PT1546357E

PT1546357E - Polipéptidos imunogénicos de mycoplasma hyopneumoniae

Info

Publication number: PT1546357E
Application number: PT37423084T
Authority: PT
Inventors: Chris F Minion; Steven P Djordjevic
Original assignee: Univ Iowa State Res Found Inc; Dept Of Agriculture For & On Behalf Of The State Of New South Wales
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2013-09-10
Also published as: EP1546357B1; US20040091901A1; EP1546357A2; AU2003280431A8; US7858345B2; AU2003280431A1; WO2004003161A2; SI1546357T1; US20090010957A1; US7419806B2; BR0312274A; ES2427115T3; EP1546357A4; WO2004003161A3; DK1546357T3

Description

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DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS IMUNOGÉNICOS DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE"

Antecedentes 1. Campo Técnico São aqui descritos métodos e materiais envolvidos na protecção de animais contra a pneumonia enzoótica. 2. Informação Antecedente A pneumonia enzoótica em porcos, também denominada de pneumonia micoplásmica, é causada por Mycoplasma hyopneumoniae. A doença é crónica e não fatal, afectando os porcos de todas as idades. Embora os porcos infectados exibam somente sintomas suaves de tosse e febre, a doença tem um impacto económico significativo devido à redução na eficácia da alimentação e redução no ganho de peso. A pneumonia enzoótica e transmitida por organismos existentes no ar expelidos a partir dos pulmões dos porcos infectados. A infecção primária, pela M. hyopneumoniae pode ser seguida por uma infecção secundária de outras espécies de Mycoplasma, como por exemplo, o Mycoplasma hyorhinis e o Mycoplasma flocculare, bem como por outros patogénios bacterianos. 2 ΡΕ1546357 A M. hyopneumoniae infecta o trato respiratório dos porcos colonizando a traqueia, os brônquios e os bronquiolos. 0 patogénio produz um factor ciliostático que faz com que os cilios que revestem as passagens respiratórias parem de bater. Possivelmente, os cilios degeneram, deixando os porcos sujeitos a infecção através de patogénios secundários. As lesões caracteristicas de áreas de consolidação de cor púrpura até cinza são observadas em porcos infectados. As pesquisas em porcos abatidos revelaram lesões em 30% até 80%. Os resultados de 37 varas de porcos em 13 estados indicaram que 99% das varas tinham porcos com lesões de pneumonia tipicas da pneumonia enzoótica. Deste modo, existe uma necessidade para medidas eficazes de prevenção e de tratamento.

Os micoplasmas variam a sua estrutura de superfície através de uma série complexa de eventos genéticos para apresentar um mosaico estrutural ao sistema imunitário do hospedeiro. A troca de fases das moléculas de superfície ocorre através de uma variedade de mecanismos tais como as mudanças no número de unidades repetitivas durante a replicação do ADN, inversões genómicas, eventos de transposição, e/ou conversão de genes. Ver, por exemplo, Zhang e Wise, 1997, Mol. Microbiol., 25: 859-69; Theiss e Wise, 1997, J. Bacteriol., 179: 4013-22; Sasche et al., 2000, Infect. Immun. 68: 680-7; Dybvig e Uy, 1994, Mol. Microbiol., 12: 547-60; e Lysnyansky et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 5395-5401. Todos os genes identificados de 3 ΡΕ1546357 variáveis de fase de troca de fases em micoplasmas que codificam para as proteinas de superficie são lipopro-teinas.

Sumário São descritos materiais e métodos para a protec-ção de um animal contra a pneumonia enzoótica. Descobriram-se ácidos nucleicos da Mycoplasma hyopneumoniae que codificam para os polipéptidos da superficie da célula que podem ser usados para a indução de uma resposta imune pro-tectora num animal susceptivel a pneumonia. Mais especi-ficamente, são descritos polipéptidos imunoqénicos purificados desses polipéptidos para serem usados como antiqénios para provocar uma resposta imune num animal, como por exemplo um porco. Além disso, são descritos ácidos nucleicos isolados que codificam esses polipéptidos imunogénicos para serem usados na geração de uma resposta imune num animal. Os polipéptidos purificados e os ácidos nucleicos isolados aqui descritos podem ser combinados com veiculos farmaceuticamente aceitáveis para serem introduzidos num animal. São discutidos materiais e métodos para determinar se um animal tem um anticorpo relativo aos polipéptidos aqui descritos.

Num aspecto, a invenção proporciona um polipé-ptido imunogénico purificado com um comprimento de 8 a 30 aminoácidos, cuja sequência de aminoácidos compreende pelo menos oito residuos consecutivos de uma sequência de SEQ ID NO: 8 . 4 ΡΕ1546357

Noutro aspecto, a invenção proporciona mutantes do polipéptido imunogénico acima descrito, em que tais polipéptidos mutantes retêm a imunogenicidade e têm uma variação de aminoácido conservativa em comparação com o polipéptido nativo.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma composição que inclui um ou mais dos polipéptidos imunogénicos descritos acima ou polipéptidos mutantes imunogénicos da invenção.

Num aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo os polipéptidos imunogénicos descritos acima ou polipéptidos mutantes imunogénicos da invenção para utilização para provocar uma resposta imune num animal. Uma tal composição pode ser administrada por via oral, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Um animal representativo no qual as composições da invenção podem ser introduzidas é um suino.

Num outro aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que consiste numa sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido imunogénico com um comprimento de 8 a 30 aminoácidos, a sequência de aminoácidos da qual compreende pelo menos oito resíduos consecutivos de uma sequência de SEQ ID N° 8 ou um mutante do polipéptido imunogénico em que o mutante tem uma variação de um aminoácido conservativa em comparação com o 5 ΡΕ1546357 polipéptido nativo e em que o polipéptido mutante retêm imunogenicidade. Um ácido nucleico representativo que codifica para tais polipéptidos imunogénicos tem uma sequência nucleotidica que é um fragmento de SEQ ID NO: 7. A invenção também proporciona um vector que contém um ácido nucleico da invenção. Um vector pode ainda incluir uma sequência de controlo de expressão ligada de forma operacional ao ácido nucleico. Além disso, a invenção proporciona células hospedeiras que compreendem tais vectores. A invenção também proporciona uma composição que inclui tais vectores e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Ainda num outro aspecto, a invenção proporciona uma composição da invenção para provocar uma resposta imune num animal. Tais composições podem ser administradas por via oral, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Geralmente, o animal é um suino.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método determinação se um animal tem ou não um anticorpo reactivo a um polipéptido imunogénico da invenção, compreendendo o método: contactar uma amostra de teste do referido animal com o polipéptido imunogénico sob condições permissiveis para ligação especifica do polipéptido imunogénico com o anticorpo; e detectar a presença ou a ausência da ligação especifica, em que a presença de uma ligação especifica indica que o animal tem o anticorpo, e a 6 ΡΕ1546357 ausência da ligação especifica indica que o animal não tem o anticorpo.

Geralmente, uma amostra de teste apropriada é um fluido biológico tal como o sangue, fluido nasal, fluido da garganta, ou fluido do pulmão. Nalgumas das realizações, o polipéptido imunogénico está ligado a um suporte sólido tal como uma microplaca, ou esferas de poliestireno. Nalgumas realizações, o polipéptido imunogénico é marcado. A titulo de exemplo, o passo de detecção pode ser executado por um radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA), ou ensaio de imunossorção ligado a enzima (ELISA).

Noutro aspecto, a invenção proporciona um kit de diagnóstico para a detecção da presença de um anticorpo numa amostra de teste, em que esse anticorpo é reactivo a um polipéptido imunogénico da invenção. Esse kit pode compreender um ou mais dos polipéptidos imunogénicos da invenção. A não ser se definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que normalmente entendido por qualquer pessoa competente na técnica à qual esta invenção diz respeito. Apesar de métodos ou materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório poderem ser usados na prática ou no teste da presente invenção, são descritos abaixo métodos e materiais adequados. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo as definições, irá con- 7 ΡΕ1546357 trolar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se pretende que sejam limitativos .

