é helicamente organizada sobre um eixo central e composta por dois níveis de hierarquia de torção. Quando seis cordas são usadas em paralelo (por ex., Matriz 1), o fio tem propriedades mecânicas semelhantes ao ligamento nativo. A Fig. 2D ilustra uma única corda de fio com uma geometria que é helicamente organizada sobre um eixo central e composta por três níveis de hierarquia de torção. Quando seis cordas são usadas em paralelo (por ex., Matriz 2), a matriz tem propriedades mecânicas semelhantes ao ligamento nativo. A Fig. 3A ilustra curvas de alongamento de carga para cinco amostras (n=5) da Matriz 1 formadas a partir de seis cordas de fibroína de seda paralelas ilustradas na Fig. 2A. A Fig. 3B é um gráfico de ciclos para falha na UTS, cargas de 1680N e 1200N (n=5 para cada carga), ilustrando os dados de fadiga da Matriz 1. A análise de regressão de 22/98 dados de fadiga da Matriz 1, quando extrapolada a niveis de carga fisiológica (400 N) para um número previsto de ciclos de falha in vivo, indica uma vida de matriz de 3,3 milhões de ciclos. A Fig. 3C ilustra curvas de alongamento de carga para três amostras (n=3) da Matriz 2 (n=3) formadas a partir de seis cordas de fibroina de seda paralelas ilustradas na Fig. 2B. A Fig. 3D é um gráfico de ciclos para falha na UTS, cargas de 2280N, 2100N e 1800N (n=3 para cada carga), ilustrando os dados de fadiga da Matriz 2. A análise de regressão de dados de fadiga da Matriz 2, quando extrapolada a niveis de carga fisiológica (400 N) para um número previsto de ciclos de falha in vivo, indica uma vida de matriz superior a 10 milhões de ciclos. A Fig. 4A mostra imagens de múltiplas formas de fio e tecido geradas nos nossos laboratórios. Várias estruturas de fio diferentes, incluindo vários tipos de entrançados (i, ii, iv) , um entrançado liso (iii), um diâmetro variante ou entrelaçado cónico (v) , um conjunto de dois níveis cablado maior (-250 fibras) (vi), um fio paralelo torcido e unido (estampado) consistindo de fios texturizados de 24-12 fibras (vii), uma variedade de fios torcidos (viii-xi) , e um fio torcido e unido de forma paralela (estampado) consistindo de fios de cabo de dois níveis de 24-12 fibras (xii). A Fig. 4B é um gráfico de curvas de alongamento de carga para (I) um entrançado (48 fibras, um entrançado de 4 portadores usando fio de 12 fibras extraídas torcidas) e fios texturizados (48 fibras no total) e (II) torcido 23/98 comparado a fios de cabo, 12 fibras no total - todas as amostras tinham 3 cm de comprimento. A Fig. 4C é um gráfico de dados de fadiga para pequenos fios, 3 cm de comprimento, como comparado a 3B e 3D para (I) um pequeno cabo de 36 fibras e (II) um pequeno fio texturizado de 60 fibras). A Fig. 5A providencia dados de força e rigidez para um fio de 36 fibras como uma função de 6 taxas diferentes de tensão nas quais foram testadas (N=5 por grupo). A Fig. 5B mostra curvas de alongamento de carga para um fio de 36 fibras, 3 cm de comprimento, testado nas 2 das 6 diferentes taxas de tensão. Os dados representam o efeito dos procedimentos de teste (aqui, especificamente de taxa de tensão) nas propriedades mecânicas reportadas (por ex., UTS) da estrutura de fio. A Fig. 6A é um gráfico de UTS como uma função de torções por polegada (TPI); as linhas de tendência foram geradas para extrapolar dados até uma 4a ordem polinominal - são mostradas TPI de 0-15. Um máximo foi observado indicando uma estrutura ordenada onde os filamentos individuais trabalham em unissono. A Fig. 6B é um gráfico de rigidez (para uma amostra de comprimento de 3 cm) como uma função de torções por polegada (TPI); as linhas de tendência foram geradas para extrapolar dados para uma 5a ordem polinominal- são mostradas TPI de 0-15. Foi observado um máximo indicando que a TPI pode ser usada como uma ferramenta para conceber um UTS ou rigidez específicos. 24/98 A Fig. 7 A ilustra SEM de fibroína de seda extraída antes da inoculação com células. A Fig. 7B ilustra SEM de células estromais da medula óssea inoculadas e anexadas em fibroína de seda, imediatamente após a inoculação. A Fig. 7C ilustra SEM de células da medula óssea anexadas e difundidas em fibroína de seda, 1 dia após inoculação. A Fig. 7D ilustra SEM das células estromais da medula óssea inoculadas em fibroína de seda, 14 dias após inoculação que forma uma folha matriz extracelular de célula intacta. A Fig. 8A ilustra um comprimento de 3 cm da corda de fibroína de seda ilustrada na Fig. 2C, e inoculada com células estromais da medula óssea, cultivada durante 14 dias num ambiente estático e marcada com MTT para mostrar até mesmo a cobertura de célula da matriz após o período de crescimento. A Fig. 8B ilustra um filamento de controlo da corda de fibroína de seda com 3 cm de comprimento marcado com MTT. A Fig. 9A é um gráfico que ilustra proliferação de células estromais da medula óssea na Matriz 1 de fibroína de seda determinada por um ADN celular total durante um período de cultura de 21 dias, indicando um aumento significativo na proliferação de células após 21 dias de cultura.

A Fig. 9B é um gráfico de barras que ilustra a proliferação de células estromais da medula óssea na Matriz 2 de fibroína de seda determinada por um ADN 25/98 celular total durante um período de cultura de 14 dias, indicando um aumento significativo na proliferação de células após 14 dias de cultura. A Fig. 10 ilustra a resistência à tracção da construção extraída de 30 fibras de seda que é inoculada com células estromais da medula óssea ou não inoculada durante 21 dias de cultura nas condições de crescimento fisiológicas. A Fig. 11A é um gráfico de UTS como uma função de degradação enzimática in vitro; não foi observada perda de força no controlo negativo, PBS. A seda perde 50% da sua resistência após 21 dias em cultura. Foi usada uma solução de 1 mg/ml de Protease XIV de SIGMA. A Fig. 11B é um gráfico de perda de massa como uma função de degradação enzimática in vitro·, não foi observada perda de resistência no controlo negativo, PBS. Foi observada 50% de perda de massa após 41 dias em cultura. A Fig. 12 é um gráfico de perda de UTS como função da degradação in vivo após implantação de matriz modificada por RGD num modelo de rato subcutâneo nao carregado para 10, 20 e 30 dias. Foi observada 50% de perda de resistência após ~10 dias in vivo num ambiente não carregado. A Fig. 13A mostra secções histológicas de 12(0) x 3(8) não modificadas e matrizes de fibroína de seda sem sericina modificadas com RGD após 30 dias de implante subcutâneo num rato Lewis. A fila I é coloração H&E a 40X, a fila II é coloração H&E a 128X, a fila III é coloração colagénio tricromo a 128X, a fila IV é colagénio retirado das imagens da fila III para permitir a qualificação do 26/98 crescimento do colagénio, e a fila V são os pixéis associados às secções de fibroinas de seda remanescentes, retirados para permitir uma quantificação de degradação. Após avaliação qualitativa, no ambiente subcutâneo, ambos os grupos não tratados e modificados apoiam o crescimento da célula e deposição de colagénio dentro da própria matriz com encapsulamento periférico limitado. A Fig. 13B representa qualitativamente uma diminuição de 36% na área transversal de seda modificada por RGD após 30 dias de implantação subcutânea, indicando um melhoramento significativo na capacidade do anfitrião em degradar a superficie modificada de matrizes de fibroina de seda quando comparado com controlos não tratados. A Fig. 13C mostra quantitativamente um aumento significativo de 63% na deposição de colagénio dentro das matrizes de fibroina modificada por RGD, como comparado com os controlos não tratados demonstrando novamente a capacidade da matriz de seda modificada em suportar a célula anfitriã e crescimento de tecido. A Fig. 13D mostra a coloração H&E de um fio de fibroina de 36 fibras extraídas implantado intra-muscularmente no abdominal de um rato Lewis. As imagens são mostradas a 40x e 128x para matrizes não modificadas e modificadas por RGD. Os resultados mostram, qualitativamente, que a modificação por RGD aumentou dramaticamente a infiltração de células e tecido nos 30 dias in vivo. Ao contrário da sutura de seda entrançada negra ou sutura de seda virgem, não foram observados encapsulamentos periféricos ou células plasma. Comparado com os implantes subcutâneos, foi observada pouca ou nenhuma infiltração de célula e deposição de colagénio nos controlos não tratados, 27/98 indicando o efeito do local de implantação adicionalmente à modificação de superfície. A Fig. 13E é uma representação de perda de massa in vivo de dois grupos de modificação diferente comparado com controlos não tratados. A modificação por RGD, seguida por uma modificação de plasma de gás aumentou significativamente (p<0,05) a extensão da degradação após 90 dias de implantação intra-muscular. Contudo, parece que a degradação foi mais agressiva no ambiente subcutâneo como comparado com ambiente intra-muscular, como foi esperado. A Fig. 14 ilustra análise de gel electroforético de amplificação RT-PCR de marcadores seleccionados ao longo do tempo. O gel mostra supra-regulação nos tipos I e III dos níveis de expressão normalizados para o gene regulador, GAPDH por crescimento de célula estromais da medula óssea na Matriz 2 durante 14 dias em cultura. O colagénio tipo II (como um marcador de cartilagem) e sialoproteina óssea (como um marcador da formação de tecido ósseo) não foram detectados indicando uma resposta de diferenciação específica de ligamento por BMSC quando cultivado com Matriz 2.

As Figs. 15A e 15B ilustram uma única corda de Matriz 1 (não inoculada no momento da implantação) após seis semanas de implantação in vivo e usada para reconstruir o ligamento colateral médio (MCL) num modelo coelho. A Fig. 15A mostra as fibras de fibroína de Matriz 1 rodeadas por células anfitriãs progenitoras e crescimento de tecido na matriz e em redor de fibras de fibroína individuais visualizadas pela marcação através de hematoxilina e eosina. A Fig. 15B mostra um crescimento de tecido 28/98 colagénio na matriz e em redor das fibras de fibroina individuais visualizadas por coloração tricromo.

As Figs. 16A, 16B e 16C ilustram células estromais da medula óssea inoculadas e crescidas em fibras de colagénio durante 1 dia (Fig. 16A) e 21 dias (Fig. 16B) ; RT-PCR (Fig. 16C) e análise electroforética de gel de colagénio I e em expressão vs. o gene regulador GAPDH: a = Colagénio I, dia 14; b = Colagénio I, dia 18; c = Colagénio III, dia 14; d = Colagénio III, dia 18; e = GAPDH, dia 14; f = GAPDH, dia 18. Colagénio tipo II (como marcador para cartilagem) e sialoproteina óssea (como marcador de formação de tecido ósseo) não foram detectados indicando uma resposta de diferenciação especifica de ligamento. A Fig. 17 ilustra um RT-PCR quantitativo em tempo real aos 14 dias que produziu um rácio transcrito de colagénio I para colagénio III, normalizado para GAPDH, de 8,9:1. A Fig. 18A e Fig. 18B são secções coloradas com H&E de 6 conjuntos de (A) sutura de seda entrançada negra 2-0 e (B) seda modificada com RGD na superfície (36 fibras/conjunto), respectivamente, 30 dias após a implantação intra-muscular. A Fig. 18C é seda modificada por RGD pré-inoculado com BMSC durante 4 semanas antes da implantação. A Fig. 18A mostra uma reacção de corpo estranho típica e extensa à sutura de seda entrançada negra (Ethicon, Inc.) comercialmente disponível onde não pode ser observado nenhum crescimento ou infiltração de célula. A Fig. 18B demonstra a capacidade de seda fabricada para promover o crescimento de célula e tecido. As Figs. 18A, 18B e 18C ilustram a resposta de tecido às construções de fibra de seda que são revestidas com cera (Fig. 18A) , sem sericina e revestidas com RGD (Fig. 18B) , 29/98 e sem sericina e inoculadas com células estaminais adultas progenitoras (Fig. 18C).

As Figs. 19 A-D mostram imagens de secções marcadas com H&E a 4 0X (fila superior , Fig. 19A e Fig. 19B) e 128X (fila inferior, Fig. 19C e 19D) de dois fios (4x3x3 e 12x3), cada um contendo o mesmo número de fibras, mas organizado de forma diferente com hierarquias especificas após a implantação num modelo rato durante 30 dias. A indicação dos resultados é que o design do fio e estrutura podem influenciar a extensão da célula e crescimento do tecido uma vez que a construção de fio 12x3 permite o crescimento, enquanto parece que o 4x3x3 o ultrapassou.

As Figs. 20 A, B e C são imagens de (A) fibra única do tecido não tecido obtido via húmida extraída após formação de tecido (as fibras podem ser primeiro extraídas e formadas em não tecido - informação não mostrada) , (B) um tecido de malha produzido a partir de uma forma de cadeia costurada, usando um fio de 12 fibras extraído após a formação de tecido, e (C) um tecido produzido a partir de um fio de 12 fibras pré-extraídas com um fio de 36 fibras pré-extraídas que se dirige para a direcção esquerda. A Fig. 21 é um gráfico de fluxo esquemático dos vários métodos e sequências que podem ser empregues para criar uma matriz de seda de fibroína biodegradável e biocompatível. Por exemplo, extrair uma única fibra, dobrar em fios e tecer em tecidos OU dobrar fios, torcer fios dobrados, formar tecido e de seguida extrair. Um número quase infinito de combinações existe, mas tudo vai depender da hierarquia do fio, o número de fibras por nível e a TPI por nível como mostrado nas Tabelas 4, 6, 7, e 8 . 30/98

DESCRIÇÃO DETALHADA

Nos métodos descritos com maior detalhe, abaixo, as fibras de fibroina de seda são alinhadas numa orientação paralela; as fibras podem permanecer numa orientação estritamente paralela, ou podem ser torcidas ou, pelo contrário, entrelaçadas para formar um fio. 0 fio pode incluir qualquer número de hierarquias, começando no nivel de fibras e expandindo através do conjunto, filamento, corda, etc., níveis. 0 entrelaçamento pode ser provido em cada nível. Além disso, a sericina é extraída das fibras de seda em qualquer ponto da hierarquia até ao ponto onde o número de fibras excede aquele, no qual, a solução de extracção pode penetrar em todo o fio. 0 número máximo de fibras de fibroina do bicho-da-seda (20/22 denier como adquirido) que pode ser combinado e extraído com sucesso é cerca de 50 (Tabela 4) . Estes fios formam uma construção de fibra a qual é incorporada no implante de tecido para uso, por ex., na geração de rede de tecido mole para reparações tais como reparar hérnia, reconstrução de chão abdominal e suportes da bexiga. A formação das construções da fibra será debatida no contexto das aplicações exemplares, em baixo.

Apesar de muito do debate que se segue ser dirigido à matriz com base na fibra de seda (isto é, construção, suporte) para a produção de um ligamento cruzado anterior (ACL), uma variedade de outros tecidos, tais como outros ligamentos e tendões, cartilagem, músculo, osso, pele e vasos sanguíneos, podem ser formados usando uma nova matriz com base em fibra de seda. No caso do ACL, foi descrito um grande fio (540-3900 fibras por fio, antes de dobrar em paralelo; ver Tabela 8 e 11) com vários níveis hierárquicos de entrelaçamento e propriedades fisiológicas 31/98 relevantes. Adicionalmente à matriz ACL com base em fibra de seda, várias configurações de fio mais pequenas (1-50 fibras de seda) (Tabela 1, 4 e 5) com propriedades fisiológicas relevantes após combinar em paralelo ou numa formação de tecido especifico, podem servir como matrizes de tecido para formação de tecido orientada (Fig. 2A-B). Adicionalmente às matrizes de seda para formação de tecido orientada ou fabricada, este trabalho é dirigido especificamente para produzir uma variedade de tecido de matrizes com base em fibras de seda de estruturas de suporte para reparação de tecido orientado (por ex., reparação de hérnia, suportes da bexiga para incontinência urinária) (Fig. 2A-B e Fig. 20A-C).

As construções (isto é, tecidos ou fios) podem ser uma superfície modificada ou inoculada com as células adequadas (Fig. 7A-D, Fig. 8A-B e Fig. 16A-C) e exposta à estimulação mecânica adequada, se necessário, para proliferação e diferenciação no ligamento desejado, tendão ou outro tecido de acordo com as técnicas acima descritas.