Outras caracteristicas e vantagens da invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C2-mhp210 (SEQ ID NO: 1), um parálogo P012 da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 2 é a sequência de polipéptido de C2- MHP210 (SEQ ID NO: 2) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 3 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C2-mhp211 (SEQ ID NO: 3) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 4 é a sequência de polipéptido de C2- MHP211 (SEQ ID NO: 4) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 5 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C27-mhp348 (SEQ ID NO: 5), um parálogo P102 a da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. ΡΕ1546357 A FIG. 6 é a sequência de polipéptido de C27 MHP348 (SEQ ID NO: 6) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 7 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C28-mhp545 (SEQ ID NO: 7) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 8 é a sequência de polipéptido de C28- MHP545 (SEQ ID NO: 8) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 9 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C28-mhp662 (SEQ ID NO: 9) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 10 é a sequência de polipéptido de C28-MHP662 (SEQ ID NO: 10) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 11 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C28-mhp663 (SEQ ID NO: 11), um parálogo de P102 da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 12 é a sequência de polipéptido de C28 MHP663 (SEQ ID NO: 12) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 13 é a sequência de ácido nucleico que codifica C2-mhp036 (SEQ ID NO: 13), um parálogo de P102 da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. 9 ΡΕ1546357 A FIG. 14 é a sequência de polipéptido de C2- MHP036 (SEQ ID NO: 14) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 15 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C2-mhp033 (SEQ ID NO: 15), um parálogo parcial de P102 da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 16 é a sequência de polipéptido de C2- MHP033(SEQ ID NO: 16) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 17 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C2-mhp034 (SEQ ID NO: 17), um parálogo parcial de P102 da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 18 é a sequência de polipéptido de C2- MHP034 (SEQ ID NO: 18) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A FIG. 19 é a sequência de ácido nucleico que codifica para C2-mhp545 (SEQ ID NO: 19) da estirpe J de M. hyopneumoniae. A FIG. 20 é a sequência de polipéptido de C28-MHP545 (SEQ ID NO: 20) da estirpe J de M. hyopneumoniae. A FIG. 21 é a estrutura dos parálogos P102 e a sua organização no cromossoma. A FIG. 22 mostra um mapa e um gráfico da hidro-filicidade de P216. O painel superior mostra um diagrama 10 ΡΕ1546357 esquemático da sequência de proteínas de P216. Os asteriscos indicam as localizações dos péptidos usados para a clonagem do gene (esquerda, aminoácidos 94-105) e usados para produzir anti-soros específicos para P130 (direita, aminoácidos 1654-1668). A seta indica a posição do evento principal de clivagem. A caixa cinzenta indica a posição do fragmento de 30 kDa clonado e expresso (aminoácidos 1043-1226). Os triângulos cheios invertidos são as localizações dos resíduos de triptofano codificados pelos codões TGA. As caixas a tracejado são as localizações dos domínios da espiral enrolada. A caixa branca indica a localização do BNBD (aminoácidos 1012-1029). A caixa preta representa o domínio transmembranar (aminoácidos 7-30). O painel inferior representa o gráfico de hidrofilicidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA

As seguintes abreviaturas são usadas neste pedido de patente: aa, aminoácido(s); Ab, anticorpo(s); bp par(es) de base(s); CHEF, campo eléctrico homogéneo fechado; H., Haemophilus; kb, quilobase(s) ou 1000 pb; Kn, canamicina; LB, meio de Luria-Bertoni; M., Mycoplasma; mAb, Ab monoclonal; ORF, grelha de leitura aberta; PCR, reacção em cadeia de polimerase; R, resistente/resistência; Tn, transposão(ões); junção nova (fusão ou inserção). As designações em códigos de uma letra e de três letras para os aminoácidos são dadas na Tabela 1. ΡΕ1546357 11 TABELA 1

Designação em Código dos Aminoácidos

Aminoácido Código de três letras Código de uma letra Aminoácido Código de três letras Código de uma letra Alanina Ala A Leucina Leu L Arginina Arg R Usina Lys K Asparagina Asn N Metionina Met M Ácido aspártico Asp D Fenilalanina Phe F Cisteina Cys C Prolina Pro P Ácido glutâmico Glu E Serina Ser S Glutamina Gin Q Treonina Thr T Glicina Gly G Triptofano Trp W Histidina His H Tirosina Tyr Y Isoleucina Ile I Valina Vai V

Polipéptidos e ácidos nucleicos de M. hyopneumoniae

Tal como aqui usado, o termo "polipéptido" refere-se a um polímero de três ou mais aminoácidos ligados de forma covalente através de ligações amida. Um polipéptido pode ou não pode ser modificado após a tradução. Tal como aqui utilizado, o termo "polipéptido purificado" refere-se uma preparação de polipéptido que esteja substancialmente isenta de material celular ou outros polipéptidos contaminantes a partir da fonte das células ou de tecido a partir da qual o polipéptido é derivado, ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizado. Por exemplo, uma preparação de polipéptido é substancialmente isenta de material celular quando o 12 ΡΕ1546357 polipéptido é separado a partir de componentes de células a partir das quais o polipéptido é obtido ou produzido de forma recombinante. Assim, uma preparação de polipéptido que seja substancialmente isenta de material celular inclui, por exemplo, uma preparação com menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (peso seco) de polipéptidos heterólogos (também aqui referidos como "polipéptidos con-taminantes"). Quando um polipéptido é produzido de forma recombinante, o polipéptido também é preferentemente substancialmente isento de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, 10%, 5% do volume da preparação de polipéptido. Quando um polipéptido é produzido através da sintese quimica, ele é preferencialmente substancialmente isento de precursores químicos ou de outros produtos químicos, isto é, ele é separado de precursores químicos ou de outros produtos químicos que estejam envolvidos na síntese do polipéptido. Deste modo, essas preparações de polipéptido têm menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou outros compostos que não o polipéptido de interesse.

Tal como aqui utilizado, o termo "mutante" refere-se a um polipéptido, ou a um ácido nucleico que codifica para um polipéptido, que tem uma ou mais variações conservadas de aminoácido ou outras modificações menores de modo que (1) o polipéptido correspondente tem uma função substancialmente equivalente quando comparado com o polipéptido nativo ou (2) um anticorpo contra o polipéptido é imunorreactivo com o polipéptido nativo. 13 ΡΕ1546357 0 termo "variação conservada" indica a substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo biologicamente similar, ou a substituição de um nucleótido numa sequência de ácido nucleico de tal forma que o resíduo de aminoácido codificado não mude ou seja um outro resíduo biologicamente similar. Os exemplos de variações conservadas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como a isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina pela lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, e semelhantes. A expressão "variação conservada" também inclui o uso de aminoácidos substituídos em vez de um amimo ácido não substituído desde que os anticorpos estimulados em relação ao polipéptido substituído também apresentem uma imunorreacção com o polipéptido não substituído.