Adicionalmente, a presente invenção não é limitada à utilização das células estromais da medula óssea para inocular na construção da fibra, e outras células progenitoras, pluripotentes e estaminais, tais como aquelas no osso, músculo e pele por exemplo, pode também ser usados para diferenciar em ligamentos e outros tecidos.

Os tecidos podem também ser formados a partir de construções similares de filamentos purificados, e usados em várias aplicações. Os tecidos podem ser divididos em várias classes, incluindo tecido, não tecido, tecidos tricotados, e tecidos ligados por costura, cada um com 32/98 vários subtipos. Cada um desses tipos é útil como um implante em circunstâncias particulares. Ao debater sobre estes tecidos com base em seda, descrevemos a seda natural, por ex., de Bombyx mori, como "fibra de fibroína." As fibras devem ser pelo menos de um metro de comprimento, e este comprimento deve ser mantido ao longo de todo o processo para facilitar o seu manuseamento durante o processamento e incorporação no tecido. Dado que um fio pode ser definido como um conjunto de fibras torcidas ou, pelo contrário, mantidas em conjunto num filamento continuo e que uma única fibra de fibroína, como acima definido, é compreendida de vários broins dobrados, por vezes, a partir de vários casulos, uma única fibra de fibroína pode ser denominada como "fio". Do mesmo modo, as fibras de fibroína são torcidas em conjunto ou, pelo contrário, entrelaçadas para formar um "fio". Os fios são usados para tecer ou tricotar tecidos para uso na invenção. Num procedimento alternativo, os fios de seda são desagregados em comprimentos mais curtos (5 mm a 100 mm) ou em filamentos de fibroína de seda. Estes filamentos podem então ser dispostos (húmidos) para formar um tecido não tecido (Fig. 20A).

Quando os fios são formados num tecido, a tensão (força) exercida nos fios (normalmente, via maquinaria) não é superior ao limite de elasticidade do fio (Fig. 3A-D). Consequentemente, os fios são manuseados a velocidades mais baixas e sob pequenas cargas que são fios, que são normalmente usados em, por ex., produção de têxteis quando formando o tecido de modo a preservar a integridade das fibras de fibroína frágeis expostas. Do mesmo modo, os pontos de contacto entre a maquinaria de manuseamento e o fio são desenhados para evitar ângulos agudos e interacções de alta fricção de modo a evitar o 33/98 afrouxamento e desfiamento das fibras em redor do perímetro do fio (Fig. 4A-C). Várias aplicações de implantes de tecido são conhecidos nas técnicas médicas e cirúrgicas. Um exemplo é como suporte numa reparação de hérnia. Para tal reparação, um tecido, a maior parte normalmente uma malha-urdidura com um ponto de malha desejado (por ex., um ponto atlas concebido para evitar um desfiamento da rede durante o corte), é cosido (ou por vezes agrafado ou colado) ou simplesmente disposto no local sem tensão, no interior da parede abdominal após ser reparado com suturas convencionais. Uma função do tecido de malha-urdidura é providenciar um suporte a curto prazo para a reparação. Numa forma de realização preferida da presente invenção, as fibras de fibroína no tecido promovem o crescimento de células e subsequente crescimento de tecido no próprio tecido (Fig. 13A e 13D), assim como através dos interstícios do tecido formados durante a tecelagem e na região com necessidade de reparação. Esta forma de realização visa reforçar permanentemente a área danificada através do crescimento de tecido funcional e remodelar à medida que a matriz de seda se degrada (Fig. 13A, B e C).

Os tecidos de reforço de reparações são usados em situações semelhantes para a reparação de qualquer parte da parede abdominal, em particular na reparação de hérnia e reconstrução do chão abdominal, ou na reparação ou suporte de outras paredes e septos no corpo, por exemplo do peito, ou dos órgãos tais como o coração ou a bexiga, em particular após a cirurgia ou remoção de tumor. Os tecidos implantáveis podem também ser usados para suporte de bexigas ou outros órgãos internos (incluído mas não limitado aos intestinos, as ureteres ou uretra, e o útero) 34/98 para retê-los nas suas posições normais após cirurgia, danos ou desgaste natural como um resultado da idade ou gravidez, ou para posicioná-los numa localização adequada. "Órgão" aqui inclui órgãos "sólidos", tais como figado, e órgãos tubulares como um intestino ou uma uretra. Tecidos, especialmente tecidos volumosos, tais como alguns tipos não tecido ou aqueles que podem ser criados através de tecelagem ou entrelaçamento tridimensionais (Fig. 4A-C), podem ser usados para preencher cavidades deixadas pela cirurgia para providenciar uma construção de fibras para a qual as células podem migrar ou para a qual as células podem ser pré-anexas (por ex., para melhorar a taxa de reparação). Os locais de uso incluem cavidades nos tecidos moles e tecidos duros, tais como osso. Em outros casos, os implantes de tecido são usados para evitar adesões, ou para evitar a fixação e/ou crescimento de células; isto pode ser atingido através da modificação da superfície da matriz de fibroina de seda ou através da fixação de um fármaco ou factor à matriz. 0 implante de tecido com base em fibroina de seda da invenção pode ser facilmente modificado de várias formas para melhorar a cicatrização ou reparação no local. Estas modificações podem ser usadas sozinhas ou em combinação. Os implantes de tecido com base em fibroina de seda da invenção podem ser modificados na superfície para suportar a união e disseminação de células, o crescimento e remodelação do tecido e células, e biodegradação do dispositivo através do uso de união de péptido RGD ou irradiação do plasma de gás (Figs. 13A-E). Os implantes de tecido podem ser modificados para realizar os factores de união da célula, tais como o péptido bem conhecido "RGD" (ácido aspártico-arginica-glicina) ou qualquer um dos muitos materiais de promoção de fixação sintéticos e 35/98 naturais, tais como soro, factores de soro e proteínas incluindo fibronectina, sangue, medula, grupos, determinantes, etc., conhecidos na literatura. Tais materiais podem ser em qualquer uma das classes bioquímicas normais de tais materiais, incluindo sem limitação, proteínas, péptidos, carbohidratos, polissacarídeos, proteoglicanos, ácidos nucleicos, lípidos, moléculas orgânicas pequenas (inferiores a cerca de 2000 Daltons) e combinações destas. Tal modificação de plasma pode melhorar a funcionalidade da superfície de tecido e/ou carga sem afectar as propriedades mecânicas dos materiais a granel. Os implantes de tecido podem ser irradiados de plasma de gás após a extracção de sericina sem comprometer a integridade das fibras de fibroína de seda de onde foi extraída a sericina (Tabela 9).

Adicionalmente, os implantes de tecido podem ser tratados de modo a administrar um fármaco. A fixação do fármaco no tecido pode ser covalente, ou covalente via ligações degradáveis, ou por qualquer outra forma de ligação (por ex., atracção de carga) ou absorção. Qualquer fármaco pode ser potencialmente usado; exemplos não limitativos de fármacos incluem antibióticos, factores de crescimento tais como proteínas morfogénicas ósseas (BMP) ou factores de diferenciação de crescimento (GDF), inibidores de crescimento, quimioatraentes e ácidos nucleicos para transformação, com ou sem materiais de encapsulamento.

Noutra modificação, as células podem ser adicionadas ao implante de tecido antes da sua implantação (Fig. 7A-D, Fig. 8A-B, e Fig. 9A-B) . As células podem ser inoculadas/absorvidas em ou para o implante de tecido. As células podem também, ou em adição, serem cultivadas no implante de tecido como um primeiro passo na direcção da 36/98 substituição ou melhoria do tecido. As células podem ser de qualquer tipo, mas as células alógenas, de preferência dos tipos de células estaminais "imunoprotegidos", "imunoprivilegiados", são preferidas, e as células autólogas são particularmente preferidas. As células são seleccionadas para serem capazes de proliferar nos tipos de células requeridas ou na construção de fibras (Fig. 9A-B) .

Outra classe de modificação é a incorporação de outros polímeros (por ex., na forma de uma fibra ou gel) para o implante de tecido para providenciar as propriedades estruturais específicas ou para modificar as superfícies nativas da fibroina da seda e as suas caracteristicas biológicas (ver a Fig. 16A-C: inoculação de fibras de colagénio com BMSC). Num tipo de incorporação, as fibras e fios de seda e de outro material são misturados no processo de produção do tecido. Noutro tipo, as fibras com base em seda, fios ou tecidos são revestidos ou envolvidos com uma solução ou com fibras de outro polímero. A mistura pode ser executada (i) de forma aleatória, por exemplo por dobragem (1 ou várias fibras de) seda e o polímero em conjunto paralelamente antes de torcer ou (ii) e uma forma organizada tal como no entrelaçamento onde as fibras ou fios, sendo inseridas no fio ou tecido maior, podem alternar as posições de alimentação da máquina criando um resultado previsível. 0 revestimento ou envolvimento pode ser executado ao entrelaçar ou cablar num núcleo central, onde o núcleo pode ser o polímero, a fibroina de seda ou um composto de ambos, dependendo do efeito desejado. Alternativamente, um fio pode ser envolvido numa forma controlada sobre o outro polímero, onde o fio de envolvimento pode ser envolvido para estabilizar a estrutura. Qualquer polímero biocompatível é 37/98 potencialmente usável. Exemplos de polímeros adequados incluem proteínas, particularmente proteínas estruturais tais como colagénio e fibrina, e polímeros sintéticos degradáveis que providenciam força, tais como polímeros que compreendem anidridos, ácidos hidróxi, e/ou carbonatos. Os revestimentos podem ser providos como géis, particularmente géis degradáveis, formados por polímeros naturais de polímeros sintéticos degradáveis. Os géis que compreendem fibrina, colagénio, e/ou proteínas da membrana basal podem ser usados. Os géis podem ser usados para administrar células ou nutrientes, ou para proteger a superfície da fixação da célula. Além disso, as proteínas ou péptidos podem ser covalentemente unidos às fibras ou as fibras podem ser modificadas por plasma num gás carregado (por ex., nitrogénio) para depositar grupos aminos; cada um desses revestimentos suporta a fixação e crescimento da célula, uma vez que a seda é normalmente hidrofóbica, e esses revestimentos tornam as fibras mais hidrofílicas.

Exemplos não descritivos de algumas destas formas de realização são descritos nos exemplos, em baixo.

Foi seleccionada uma disposição húmida para um protótipo de formação de tecido porque é o procedimento mais simples. 0 produto não tecido (Fig. 20A) foi criado a partir de uma única fibra de fibroína de seda antes da extracção ao nivel do tecido. 0 produto é correspondentemente um material relativamente barato, e pode ser usado em aplicações onde a sua baixa resistência à tracção seria satisfatória. Quando é necessária mais resistência à tracção, um material não tecido pode ser unido em conjunto, como será bem conhecido para tecidos e papel, ou mineralizado para reparação óssea. 38/98

Alternativamente, o material de fio de seda produzido pela extracção da sericina pode ser formado numa variedade de fios mais complexa, como acima descrito. 0 tamanho e design do fio podem ser usado para controlar a porosidade, independentemente das capacidades da máquina não tecido. Os fios podem também ser tricotados (Fig. 20B) ou tecidos (Fig. 20C) num tecido. Um tipo de tecido de interesse é uma simples rede, semelhante à gaze, que pode ser utilizado por si só, (por ex., como um hemostato) , ou para administrar células ou fármacos (por ex., um factor de coagulação) a um local, numa situação onde a flexibilidade é importante.

Quando é importante a força, um tecido de malha-urdidura (Fig. 20B), incluindo os tricots e jerseys familiares, com uma elasticidade que pode ser controlada através do desenho hélico do fio usado no tecido, e resistência à tracção normalmente substancial, pode ser muito útil para aplicações (por ex., reparação da hérnia, suportes da bexiga, reconstruções de chão pélvico, etc.) requerendo provisão de apoio mecânico para uma duração significativa de tempo, tal como meses.

Noutras aplicações, o material deve ter um pouco de elasticidade e maior resistência. Para tais tecidos, uma tecelagem densa de fios espessos é adequada, produzindo um material semelhante aos tecidos tecido padrão (Fig. 20C) . Tal material pode opcionalmente ser suplementado por um tratamento de revestimento ou um tratamento de calor para ligar os pontos de intersecção dos segmentos de fio, evitando deste modo o desfiamento e o esticamento. 0 tratamento de calor não deve totalmente desnaturar a proteina de seda. 0 tecido pode opcionalmente ser cosido, colado ou agrafado no local, uma vez que é actualmente 39/98 realizado com rede de polipropileno. 0 implante, como qualquer um dos outros tipos debatidos, pode ser revestido com vários materiais para aumentar a cicatrização local e processo de crescimento do tecido, e/ou com um revestimento para evitar a adesão do local da reparação para as vísceras.

Noutra alternativa, o tecido, rede, não tecido, malha ou outro material de reparação podem ser feitos de seda não extraída, e de seguida, o tecido acabado pode ser extraído como aqui descrito (Fig. 21) (por ex., com solução detergente alcalina a uma temperatura elevada) para remover as sericinas imunomodulatórias do material. Como outra alternativa, a extracção da sericina pode ocorrer a uma fase intermédia, tal como uma extracção do fio formado, conjunto, ou filamento, até agora como o número de fibras não excede aquele no qual a solução de extracção pode penetrar em todas as fibras (ver Fig. 21 para opções não limitativas). 0 debate acima descreveu a produção de tecidos compostos por fio, onde a forma mais típica de fio nas formações de tecido debatidas vai derivar das fibras de fibroína de bicho-da-seda, torcendo em conjunto numa forma organizada e extraindo sericina. Muitas das geometrias de fio e métodos de formação de fio podem também ser usadas como descrito (Tabelas 4, 5, 6, 7 e 8) . Tais métodos podem incluir a formação dos conjuntos não torcidos de fibras de fibroína, unidas em conjunto ao envolver os conjuntos com seda ou outro material como acima debatido. Qualquer um desses fios pode, como acima descrito, ser formado por fibras de seda misturada com outros materiais. Ainda, as fibras podem ser entrelaçadas, por ex., cabladas, torcidas, entrelaçadas, malhadas, tricotadas, etc. (Ver as 40/98 é aqui usado

Figs. 2A e B e 21) . 0 termo, "entrelaçado," para indicar uma estrutura de repetição organizada (isto é, não aleatória) em termos de como as fibras entram em contacto e se ligam umas com as outras. A mistura pode também ocorrer em altos níveis de organização, tal como o uso de filamentos de materiais diferentes para formar um fio mais espesso, ou usando fios de materiais diferentes na tecelagem ou tricotagem. Em cada caso, o material final incluiria seda purificada essencialmente sem sericina como um componente significativo, usada para uma ou toda a sua resistência e biocompatibilidade e (por ex., a longo prazo) caracteristicas de degradação (Fig. 11A-B) . 0 outro polímero ou polímeros são seleccionados pela sua biocompatibilidade, suporte (ou inibição através de rápida formação de tecido em locais desejados) de fixação ou infiltração de células (Fig. ΙβΑ-C), perfil de degradação in vivo, e propriedades mecânicas. Polímeros biodegradáveis incluem qualquer um dos polímeros biodegradáveis conhecidos, incluindo produtos naturais tais como proteínas, polissacarídeos, glicosaminoglicanos, e polímeros derivados naturais, por ex., celuloses; e polímeros e copolímeros sintéticos biodegradáveis, incluindo ácidos polihidroxi, policarbonatos, polianidridos, algumas poliamidas, e copolímeros e misturas dos mesmos. Em particular, o colagénio e elastina são proteínas adequadas.

As construções/matrizes de tecido com seda usadas para a reparação de tecido podem ser tratadas de modo a que contenham células no momento da implantação (Fig. 7A-D, Fig. 8A-B, Fig. 9A-B, e Fig. 18C) para melhorar os resultados de tecido in vivo. As células podem ser 41/98 e mais xenogénicas, mais preferencialmente alogénicas, preferencialmente autólogas. Qualquer tipo de célula é potencialmente de uso, dependendo na localização e a função pretendida do implante. As células pluripotentes são preferidas quando os sinais de diferenciação adequados estão presentes ou são providos no ambiente. Outros tipos de células incluem células osteogénicas, fibroblastos, e células do tipo de tecido do local de implantação.

Apesar da seda de Bombyx mori e ouros bichos-da-seda convencionais ter sido descrita, qualquer fonte de seda ou proteínas derivadas da seda pode ser usada na invenção, desde que não provoque mais do que uma reacção de corpo estranho suave na implantação (isto é, é biocompatível) (ver Fig. 18B e C) . Esta inclui, sem limitação, sedas de bichos-da-seda, aranhas, e células cultivadas, particularmente células geneticamente fabricadas, e plantas e animais transgénicos. A seda produzida por clonagem pode ser de sequências totais ou parciais de genes da linha da seda nativa, ou de genes sintéticos que codificam sequências tipo seda.

Enquanto em muitos casos apenas um único tipo de tecido será usado na formação de um dispositivo médico ou prótese, pode ser útil, em alguns casos, usar dois ou mais tipos de tecido num único dispositivo. Por exemplo, na reparação da hérnia, é desejável fazer com que o lado do tecido do tecido de reparação atraia células, enquanto a face peritoneal deverá repelir células de modo a evitar adesões. Este efeito pode ser atingido por ter uma camada de seda que não atrai células, e outra camada que sim (por exemplo, uma camada não tratada e uma camada com RGD, como no exemplo, em baixo). Outro exemplo inclui a formação de um suporte de bexiga. 0 suporte básico deve ser adaptado e 42/98 de alguma forma elástico, e ter uma longa vida útil projectada. Contudo, a face do suporte mais próximo da bexiga deve ter a menor textura possível. Isto pode ser conseguido ao colocar uma camada de tecido, não tecido ou tecido tricotado fina mas firme, fabricado a partir de fio com um pequeno diâmetro (por ex., uma única fibra), da invenção no suporte onde estará em contacto com a bexiga. 0 tecido não tecido deve ser tão pequeno quanto possível (denier). Várias outras situações que precisam de dois ou mais tipos de tecido são possíveis.

Exemplos das estruturas acima descritas foram fabricados e avaliados numa série de testes. Num primeiro exemplo, um tecido foi formado a partir de fibrilhas de seda purificadas. Em primeiro lugar, a seda pura foi processada em fibrilhas de fibroína purificadas. As fibras de bicho-da-seda puras foram extraídas numa solução aquosa de 0,02 M Na2CC>3 e 0,3% peso por volume de solução IVORY com sabão durante 60 minutos a 90 graus C. as fibras extraídas foram lavadas com água para completar a extracção da proteína de sericina tipo cola. A suspensão resultante de fibrilhas foi obtida via húmida num filtro, perfurado com agulha, e seca (Fig. 20A) . 0 material felpudo resultante parecia lã ao toque, e era muito poroso. Foi suficientemente interligado por enredamento e agulhamento, pelo que foi facilmente manuseado e cortado numa forma desejada.

Noutro exemplo, as fibrilhas de fibroína de seda purificada foram tratadas com agentes que atraem células (Tabela 9) . Em primeiro lugar, os fios foram feitos ao torcer em conjunto as fibras purificadas de fibroína de seda. Alguns fios foram feitos de filamentos que foram derivados com o péptido RGD para atrair células, usando procedimentos descritos em Sofia et al, J. Biomed. Mater. 43/98

Res. 54: 139-148, 2001. As secções de fios tratados e não tratados (sutura de seda entrelaçada negra) foram implantadas na parede abdominal de ratos (Fig. 18A-C). Após 30 dias de implantação, as suturas entrelaçadas negras com conjuntos de fibrilha compactos, com infiltração de células entre os conjuntos de fibrilha mas não dentro delas. Em contraste, os conjuntos de fibrilha tratados com RGD foram extensivamente invadidos por células anfitriãs, e foram expandidos e não compactados (Fig. 13A-E, 18B), mas não foram ainda significativamente degradados (Fig. 13A-E).

Este exemplo ilustra o uso de derivatização para controlar a taxa de degradação de fibrilhas de fibroina de seda implantadas, assim como demonstrar a capacidade de fibrilhas derivadas para recrutar células para a estrutura tipo tecido. Claramente, uma especificidade maior de recrutamento pode ser obtida ao usar um atractivo mais especifico. Técnicas similares (derivatização química) ou métodos mais simples, tais como absorção, adsorção, revestimento, e embebimento, podem ser usados para providenciar outros materiais ao local de implantação.

Cada uma das amostras indicadas nas Tabelas em baixo, foi preparada de acordo com a descrição acima, em que a sericina foi removida após 60 minutos a uma temperatura de 90° + /- 2°C. Usando a temperatura neste intervalo para o período de tempo suficiente, foi descoberto que produz fibras das quais a sericina é substancialmente removida (Fig. 1A-C, Tabela 1, 2, 3) (para produzir uma construção de fibra que é substancialmente livre de sericina de modo a não produzir uma resposta imunologicamente significativa e não impede significativamente a biodegradabilidade da fibra) enquanto preserva substancialmente a integridade 44/98 mecânica da fibroína (Tabela 1) . Note-se que quando as temperaturas atingem os 94 °C (Tabela 1) a UTS não é dramaticamente afectada; contudo, a rigidez diminuiu significativamente indicando uma seda termossensivel a temperaturas de 94 °C e superiores. As fibras em cada grupo foram manualmente endireitadas (isto é, tornadas paralelas) ao puxar as extremidades das fibras; alternativamente, o endireitamento pode facilmente ter sido executado via um processo automatizado. A força aplicada foi marginalmente superior do que foi requerido para endireitar o grupo.

As mesmas designações geométricas em todas as Tabelas reflectem as seguintes construções: # de fibras (tpi no nivel de fibra na direcção S) x # de grupos (tpi no nivel de grupo na direcção Z) x # de conjuntos (tpi no nivel de conjunto na direcção S) x # de filamento (tpi no nivel de cultura na direcção Z) x etc., em que as amostras são torcidas, entre niveis excepto indicado pelo contrário. A designação torção por polegada, tais como lOs x 9z tpi, reflecte (o número de torções das fibras/polegada dentro do grupo) x (o número de torções dos grupos/polegada dentro do conjunto) . Em cada amostra, uma inclinação da torção é substancialmente superior do que é normalmente encontrado nos fios convencionais que são torcidos a uma baixa inclinação, meramente destinado a manter em conjunto as fibras. Aumentando a inclinação das torções (isto é, aumentando os torções por polegada) diminui a resistência à tracção, mas também diminui ainda a rigidez e aumenta o alongamento na ruptura da construção.

A resistência à tracção (UTS), percentagem de alongamento na ruptura (% Along), e rigidez foram todos medidos usando uma máquina de teste de material servo-hidráulico INSTRON 45/98 8511 com software FAST-TRACK, que forçou a amostra na taxa elevada de -100% de comprimento da amostra por segundo numa análise puxar até falhar (pull-to-failure). Em outras palavras, até ao ponto de falha, a amostra é esticada para duplicar o seu comprimento a cada segundo, o que restringe bastante a capacidade da amostra em relaxar e recuperar antes da falha. Contudo, a Fig. 5A-B demonstra o efeito que a taxa de tensão pode ter em propriedades mecânicas observadas, assim como condições de teste húmidas ou secas que são mostradas (Fig. 6A-B) para ter um efeito dramático na matriz de seda UTS e rigidez. A consistência é necessária se forem feitas comparações os conjuntos de dados. Os dados resultantes foram analisados usando software Instron Series DC. A resistência à tracção é o pico de tensão da curva de pressão/tensão resultante, e a rigidez é a inclinação da linha de pressão/tensão até ao limite de elasticidade. Excepto se especificado, pelo menos um N=5 foi usado para todos os grupos testados para gerar médias e desvios padrão. Os métodos estatísticos padrão foram empregues para determinar se as diferenças estatisticamente significativas existiam entre os grupos, por ex., teste t de Student, teste one-way ANOVA.

As fibras de fibroína nas amostras em todas as Tabelas e Figuras acima (e em toda esta descrição) são nativas (isto é, as fibras não são dissolvidas e reformadas); a dissolução e reformulação das fibras resultam numa estrutura de fibras diferente com as propriedades mecânicas diferentes após reformação. Surpreendentemente, estas amostras demonstram que os fios das fibras de fibroína de seda, a partir das quais a sericina foi completamente ou quase completamente removida, podem possuir altas resistências e outras propriedades mecânicas que tornam os fios adequados para 46/98 várias propriedades biomédicas (Tabela 4, Fig. 2A-D e Fig. 20A-C) , tais como para formar uma construção de fibra ou suporte para substituição de ligamentos, reparação de hérnia ou reconstrução de chão pélvico. Previamente, acreditava-se que a fibroina necessitava de ser dissolvida e extrudada numa fibra reformulada para providenciar as propriedades mecânicas desejadas. A resistência à fadiga foi geralmente descoberta sofrer nas ditas fibras de fibroina reformada. Os métodos da presente invenção permitem a remoção de sericina sem uma perda significativa de resistência (Tabelas 1 e 4; Figs. 3A-D e 4A-B).

Na Tabela 8, as amostras 1 e 2 comparam as propriedades de um grupo de 3 fibras (amostra 1) com aquelas de um grupo de 4 fibras (amostra 2) . A amostra 2 tinha uma configuração quadrada de fibras, enquanto as fibras de amostra 1 tinham uma configuração triangular. Como mostrado na Tabela, a adição da fibra extra na amostra 2 baixou a rigidez por fibra da amostra que demonstra a capacidade de controlar as propriedades do fio e tecido através do design hierárquico. A Tabela 4 ilustra os efeitos de configurações diferentes das construções de fibra cabladas e uma geometria de fibras torcidas. Note-se, em particular, que as amostras 7 e 8 incluem o mesmo número de fibras e o mesmo número de níveis geométricos. A geometria de fibras torcidas da mostra 8 oferece uma UTS maior e maior rigidez, enquanto a geometria cablada da amostra 7 tem menor resistência e rigidez inferior. Das amostras 7-9, a geometria cablada da amostra 7 tem o maior rácio de resistência para rigidez; para uso como uma construção de fibra ACL é desejado um rácio elevado de 47/98 resistência para rigidez (isto é, possuindo uma elevada resistência e baixa rigidez).

As Tabelas 1 e 4 demonstram o efeito de extracção da sericina nas fibras. Todas as amostras foram imersas numa solução de extracção, como descrito na Tabela 1. As amostras 1-5 foram imersas num banho à temperatura ambiente, a 33 °C e 37 °C. Acredita-se que estas temperaturas sejam muito baixas para providenciar uma extracção de sericina significativa. As amostras 6-9 foram extraídas a 90 °C, onde a extracção de sericina completa acredita-se ser atingida, mas variando. Do mesmo modo, a amostra 10 foi extraída na temperatura ligeiramente superior de 94 °C. Os dados sugerem que 30 a 60 minutos a 90 °C é suficiente para remover significativamente sericina (ver Tabelas 2 e 3) e que 94 °C pode danificar a estrutura de proteína de seda como mostrado por uma diminuição dramática na rigidez.

Finalmente, as amostras 11 a 16 têm geometrias cabladas comparáveis; as fibras de amostras 12, 14 e 16 foram extraídas, pelo que as fibras de amostras 11, 13, e 15 não. Como pode ser visto na Tabela, a extracção parece ter tido pouco efeito nas resistências à tracção (elevadas) por fibra.

As fibras da amostra 10 da Tabela 4 foram sujeitas ao procedimento de rotação - contracção, em que as fibras foram torcidas numa direcção e depois na direcção oposta, rapidamente; as fibras foram então aquecidas para prenderem na estrutura torcida e testada não extraída. A resistência e rigidez do fio resultante foram comparativamente inferiores do que a maioria dos outros fios não extraídos testados. Contudo, as Tabelas 48/98 6 e 7 mostraram a capacidade notável de fibroínas, pós-extracção para suportarem até 30 TPI. A Tabela 6 mostra o efeito de ordenação que o TRI tem nas matrizes de seda, provavelmente devido à ordenação da estrutura multi-filamento após a extracção. A Fig. 10 demonstra as propriedades de um grupo de 30 fibras de fibroina paralelas inoculadas e não inoculadas em condições de cultura durante 21 dias. Estas três amostras exibem propriedades mecânicas similares, reflectindo, desse modo, pouca, se alguma, degradação de matrizes de seda devido ao crescimento de célula depois disso ou devido ao tempo in vitro. Os valores de rigidez são provavelmente muito baixos nesta experiência na comparação com as outras amostras como um resultado dos 21 dias de incubação húmida anterior ao teste mecânico (ver Tabela 5).

Tabela 4, as amostras 14-16 são todas as amostras entrelaçadas. As fibras da amostra 14 foram entrelaçadas a partir dos oito portadores, com um carretel montado em cada portador, em que duas fibras foram retiradas de cada carretel. As fibras da amostra 15 foram retiradas a partir dos 16 portadores, com um carretel montado em cada portador; novamente, duas fibras foram retiradas de cada carretel. Finalmente, a amostra 16 foi formada a partir de 4 fios, cada fio compreendendo 3 grupos torcidos de quatro fibras (providenciando um total de 12 fibras por fio) ; cada um dos fios foi retirado a partir do carretel e portador separado. A Tabela 9 demonstra o efeito da modificação de superfície. A designação "PBS" reflecte que as amostras foram imersas numa solução salina fosfato-tamponada por 49/98 cerca de 24 horas antes do teste. 0 efeito de exposição das amostras à solução salina foi medido e provida uma indicação de que a construção de fibra pode manter as suas caracteristicas mecânicas e substancialmente preservar a estrutura de proteína inerente num ambiente salino (por ex., dentro do corpo humano). A designação "RGD" reflecte que as amostras foram imersas numa solução salina arg-gly-asp (RGD) por cerca de 24 horas antes do teste. A RGD pode ser aplicada à construção para atrair células para a construção e deste modo promover o crescimento de células depois disso. Consequentemente, qualquer efeito de RGD nas propriedades mecânicas da construção é algo de interesse, apesar de ter sido aparente nenhuma degradação significativa da construção.

Consequentemente, estas amostras oferecem evidência que prolongou a exposição a uma solução salina ou esterilização de ácido de etileno gasoso ou para uma solução RGD resulta em pouca, se alguma, degradação das propriedades do material das construções da fibra. Assim, os dados associados com amostras 28 e 29, em que a hierarquia geométrica foi estendida a um nível maior, revelam que a UTS/fibra diminui à medida que níveis maiores (e uma contagem de fibra geral aumentada) são atingidos. Este é um efeito de design hierárquico (Tabela 8) em vez da modificação da superfície.

Tabela 4, as amostras 18 à 23 foram esticadas sob aproximadamente 3 kg de força constante durante 1, 2, 3, 4, 5 e 6 dias, respectivamente, antes de testar para avaliar o efeito da tensão nas propriedades mecânicas ao longo do tempo. A partir dos dados, não parece ser muita, se alguma, mudança nas propriedades do material da construção na medida em que o procedimento de pré- 50/98 tensão é estendido ao longo de períodos de tempo maiores. A amostra 25 foi também "pré-esticada" (após torção) em força de aproximadamente 3 kg para um dia antes do teste; para comparação, a amostra 24, que tinha uma configuração geométrica idêntica não foi pré-esticada. As amostras 24 e 25 revelam, consequentemente, o efeito do pré-tensionamento da construção para remover a folga na estrutura, o que resulta numa redução ligeira em ambas as UTS da construção e o seu alongamento na ruptura. A construção com base em fibra de seda serve como uma matriz para células infiltrantes ou já infiltradas ou inoculadas com células, tais como progenitoras, ligamento ou tendão ou fibroblastos ou células musculares, que podem proliferar e/ou diferenciar para formar um ligamento cruzado anterior (ACL) ou outro tipo de tecido desejado. A nova construção com base na fibra de seda é concebida com fibras em qualquer uma das variedades de geometrias de fio, tal como um cabo, ou uma estrutura entrelaçada, tal como fio torcido, entrelaçado, fio tipo rede ou fio tipo malha. 0 fio exibe propriedades mecânicas que são idênticas ou quase idênticas àquelas de um tecido natural, tal como um ligamento cruzado anterior (ver Tabela 4, 1 em baixo); e variações simples na organização de construção de fibras e geometria podem resultar na formação de qualquer tipo de tecido desejado (ver Tabela 10, em baixo). Alternativamente, uma pluralidade de fios pode ser formada num implante de tecido que é implantado para posicionar ou suportar um órgão. Adicionalmente, o implante pode ser usado para encher as cavidades internas após cirurgia ou 51/98 para evitar as adesões de tecido ou promover a fixação ou crescimento de células.

As células estromais da medula óssea pluripotentes (BMSC) que são isoladas e cultivadas como descrito no seguinte exemplo podem ser inoculadas numa construção de fibras de seda e cultivadas num biorreactor sob condições estáticas. As células inoculadas na construção de fibras, se dirigidas adequadamente, vão submeter-se à diferenciação especifica do ligamento e tendão, formando um tecido viável e funcional. Além disso, as propriedades histomorfológicas de um tecido produto de bioengenharia produzido in vitro, gerado a partir de células pluripotentes dentro da construção de fibra são afectadas pela aplicação directa de resistência mecânica para a construção de fibra durante a geração de tecido. Esta descoberta faculta novas perspectivas importantes na relação entre tensão mecânica, bioquímica e métodos de imobilização de células e diferenciação de células, e tem aplicações na produção de uma ampla variedade de ligamentos, tendões e tecidos in vitro de células pluripotentes.