Qualquer estirpe de M. hyopneumoniae pode ser usada como o material de partida para a produção de polipéptidos e de ácidos nucleicos da presente invenção. As estirpes adequadas de M. hyopneumoniae podem ser obtidas através de uma variedade de fontes, incluindo depositários tais como a American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va.) e a NRRL Culture Collection (Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111.) . As estirpes de M. hyopneumoniae também podem ser obtidas a partir da secreção de pulmões ou de tecidos de animais doentes seguida pela inoculação em meio de cultura adequado. 14 ΡΕ1546357

Um polipéptido imunogénico da presente invenção tem um comprimento de 8-30 aminoácidos e compreende pelo menos 8 residuos consecutivos da sequência apresentada na FIG. 8. Um polipéptido imunogénico da presente invenção tem oito ou mais aminoácidos de comprimento. Por exemplo polipéptido imunogénico pode ter um comprimento de 10, 12, 15, 20, 25, 30. Um polipéptido da presente invenção também pode ser um mutante de um polipéptido com 8-30 aminoácidos de comprimento e compreende pelo menos 8 residuos consecutivos da sequência de aminoácidos apresentada na FIG. 8. As mutações tanto ao nivel dos aminoácidos como ao dos ácido nucleicos podem ser úteis no aumento do rendimento dos polipéptidos, na sua imunogenicidade ou antigenicidade, ou na sua compatibilidade com os vários sistemas de expressão, adjuvantes e modos de administração. Os fragmentos sintéticos ou recombinantes dos polipéptidos nativos ou mutados são caracterizados por um ou mais dos sitios antigénicos dos polipéptidos M. hyopneumoniae naturais, cujas sequências são ilustradas nas FIG. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser obtidos a partir das células de M. hyopneumoniae ou podem ser produzidos em células hospedeiras transformadas através de ácidos nucleicos que codifiquem para esses polipéptidos. Os polipéptidos recombinantes produzidos através de células hospedeiras transformadas podem incluir residuos que não estejam relacionados com o M. hyopneumoniae. Por exemplo, 15 ΡΕ1546357 um polipéptido recombinante pode ser um polipéptido de fusão contendo uma porção de aminoácido derivada a partir de um vector de expressão, ou de outra origem, além da parte derivada a partir de M. hyopneumoniae. Um polipéptido recombinante também pode incluir uma metionina de partida. Os polipéptidos recombinantes da invenção apresentam a antigenicidade dos polipéptidos de M. hyopneumoniae nativos, cuja sequências é ilustradas na FIG. 8.

As sequências de ácido nucleico que codificam para a SEQ ID NO: 8 completa são ilustrados na FIG. 7. A presente invenção engloba as sequências de ácido nucleico que codificam para os polipéptidos imunogénicos da invenção, ou seja, capazes de estimular anticorpos ou outras respostas imunes (por exemplo, respostas de células T do sistema de imune) que reconhecem os epitopos do polipéptido com a sequência ilustrada na FIG. 8. 0 termo "ácido nucleico" tal como aqui utilizado engloba o ARN e o ADN, incluindo o cADN, o ADN genómico e o ADN sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente). 0 ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando é de cadeia simples, o ácido nucleico pode ser a cadeia de sentido directo ou a cadeia sentido inverso. Além disso, o ácido nucleico pode ser circular ou linear. 0 termo "isolado" tal como aqui utilizado com refere-se a um ácido referência a um ácido nucleico, 16 ΡΕ1546357 nucleico de ocorrência natural que não esteja imediatamente contiguo com ambas as sequências com as quais está imediatamente contiguo (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma nativo do organismo a partir do qual ele é derivado. Por exemplo, um ácido nucleico isolado pode ser, sem limitação, uma molécula de ADN recombinante de qualquer comprimento, desde que uma das sequências do ácido nucleico encontradas normalmente a flanquear imediatamente aquela molécula do ADN recombinante num genoma de ocorrência natural seja removida ou esteja ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, um ADN recombinante que exista como uma molécula separada (como por exemplo um fragmento de cADN ou de um ADN genómico produzido por tratamento com PCR ou com endonuclease de restrição), independente de outras sequências bem como o ADN recombinante que esteja incorporado num vector, um plasmídeo que se replica de forma autónoma, um virus (como por exemplo um retrovirus, adenovirus ou virus do herpes) ou no ADN genómico de um procariota ou de um eucariota. Além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir uma molécula de ADN recombinante que seja parte de uma sequência de ácido nucleico híbrida ou de fusão. 0 termo "isolado" tal como aqui utilizado em relação a ácido nucleico, também inclui qualquer ácido nucleico de ocorrência não natural, uma vez que as sequências de ácidos nucleicos de ocorrência não natural não são encontradas na natureza e não tem sequências imediatamente contíguas num genoma de ocorrência natural. 17 ΡΕ1546357

Por exemplo, um ácido nucleico de ocorrência não natural tal como um ácido nucleico fabricado é considerado como sendo um ácido nucleico isolado. Os ácidos nucleicos fabricados podem ser preparados utilizando técnicas de clonagem molecular comuns ou sintese quimica de ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos de ocorrência não natural isolados podem ser independentes de outras sequências, ou incorporados num vector, num plasmídeo que se replica de forma autónoma, um virus (por exemplo, um retrovirus, um adenovirus, ou um virus do herpes), ou o ADN genómico de um procariota ou de um eucariota. Além disso, um ácido nucleico de ocorrência não natural pode incluir uma molécula de ácido nucleico que seja parte de uma sequência de ácido nucleico hibrida ou de fusão.

Tomar-se-á evidente para os peritos na técnica que um ácido nucleico que existe entre centenas e milhões de outras moléculas de ácido nucleico em, por exemplo, cADN ou bibliotecas genómicas, ou em porções de gel que contenham digestões de restrição de ADN genómico não deve ser considerado como um ácido nucleico isolado. 0 termo "exógeno" tal como aqui utilizado com referência a um ácido nucleico e a uma célula particular refere-se a qualquer ácido nucleico que não seja originário daquela célula especifica tal como encontrada na natureza. Assim, considera-se que o ácido nucleico de ocorrência não natural é exógeno em relação a uma célula uma vez introduzido na célula. É importante notar que o ácido 18 ΡΕ1546357 nucleico de ocorrência não natural pode conter sequências de ácido nucleico ou fragmentos de sequências de ácido nucleico que são encontradas na natureza, desde que o ácido nucleico como um todo não exista na natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico contendo uma sequência de ADN genómico no interior de um vector de expressão é um ácido nucleico de ocorrência não natural, e desse modo é exógeno em relação a uma célula uma vez introduzido na célula, uma vez que a molécula de ácido nucleico como um todo (DNA genómico mais o ADN do vector) não existe na natureza. Assim, qualquer vector, plasmídeo que se replica de forma autónoma, ou virus (por exemplo, retrovirus adenovírus ou virus do herpes) que como um todo não exista na natureza é considerado como sendo um ácido nucleico de ocorrência não natural. Segue que os fragmentos de ADN genómico produzidos através de PCR ou de tratamento com endonucleases de restrição assim como os cADN são considerados como sendo ácidos nucleicos de ocorrência não natural, uma vez que eles existem como moléculas separadas não encontradas na natureza. Também se segue que qualquer ácido nucleico que contenha uma sequência promotora e uma sequência que codifica para um polipéptido (por exemplo, cADN ou ADN genómico) num arranjo não encontrado na natureza é um ácido nucleico que não ocorre de forma natural.

Um ácido nucleico que ocorra de forma natural pode ser exógeno relativamente a uma célula particular. Por exemplo, um cromossoma inteiro isolado a partir de uma 19 ΡΕ1546357 célula da pessoa X é um ácido nucleico exógeno em relação a uma célula da pessoa Y uma vez que aquele cromossoma é introduzido na célula de Y. São também proporcionadas moléculas de ácido nucleico recombinantes que são úteis para a preparação dos polipéptidos acima mencionados. As moléculas de ácido nucleico recombinantes preferidas incluem, sem limitação, (1) aquelas que codificam tem uma sequência de ácido nucleico ilustrada na FIG. 79; (2) vectores de clonagem ou de expressão contendo sequências que codificam para polipéptidos recombinantes da presente invenção; (3) sequências de ácido nucleico que se hibridam com aquelas sequências que codificam para os polipéptidos de M. Hyopneumoniae da invenção; (4) sequências de ácido nucleico degeneradas que codificam para polipéptidos da invenção.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser inseridos no interior de qualquer um de uma grande variedade de vectores de expressão através de uma variedade de procedimentos, de um modo geral através da utilização de um sitio de restrição de endonuclease apropriado. Os vectores apropriados incluem, por exemplo, vectores que consistem em segmentos de sequências de ácido nucleico cromossómico, não cromossómico e sintético, tais como vários derivados conhecidos de SV40; plasmideos bacterianos conhecidos, como por exemplo plasmideos de E. coli incluindo col El, pCRl, pBR322, pMB9 e os seus derivados; plasmideos com uma gama mais alargada de hospedeiros, por 20 ΡΕ1546357 exemplo RP4; os ADN de fagos, como por exemplo os numerosos derivados de fago λ, por exemplo NM 98 9, e outros fagos de ADN tais como M13 ou fagos filamentosos de ADN de cadeia simples; plasmídeos de levedura tais como o plasmideo 2μ ou os seus derivados; ADN virai tais como o baculovirus, vaccinia, adenovirus, virus da varicela, ou pseudo-raiva; e vectores derivados a partir de combinações de plasmideos e de ADN fagos, tais como plasmideos que tenham sido modificados para o emprego de ADN de fagos ou outras sequências de controlo de expressão.