Uma construção de fibras que compreende as fibras de seda com uma geometria cablada é ilustrada nas Figs. 2C e 2D. A construção de fibras compreende uma hierarquia nos termos da forma que as fibras são agrupadas em paralelo e torcidas e como o grupo resultante é agrupado e torcido, etc., ao longo de uma pluralidade de níveis na hierarquia, como melhor explicado mais adiante. As fibras de seda são inicialmente esticadas em uso paralelo, por exemplo, um suporte contendo grampos com molas que servem como apoios para as fibras. 0 suporte pode ser imerso na solução de extracção de sericina de modo a que os grampos possam 52/98 manter uma tensão constante nas fibras através da extracção, enxaguamento e secagem. A solução de extracção pode ser uma solução detergente alcalina ou detergente e é mantida a cerca de 90 °C. o suporte é imerso na solução durante um período de tempo (por ex., em pelo menos 0,5 a 1 hora, dependendo do fluxo da solução e condições de mistura) gue é suficiente para remover toda ( + /- 0,4% remanescente, por peso) ou substancialmente quase toda a sericina (permitindo um possível resíduo) das fibras. Após a extracção, o suporte é removido de uma solução e as fibras são enxaguadas e secas. As máquinas de torção controladas por computador, cada uma das quais dispõe as fibras ou construções de fibras num perímetro de um disco e roda o disco num eixo central para torcer as fibras (isto é, cablagem) ou construções de fibras torcidas umas nas outras, de acordo com processos padrão usados na indústria têxtil; no entanto, uma taxa de inclinação maior para as torções (por ex., entre cerca de 0 e cerca de 11,8 torções por cm) do que é normalmente produzido nos fios tradicionais. A taxa de cablagem ou torção, contudo, na deve ser tão alta de forma a causar a deformação plásticas das fibras como resultado de uma tensão do balão criada à medida que o fio é libertado do carretel de alimentação antes da torção ou cablagem. A extracção pode ser executada em qualquer nível da construção desde que a solução possa penetrar na construção para remover a sericina de todas as fibras. Acredita-se que o limite superior para o número de fibras numa disposição compacta que pode ainda ser completamente permeada com a solução é cerca de 20-50 fibras. 53/98

No entanto, claro, aquelas fibras podem ser dispostas como um grupo de 20 fibras paralelas ou, por exemplo, como 4 grupos de 5 fibras paralelas, em que os grupos podem ser torcidos, ou mesmo uma construção que compreende um nivel ainda elevado tal como 2 conjuntos de 2 grupos de 5 fibras, em que os grupos e conjuntos podem ser torcidos. Aumentando o número de níveis hierárquicos na estrutura pode também aumentar o espaço vazio, deste modo aumentando potencialmente o número máximo de fibras das quais a sericina pode ser totalmente extraída de 20 a 50 fibras.

Porque a sericina, em alguns casos, é removida da construção após as fibras serem agrupadas ou após ter sido formada uma construção de nível superior, não há necessidade de aplicar cera ou qualquer outro tipo de revestimento mecanicamente protector nas fibras ou no sentido de também formar uma barreira para evitar contacto com a sericina nas fibras; e a construção pode ser livre de revestimentos (particularmente sendo livre de revestimentos que não são totalmente degradados pelo corpo ou que causem uma resposta inflamatória).

Como descrito nos exemplos em baixo, as propriedades mecânicas da fibroína de seda (como ilustrado nas Figs. 1 A, 1B e 1C) foram caracterizadas, e foram derivadas geometrias para formar matrizes aplicáveis para a criação de ACL através de engenharia usando um modelo computacional teórico (ver Fig. 1D) . Uma construção de seis cordas foi escolhida para uso como uma substituição ACL para aumentar a área de superfície da matriz e para melhorar o suporte para crescimento do tecido. Duas hierarquias geométricas de construção para reparação de ACL compreendem o seguinte: 54/98

Matriz 1: 1 fio ACL = 6 cordas paralelas; 1 corda = 3 filamentos torcidos (3 torções/cm); 1 filamento = 6 conjuntos torcidos (3 torções/cm); 1 conjunto = 30 fibras lavadas paralelas; e

Matriz 2: 1 fio ACL = 6 cordas paralelas; 1 corda = 3 filamentos torcidos (2 torções/cm); 1 filamento = 3 conjuntos torcidos (2,5 torções/cm); 1 conjunto = 3 grupos (3 torções(cm); 1 grupo = 15 fibras de fibroina de seda extraídas paralelas. O número de fibras e geometrias para a Matriz 1 e Matriz 2 foi seleccionado de tal forma que as próteses de seda são semelhantes às propriedades biomecânicas de ACL na resistência à tracção, rigidez linear, limite de elasticidade e % de alongamento na ruptura, servindo como um ponto de partida sólido para o desenvolvimento de um ACL de tecido grado através de engenharia. Os efeitos do número crescente de fibras, número de niveis, e quantidade de torções em cada uma dessas propriedades biomecânicas são mostradas na Tabela 8 e Tabelas 6 e 7, respectivamente. A capacidade de gerar duas matrizes com geometrias diferentes, ambas resultando em propriedades mecânicas que imitam propriedades do ACL, indica que uma ampla variedade de configurações geométricas existe para atingir as propriedades mecânicas desejadas. As geometrias alternativas para qualquer ligamento desejado ou tecido do tendão podem compreender qualquer número, combinação ou organização de cordas, filamentos, conjuntos, grupos e fibras (ver Tabela 10, em baixo) que resulta numa construção de fibra com propriedades mecânicas aplicáveis que imitam aquelas do 55/98 ligamento ou tendão desejado. Por exemplo, uma (1) prótese ACL pode ter qualquer número de cordas em paralelo desde que exista um meio para ancoragem da construção da fibra final in vivo ou in vivo. Também, vários números de níveis de torção (onde um único nível é definido como um grupo, conjunto, filamento ou corda) para uma dada geometria podem ser empregues desde que a construção da fibra resulte nas propriedades mecânicas desejadas. Além disso, existe um grande grau de liberdade na concepção da geometria da construção de fibra e organização no fabrico de uma prótese ACL; deste modo, o modelo computacional teórico desenvolvido pode ser usado para prever o design da construção de fibra de um ligamento desejado ou tecido de tendão (ver por exemplo, em baixo) . Por exemplo, quando vários conjuntos de matrizes mais pequenas são pretendidos (por ex., 36 fibras no total) com apenas dois níveis de hierarquia para promover o crescimento, uma TPI de 8-11 ou ~3-4 torções por cm é necessário e pode ser previsto por um modelo sem a necessidade de trabalho empírico.

Consequentemente, uma variação em geometria (isto é, o número de cordas usado para criar uma prótese ou o número de fibras num grupo) pode ser usada para gerar matrizes aplicáveis à maioria dos ligamentos e tendões. Por exemplo, para ligamento e tendões mais pequenos da mão, a geometria e organização usadas para gerar uma única corda da Matriz 1 (ou duas cordas ou três cordas, etc.) pode ser adequado dado que a organização da construção da fibra resulta em propriedades mecânicas adequadas para o ambiente fisiológico particular. Especificamente, para acomodar um ligamento ou tendão mais pequeno comparado à Matriz 1 ou Matriz 2, menos fibras por nível serão usadas para gerar conjuntos ou 56/98 filamentos mais pequenos. Vários conjuntos podem então ser usados em paralelo. No caso de um ligamento maior, tal como o ACL, pode ser desejável ter conjuntos mais pequenos torcidos, em TPI mais elevadas, para reduzir a rigidez e promover o crescimento, do que ter poucos conjuntos maiores onde o crescimento não pode ocorrer deste modo limitando a degradação da matriz.

Contudo, a invenção não é limitada com respeito à geometria do cabo como descrito, e qualquer geometria ou combinação de geometrias (por ex., paralela, torcida, entrelaçada, tipo rede) pode ser usada que resulte em propriedades mecânicas da construção da fibra similares ao ACL (isto é, maior que 2000 N de resistência à tracção, entre 100-600 N/mm de rigidez linear para um ACL nativo ou enxerto de substituição comummente usado de tal forma que o tendão patelar com o comprimento entre 26-30 mm) ou para o ligamento ou tendão desejado que deve ser produzido. O número de fibras e a geometria da Matriz 1 e Matriz 2 foi seleccionado para gerar matrizes ACL mecanicamente adequadas, ou outras matrizes do ligamento ou tendão desejadas [por ex., ligamento cruzado posterior (PCL)] . Por exemplo, uma única corda da construção da Matriz 1 de seis cordas foi usada para reconstruir o ligamento colateral médio (MC) num coelho (ver Fig. 15A e Fig. 15B). As propriedades mecânicas das construções de seis cordas de seda da Matriz 1 e Matriz 2 são descritas na Tabela 10 e nas Figs. 3A-3D, como ainda descrito no exemplo, em baixo. As geometrias adicionais e suas propriedades mecânicas relacionadas estão listadas na Tabela 11 como um exemplo do grande grau de liberdade de design que resultaria numa construção de fibra 57/98 aplicável no tecido ACL fabricado de acordo com métodos aqui descritos.

Vantajosamente, a construção de fibra com base em fibra de seda pode consistir apenas de seda. Os tipos e fontes de seda incluem os seguintes: sedas de bichos-da-seda, tais como Bombyx mori e espécies relevantes; sedas de aranhas, tal como Nephila clavipes; sedas de bactérias geneticamente fabricadas, células mamíferas, levedura, células de insectos, e plantas e animais transgénicos; sedas obtidas a partir de células cultivadas de bichos-da-seda ou aranhas; sedas nativas; sequências totais ou parciais clonadas de sedas nativas; e sedas obtidas de genes sintéticos que codificam sequências de seda ou tipo seda. Na sua forma pura, as fibras de fibroína de seda nativa dos bichos-da-seda Bombyx mori são revestidos com uma proteína tipo cola chamada sericina, a qual é extraída, completamente ou quase completamente das fibras, antes das fibras que constituem a construção de fibra serem inoculadas com células. A construção de fibras pode compreender um composto de: (1) fibras de seda e colagénio; (2) espumas de seda e colagénio, malhas, ou esponjas; (3) fibras de fibroína de seda e espumas de seda, malhas, ou esponjas; (4) polímeros de seda e biodegradáveis [por ex., celulose, algodão, gelatina, polilactida , poliglicólico, poli(lactídeo-co-glicolídeo), Policaprolactona, poliamidas, polianidridos, poliaminoácidos,, poli (orto éster), poliacetais, proteínas, poliuretanos degradáveis, polissacarideos, policianoacrilatos, glicosaminoglicanos (por ex., condroitinossulfúrico, heparina, etc.), polissacarideos (nativos, reprocessados 58/98 ou versões geneticamente fabricadas: por ex., ácido hialurónico, alginatos, xantanos, pectina, chitosano, quitina, e similares), elastina (nativa, reprocessada ou versões geneticamente fabricadas e químicas), e colagénios (nativa, reprocessada ou versões geneticamente fabricadas e químicas], ou (5) polímeros de seda e não biodegradáveis (por ex., poliamida, poliéster, poliestireno, polipropileno, poliacrilato, polivinil, policarbonato, politetrafluoretileno, ou material nitrocelulose. 0 composto aumenta geralmente as propriedades de construção da fibra tais como as porosidades, degradabilidade e também melhora a inoculação, proliferação, diferenciação da célula ou desenvolvimento do tecido. As Figs. 16A, 16B e 16C ilustram a capacidade de fibras de colagénio para suportar o crescimento das BMSC e diferenciação específica do ligamento. A construção da fibra pode também ser tratada para melhorar a proliferação da célula e/ou diferenciação do tecido depois disso. Os tratamentos de construção de fibra exemplares para melhorar a proliferação da célula e diferenciação do tecido incluem, mas não são limitados a, metais, reticulação por irradiação, modificações químicas na superfície [por ex., revestimento do péptido RGD (arg-gly-asp) , revestimento de fibronectina, união de factores de crescimento], e modificações físicas da superfície.

Um segundo aspecto desta descrição relaciona-se com um ACL, mecânica e biologicamente funcional, formado a partir de uma nova construção de fibra com base em fibra de seda e (dependendo do destinatário do tecido) células estromais da medula óssea (BMSC) autólogas ou 59/98 alogénicas inoculadas na construção da seda. A construção da fibra com base em fibra de seda induz diferenciação das células estromais face à linhagem do ligamento sem a necessidade de qualquer estimulação mecânica durante a cultivação do biorreactor. As BMSC inoculadas na construção de fibra com base em fibra de seda e cultivadas numa placa de petri começaram a fixar e difundir (ver Figs. 7A-D); as células proliferam para cobrir a construção da fibra (ver Figs. 8A-B, Fig.9A e Fig. 9B) e diferenciam, como mostrado pela expressão dos marcadores específicos do ligamento (ver Fig. 14). Os marcadores para cartilagem (colagénio tipo II) e para osso (sialoproteína óssea) não foram expressados (ver a Fig. 14) . Os dados que ilustram a expressão de marcadores específicos de ligamento são indicados num exemplo, em baixo.

Outro aspecto desta descrição relaciona-se com um método para produzir um ACL ex vivo. As células capazes de diferenciar nas células de ligamento são cultivadas sob condições que estimulam os movimentos e forças experienciadas por um ACL in vivo através do curso de desenvolvimento embriónico até à função do ligamento maturo. Especificamente, sob condições estéreis, as células pluripotentes são inoculadas dentro da construção de fibra com base em fibra da seda tridimensional para a qual as células podem aderir e a qual é vantajosamente da forma cilíndrica. A construção de fibra com base em fibra da seda tridimensional usada no método serve como uma construção de fibra preliminar, a qual é suplementada e possivelmente mesmo substituída por componentes de construção de fibra extracelular, produzida pelas células de diferenciação. 0 uso da construção de fibra com base em fibra da seda 60/98 pode melhorar ou acelerar o desenvolvimento do ACL. Por exemplo, a nova construção de fibra com base em fibra da seda pode ser concebida para possuir as propriedades mecânicas especificas (por ex. , resistência à tracção aumentada) para que possa suportar fortes resistências antes de reforçar os componentes de construção de fibra (por ex., colagénio e tenascina). Outras propriedades vantajosas da nova construção de fibra preliminar com base em fibra da seda incluem, sem limitação, biocompatibilidade e susceptibilidade para biodegradação.

As células pluripotentes podem ser inoculadas dentro da construção da fibra preliminar pré- ou pós-formação da construção da fibra, dependendo da construção de fibra particular usada e durante o método da formação de construção da fibra. Normalmente, é preferida a inoculação uniforme. Na teoria, o número de células inoculadas não limita o ligamento final produzido; contudo, a inoculação óptima pode aumentar a taxa de geração. As quantidades de inoculação óptimas vao depender das condições de cultura específica. A construção de fibra pode ser inoculada com a partir de cerca de 0, 05 a 5 vezes a densidade da célula fisiológica de um ligamento nativo.

Um ou mais tipos de células pluripotentes são usados no método. Tais células têm a capacidade de diferenciar na ampla variedade de tipos de células em resposta aos sinais de diferenciação adequados e para expressar (marcadores específicos de ligamento). Mais especificamente, o método usa células, tais como células estromais da medula óssea, que têm a capacidade para diferenciar nas células do tecido do ligamento e 61/98 tendão. Se o ligamento fabricado por bioengenharia resultante for transplantado num paciente, as células devem ser derivadas de uma fonte que é compatível com o destinatário pretendido. Apesar de o destinatário ser geralmente um humano, também existem aplicações na medicina veterinária. As células podem ser obtidas do destinatário (autólogas), apesar de também poderem ser utilizadas células do dador compatível para criar os ligamentos alogénicos. Por exemplo, ao criar os ligamentos alogénicos (por ex., usando células de outro humano, tal como células estromais da medula óssea isoladas da medula óssea doada, ou fibroblastos de ACL isolados do tecido ACL doado), as células fibroblásticas do ligamento cruzado anterior isoladas do tecido ACL dador intacto (por ex., cadavéricas ou de transplantes totais do joelho), tecido ACL com ruptura (por ex., colhido no momento da cirurgia de um paciente que vai ser submetido à reconstrução do ACL) ou podem ser usadas células estromais da medula óssea. A determinação da compatibilidade está inserida nos meios do interveniente especialista.

Os ligamentos ou tendões incluindo, mas não limitado a, ligamento cruzado posterior, tendões do manguito rotador, ligamento colateral posterior do cotovelo e joelho, tendões flexores da mão, ligamentos laterais do tornozelo e tendões e ligamentos do mandíbula ou articulação temporomandibular que não ACL, cartilagem, osso ou outros tecidos podem ser fabricados com a construção da fibra de acordo com os métodos desta descrição. Desta forma, as células a serem inoculadas na construção de fibra são seleccionadas de acordo com o tecido a ser produzido (por ex., pluripotente ou do tipo de tecido desejado). As células inoculadas na 62/98 construção da fibra, como aqui descrita, podem ser autólogas ou alogénicas. 0 uso de células autólogas cria efectivamente um aloenxerto ou autoenxerto para implantação num destinatário.

Como indicado, para formar um ACL, células, tal como células estromais da medula óssea, são inoculadas! na construção da fibra. As células estromais da medula óssea são um tipo de célula pluripotente e são também referidas, na técnica, como células estaminais mesenquimais ou apenas como células estromais. Como indicado, a fonte dessas células pode ser autóloga ou alogénica. Adicionalmente, células pluripotentes ou estaminais, embriónicas ou adultas podem ser usadas se o ambiente adequado (in vivo ou in vitro), inoculadas na construção de fibra com base em fibra de seda, poder recapitular um ACL ou qualquer outro ligamento ou tecido desejado numa composição de construção de fibra extracelular (por ex., proteína, conteúdo de glicoproteína), organização, estrutura ou função.

As células fibroblásticas podem também ser inoculadas na construção de fibra inventiva. Uma vez que as células fibroblásticas não são referidas muitas vezes como células pluripotentes, os fibroblastos pretendem incluir fibroblastos ACL humano maturo (autólogo ou alogénico) isolados do tecido ACL, fibroblastos do outro tecido do ligamento, fibroblastos do tecido do tendão, do prepúcio neonatal, do sangue do cordão umbilical, ou de qualquer outra célula, matura ou pluripotente, matura desdiferenciada, ou geneticamente fabricadas, de tal forma que quando cultivada num ambiente adequado (in vivo ou in vitro), e inoculada na construção de fibra com base em fibra de seda, pode 63/98 recapitular um ACL ou qualquer outro ligamento desejado ou tecido na composição da construção de fibra extracelular (por ex., proteína, conteúdo de glicoproteína), organização, estrutura ou função.

As faces do cilindro de construção de fibra são cada uma fixa em apoios, através dos quais um intervalo de forças deve ser aplicado à construção da fibra. Para facilitar a administração da força à construção da fibra, toda a superfície de cada face respectiva da construção da fibra pode estar em contacto com a face dos apoios respectivos. Os apoios com uma forma que reflecte o local da fixação (por ex., cilíndrico) são melhor adequados para uso neste método. Uma vez reunidas, as células na construção de fibra ancorada são cultivadas sob condições adequadas para crescimento e regeneração de célula. A construção da fibra é sujeita a uma ou mais forças mecânicas aplicadas através de apoios fixos (por ex., via movimento de uma ou ambos os apoios fixos) durante o decorrer da cultura. As forças mecânicas são aplicadas durante o período de cultura para imitar condições experimentadas por um ACL nativo ou outros tecidos in vivo.

Os apoios devem ser feitos de um material adequado para fixação da construção de fibra, e a fixação resultante deve ser forte o suficiente para suportar a tensão das forças mecânicas aplicadas. Adicionalmente, os apoios podem ser de um material que é adequado para a fixação da construção da fibra extracelular que é produzida pelas células diferenciadoras. Os apoios suportam o crescimento do tecido ósseo (in vitro ou in vivo) ao mesmo tempo que suportam o ligamento de desenvolvimento. Alguns exemplos de material de apoio 64/98 adequado, sem limitação, hidroxiapatite, coral Goinopra coral, osso desmineralizado, osso (alogénico ou autólogo). Os materiais de apoio podem também incluir titânio, aço inoxidável, polietileno de alta densidade, DACRON e TEFLON.

Alternativamente, o material de apoio pode ser criado ou ainda melhorado por infusão de um material seleccionado com um factor que promove uma união da construção de fibra de ligamento ou união da construção de fibra de osso ou ambos. 0 termo "infundir" considera incluir qualquer método de aplicação que distribui adequadamente o factor no apoio (por ex., revestir, permear, contactar). Os exemplos de tais factores incluem sem limitação, laminina, fibronectina, qualquer proteína de construção de fibra extracelular que promova adesão, seda, factores que contêm regiões de união de péptido arginina-glicina-aspartato (RGD) ou os próprios péptidos RGD. Os factores de crescimento ou proteína morfogénica de osso podem também ser usados para melhorar a fixação do apoio. Adicionalmente, os apoios podem ser pré-inoculados com células (por ex., células estaminais, células de ligamento, osteoblastos, células progenitoras osteogénicas) que aderem aos apoios e unem a construção de fibra, para produzir uma ligação de construção de fibra melhorada in vitro e in vivo.

Um sistema de apoio exemplar é descrito no pedido co-pendente do requerente U.S.S.N. 09/950,561. A construção da fibra é fixa aos apoios via o contacto com a face do apoio ou alternativamente por penetração actual do material de construção da fibra através do material do apoio. Porque a força aplicada à construção da fibra via os apoios dita o ligamento final produzido, o tamanho do ligamento final 65/98 produzido é, em parte, ditado pelo tamanho do local de fixação do apoio. Um apoio de tamanho adequado para o ligamento final desejado deve ser usado. Um exemplo de uma forma de apoio para a formação de um ACL é um cilindro. Contudo, outras formas e tamanhos de apoio também vão funcionar de forma adequada. Por exemplo, os apoios podem ter um tamanho e composição adequados para inserção directa nos túneis do osso no fémur e tibia de um destinatário do ligamento obtido por bioengenharia.

Alternativamente, os apoios podem ser usados apenas temporariamente durante a cultura in vitro, e de seguida, removidos apenas quando a construção da fibra é implantada in vivo.

Ainda, a nova construção da fibra com base em fibra de seda pode ser inoculada com BMSC e cultivada num biorreactor. Dois tipos de ambientes de crescimento que existem actualmente podem ser usados de acordo com métodos desta descrição: (1) o sistema do dispositivo biorreactor in vitro, e (2) a articulação do joelho in vivo, que serve como um "biorreactor" à medida que providencia o ambiente fisiológico incluindo as células progenitoras e estímulos (químicos e físicos) necessários para o desenvolvimento de um ACL viável dando uma construção de fibra com propriedades mecânicas biocompatíveis e mecânicas. 0 dispositivo biorreactor providencia condições de cultura óptimas para a formação de um ligamento em termos de diferenciação e produção de construção de fibra extracelular (ECM), e o qual providencia assim o ligamento com propriedades mecânicas e biológicas óptimas antes da implantação num destinatário. Adicionalmente, quando a construção de fibra com base na fibra de seda é inoculada e cultivada com células in vitro, uma placa petri pode ser 66/98 considerada ser o biorreactor dentro da qual existem condições adequadas para o crescimento de célula e regeneração, isto é, um ambiente estático.

As células podem também ser cultivadas na construção da fibra sem a aplicação de quaisquer forças mecânicas, isto é, num ambiente estático. Por exemplo, a construção da fibra apenas com base na fibra de seda, sem forças ou estimulações mecânicas aplicadas in vitro, quando inoculada e cultivadas com BMSC, induz as células para proliferar e expressar os marcadores específicos do ligamento e tendão (ver os exemplos, aqui descritos) . A articulação do joelho pode servir como crescimento fisiológico e ambiente de desenvolvimento que pode providenciar as células e os sinais ambientais correctos (químicos e físicos) para a construção da fibra, de tal forma que se desenvolve tecnicamente um ACL. Deste modo, a articulação do joelho (como a sua própria forma de biorreactor) mais a construção da fibra (não inoculada, inoculada e não diferenciada in vitro, ou inoculada e diferenciada in vitro antes da implantação) vai resultar no desenvolvimento de um ACL, ou outro tecido desejado dependendo do tipo de célula inoculada na construção da fibra e a localização anatómica de implantação da construção da fibra. A Fig. 15 A-B ilustra os efeitos do ambiente da articulação de joelho colateral médio no desenvolvimento do ligamento colateral médio (MCL) apenas quando uma construção de fibra com base na fibra de seda não inoculada com propriedades mecânicas MCL adequadas é implantada durante 6 semanas in vivo. Se as células são cultivadas num ambiente estático sem estimulação mecânica aplicada, ou num ambiente dinâmico, tal como num dispositivo biorreactor, as condições adequadas para o crescimento e regeneração da célula estão 67/98 vantajosamente presentes para o fabrico do ligamento ou tecido desejado.

Nas experiências descritas nos exemplos, em baixo, a estimulação mecânica aplicada mostrou influenciar a morfologia e organização celular das células progenitoras dentro do tecido resultante. Os componentes segregados da construção da fibra extracelular pelas células e organização da construção da fibra extracelular ao longo do tecido, foram também significativamente influenciados pelas forças aplicadas à construção da fibra durante a geração de tecido. Durante a geração de tecido in vitro, as células e construção da fibra extracelular alinhada ao longo do eixo da carga, reflectindo a organização in vivo de um ACL nativo que é também ao longo de vários eixos de carga produzido por movimento e função natural da articulação do joelho. Estes resultados sugerem que o estimulo fisico experienciado na natureza pelas células de tecido em desenvolvimento, tal como o ACL, têm um papel significativo na diferenciação das células progenitoras e formação de tecido. Indicam ainda que este papel pode ser efectivamente duplicado in vitro através de manipulação mecânica para produzir tecido semelhante. Quanto mais idênticas forem as forças produzidas por manipulação mecânica das forças experienciadas por um ACL in vivo, mais idêntico será o tecido resultante com um ACL nativo.

Quando é aplicada estimulação mecânica in vitro à construção da fibra através de um biorreactor, existe independência mas controlo concorrente ao longo de forças de rotação e cíclicas como aplicado a um apoio relativamente ao outro apoio. Alternativamente, a construção da fibra pode ser implantada in vivo, inoculada 68/98 com células ACL do paciente e expostas in vivo à sinalização mecânica através do paciente.

Quando a construção da fibra for inoculada com células antes da implantação, as células são cultivadas dentro da construção da fibra sob condições adequadas para o crescimento celular e diferenciação. Durante o processo de cultivo, a construção da fibra pode ser sujeita a uma ou mais forças mecânicas através do movimento de uma ou ambos os apoios anexos. As forças mecânicas de tensão, compressão, torção e corte, e combinação das mesmas, são aplicadas nas condições, magnitudes e frequências adequadas para imitar o estimulo mecânico experienciado por um ACL in vivo. Vários factores terão influência na quantidade de força que pode ser tolerada pela construção da fibra (por exemplo, composição e densidade celular da construção da fibra). A resistência da construção da fibra é esperada mudar ao longo do curso do desenvolvimento de tecido. Assim, as forças ou esforços mecânicos irão aumentar, diminuir ou permanecer constantes em magnitude, duração, frequência e variedade ao longo do período de geração de ligamento, para corresponder adequadamente à força da construção da fibra aquando da aplicação.

Ao produzir um ACL, quanto mais exacta for a intensidade e combinação do estímulo aplicado à construção da fibra durante o desenvolvimento do tecido, mais o ligamento será parecido com um ACL nativo. Os dois tecidos devem ser considerados relativamente à função natural do ACL ao conceber o regime de força in vitro que imita o ambiente in vitro: (1) os diferentes tipos de movimento experienciados pelo ACL e as respostas do ACL aos movimentos da articulação do joelho, e (2) a extensão 69/98 das tensões mecânicas que o ligamento está sujeito. São geradas combinações especificas de estímulos mecânicos a partir de movimentos naturais da estrutura do joelho e transmitidos pelo ACL nativo.

Para descrever, brevemente, os movimentos do joelho, a ligação da tíbia e fémur pelo ACL providencia seis graus de liberdade quando se considera os movimentos de dois ossos relativamente um ao outro. A tíbia pode mover-se em três direcções e pode rodar relativamente aos eixos para cada uma dessas três direcções. 0 joelho é restrito de conseguir a amplitude total destes seis graus de liberdade devido à presença de ligamentos e fibras capilares e às superfícies do joelho (Biden et al., "Experimental Methods Used to Evaluate Knee Ligament Function," Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. D. Daniel et al., Raven Press, pp. 135-151,1990). Também são possíveis pequenos movimentos de translação. Os locais de anexo do ACL são responsáveis pela sua função de estabilização na articulação do joelho. 0 ACL funciona como um estabilizador primário da translação anterior tibial, e como um estabilizador secundário da angulação valgus-varuSf e rotação tibial (Shoemaker et al., "The Limits of Knee Motion," Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. D. Daniel et al., Raven Press, pp.1534-161, 1990) . Assim, o ACL é responsável por estabilizar o joelho em três dos seis possíveis graus de liberdade. Como resultado, o ACL desenvolveu uma organização de fibra específica e estrutura geral para realizar estas funções de estabilização. Estas condições são estimuladas in vitro para produzir um tecido com estrutura similar e organização em fibra. A extensão das tensões mecânicas experienciadas pelo ACL pode ser igualmente resumida. O ACL sofre cargas cíclicas 70/98 de cerca de 400 N entre um ou dois milhões de ciclos por ano (Chen et al. , J. Biomed. Mat. Res. 14: 567-586,1980). Também considerada é a rigidez linear (-182 N/mm), deformação última (100% do ACL) e energia absorvida na falha (12,8 N-m) (Woo et al. , The tensile properties of human anterior cruciate ligament (ACL) and ACL graft tissues, Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. D. Daniel et al. Raven Press, pp.279-289, 1990) ao desenvolver um substituto cirúrgico do ACL. A secção dos exemplos, em baixo, pormenoriza a produção de um protótipo de bioengenharia do ligamento cruzado anterior (ACL) ex vivo. Forças mecânicas que imitam um subconjunto de estímulos mecânicos experienciados por um ACL nativo in vivo (deformação rotacional e deformação linear) foram aplicadas em combinação, e o ligamento resultante que foi formado foi estudado para determinar os efeitos das forças aplicadas no desenvolvimento do tecido. A exposição do ligamento em desenvolvimento à carga fisiológica durante a formação in vitro induziu as células a adoptar uma orientação definida ao longo dos eixos de carga, e para gerar também matrizes extracelulares ao longo dos eixos. Estes resultados indicam que a incorporação de forças mecânicas multi-dimensionais complexas no regime para produzir uma rede mais complexa de eixos de carga que imitam o ambiente do ACL nativo, irá produzir um ligamento de bioengenharia que se parece mais com um ACL nativo.

As diferentes forças mecânicas que podem ser aplicadas incluem, sem limitação, tensão, compressão, torção e corte. Estas forças são aplicadas em combinações que simulam as forças experienciadas por um ACL no curso dos movimentos e função natural da articulação do joelho. 71/98

Estes movimentos incluem, sem limitação, extensão e flexão da articulação do joelho como definido nos planos coronal e sagital, e flexão da articulação do joelho. De forma óptima, a combinação de forças aplicadas imitam o estimulo mecânico experienciado por um ligamento cruzado anterior in vivo de forma tão precisa quanto experimentalmente possível. Variando o regime especifico da aplicação da força através do curso da geração de ligamento é esperado influenciar a taxa e resultado do desenvolvimento de tecido, com condições óptimas a serem determinadas empiricamente. Variáveis potenciais no regime incluem, sem limitação: (1) taxa de esforço, (2) percentagem de esforço, (3) tipo de esforço (por exemplo, transladação e rotação), (4) frequência, (5) número de ciclos num dado regime, (6) número de diferentes regimes, (7) duração em pontos extremos da deformação do ligamento, (8) níveis de força e (9) combinação de força diferentes. Existe uma grande variedade de variações. 0 regime de forças mecânicas aplicadas pode produzir fibras organizadas helicamente, similares àquelas do ligamento nativo, descrito em baixo.