Dentro de cada vector especifico de clonagem ou de expressão, podem ser seleccionados diversos sítios para a inserção dos ácidos nucleicos desta invenção. Esses sítios são geralmente designados pelas endonucleases de restrição que os cortam, e existem diversos métodos conhecidos para a inserção de ácidos nucleicos no interior de tais sítios para a formação das moléculas recombinantes. Esses métodos incluem, por exemplo resíduos de dG-dC ou dA-dT, ligação directa, ligantes sintéticos, reacções de reparação associadas a exonuclease e polimerase seguidas por ligação, ou extensão da cadeia do ácido nucleico com a ADN polimerase e um padrão apropriado de cadeia simples seguido por ligação. Deve ser entendido que um vector de clonagem ou de expressão útil nesta invenção não necessita de ter um sitio de restrição de endonuclease para a inserção do fragmento do ácido nucleico escolhido, e que aquela inserção pode ocorrer através de meios alternativos. 21 ΡΕ1546357

Para a expressão dos ácidos nucleicos desta invenção, essas sequências de ácido nucleico são ligadas de modo operativo a uma ou mais sequências de controlo de expressão no vector de expressão. Tal ligação operativa, que pode ser efetuada antes ou depois do ácido nucleico escolhido ser inserido num veiculo de clonagem, permite as sequências de controlo de expressão controlarem e promover a expressão do ácido nucleico inserido.

Qualquer uma de uma grande variedade de sequências de controlo de expressão - sequências que controlam a expressão de um ácido nucleico quando ligadas de forma operativa ao mesmo - podem ser usadas nesses vectores expressar as sequências de ácido nucleico desta invenção. Tais sequências de controlo de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, os sistemas lac ou trp, o sistemas TAC ou TRC, as regiões operadoras e promotoras principais de λ, as regiões de controlo da proteína de revestimento fd, o promotor para a 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicoliticas, os promotores para a fosfatase ácida, como por exemplo, Pho5, os promotores dos factores alfa de cruzamento da levedura, e outras sequências conhecidas por controlar a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou dos seus vírus, e várias das suas combinações. 0 vector de expressão também inclui uma sequência não codificante para um sítio de ligação de ribossoma para a iniciação da tradução e um terminador de transcrição. 0 vector também pode incluir sequências apropriadas para a amplificação da 22 ΡΕ1546357 expressão. Em células de mamíferos, é adicionalmente possível a amplificação das unidades de expressão através da ligação do gene àquela que codifica para a desidrofolato reductase e aplicando uma selecção para células hospedeiras de ovário de hamster Chinês. 0 vector ou o veiculo de expressão, e em particular, os sitios escolhidos nos mesmos para a inserção do fragmento de ácido nucleico seleccionado, e a sequência de controlo de expressão empregue nesta invenção são determinados por uma variedade de factores, por exemplo, o número de sítios susceptíveis a uma enzima de restrição particular, a dimensão do polipéptido a ser expresso, características de expressão tais como a localização dos codões de início e de paragem em relação às sequências do vector, e outros factores reconhecidos pelos peritos na técnica. A escolha de um vector, sequência de controlo de expressão, e/ou sítio da inserção são determinados por um equilíbrio desses factores, uma vez que nem todas as selecções são igualmente eficazes para um determinado caso. A molécula de ácido nucleico recombinante que contém a sequência codificante desejada ligada de forma operacional a uma sequência de controlo de expressão pode então ser empregue para a transformação de uma ampla variedade de hospedeiros de modo a permitir que esses hospedeiros (transformantes) expressem a sequência codificante, ou um seu fragmento, e produzir o polipéptido, ou uma sua porção, para qual o ácido nucleico híbrido 23 ΡΕ1546357 codifica. A molécula do ácido nucleico recombinante também pode ser empregue para transformar um hospedeiro de tal forma a permitir que o hospedeiro sob replicação produza moléculas adicionais do ácido nucleico recombinante como uma fonte de sequências codificantes de M. hyopneumoniae e seus fragmentos.

Uma ampla variedade de hospedeiros são também úteis para a produção dos polipéptidos e dos ácidos nucleicos desta invenção. Esses hospedeiros incluem, por exemplo, bactérias tais como E. coli, Bacillus e Streptomyces, fungos tais como leveduras, e células animais ou de plantas em cultura de tecidos. A selecção de um hospedeiro apropriado para essas utilizações é controlada por diversos factores. Esses incluem, por exemplo, compatibilidade com o vector escolhido, toxicidade dos produtos secundários, facilidade de recuperação do polipé-ptido desejado, caracteristicas da expressão, biossegurança e custos. Não pode ser feita uma escolha absoluta do hospedeiro para uma molécula de ácido nucleico recombinante ou de um polipéptido particulares apenas a desses factores. No vez disso, um equilíbrio desses factores é aplicado com a percepção de que nem todos os hospedeiros podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma molécula de um ácido nucleico recombinante específica.

Também é entendido que as sequências de ácido nucleico que são inseridas no sítio seleccionado de um vector de expressão ou de clonagem podem incluir nucleótidos que não façam parte da sequência codificante 24 ΡΕ1546357 real para o polipéptido desejado ou podem incluir apenas um fragmento da totalidade da sequência codificante para aquele polipéptido. É apenas necessário que qualquer que seja a sequência de ADN utilizada, o hospedeiro transformado produza um polipéptido que tenha antigenicidade dos polipéptidos nativos de M. hyopneumoniae.

Por exemplo num vector de expressão desta invenção, um ácido nucleico desta invenção pode ser fundido na mesma grelha de leitura a uma porção de uma sequência de ácido nucleico que codifica para pelo menos um polipéptido transportados eucariótico ou procariótico, ou para uma sequência de ácido nucleico que codifica para, pelo menos, uma sequência de sinal eucariótica ou procariótica, ou suas Tais construções podem auxiliar na expressão da sequência de ácido nucleico desejada ou melhorar a purificação, permitir a secreção e de preferência a maturação do polipéptido desejado a partir da célula hospedeira. A sequência de ácido nucleico pode alternativamente incluir um codão de iniciação ATG, isoladamente ou em conjunto com outros codões, fundido directamente à sequência que codifica para primeiro aminoácido de um polipéptido desejado. Tais construções permitem a produção de, por exemplo, um polipéptido de metionilo ou de outro peptidilo que seja parte desta invenção. Esta metionina ou péptido N-terminal pode então ser clivado de forma intracelular ou extracelular através de uma variedade de processos conhecidos, ou o polipéptido pode ser usado em conjunto com a metionina ou outra fusão a ele ligada nas composições e métodos desta invenção. 25 ΡΕ1546357 A sequência de ácido nucleico apropriada presente no vector quando introduzida dentro de um hospedeiro pode expressar parte ou somente uma parte do polipéptido que é codificado, sendo suficiente que o polipéptido expresso seja capaz de estimular um anticorpo ou outra resposta imune que reconheça um epitopo da sequência de aminoácido apresentada na FIG. 8. Por exemplo, ao utilizar E. coli como organismo hospedeiro, o codão UGA é um codão de terminação de modo que o polipéptido expresso só pode ser um fragmento do polipéptido codificado pelo vector, e como tal, é geralmente preferido que todos os codões UGA na sequência de ácido nucleico apropriada sejam convertidos em codões que não são de terminação. Alternativamente, uma sequência de ácido nucleico adicional que codifique para um t-ARN que traduza o codão UGA num resíduo de triptofano pode ser introduzida no hospedeiro. 0 polipéptido expresso pelo hospedeiro transformado pelo vector pode ser recolhido através de métodos conhecidos pelos peritos na técnica e usados para a protecção de um animal não humano tal como um porco, gado, etc., contra a pneumonia enzoótica causada por M. hyopneumoniae. 0 polipéptido é usado numa quantidade eficaz para proporcionar protecção contra a pneumonia enzoótica causada por M. hyopneumoniae e pode ser usado em combinação com um veículo adequado fisiologicamente aceitável tal como descrito abaixo. 26 ΡΕ1546357

Detecção de M. hyopneumoniae

Os polipéptidos da presente invenção também podem ser usados como antigénios para fins de diagnóstico para a determinação de se uma amostra de teste biológico contém antigénios de M. hyopneumoniae ou anticorpos para esses antigénios. Tais testes para a infecção por M. hyopneumoniae num animal envolve de forma típica a incubação de uma amostra biológica que contenha anticorpos de um animal que se suspeita ter uma tal condição na presença de um poli-péptido da presente invenção marcado que possa ser detectado, e detectando a ligação. 0 polipéptido imunogé-nico está geralmente presente numa quantidade que seja suficiente para a produção de um nivel detectável de ligação com um anticorpo presente na amostra que contém o anticorpo.

Assim, neste aspecto da invenção, o polipéptido pode estar ligado a um suporte sólido, como por exemplo uma microplaca, que seja capaz de imobilizar células, partículas de células ou polipéptidos solúveis. 0 suporte pode ser lavado então com tampões adequados seguido pelo tratamento com a amostra do animal. 0 suporte de fase sólida pode então ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover os anticorpos não ligados. 0 polipéptido marcado é adicionado e o suporte é lavado uma terceira vez para remover os polipéptidos marcados não ligados. A quantidade de marcação ligada no referido suporte sólido podem então ser detectada através de dispositivos convencionais. 27 ΡΕ1546357

Por "suporte de fase sólida" pretende-se referir a qualquer suporte capaz de ligar a antigénios ou anticorpos. Suportes ou veiculos bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas (especialmente nitrocelulose), poliacrilamidas, agarose e magnetite. A natureza do veiculo pode ser ou de algum modo solúvel ou insolúvel para os efeitos da presente invenção. 0 material de suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar a um antigénio ou a um anticorpo. Por esse motivo, a configuração do suporte pode ser esférica, como numa conta, ou cilíndrica, como na superfície interna de um tubo de ensaio, ou na superfície externa de uma haste. Alternativamente, a superfície pode ser plana tal como por exemplo uma folha ou tira. Os suportes preferidos incluem as contas de poliestireno. 0 anticorpo especifico para a M. hyopneumoniae pode ser marcado de forma a ser detectado através da ligação do mesmo a uma enzima e utilizando uma imunoensaio enzimático (EIA), ou uma análise de imunossorção associada a enzima (ELISA). Por seu lado, esta enzima, quando exposta mais tarde ao seu substrato, irá reagir com o substrato de uma tal maneira, de modo a produzir uma porção química que possa ser detectada, por exemplo, através de meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais. As enzimas que podem ser usadas para marcar de forma a serem detec- 28 ΡΕ1546357 tados os anticorpos específicos para M. hyopneumoniae incluem, mas não estão limitadas a, peroxidase do rábano silvestre, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, isomerase de esteróide-delta-V, álcool desidrogenase de levedura, alfa glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxida-se, beta-galactosidase, ribonuclease, ureiase, catalase, glucose-β-fosfato desidrogenase de, glucoa/nilase e acetil-colinesterase. A detecção pode ser conseguida com a utilização de qualquer um de uma variedade de imunoensaios. Por exemplo através da marcação radioactiva da proteína recombinan-te, é possível a detecção de ligação de anticorpo através de uma radioimunoensaio (RIA). 0 isótopo radioactivo poder ser detectado por meios tais como o uso de um contador gama ou um contador de cintilações ou através de autorradio-grafia. Isótopos que são particularmente úteis para os objectivos da presente invenção incluem Η, I, I, S, e 14C, de preferência 1251.

Também é possível a marcação do polipéptido recombinante com um composto fluorescente. Quando o polipéptido marcado com fluorescência é exposto a luz de um comprimento de onda apropriado, a sua presença pode então ser detectada devido a fluorescência. Entre os compostos de marcação por fluorescência mais comummente usados estão o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, a ficoeriterina, a ficocianina, a aloficocianina, o o-ftaldeído e a 29 ΡΕ1546357 fluorescamina. 0 polipéptido também pode ser marcado de forma a ser detectado com a utilização de metais que emitem fluorescência tais como o 152Eu, ou outros da série dos lantanideos. Esses metais podem ser ligados à proteina com a utilização de tais grupos quelantes de metais como o ácido dietilenotriamina penta acético (DTPA) ou o ácido etilenodiamina tetra acético (EDTA). 0 polipéptido também pode ser marcado de forma a ser detectado pelo seu acoplamento a um composto quimio-luminsecente ou bioluminescente. A presença do polipéptido marcado com o composto quimioluminsecente é de seguida determinada através da detecção da presença de luminescência que surge no decurso da reacção química. A biolumi-nescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos nos quais uma proteína catalítica aumenta a eficácia da reacção de quimioluminescência. Os exemplos de compostos particularmente úteis de marcação com quimioluminescência são o luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazole, éster de oxalato e sal de acridínio. Os compostos bioluminescentes importantes para os objectivos de marcação são a luciferina, a luciferase e a aequorina. A detecção do marcador pode ser conseguida através de um contador de cintilações, por exemplo, se o marcador que pode ser detectado é um emissor gama radioactivo, ou através de um fluorímetro, por exemplo, se o marcador for um material fluorescente. No caso de um 30 ΡΕ1546357 marcador enzimático, a detecção pode ser conseguida através de métodos colorimétricos que empregam um substrato para a enzima. A detecção também pode ser conseguida através de comparação visual do grau de reacção enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de forma similar. A detecção de focos de anticorpos de podem ser marcados de forma a derem detectados é indicativa de um estado de doença ou de disfunção e pode ser usado para a medição de M. hyopneumoniae numa amostra. A ausência de tais anticorpos ou de outra resposta imune indica que o animal não foi vacinado nem infectado. Para os objectivos da presente invenção, a bactéria que é detectada através desse ensaio pode estar presente numa amostra biológica. Qualquer amostra que a contenha pode ser usada, no entanto, um dos benefícios da presente invenção de diagnóstico é que a remoção invasiva de tecido pode ser evitada. Por esse motivo, preferentemente, a amostra é um fluido biológico tal como, por exemplo, sangue, fluido nasal, da garganta ou do pulmão, mas a invenção não está limitada a análises com a utilização dessas amostras. A detecção in situ pode ser conseguida através da remoção de um espécimen histológico de um animal, e proporcionar a combinação de anticorpos marcados da presente invenção a um tal espécimen. 0 anticorpo (ou fragmento) é preferencialmente proporcionado através da aplicação ou pela superposição do anticorpo (ou fragmento) 31 ΡΕ1546357 marcado numa amostra biológica. Através da utilização de um tal procedimento, é possivel a determinação não só da presença de M. hyopneumoniae mas também da sua distribuição no tecido examinado. Com a utilização da presente invenção, as pessoas competentes técnica irão facilmente perceber que qualquer um de uma vasta variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) podem ser modificados de modo a conseguir essa detecção in situ.