Os conjuntos de fibras de um ligamento nativo são dispostos numa organização helical. 0 modo de ligação e a necessidade para a rotação do joelho que roda -140° de flexão resultou no facto do ACL nativo herdar uma torção de 90° e com os conjuntos de fibras periféricas a desenvolver uma organização helical. Esta caracteristica biomecânica única permite que o ACL sustente cargas extremamente elevadas. No ACL funcional, esta organização helical das fibras permite que fibras anterior-posterior e posterior-anterior permaneçam relativamente isométricas relativamente umas às outras para todos os graus de flexão, assim, a carga pode ser igualmente distribuída a 72/98 todos os conjuntos de fibras em qualquer grau de flexão da articulação do joelho, estabilizando o joelho em todos os intervalos de movimento da articulação. As forças mecânicas que estimulam uma combinação de flexão de articulação do joelho e extensão da articulação do joelho podem ser aplicadas ao ligamento em desenvolvimento para produzir um ACL criado que possui esta mesma organização helical. 0 dispositivo mecânico utilizado nas experiências apresentadas nos exemplos, em baixo, providencia controlo sobre as taxas de esforço e sobre-esforço (ambas translacionais e rotacionais). 0 dispositivo mecânico irá monitorizar a carga actual nos ligamentos em crescimento, servindo para "ensinar" os ligamentos, ao longo do tempo, através da monitorização e ao aumentar os regimes de carga.

Outro aspecto desta descrição relaciona-se com o ligamento cruzado anterior de bioengenharia, produzido pelos métodos acima descritos. 0 ligamento de bioengenharia produzido por estes métodos é caracterizado pela orientação celular e/ou um padrão de crimpagem da construção da fibra na direcção das forças mecânicas aplicadas durante a geração. 0 ligamento é também caracterizado pela produção/presença de componentes de construção da fibra extracelular (por exemplo, colagénio tipo I e tipo III, fibronectina, e proteínas tenascina-C) ao longo do eixo de carga mecânica experienciada durante a cultura. Os conjuntos de fibras do ligamento podem ser dispostos numa organização helical, como debatido acima.

Os métodos acima usando a construção da fibra com base numa nova fibra de seda não são limitados à produção de um ACL, mas podem também ser usados para produzir outros ligamentos e tendões encontrados no joelho (por exemplo, ligamento cruzado anterior) ou outras partes do corpo (por 73/98 exemplo, mão, pulso, tornozelo, cotovelo, mandíbula e ombro) , tal como por exemplo, mas não limitado ao ligamento cruzado posterior, tendões do manguito rotador, ligamento colateral médio do cotovelo e tornozelo e tendões e ligamentos da mandíbula ou articulação temporomandibular. Todas as articulações movíveis num corpo humano têm ligamentos especializados que ligam a extremidades articulares dos ossos na articulação. Cada ligamento no corpo tem uma estrutura específica e organização que é ditada pela sua função e ambiente. Os vários ligamentos do corpo, as suas localizações e funções são listadas em Anatomy, Descriptive and Surgical (Gray, H., Eds. Pick, T. P., Howden, R., Bounty Books, New York, 1977. Ao determinar os estímulos físicos experienciados por um ligamento ou tendão, e incorporando forças que imitam estes estímulos, o método acima mencionado para produzir um ACL ex vivo pode ser adaptado para produzir ligamentos e tendões criados em bioengenharia ex vivo que simulam qualquer ligamento e tendão no corpo. 0 tipo especifico de ligamento ou tendão a ser produzido é pré-determinado antes da geração de tecido uma vez que vários aspectos do método variam com as condições específicas experienciadas in vivo pelo ligamento ou tendão nativo. As forças mecânicas às quais o ligamento ou tendão em desenvolvimento são sujeitas durante a cultura de células são determinadas pelo ligamento ou tendão particular a serem cultivados. As condições especificas podem ser determinadas ao estudar o ligamento ou tendão nativo e o seu ambiente e função. Uma ou mais forças mecânicas experienciadas pelo ligamento e tendão in vivo são aplicadas à construção da fibra durante a cultura de células na construção da fibra. 0 médico com experiência irá reconhecer que um tendão e ligamento que é superior 74/98 àqueles actualmente disponíveis podem ser produzidos pela aplicação de um subconjunto de forças experienciadas pelo ligamento e tendão nativo. Contudo, optimamente, o intervalo total de forças in vivo será aplicado à construção de fibra nas magnitudes e combinações adequadas para produzir um produto final que se parece muito com o ligamento ou tendão nativo. Estas forças incluem, sem limitação, as forças descritas acima para a produção de um ACL. Devido às forças mecânicas aplicadas variarem com o tipo de ligamento ou tendão, a dimensão final do ligamento ou tendão será influenciada pelos apoios usados, composição óptima do apoio, a dimensão e locais de ligação da construção serão determinados para cada tipo de ligamento ou tendão através do médico com experiência. Os tipos de células cultivadas na construção de fibra são obviamente determinados com base no tipo de ligamento ou tendão a ser produzido.

Outros tipos de tecido podem ser produzidos ex vivo usando métodos semelhantes àqueles descritos acima para a geração de ligamentos ou tendões ex vivo. Os métodos acima descritos podem também ser aplicados para produzir um intervalo de produtos de tecido através de engenharia que envolvam deformação mecânica como uma grande parte da sua função, tal como músculo (por exemplo, músculo liso, músculo esquelético, músculo cardíaco), osso, cartilagem, discos vertebrais e alguns tipos de vasos sanguíneos. As células estromais da medula óssea possuem a capacidade de se diferenciar nestas bem como em outros tecidos. A geometria da construção de fibra com base em seda, ou construção de fibra compósito, pode ser facilmente adaptada à configuração geométrica anatómica do tipo de tecido desejado. Por exemplo, as fibras de fibroína de seda podem ser reformadas num tubo cilíndrico para recriar artérias. 75/98

Os resultados apresentados nos exemplos, em baixo, indicam que o crescimento num ambiente que imita o ambiente mecânico especifico de um dado tecido irá induzir a diferenciação celular adequada para produzir um tecido através de bioengenharia que se parece, significativamente, com o tecido nativo. Os intervalos e tipos de deformação mecânica da construção de fibra podem ser estendidos para produzir um amplo leque de organização estrutural de tecidos. 0 ambiente de cultivo celular pode reflectir o ambiente in vivo experienciado pelo tecido nativo e as células que contém, através do curso de desenvolvimento embriónico até à função matura das células dentro do tecido nativo, tão preciso quanto possível. Os factores a considerar ao conceber condições de cultivo específicas para produzir um dado tecido incluem, sem limitação, a composição da construção de fibra, o método de imobilização celular, o método de ancoragem da construção de fibra ou tecido, as forças específicas aplicadas e o meio de cultura da célula. 0 regime específico de estimulação mecânica depende do tipo de tecido a ser produzido, e é estabelecido ao variar a aplicação de forças mecânicas (por exemplo, apenas tensão, apenas torção, combinação de tensão e torção com ou sem corte, etc.) a amplitude da força (por exemplo, ângulo ou elongação, a frequência e duração da aplicação, e a duração de períodos de estimulação e descanso. 0 método para produzir o tipo de tecido específico ex vivo é uma adaptação do método acima descrito para produzir um ACL. Os componentes envolvidos incluem células pluripotentes, uma construção de fibra tridimensional na qual as células podem aderir, uma pluralidade de apoios que têm uma face adequada para a ligação da construção de fibra. As células pluripotentes (tais como células 76/98 estromais de medula óssea) são semeadas na construção de fibra tridimensional através de meios para imobilizar de forma uniforme as células dentro da construção de fibra. 0 número de células semeadas também não é visto como limitador; contudo, semear a construção de fibra com células de alta densidade pode acelerar a geração de tecido.

As forças especificas aplicadas serão determinadas para cada tipo de tecido produzido através de exame de tecido nativo e estimulo mecânico experienciado in vivo. Um dado tipo de tecido experiencia forças caracteristicas que são ditadas por função de localização árida do tecido dentro do corpo. Por exemplo, é sabido que a cartilagem experiencia uma combinação de corte e compressão/tensão in vivo; o osso experiencia compressão.

Os estímulos adicionais (por exemplo, estímulos químicos, estímulos electromagnéticos) podem também ser incorporados nos métodos acima descritos para produzir ligamentos, tendões e outros tecidos através de bioengenharia. É sabido que a diferenciação celular pode ser influenciada por estímulos químicos do ambiente, habitualmente produzidos pelas células próximas, tal como crescimento segregado ou factores de diferenciação, contacto célula-célula, gradientes químicos e níveis de pH específicos, apenas para nomear alguns. Outros estímulos mais únicos são experienciados por tipos mais especializados de tecidos (por exemplo, a estimulação eléctrica do músculo cardíaco) . A aplicação dos ditos estímulos específicos do tecido (por exemplo, 1-10 mg/ml de factor de crescimento transformante beta-1 (TGF-βΙ) independentemente ou em conjunto com as forças mecânicas adequadas, é esperado 77/98 facilitar a diferenciação das células num tecido que se aproxima do tecido natural especifico.

Os tecidos produzidos pelos métodos acima descritos providenciam um conjunto ilimitado de tecidos equivalentes para implantação cirúrgica num recipiente compatível, particularmente para substituição ou reparação de tecido danificado. Podem também ser utilizados tecidos criados através de engenharia para estudos in vitro de função de tecido patológico ou normal, por exemplo, para teste in vitro de células e respostas ao nível do tecido até manipulações genéticas, mecânicas ou moleculares. Por exemplo, os tecidos com base em células normais ou transfectadas podem ser usados para avaliar as respostas de tecido ao estímulos bioquímicos ou mecânicos, identificar as funções de genes específicos ou produtos de genes que podem ser superexpressados ou removidos, ou para estudos dos efeitos de agentes farmacológicos. Os tais estudos irão, provavelmente, providenciar mais informação sobre o desenvolvimento do tendão e tecido, função normal e patológica e, eventualmente, levar até substituições de tecido criadas através de engenharia, baseadas, em parte, em abordagens de engenharia de tecido já estabelecidas, novas informações sobre diferenciação celular e desenvolvimento de tecido, e o uso de sinais reguladores mecânicos em conjunção com factores exógenos e derivados de células para melhorar as propriedades estruturais e funcionais do tecido. A produção de tecidos através de engenharia, tal como ligamentos e tendões, tem também a potência para aplicações tais como colheita de células estromais de medula óssea de indivíduos com alto risco de ferimento de tecido (por exemplo, ruptura do ACL) antes do ferimento. 78/98

Estas células podem ser armazenadas até serem necessárias ou semeadas na construção de fibra adequada e cultivadas e diferenciadas in vitro sob estímulos mecânicos para produzir uma variedade de tecidos protéticos através de bioengenharia a serem mantidos em reserva até necessário pelo doador. A utilização de próteses de tecido vivo em bioengenharia que melhor corresponde ao ambiente biológico in vivo e que providencia a carga fisiológica necessária para suster, por exemplo, o equilíbrio dinâmico de um ligamento normal totalmente funcional, deverá reduzir o tempo de reabilitação para um destinatário de umas próteses de meses para semanas, particularmente se o tecido é pré-cultivado e armazenado. As vantagens incluem uma mais rápida retoma às actividades funcionais, estadias menores em hospitais e menos problemas com rejeições de tecido e falhas.

Os aspectos adicionais desta invenção são exemplificados nos seguintes exemplos. Será aparente para aqueles com experiência na técnica que muitas modificações, materiais e em termos de métodos, podem ser praticadas sem sair do âmbito da invenção.

Num primeiro exemplo, as fibras do bicho-da-seda Bombyx mori puras, mostradas na Fig. IA, foram extraídas para remover sericina, a proteína tipo cola que reveste a fibroína da seda (ver Figs. 1A-C). 0 número adequado de fibras por grupo foi disposto em paralelo e extraído numa solução aquosa de 0,02 M Na2CC>3 e 0,3% (peso por volume) de solução de sabão IVORY durante 60 minutos a 90°C, depois lavadas com água para extrair as proteínas sericina tipo cola. 79/98 A equação de Costello para uma geometria de corda helical de três filamentos foi derivada para prever as propriedades mecânicas da construção baseada em fibra de seda. 0 modelo derivado é uma série de equações que, quando combinadas, têm em conta as propriedades do material de fibra extraído e a hierarquia desejada da construção de fibra para calcular a força geral e rigidez da construção de fibra como uma função do ângulo inclinado para um dado nível de hierarquia geométrica.

As propriedades do material de uma única fibra de seda incluem diâmetro da fibra, módulos de elasticidade, rácio de Poisson e a força de resistência à tracção (UTS) . A hierarquia geométrica pode ser definida como o número de níveis de torção num dado nível de construção de fibra. Cada nível (por exemplo, grupo, conjunto, fio, corda, ligamento) é ainda definido pelo número de grupos de fibras torcidas umas nas outras e o número de fibras em cada grupo no primeiro nível torcido, onde o primeiro nível é definido como um grupo, o segundo nível como um conjunto, o terceiro como um fio e o quarto como uma corda, o quinto como o ligamento. 0 modelo assume que cada grupo de múltiplas fibras agem como uma única fibra, com um raio efectivo determinado pelo número de fibras individuais e o seu raio inerente, isto é, o modelo desconta a fricção entre as fibras individuais devido ao seu papel limitado num dado ângulo de inclinação relativamente alto.

As duas geometrias aplicáveis (Matriz 1 e Matriz 2) das muitas configurações geométricas da construção de fibra (ver Tabela 10, supra) calculadas para atingir propriedades mecânicas que imitam aquelas de um ACL nativo 80/98 foram derivadas para análise mais pormenorizada. Foi seleccionada uma construção de seis cordas para usar como substituição do ACL. As configurações da matriz são as seguintes: Matriz 1: 1 prótese ACL = 6 cordas paralelas; 1 corda = 3 fios torcidos (3 torções/cm); 1 fio = 6 conjuntos torcidos (3 torções/cm); 1 conjunto = 30 fibras lavadas torcidas; e Matriz 2: 1 Matriz ACL = 6 cordas paralelas; 1 corda = 3 fios torcidos (2 torções/cm); 1 fio = 3 conjuntos torcidos (2,5 torções/cm); 1 conjunto = 3 grupos (3 torções/cm); 1 grupo = 15 fibras de fibroina de seda extraídas paralelas. O número de fibras e geometrias foi seleccionado de modo a que as próteses de seda são semelhantes às propriedades biomecânicas do ACL em UTS, rigidez linear, limite de elasticidade e % de alongamento ao partir (ver Tabela 10, supra) servindo assim como ponto de início sólido para o desenvolvimento de um ACL com tecido realizado através de engenharia.

As propriedades mecânicas da fibroina da seda foram caracterizadas usando um sistema de compressão/tensão servo-hidráulico Instron 8511 com software Fast-Track (Instron Corp., Canton, Massachusetts, USA) (ver Fig. 1D). Foram realizadas análises únicas de fadiga e puxar até falhar (pull-to-failure)em fibras de seda únicas, fibroina extraída e cordas organizadas. As fibras e fibroina foram organizadas em ambas as geometrias helicais paralelas da Matriz 1 (ver Fig. 2C) e da Matriz 2 (Ver Fig. 2D) para caracterização. O teste de puxar até falhar (pull-to-failure) foi realizado numa taxa de esforço de 100%/seg.; foram gerados histogramas de alongamento de força e a informação analisada usando software Instron Series IX. A Matriz 1 e Matriz 2 produziram propriedades mecânicas e de fadiga semelhantes ao ACL em UTS, rigidez linear, limite 81/98 de elasticidade e alongamento de percentagem na falha (Ver Tabela 10 e Figs. 3A-D).

As análises de fadiga foram realizadas usando um sistema de tensão/compressão servo-hidráulico Instron 8511 com software Wavemaker, em cordas únicas da Matriz 1 e Matriz 2. A informação foi extrapolada para representar a prótese de 6 cordas do ACL, que foi mostrada na Fig. 3B e 3D. O final das cordas foi embebido num molde de epóxi para gerar uma construção de 3 cm entre os apoios. Os ciclos de falha na UTS de 1, 680 N e 1,200 N (n= 5 para cada carga) para a Matriz 1 (ver Fig. 3B) e a UTS de cargas de 2280 N, 2100 N e 1800 N (n= 3 para cada carga) para a Matriz 2 (ver Fig. 3D) foram determinados usando uma função sinusoidal H a 1 Hz gerado pelo software Wavemaker 32 versão 6.6 (Instron Corp.). O teste de fadiga foi realizado numa solução neutra tampão de soro com fosfato (PBS) à temperatura ambiente. A remoção completa de sericina foi observada após 60 min. a 90 °C como determinado pelo SEM (ver Figs. 1A-C) . A remoção de sericina das fibras de seda alteraram a ultraestrutura das fibras, resultando numa superfície da fibra mais suave, e a fibroína de seda foi revelada (mostrada nas Figs. 1A-C), com diâmetro médio que varia entre 20-40 pm. A fibroína exibiu uma diminuição significativa de 15,2% na força de resistência à tracção (1,033 +/- 0,042 N/fibra a 0,876 +/- 0,1 N/fibra) (p<0,05, emparelhado com teste t de Student) (ver Fig. 1D) . As propriedades mecânicas das matrizes de seda optimizadas (ver Fig. 2A-D e Fig. 3A-D) são resumidas na Tabela 11 e na Fig. 3A (para a Matriz 1) e na Fig. 3C (para a Matriz 2). É evidente a partir destes resultados que as matrizes de seda optimizadas exibiram valores comparáveis àqueles 82/98 do ACL nativo, que foram reportados ter uma resistência à tracção média (UTS) de -2100 N, rigidez de -250 N/nm, SL-Y, et ai., The Tensile Properties of Human Anterior Cruciate Ligament (ACL) and ACL Graft Tissue in Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, 279-289, Ed. D. Daniel et al. , Raven Press 1990) . A análise de regressão da informação da fadiga da construção de fibra, mostrada na Fig. 3B para a Matriz 1 e na Fig. 3D para a Matriz 2, quando extrapolada para níveis de carga fisiológica (400 N) prevê o número de ciclos até à falha in vivo, indicou uma vida de construção de fibra de 3,3 milhões de ciclos para a Matriz 1 e uma vida superior a 10 milhões de ciclos para a Matriz 2. A concepção helical da construção de fibra com propriedades estruturais fisiologicamente equivalentes confirma a sua adequação como suporte para fabrico de tecido de ligamento.