Alternativamente, uma amostra (por exemplo uma amostra de fluido ou de tecido) pode ser testada para a presença de uma sequência que codifique para um polipéptido de M. hyopneumoniae da invenção através da reacção com uma sequência de ácido nucleico recombinante ou sintética que esteja contida no interior da sequência mostrada nas FIG. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, ou qualquer sequência de ARN equivalente a esta sequência de ácido nucleico. A ausência da sequência codificante indica que o animal não foi vacinado nem infectado. Este teste envolve métodos de sintese, amplificação, ou hibridação de sequências de ácido nucleico que são conhecidas pelos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; PCR, A Practical Approach, Vols. 1 & 2, McPherson et al., (eds), Oxford University Press, 1992 e 1995; e PCR Strategies, Innis (ed.), Academic Press, 1995. 32 ΡΕ1546357

Composiçoes A presente invenção também contempla uma composição (por exemplo uma vacina) que compreende os polipépti-dos recombinantes da presente invenção, ou sequências de ácido nucleico que codificam para esses polipéptidos, para a imunização ou a protecção de animais não humanos, de preferência suinos, contra as infecções por M. hyopneumo-niae, particularmente a pneumonia enzoótica. Os termos "protegendo" ou "protecção" quando usados em relação à composição para a pneumonia enzoótica aqui descrita significa que a composição previne a pneumonia enzoótica causada pela M. hyopneumoniae e/ou reduz a gravidade da doença. Quando uma composição provoca o aparecimento de uma resposta imunológica num animal, o animal é considerado seropositivo, isto é, o animal produz uma quantidade detectável de anticorpos contra um polipéptido da invenção. Os métodos para a detecção de uma resposta imunológica num animal são bem conhecidos.

As composições geralmente incluem uma dosagem imunologicamente eficaz de um polipéptido da invenção. Uma dosagem "imunologicamente eficaz" é uma quantidade que, quando administrada a um animal, provoca uma resposta imunológica no animal mas não faz com que o animal desenvolva sinais clínicos graves de uma infecção. Um animal que tenha recebido uma dosagem imunologicamente eficaz é um animal inoculado ou um animal que contém um inoculo de uma quantidade imunologicamente eficaz de um polipéptido da 33 ΡΕ1546357 invenção. As dosagens imunologicamente eficazes podem ser determinadas de forma experimental e podem variar de acordo com o tipo, tamanho, idade, e saúde ao animal vacinado. A vacinação pode incluir uma única inoculação ou múltiplas inoculações. Podem ser úteis outros esquemas e quantidades de dosagem, incluindo dosagens de reforço da vacina.

As composições podem ser empregues em conjunto com um veiculo, o qual pode ser qualquer um de uma variedade ampla de veículos. Os veículos representativos incluem a água estéril, soluções salinas tamponizadas, óleo mineral, alúmen e polímeros sintéticos. Também podem ser usados agentes adicionais para o aumento da capacidade de suspensão e de dispersão em solução. A selecção de um veículo adequado é dependente da maneira através da qual a composição irá ser administrada. A composição é geralmente usada em animais não humanos que são susceptíveis a pneumonia enzoótica, de modo específico em suínos. A composição pode ser administrada através de qualquer método adequado, tal como através de injecção intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. Alternativamente, a composição pode ser administrada por via intranasal ou por via oral, tal como através da mistura dos componentes activos com alimento ou água, ou proporcionando uma forma em comprimido. Os métodos tais como bombardeamento de partículas, micro-injecção, electropo-ração, transfecção através de fosfato de cálcio, trans-fecção lipossómica e transfecção virai são particularmente 34 ΡΕ1546357 adequados para a administração de um ácido nucleico. As composições de ácido nucleico e os métodos para a sua administração são conhecidos na técnica, e estão descritos nas patentes dos Estados Unidos Nos. 5,836,905; 5,703,055; 5,589,466; e 5,580,858. Outros meios para a administração da composição tornar-se-ão evidentes aos peritos na técnica dos ensinamentos aqui realizados; deste modo, o âmbito da invenção não está limitado a nenhuma forma especifica de administração. A composição também pode incluir componentes activos ou adjuvantes (como por exemplo o adjuvante incompleto de Freund) além do(s) antigénio(s) ou fragmentos aqui acima descritos neste relatório. Os adjuvantes podem ser usados para aumentar a imunogenicidade do antigénio. Entre os adjuvantes que podem ser usados estão as emulsões de óleo e de água, o adjuvante de Freund completo, o adjuvante de Freund incompleto, Corynebacterium parvum, Hempohilus, Mycobacterium butyricum, hidróxido de alumínio, sulfato de dextrano, óxido de ferro, alginato de sódio, Bacto-Adjuvante, determinados polímeros sintéticos tais como os poliaminoácidos e copolímeros de aminoácidos, saponina, jota carragénio, Re-gressin™, Arvidine™, mono-oleato de manitol, óleo de parafina e dipéptido de muramilo.

As composições de ácido nucleico e de poli-péptidos ou as vacinas tal como aqui descritas podem ser combinadas com materiais de embalagem que incluam 35 ΡΕ1546357 instruções para o uso dos mesmos para serem vendidos como artigos de fabrico ou kits. Os componentes e os métodos para a produção de artigos de fabrico são bem conhecidos. Os artigos de fabrico podem combinar uma ou mais vacinas (como por exemplo ácido nucleico ou polipéptido) como aqui descritos. Instruções que descrevem como uma vacina é eficaz para a prevenção da incidência de uma infecção por M. hyopneumoniae, prevenindo a ocorrência de sinais clinicos da infecção por M. hyopneumoniae, melhorando os sinais clinicos de uma infecção por M. hyopneumoniae, baixando o risco de sinais clinicos de uma infecção por M. hyopneumoniae, baixando a ocorrência de sinais clinicos de uma infecção por M. hyopneumoniae e/ou a disseminação de infecções por M. hyopneumoniae em animais podem ser incluidas nesses kits.

Convenientemente, as vacinas da invenção podem ser proporcionadas numa forma pré-embalada em quantidades suficientes para uma dose de protecção para um único animal ou para um número pré-especif içado de animais em, por exemplo, ampolas seladas, cápsulas ou cartuchos. A aplicação dos ensinamentos da presente invenção em relação a um problema ou a um ambiente específicos está no âmbito da capacidade de uma pessoa competente técnica. Os exemplos dos produtos e dos processos da presente invenção aparecem nos exemplos que se seguem. A invenção será adicionalmente descrita nos 36 ΡΕ1546357 exemplos que se seguem, que não limitam o âmbito da invenção descrito nas reivindicações.

EXEMPLOS A. P102 E SEUS PARÁLOGOS Exemplo A.l. Estirpes de Mycoplasma

As estirpes de Mycoplasma hyopneumoniae usadas incluíram a 232, J, e Beaufort. A fonte e as condições de cultura usadas para o cultivo de M. hyopneumoniae foram tal como descritas em Scarman et al., (1997) Microhiology 143: 663 a 673.

Exemplo A.2 - Clonagem do gene que codifica para P102 0 gene que codifica para P102 foi obtido através de uma reacção em cadeia de polimerase (PCR) e clonado em pTrcHis (Invitrogen). Os oligonucleótidos TH130 e TH131 foram usados para a amplificação da região que codifica para os aminoácidos de 33 a 887 de P102 a partir de pISM1217 como descrito em Hsu e Minion ((1998) Infect. Immun. 66: 4762-4766). 0 produto da PCR com locais de restrição 5'BamRI e 3'PstI foi digerido de forma sequencial com BamRI e Pst I, purificado com gel, e ligado no ADN plasmídico de pTrcHis digerido com BamRI/Pstl. A mistura de ligação foi transformada em Escherichia coli CSH50 e os transformantes foram para resistência à ampicilina (100 yg 37 ΡΕ1546357 por mL) . 0 plasmídeo resultante foi sequenciado com o iniciador SA1528 para a confirmação da inserção e orientação do inserto.