Noutro exemplo que envolve o isolamento e cultura celular, as células estromais de medula óssea, células pluripotentes capazes de diferenciar linhagens osteogénicas, condrogénicas, tendonogénicas, adipogénicas e miogénicas, foram escolhidas uma vez que a formação das condições adequadas podem dirigir a sua diferenciação para uma linha celular de fibroblasto de ligamento desejado ((Markolf et al., J. Bone Joint Surg. 71A: 887-893,1989; Caplan et al., Mesenchymal stem cells and tissue repair, The Anterior Cruciate Ligament: Current and Future Concepts, Ed. D. W. Jackson et al., Raven Press, Ltd, New York, 1993; Young et al. , J. Orthopaedic Res. 16:406-413,1998) . 83/98

As BMSC humanas foram isoladas da medula óssea a partir da cristã iliaca de doadores que consentiram, de pelos 25 anos de idade, por um fornecedor comercial (Cambrex, Walkersville, MD). Vinte e dois milímetros de medula humana foi assepticamente aspirada para uma seringa de 25 ml contendo três milímetros de soro heparinizado (1000 unidades por milímetro). A solução de medula óssea heparinizada foi enviada em gelo para o laboratório para isolamento e cultura de células estromais de medula óssea. Após chegar ao fornecedor, vinte e dois milímetros de aspirado foram ressuspensos em Meio de Sagle modificado por Duibecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) , 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/L de estreptomicina (P/S) e 1 ng/ml de factor de crescimento fibroblástico básico (bFGF) (Life Technologies, Rockville, MD) e dispostos em 8-10 microlitros de aspirado/cm2 em frascos de cultura de tecido. 0 meio recente foi adicionado ao aspirado de medula duas vezes por semana até 9 dias da cultura. Foram seleccionadas BMSC com base na sua capacidade de aderir ao plástico de cultura de tecido; células hemotopoéticas não aderentes foram removidas durante o meio de substituição após 9-12 meses em cultura. O meio foi alterado duas vezes por semana após isso. Quando as BMSC primárias se tornaram quase confluentes (12-14 dias), foram removidas usando 0,25% de tripsina/1 nM EDTA e substituídas em 5x103 células/cm2. As hBMSC de primeira passagem (Pl) foram tripsinizadas e congeladas em 8% de DMSO/10% FBS/ DMEM para uso futuro.

As hBMSC Pl foram descongeladas, dispostas novamente em 5x103 células/cm2 (P2), tripsinizados quando perto da confluência e usados para inoculação da construção de fibra. As matrizes de seda esterilizadas (óxido de 84/98 etileno) (especificamente, cordas únicas de Matrizes 1 e 2, conjuntos de 30 fibras paralelas de seda extraídas, e cordas helicais de fibras de colagem) foram inoculadas com células em câmaras de inoculação personalizadas (1 ml de volume total) maquinadas em blocos de Teflon para minimizar o volume do meio de célula e aumentar o contacto da construção de fibra - célula. As matrizes inoculadas, após 4 horas de período de incubação com a suspensão espessada célula (3,3xl06/BMSC/ml) foram transferidas numa placa petri contendo uma quantidade adequada de meio de cultivo de célula para a duração das experiências.

Para determinar a taxa de degradação da fibroína da seda, a resistência à tracção (UTS) foi medida como uma função do período de cultivação em condições de crescimento fisiológico, isto é, no meio de cultura da célula. Grupos de 30 fibras de seda paralelas com 3 cm de comprimento foram extraídos, inoculados com hBMSC e cultivados na fibroína ao longo de 21 dias a 37 °C e 5% CO2. Os grupos de controlo não inoculados foram cultivados em paralelo. A UTS de fibroína da seda foi determinada como uma função da duração da cultura para grupos inoculados e não inoculados. A resposta das células estromais da medula óssea à construção de fibra de seda foi também examinada.

As BMSC ligaram-se rapidamente e cresceram na seda e matrizes de colagénio após 1 dia em cultura (ver Fig. 7A-C e Fig. 16A), e formaram extensões celulares para ligar fibras próximas. Como mostrado na Fig. 7D e Fig. 16B, uma folha uniforme de células que cobrem a construção foi observada aos 14 e 21 dias de cultura, respectivamente. A análise MTT confirmou a total cobertura da construção de 85/98 fibra por BMSC inoculadas após 14 dias em cultura (ver Fig. 8A-B) . A quantificação de ADN total das células cultivadas na Matriz 1 (ver Fig. 9A) e Matriz 2 (ver Fig. 9B) confirmaram que as BMSC proliferaram e cresceram na construção de seda com a maior quantidade de ADN medida após 21 e 14 dias, respectivamente, em cultura.

Os grupos de fibroina de seda de 30 fibras de controlo extraídos inoculados com BMSC e não inoculados, mantiveram a sua integridade mecânica como uma função do período de cultura após 21 dias (Ver Fig. 10). A análise RT-PCR das BMSC inoculadas nas cordas da Matriz 2 indica que o colagénio I e II não foram regulados ao longo dos 14 dias em cultura (Fig. 14) . O colagénio tipo II e sialoproteína do osso (como indicadores de cartilagem e diferenciação específica do osso, respectivamente) não foram detectáveis ou negligenciavelmente expressos ao longo do período de cultivação. A RT-PCR quantitativa em tempo-real, aos 14 dias, rendeu um rácio de transcrição de colagénio I para colagénio III, normalizado para GAPDH, de 8,9:1 (ver Fig. 17) . O elevado rácio de colagénio I para colagénio III indica que a resposta não é cicatrização de ferida ou formação de tecido de cicatrização (como é observado com altos níveis de colagénio tipo III), mas em vez disso, é específico do ligamento; o rácio relativo de colagénio I para colagénio III num ACL nativo é -6,6:1 (Amiel et al. , Knee Ligaments: Structure, Function, Injury, and Repair, 1990).

Adicionalmente, são realizados estudos para providenciar informação na influência de estimulação mecânica multi-dimensional na formulação do ligamento a partir de células estromais de medula óssea no sistema biorreactor. O 86/98 biorreactor é capaz de aplicar forças multi-dimensionais cíclicas concorrentes mas independentes (por exemplo, transladação, rotação) aos ligamentos em desenvolvimento. Após 7 a 14 dias de período de descanso estático (tempo após inoculação), as taxas de esforço de rotação e translação e deformação linear e rotacional são mantidas constantes durante 1 a 4 semanas. 0 esforço translacional (3,3% —10%, 1-3 mm) e o esforço rotacional (25%, 90°) são concorrentemente aplicados a uma frequência de 0,0167 Hz (um ciclo completo de tensão e relaxamento por minuto) para as matrizes com base em seda inoculada com BMSC; um conjunto de outro modo idêntico de biorreactores com matrizes inoculadas sem carga mecânica serve como controlo. Os ligamentos são expostos a forças cíclicas constantes durante a duração dos dias da experiência.

Após o período de cultura, as amostras de ligamento, tanto as mecanicamente desafiantes como as de controlo (estáticas) são caracterizadas por: (1) aparência histomorfológica geral (por inspecção visual); (2) distribuição celular (processamento de imagem de secções marcadas com MTT e histológicas); (3) morfologia e orientação das células (análise histológica); e (4) a produção de marcadores específicos de tecido (RT-PCR, imunomarcação).

A estimulação mecânica afecta marcadamente a morfologia e organização das BMSC e a construção de fibra extracelular recém-desenvolvida, a distribuição de células ao longo da construção da fibra, e proliferação de uma cascata de diferenciação específica do ligamento; as BMSC alinham-se ao longo do eixo da fibra, têm uma morfologia esferóide similar aos fibroblastos do ligamento/tendão e proliferam os marcadores específicos do ligamento/tendão. A 87/98 construção de fibra extracelular recém-formada (isto é, a composição de proteínas produzidas pelas células) é esperada alinhar-se ao longo das linhas de carga bem como ao longo do eixo da construção de fibra. 0 estímulo mecânico directo é esperado melhorar o desenvolvimento do ligamento e formação in vitro num biorreactor resultando das BMSC inoculadas numa nova construção de fibra com base em seda. A orientação longitudinal das células e construção de fibra recém-formada é semelhante aos fibroblastos do ligamento encontrado num ACL in vivo (Woods et al. , Amer. J. Sports Med. 19:48-55, 1991). Além disso, a estimulação mecânica mantém o rácio de estimulação mecânica entre os transcriptos do tipo I e transcriptos de colagénio tipo III (por exemplo, maior de 7:1) indicando a presença de tecidos de ligamentos recém-formados versus formação de tecido de cicatrização. Os resultados acima irão indicar que o dispositivo mecânico e sistema biorreactor providencia um ambiente adequado (por exemplo, esforços multi-dimensionais) para formação in vitro de ligamentos de tecido criados através de engenharia com inicio em células estromais de medula óssea e a construção inovadora de fibra de base em seda.

As condições de cultivo utilizadas nestas experiências preliminares podem ser ainda mais expandidas para melhor reflectir o ambiente fisiológico de um ligamento (por ex., aumentar os diferentes tipos de forças mecânicas) para a criação in vitro de equivalentes funcionais de ACL nativo para potencial uso clínico. Estes métodos não são limitados à criação de um ACL através de engenharia. Ao aplicar a magnitude apropriada e variedade de forças experienciadas in vivo qualquer tipo de ligamento no corpo, bem como outros tipos de tecido podem ser produzidos ex vivo pelos métodos desta descrição. 88/98

Tabela 1: Resistência à tracção e rigidez (N/mm numa amostra de 3 cm de comprimento) como uma função da extracção de sericina de 10 fibras de fio de seda de bichos-da-seda com 0 torções por polegada (isto é, paralelas) e (i) temperatura e (ii) tempo. As amostras de repetição foram processadas dois anos após as amostras iniciais sem qualquer alteração significativa nas propriedades. N=5 para todas as amostras

Fio % de fibras Temp. Tempo UTS (N) d - p - Rigidez (N/mm) d.p. UTS/fibra (N) Rigidez/f ibra (N/mm) 10(0) 10 RT 60min 10,74 0,83 6,77 0,65 1,07 0,68 10(0) 10 RT 60 mln (repetir) 10,83 0,28 6,36 0,14 1,08 0,64 10(0) 10 33C 60min 10,44 0,17 6,68 0,55 1,04 0,67 10(0) 10 37C 60min 9,60 0,84 6,09 0,59 0,96 0,61 10(0) 10 37C 60 min (repetir) 9,54 0,74 5,81 0,67 0,95 0,58 10(0) 10 90C 15 min. 9,22 0,55 4,87 0,62 0,92 0,49 10(0) 10 90C 30 min 8,29 0,19 4,91 0,33 0,83 0,49 10(0) 10 90C 60 min 8,60 0,61 4,04 0,87 0,86 0,40 10(0) 10 90C 60 min(repetir) 8,65 0,67 4,55 0,69 0,87 0,46 10(0) 10 94C 60 min 7,92 0,51 2,42 0,33 0,79 0,24 9(12s) x3(9z) 27 Não extrado 24,50 0,38 8,00 0,49 0,91 0,30 9(12s) x3(9z) 27 90C 60 min 21,88 0,18 7,38 0,34 0,81 0,27 9(6s) x3(3z) 27 Nãoextraclo 24,94 0,57 9,51 0,57 0,92 0,35 9(6s) x3(3z) 27 90C 60 min 21,36 0,40 7,95 1,00 0,79 0,29 9(12s) x3(6z) 27 Não extraio 24,69 0,65 9,08 0,56 0,91 0,34 9(12s) x3(6z) 27 90C 60 min 21,80 0,47 7,48 0,97 0,81 0,28

Tabela 2. Perda de massa como função da extracção de sericina. +/- 0,43% de desvio padrão de um N=5, reflecte a maior precisão que pode ser conseguida ao confirmar a remoção de sericina, isto é, 0,87 ou 1% de erro será sempre inerente aos métodos usados e uma perda de massa de cerca de 24% representa construções substancialmente livres de sericina.

Fio Não extraída e Extraída e % perda de seca (mg) seca (mg) 43,6 massa 9(12) x3(6) 57,6 24,31 9(12) x 3(6) 58,3 43,9 24,70 9(12) x 3(6) 57,0 42,9 24,74 9(12) x 3(6) 57,2 42,7 25,35 média 57,53 43,28 24,77 Desvio padrão 0,57 0,57 0,43 89/98

Tabela 3. Ilustra a alteração na massa como uma função de uma segunda extracção de sericina. Correlacionada com a Fig. 1E - 1G, uma perda de massa inferior a 3% indica provavelmente uma perda de massa de fibroina devido aos danos mecânicos durante a 2a extracção *'° Massa após 1 x extracção, Massa após 2x % perda de seca (mg) extracção, seca (mg) massa 9(12) x 3(6) 42,5 41,7 1,88 9(12) x 3(6) 43,1 42 2,55 9(12) x 3(6) 43,1 42,1 2,32 9(12) x 3(6) 42,5 41,7 1,88 9(12) x 3(6) 42,6 42,4 0,47 9(12) x 3(6) 43,7 42,4 2,97 9(12) x 3(6) 43,4 42,9 1,15 9(12) x 3(6) 43,7 43,1 1,37 9(12) x 3(6) 44 43,2 1,82 média 43,18 42,39 1,82 Desvio padrão 0,56 0,57 0,76 90/98 91/98

Tabela 4

Gftrnaric Mkrt otba Grdçã tickiá Tdá #tfe Rb2B IVfelalJIS ots/ (N parfãD UIS(N °/J\/feia %± ofeácng cte/. pBdãDcb àcng F^oteméda Cte/.FàdãD d (Nhirr) rigcte(Nrm) UISpaRbc Rgcte pafiba ctotbapr tm cár Bdraot c C r V 1,3 m 15 217 Q51 QS Q7 ipMEt) doe Bdract r C L 25 115 1,5 23 031 Q7 Q5 33 x30 cár Bdraot r C ç 67 123 Q72 45 Q1f Q7 Q5 i(Qxa;iQ>a:9 doe Bdract r c Ç aa 1311 14 43 03 Q7 Q4 doe c c 12 73 1QQ Q9 Q5 terçã ls§oe<traot c c 12 1Q17 19a 14 Q3 i(Qx3;iq>^q doe Bdraot r c 12 92 143 Q3 5t Q31 Q7! Q4 1(Qx4(11)>G[11) terçã Btract r \ 12 9* 125 1,3 75 03 Q81 QS 1(Qx4(1Qx3q cár Extracb rã edraob 3 12 m 142 1,3 51C Q3 07 Q4 15(textuiacq textuiact 1 t 1QS W 1,7 47 Q3 Q71 Q31£ m paâéc Bdract! h/riob 1 3 2g 233 351 1,4 Q15 QS QGS m paâéc βΰΓ 1 3 197: 2X 2Q7C 63 qa 3QR paâéc ggari 1 3 295 1,3 293 73 QS z ticraB per potact rim8 teraot Bdraotiaaa: c c t 1Q3 Q13 6ΘΒ 1,4 QS Q43 4 fibsB per potact njn8 teraot Bdraotiaaa: c c 3 m Q22 123 Q5 Q7 Q3S 4(q>aq rurpcrtati teraot Bdraotiaaa: r c 4 3/S qt 2ζ3 Q3 07 ΐ39χ3ΐ3 cár Sác c c 4 23 QS 31,3 13 4S Q4 QS Q1CE3 igq>a;i9>a;iq cár Nbetrabtldap táKD e V 13 7361 aa 3372 53 123 1,5 Q5 QC913Í i5Qx3iqx3iq cár NpMgõE72dã Φ&τίηω r_ 13 723 5S 31,1? 42 Q5 i5qxs;iq>a;iq cár ΐ\ΒρθΦ9φ 3da Φ&τίηω r c 13 7Q74 23 2953 44 05 is;qxqiqxqiq cár INBpe«9CQ40a φδτώιω r c 13 7580 16! 3457 419 05 i5(q>3[i^>3[iq cár i\epBdracq baa φδτ£θΐω r c 13 71,91 571 3672 33 05 igq>a;iq>a;iq cár iNBpetrgcti bda Φ&τίηω r c 13 745/ 1,4 3/67 42 Q5 ^qxqn)Xd(iq> cár isãoedraotiaaa: í 351 18901 m 4587 379 Q5 iqq>£(ii)>a:iq cár i\bd atraca tetj ddQSLkpaapre tensaqaaao í 351 17012 73 3935 13 Q4 92/98

Tabela 5: Comparação de UTS e rigidez entre condições de teste mecânicas húmidas (incubação de 2h em PBS a 37%) e secas. N=5.