Realizou-se mutagénese dirigida na sequência do inserto para a remoção dos codões TGA, os quais codificam para o triptofano em Mycoplasmas. A mutagénese dirigida foi realizada com a utilização do Stratagene QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Cinco codões TGA na sequência clonada foram trocados para TGG com a utilização dos seguintes pares de iniciadores:

P102.2Í: 5 ' -GAT AAT TTT AAA AAA TGG TCG GCA AAA ACA GTT TTA ACT GCT GCC-3' (SEQ ID NO: 21); PI02.2r: 5'-GGC AGC AGT TAA AAC TGT TTT TGT TTT TGC CG A CCA TTT TTT AAA ATT ATC-3' (SEQ ID NO: 22); P102.3Í: 5'-GAA AGA GGA AGT AAT TGG TTT TCA CGA CTT GAA AGA GC-3' (SEQ ID NO: 23);

PI 02.3r: 5 '-GCT CTT TCA AGT CGT GAA AAC CAA TTA CTT CCT CTT TC-3' (SEQ ID NO: 24);

P102.4Í: 5 ' -CTA AAA TTC TAA AAT CCT GGC TTG AAA CAA ATC TTC AAG GC-3' (SEQ ID NO: 25);

PI 02.4r: 5'-GCC TTG AAG ATT TGT TTC AAG CCA GGA TTT TAG AAT TTT AG-3' (SEQ ID NO: 26);

P102.5Í: 5'-GCC TCT CTG ATT ATT GGT ATG GAT CTC CGA ATT C-3' (SEQ ID NO: 27); 38 ΡΕ1546357 Ρ102.5r: 5'-GAA TTC GGA GAT CCA TAC CAA TCA GAG AGG C-3' (SEQ ID NO: 28); P102.6Í: 5'-GGG ACA AGC ATT TGG ACA GCT TTT AAT TTC G-3' (SEQ ID NO: 29); P102.6r: 5'-CGA AAT TAA AAG CTG TCC AAA TGC TTG TCC C-3' (SEQ ID NO: 30). A E. coli XLl-Blue MRF' foi o receptor de cada passo de mutagénese. Para a confirmação da sequência e as trocas de base única, e para determinar se foram introduzidos erros nos passos de clonagem e de mutagénese, o produto final foi sequenciado com a utilização dos iniciadores: P102.2-SEQ: 5'-TCC GAC GAT GAC GAT AAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; PI 02.5-SEQ: 5'-TGG AAA ATT AGT TCT TGG-3' (SEQ ID NO: 32) ; PI 02.6-SEQ: 5'-AGT TTC CAC TTC ATC GCC-3' (SEQ ID NO: 33) . A construção final foi designada como pISM1316.6.

Exemplo A.3 - Expressão e purificação de P102 O plasmideo pISM1316.6 foi transformado em E. coli ER1458 (F-Δ (lac) U169 Ιοη-lOOhsdR araDl39 rpsL(StrR) supF mcrA trp+ zjj202::TnlO(TetR) hsdR2 (rk-mk+) mcrBl), um mutante de protease Lon, em preparação para a expressão proteica. Uma cultura de um dia para o outro foi diluída 1:10 em meio "superbroth" fresco (por litro; 32 g Bacto triptona, 20 g de extracto de levedura, 5 g de cloreto de 39 ΡΕ1546357 sódio, pH 7,3) que continha 1 mM de tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) e uma mistura de inibidores de proteases (Sigma P8848) numa diluição de 1:200. A cultura foi incubada durante 5 horas a 30°C com agitação. As células foram recolhidas por centrifugação e de novo suspensas em tampão TS (10 mM Tris, 100 mM cloreto de sódio, pH 7,4) mais 8 M de ureia e 2 mg/mL de lisozima. Depois de se incubar durante 30 minutos em gelo, a suspensão foi congelada num banho de gelo seco e etanol e passada sequencialmente através de três ciclos de congelamento e descongelamento. O ADN cromossómico foi cisalhado pela passagem da suspensão através de uma agulha de calibre 18, e os restos celulares insolúveis foram removidos através de centrifugação. A solução final foi passada através de uma coluna de Talon Metal Affinity Resin (Clontech Laboratories, Inc. CA) . A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão TS que continha 10 mM de imidazole. A proteína ligada foi eluída com tampão TS contendo 500 mM de imidazole e o eluente da coluna foi submetido a diálise de um dia para o outro contra tampão fosfato salino (10 mM Na2HP04, 100 mM NaCl, pH 7,4). A pureza das preparações de proteína foi avaliada através de electroforese com gel de dodecil sulfato de sódio e por "Western blotting" usando anticorpo monoclonal 6xHis (Clontech).

Exemplo A.4 - Geração dos anti-soros de P102

Imunizaram-se ratinhos com 10 yg de P102 purificada misturada com 200 yL de adjuvante de Freund 40 ΡΕ1546357 incompleto, e ao dia 21 foram administradas segundas dosagens. Foram desenvolvidas ascites através da introdução de células de mieloma Sp2 usando o método de Luo e Lin ((1997) BioTechniques 23: 630-632), e o fluido das ascites foi dividido em aliquotas e armazenado a -70°C. A especificidade dos anticorpos foi testada por análise de "imunoblot" com a utilização de proteína P102 purificada e antigénio total de M. hyopneumoniae.

Exemplo A.5 - Analise microscópica imunoelectrónica de secções de célula imunomarcadas com ouro

Para a determinação de se P102 está exposta à superfície ou associada com a adesina do cílio P 97, utilizou-se anti-soro anti-P102 mono específico policlonal nos estudos microscópicos imunoelectrónicos para a determinação da localização de P102 na célula de Mycoplasma.

As estirpes 90-1 e 60-3 de M. hyopneumoniae foram cultivadas em meio de Friis modificado (Friis (1971) Acta Vet. Scand. 12: 69-79) até meio da fase log como descrito (Hsu et al., (1997) J. Bacteriol. 179: 1317-1323). As células foram sedimentadas através de centrifugação e lavadas uma vez com tampão fosfato salino (PBS) por centrifugação. As células foram de novo suspensas em PBS e então postas em reacção ou com o fluido de ascite anti-P102 diluído a 1:50, ou sobrenadante de cultura de células F1B6 (Zhang et al., (1995) Infect. Immun. 63: 1013-1019) 41 ΡΕ1546357 diluídas a 1:10, de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte, as células foram lavadas cinco vezes com PBS e então reagidas durante 30 minutos à temperatura ambiente com IgG + IgM de cabra anti-ratinho marcados com partículas de 10 nm de ouro (EY Laboratories, Inc. San Mateo, Calif.) diluído a 1:25. As células foram então lavadas cinco vezes com PBS e sedimentadas por centrifugação.

Os sedimentos finais de células foram fixados com 3% de glutaraldeído em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio (pH 7,2) a 4°C de um dia para o outro. Os sedimentos foram lavados três vezes, 15 minutos em cada vez, com 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio durante 2 horas à temperatura ambiente. Os sedimentos foram então lavados com água destilada, passados através de uma série de acetona e embebidas em Embed 812 e Araldite (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA).

Para as secções de traqueia, porcos isentos de Mycoplasma foram inoculados por via intra-traqueal, com a estirpe 232 de M. hyopneumoniae como descrito em Thacker et al., ((1997) Potentiation of PRRSV pneumonia by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae. Em Conference of Research Workers in Animal Diseases. Ellis, R.P. (ed.) Chicago, IL; Iowa State University Press, pág. 190). Aos dias 10 e 21 os porcos foram sacrificados e as traqueias foram removidas. Fixaram-se blocos de um cm de tecido foram com 1% de glutaraldeído de um dia para o outro, desidratados em série de acetona e embebidos como acima. 42 ΡΕ1546357

Secções espessas (1-2 ym) foram coradas com policromo de azul de metileno e examinadas por microscopia para regiões que contivessem epitélio ciliado. Secções delgadas (80 a 90 nm) foram então preparadas para marcação. Para alguns estudos, células cultivadas in vitro foram embebidas e seccionadas antes da marcação. As secções foram pré-tratadas com cloreto de amónio (1%) durante uma hora, 0,05 M de glicina em PBS durante 15 minutos e bloqueadas durante 30 minutos em 2% de gelatina de peixe + 2% de albumina de soro bovino em tampão TS (10 mM Tris, 100 mL NaCl, pH 7,5). Os anticorpos primários foram diluidos (1:50) em tampão TS e colocados a reagir durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram lavadas seis vezes com tampão TS e então incubadas com IgG + IgM de cabra anti-ratinho marcados com partículas de 10 nm de ouro (diluido de 1:2), durante 15 minutos à temperatura ambiente. Tanto os anticorpos primários como os conjugados foram diluidos e brevemente centrifugados (12000 x g durante 5 minutos) para a remoção dos agregados de ouro antes de utilização. As secções foram então lavadas seis vezes com tampão TS, secas, contrastadas com vapores de ósmio durante 2 minutos e coradas com citrato de uranilo-citrato de chumbo. As secções foram examinadas num microscópio electrónico Hitachi 500 a 75 kV.