Os resultados mostram, aproximadamente, uma diminuição de 17% em UTS como função de teste húmido.

Fio % de fibra Condições de Teste do Fio UTS (N) UTS desv. padrão Rigidez Rigidez UTS/fibra Rigidez/ fibra s (N/mm) Desv.padrão (N) (N/mm) 9(12s) x3(9z) 27 extraído - seco 21,88 0,18 7,38 0,34 0,81 0,27 9(12s) x3(9z) 27 extraído - húmido 18,52 0,25 2,56 0,31 0,69 0,09 9(6s) x 3(3z) 27 extraído - seco 21,36 0,40 7,95 1,00 0,79 0,29 9(6s) x 3(3z) 27 extraído - húmido 17,94 0,30 2,40 0,28 0,66 0,09 9(12s) x3(6z) 27 extraído - seco 21,80 0,47 7,48 0,97 0,81 0,28 9(12s) x3(6z) 27 extraído - húmido 18,74 0,22 2,57 0,11 0,69 0,10 12(0) x 3(1 Os) 36 extraído - seco 30,73 0,46 16,24 0,66 0,85 0,45 12(0) x 3(1 Os) 36 extraído-húmido 25,93 0,29 6,68 0,70 0,72 0,19 4(0) x3(10s)x 3(9z) 4(0) x 3(1 Os) x 3(9z) 36 extraído - seco 30,07 0,35 15,49 1,06 0,84 0,43 36 extraído - húmido 22,55 0,66 7,63 1,00 0,63 0,21

Tabela 6. Efeito da TPI na UTS e Rigidez. N=5 Fio TPI UTS (N) Desv. Rigidez Desv. UTS/fibra Rigidez/fibra padrão (N/mm) padrão (N) (N/mm) 12(0) x 3(2) 2 23,27 0,28 6,86 0,60 0,65 0,19 12(0) x 3(4) 4 24,69 0,31 7,61 1,17 0,69 0,21 12(0) x 3(6) 6 25,44 0,42 6,51 1,35 0,71 0,18 12(0) x 3(8) 8 25,21 0,23 5,80 0,67 0,70 0,16 12(0) x 3(10) 10 25,94 0,24 6,45 0,77 0,72 0,18 12(0) x 3(12) 12 25,87 0,19 6,01 0,69 0,72 0,17 12(0) x 3(14) 14 22,21 0,58 5,63 0,71 0,62 0,16

Tabela 7. Informação TPI adicional para verificar que até 30 tpi pode ser usada sem causar danos no fio o que resultaria numa diminuição dramática em UTS e rigidez; nota, todas as matrizes (N = 5 por grupo) foram torcidas.

Fio # de fibras UTS (N) Desv. Padrão (N) Rigidez Desv. (N/mm) Padrão (N/mm) UTS/fibra Rigidez/ (N) fibra (N/mm) Condições 1 (30) x 6(20) x 3(4,5) 18 1 (30) x 6(20) x 3(10) 18 1(30) X 6(6) ^ 15(20) 15 10,92 0,44 11,48 0,37 3,83 0,24 13,19 0,27 1,21 0,02 1,25 0,06 0,37 0,04 6,03 0,67 0,61 0,07 0,64 0,07 0,64 0,06 0,88 0,40 Não extraído, húmido Não extraído, húmido Não extraído, húmido Extraído, seco 93/98

Tabela 8. Efeito da hierarquia do fio nas propriedades mecânicas (isto é, o número de niveis e o número d< fibras por nivel podem influenciar significativamente os resultados do fio e tecido.

Geometria Condição # de níveis de dobragem Total # de fibras UTS(N) UTS desv. padrão (N) % de média % de dealong. desv. padrão do along. Rigidez média (N/mm) Desv. padrão da rigidez (N/mm) UTS por fibra Rigidez por fibra 1(0) x3(10) extraído 2 3 1,98 0,05 10,42 1,63 2,17 0,51 0,66 0,72 1(0) x3(10) x3(9) extraído 3 9 6,86 0,23 13,11 1,45 4,06 0,36 0,76 0,45 1(0) x3(10) x4(9) extraído 3 12 9,29 0,19 14,07 0,98 5,10 0,31 0,77 0,43 1(0) x4(10) extraído 2 4 2,66 0,14 11,98 1,54 2,08 0,31 0,72 0,52 1(0) x4(10) x3(9) extraído 3 12 8,78 0,17 14,25 1,09 5,10 0,32 0,73 0,43 15(0)x3(12) Não extraído seco 2 45 27,39 0,62 31,68 1,35 4,63 0,49 0,61 0,10 15(0) x3(12) x3(10) Não extraído seco 3 135 73,61 6,00 33,72 5,67 12,33 1,53 0,55 0,09

Tabela 9 Efeitos da modificação de superfície (esterilização a gás de RGD e ETO) nas propriedades mecânicas da matriz de seda extraída; foi usado PBS cano um controlo negativo durante os tratamentos de modificação

Fio # de fibras Modificação/ esterilização da superfície UTS (N) Desv. padrão Rigidez (N/mm) Desv. padrão UTS/fibra (N) Rigidez/fibra (N/mm) 12(0) x 3(10s) 36 Não tratado 25,94 0,24 6,45 0,77 0,72 0,18 12(0) x 3(1 Os) 36 RGD 23,82 2,10 3,79 2,06 0,66 0,11 12(0) x3(10s)x3(9z) 108 Não tratado 48,89 4,84 9,22 0,84 0,45 0,09 12(0) x3(10s)x3(9z) 108 RGD 55,28 3,28 8,17 0,81 0,51 0,08 4(11s) x3(11z) x3(10s) 36 ETO 18,72 0,45 5,52 0,42 0,52 0,15 4(11S) x3(11z) x3(10s) 36 RGD + ETO 19,30 0,62 4,67 0,3 0,54 0,13

Tabela 10 UTS Rigidez Limite de elasticidade Alongamento (N) (N/mm) (N) <%) Matriz 1 Seda 2337+/-72 354+/-26 1262+/-36 38,6+/-2,4 Matriz 2 Seda 3407+/-63 580+/-40 1647+/-214 29+/-4 ACL Humano 2160+/-157 242+/-28 -1200 -26-32%

Propriedades mecânicas para duas cordas diferentes com base no comprimento de corda de 3 cm, em comparação com propriedades de ACL humano 94/98

Tabela 11 : Nível de Torção (# de torções/cm) Matriz 1 Matriz 2 Matriz 3 Matriz 4 Matriz 5 Matriz 6 Matriz # fibras por grupo 30 15 1300 180 20 10 15 (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0) # grupos por conjunto 6 3 3 3 6 6 3 (3) (3) (2) (3,5) (3) (3) (3) # conjuntos por fio 3 6 1 3 3 3 3 (3) (2,5) (0) (2) (2) (2,5) (2,5) # filamentos por corda 6 3 - 2 3 3 3 (0) (2,0) (0) (D (2) (2) # cordas por ACL - 6 - - 3 6 12 (0) (0) (0) (0) UTS (N) 2337 3407 2780 2300 2500 2300 3400 Rigidez (N/mm) 354 580 300 350 550 500 550

Exemplos de várias hierárquicas geométricas que poderiam resultar em propriedades mecânicas adequadas para a substituição do ACL. Nota: A Matriz 1 e 2 foram desenvolvidas como mostrado nos exemplos; a Matriz 3 produziria uma única prótese de conjunto, a Matriz 4 produziria uma prótese de dois filamentos, a Matriz 5 produziria uma prótese de 3 cordas, a Matriz 6 é outra variação de uma prótese de 6 cordas e a Matriz 7 produziria uma prótese de 12 cordas.

Lisboa, 29 de Setembro de 2011 95/98

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido. 96/98

Documentos de Patente citados na descrição

WO 9703315 A US 5245012 A US 5252285 A US 5749040 A US 6302922 B US 5598615 A US 6175053 B US SN09950561 A

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Claims (13)

1. REINVIDlCAÇOES 1. Um implante de tecido biocompativel, o implante de tecido compreendendo: um fio, o dito fio compreendendo uma ou mais fibras de fibroina de seda de onde foi extraída a sericina que retêm, substancialmente, a sua estrutura de proteína nativa e não foram dissolvidos e reconstituídos, as ditas fibras de fibroina de seda de onde foi extraída a sericina sendo biocompatíveis e organizadas de forma aleatória, onde o dito fio promove o crescimento das células em redor das ditas fibras de fibroina de seda de onde foi extraída a sericina e onde as ditas fibras de fibroina de seda de onde foi extraída a sericina são biodegradáveis. 2. 0 implante de tecido como recitado na reivindicação 1, em que as fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina compreendem fibras de fibroina obtidas a partir do bicho-da-seda Bombyx mori. 3. 0 implante de tecido da reivindicação 1, em que o implante de tecido não é imunogénico. 4. 0 implante de tecido da reivindicação 1, em que as fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina incluem menos de 20% de sericina por peso.
2. 5. O implante de tecido da reivindicação 1, em que as fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina incluem menos de 10% de sericina por peso.
3. 6. O implante de tecido da reivindicação 1, em que as fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina incluem menos de 1% de sericina por peso. 1/7 7. 0 implante de tecido da reivindicação 1, em que o fio tem uma resistência à tracção de, pelo menos, 0,52 N por fibra.
4. 8. O implante de tecido da reivindicação 7, em que o fio tem uma rigidez entre cerca de 0,27 e cerca de 0,5 N/mm por fibra. 9. 0 implante de tecido da reivindicação 8, em que o fio retém 80% da sua UTS quando testado molhado. 10. 0 implante de tecido da reivindicação 8, em que o fio tem um alongamento na falha entre cerca de 10% e cerca de 50%.
5. 11. O implante de tecido da reivindicação 10, em que o fio tem uma vida de fadiga de, pelo menos, 1 milhão de ciclos numa carga de cerca de 20% da resistência à tracção do fio.
6. 12. O implante de tecido da reivindicação 1, em que o fio compreende fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina paralelas ou entrelaçadas.
7. 13. O implante de tecido da reivindicação 12, em que o fio compreende, pelo menos, três fibras de fibroina extraídas alinhadas. 14. 0 implante de tecido da reivindicação 13, em que as fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina alinhadas são entrelaçadas. 15. 0 implante de tecido da reivindicação 14, em que o fio é um fio texturado, entrelaçado, torcido, em cabo e combinações dos mesmos. 2/7 16. 0 implante de tecido da reivindicação 15, em que as fibras de fibroina de onde foi extraída a sericina alinhadas são torcidas ou cabladas em redor umas das outras em 0 a 11,8 torções por cm. 17. 0 implante de tecido da reivindicação 1, compreende ainda um fio com uma organização hierárquica de nível único, a dita organização hierárquica de nível único compreendendo um grupo de fios paralelos e entrelaçados. 18. 0 implante de tecido da reivindicação 1, compreende ainda um fio com uma organização hierárquica de dois níveis, a dita organização hierárquica de dois níveis compreendendo um conjunto de grupos entrelaçados. 19. 0 implante de tecido da reivindicação 1, compreende ainda um fio com uma organização hierárquica de três níveis, a dita organização hierárquica de três níveis compreendendo um fio de conjuntos entrelaçados. 20. 0 implante de tecido da reivindicação 1, compreende ainda um fio com uma organização hierárquica de quatro níveis, a dita organização hierárquica de quatro níveis compreendendo uma corda de fios entrelaçados. 21. 0 implante de tecido da reivindicação 1, em que o fio é torcido em ou abaixo das 11,8 torções por cm (30 torções por polegada). 22. 0 implante de tecido da reivindicação 1, em que os vários fios são entrelaçados para formar um tecido.
8. 23. O implante de tecido da reivindicação 1, em que o implante de tecido compreende um compósito de fibras de 3/7 fibroína de onde foi extraída a sericina e um ou mais polímeros degradáveis seleccionados do grupo que consiste em colagénio, ácido poliláctico ou seus copolímeros, ácido pologlicólico ou seus copolímeros, polianidridos, elastina, glicosaminoglicanos e polissacarídeos. 24. 0 implante de tecido da reivindicação 19, em que vários fios são organizados de forma não aleatória num tecido seleccionado do grupo que consiste de tecidos tecidos, tecidos tricotados, tecidos de malha-urdidura, tecidos unidos, tecidos revestidos, tecidos contracolados, tecidos laminados, malhas e combinações dos mesmos. 25. 0 implante de tecido da reivindicação 19, em que vários fios são aleatoriamente organizados num tecido não tecido. 26. 0 implante de tecido da reivindicação 1, compreendendo ainda um fármaco associado a um implante de tecido. 27. 0 implante de tecido da reivindicação 1, compreendendo ainda um factor de célula anexado associado ao implante de tecido. 28. 0 implante de tecido da reivindicação 27, em que o factor de anexação de célula é RGD. 29. 0 implante de tecido da reivindicação 1, em que o implante de tecido é tratado com plasma de gás.
9. 30. O implante de tecido da reivindicação 1, compreendendo ainda umas células biológicas inoculadas no implante de tecido. 4/7
10. 31. Um método para formar um implante de tecido compreendendo: a) Alinhar as fibras de fibroina de seda em paralelo ou entrelaçadas com outras fibras de fibroina de seda para formar um fio, b) Remover sericina de forma substancial das fibras de fibroina de seda sem alterar, substancialmente, a estrutura nativa da fibroina nas fibras, e c) Organizar vários fios para formar um implante de tecido biocompatível para implantação, as fibras de fibroina de seda sendo biocompatíveis e que não tenham sido dissolvidas e reconstituídas, e onde os vários fios são biodegradáveis e promovem o crescimento de células em redor das fibras de fibroina da seda. 32. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda entrelaçamento das fibras de seda paralelas antes da sericina ser extraída. 33. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda entrelaçamento das fibras de seda paralelas após a sericina ser extraída. 34. 0 método da reivindicação 31, compreendendo ainda alinhar múltiplas fibras de fibroina em fios, onde cada fio compreende, pelo menos, três fibras paralelas ou entrelaçadas. 35. 0 método da reivindicação 34, em que as fibras de fibroina de cada fio são torcidas sobre cada uma entre 0 a 11,8 torções por cm. 5/7 36. 0 método da reivindicação 31, em que vários fios sao torcidos em redor de cada um entre 0 a 11,8 torções por cm. 37. 0 método da reivindicação 31, em que a sericina é extraída de não mais de cerca de 50 fibras de fibroína paralelas ou entrelaçadas. 38. 0 método da reivindicação 31 , em que o fio é torcido em ou abaixo das 11,8 torções por cm (30 torçoes por polegada). 39. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda a formaçao de um tecido tricotado ou tecido a partir de vários fios organizados de forma não aleatória. 40. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda a formação de um tecido não tecido a partir de vários fios organizados de forma aleatória.
11. 41. O método das reivindicações 39 e 40, em que o tecido é formado após a sericina ser extraída a partir de fibras nos f ios .
12. 42. O método das reivindicações 39 e 40, em que o tecido é formado antes de a sericina ser extraída a partir de fibras nos fios. 43. 0 método das reivindicações 39 a 40, em que o fio é exposto a uma força não maior do que o seu limite de elasticidade.
13. 44. O método da reivindicação 31 compreende ainda a associação de um fármaco ao tecido. 6/7 45. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda a associação de um factor de anexação de células com o implante de tecido. 46. 0 método da reivindicação 45 compreende ainda a associação de um RGD com o tecido do implante. 47. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda tratar o implante de tecido com plasma de gás. 48. 0 método da reivindicação 31 compreende ainda: esterilizar o implante de tecido. Lisboa, 29 de Setembro de 2011 7/7