Nas células cultivadas in vitro, foram encontradas partículas de ouro na fora das células e foram primariamente associadas à matriz extracelular. Resultados similares foram observados para células que foram coradas 43 ΡΕ1546357 antes ou depois da fixação e de serem seccionadas. Ocasionalmente, foram observadas partículas associadas com a superfície celular, e em casos raros, foram observadas partículas intracelularmente. No entanto, nas células associadas aos cílios de porco, foram observadas partículas de ouro em alta concentração intracelularmente. A P102 também foi encontrada em associação com cílios de porco, frequentemente agregados ou em concentrações elevadas. A matriz extracelular que era tão proeminente em células crescidas em meio de cultura não foi evidente em secções de epitélio de porcos infectados.

Exemplo A.6 - Electroforese bidimensional A electroforese bidimensional sobre gel (2-DGE) foi realizada essencialmente como descrita em Guerreiro et al. ((1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 506-16).

Prepararam-se tiras de gradientes pH imobilizadas (IPG) de primeira dimensão (180 mm, pH 3-10 lineares ou não lineares e pH4-7 e 6-11 lineares: Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) para serem focagem através de submersão num tampão de hidratação (8 M ureia, 0,5% p/v CHAPS, 0,2% p/v DTT, 0,5% p/v Bio-Lyte e vestígios de azul de bromofenol) de um dia para o outro. Diluiu-se proteína de célula inteira de M. hyopneumoniae (100 yg para géis analíticos, 0,5 a 1,0 mg para géis preparativos e "imunoblots") com tampão de amostra (8 M ureia, 4% p/v CHAPS, 1% p/v DTT, 0,8% p/v Bio-Lyte, 35 mM TRIS e 0,02% p/v de azul de bromofenol) até um volume de 50 a 100 μΐ 44 ΡΕ1546357 para aplicação à extremidade anódica de cada uma das tiras de IPG. A focagem isoelétrica foi realizada com uma unidade de electroforese Multiphor II (Pharmacia) durante 200 kVh a 20°C excepto para as tiras de pH de 6 a 11, que foram submetidas a electroforese durante 85 kVh. As tiras IEF foram reduzidas e alquiladas em Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) contendo 6 M de ureia, 30% p/v de glicerol, 2% p/v de dodecil sulfato de sódio (SDS) , 2% p/v de DTT e 0,02% de

azul de bromofenol. As tiras equilibradas foram colocadas sobre Pharmacia ExcelGels (T = 12 a 14% de acrilamida) para SDS-PAGE com a utilização de Multiphor II. As condições da electroforese consistiram em 200 Volts durante 1,5 horas seguida por 4 horas a 600 Volts a 5°C. Os géis foram corados com azul de Coomassie R-250 (Bio-Rad, Hercules, CA) e as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) com a utilização de uma Hoefer TE70 Series SemiPhor Semi-Dry Transfer Unit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). A transferência foi levada a cabo durante 1,5 horas à voltagem máxima e a uma corrente medida através da multiplicação da área do gel (cm2) por 0,8 mA.

Exemplo A.7 - Análises de pós separação

Pontos de proteína foram extraídos a partir de géis com a utilização de um bisturi estéril e colocados numa placa de 96 poços. Os pedaços de gel foram lavados com 50 mM de bicarbonato de amónio/100% acetonitrilo (60:40 v/v) e então secos num Sped Vac (Savant Instruments, 45 ΡΕ1546357

Holbrook, NI) durante 25 minutos. Os pedaços de gel então foram então hidratados em 12 μΐ de tripsina modificada a 12 ng yL-1 de grau de seguenciação (Promega, Madison, WI) durante uma hora a 4°C. 0 excesso da solução de tripsina foi removido e os pedaços de gel foram imersos em 50 mM de bicarbonato de amónio e incubados de um dia para o outro a 37°C. Os péptidos eluidos foram concentrados e dessalinizados usando Zip-Tip™ Cis. Os péptidos foram lavados numa coluna com 10 yL de ácido fórmico a 5%. Os péptidos ligados foram decantados a partir da Zip-Tip™ em solução de matriz (10 mg mL"1 de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico [Sigma] em acetonitrilo a 70%) directamente sobre a placa alvo. Obtiveram-se espectros de massa de espectrometria de massa de tempo de voo de desabsor-ção/ionização de laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) usando ou um PerSeptive Biosystems Voyager DE-STR (Framingham, MA) ou um Micromass TofSpec2E (Micromass, Manchester, UK). Ambos os instrumentos foram equipados com lasers de azoto de 337 nm. Todos os espectros foram obtidos no modo de extração reflector/retardado, com a média de 256 incidências de laser por amostra. Realizou-se uma calibra-ção interna de dois pontos para os espectros com base nos péptidos da autólise interna da tripsina porcina (iões 842,5 e 2211,10 [M+H]+) . Usou-se uma lista de picos monoisotópicos que correspondem a massa dos péptidos tripticos gerados para a pesquisa de uma versão traduzida modificada do genoma de M. hyopneumoniae. As identificações com sucesso foram baseadas no numero de massas de péptido coincidentes e na percentagem de cobertura de sequência 46 ΡΕ1546357 permitida por essas coincidências. Realizou-se a sequencia-ção de Edman da extremidade N como descrito anteriormente (Nouwens et al., 2000).

Exemplo A.8 - A P102 é expressa à superfície

Para gerar um anticorpo especifico para P102, a proteina P102 recombinante foi expressa em E. coli e depois purificada como se segue. A sequência codificante para a P102 foi obtida a partir do plasmideo pISM1217, que continha a sequência total de P102 (Hsu e Minion (1998) Infect. Immunol. 66: 4762-4766). A região da sequência codificante que codifica para os aminoácidos 33-887 foi amplificada por PCR usando os iniciadores com locais de restrição BamRI e PstI nas extremidades 5' para permitir a clonagem em pTerHis. A construção resultante foi designada como pISM1249. Para permitir a expressão da sequência codificante em E. coli, os codões TGA na sequência de pISM1249 foram alterados por mutagénese dirigida para os codões TGG. A construção final pISM1316.6 foi sequenciada para confirmar essas alterações e para verificar a existência de erros introduzidos pela PCR durante o passo de mutagénese. A expressão da sequência clonada em pISM1316.6 resultou numa proteina marcada com poli-histidina de cerca de 100 kDa. Os niveis de expressão da P102 foram baixos em E. coli apesar da remoção dos codões de terminação opala (TGA). Usou-se uma coluna Talon Metal Affinity Resin para a 47 ΡΕ1546357 remoção das proteínas contaminantes de E. coli durante a purificação. Anti-soro hiperimune de ratinho contra esta proteína recombinante foi usado na analise de "imunoblot" das células inteiras de M. hyopneumoniae. 0 anti-soro anti P103 apresentou três bandas indicando ou a presença de proteínas de reacção cruzada ou que a P102 estava a ser processada proteoliticamente. 0 tratamento com a tripsina das células inteiras seguido por "imunoblot" e a revelação com o anti-soro anti-P102 mostrou que P102 estava localizada à superfície da membrana; todas as bandas imunorreactivas foram sensíveis à tripsina.

Exemplo A.9 - Parálogos de P102 são encontrados ao longo do genoma de M. hyopneumoniae

Estudos de hibridação indicaram que a sequência de P102 ou as sequências relacionadas com P102 podem existir em múltiplas copias no genoma de M. hyopneumoniae (Hsu et al., (1997) J. Bacteriol. 179: 1317-1323) . Os estudos da sequenciação do genoma identificaram quatro parálogos distintos de P102 (C2-mhp210, C27-mhp348, C28-mhp663 e C2-mhp036) e dois parálogos parciais, (C2-mhp033 e C2-mhp034) espalhados através do cromossoma (Fig. 21). Análises adicionais da sequência do genoma de M. hyopneumoniae revelaram grelhas de leitura aberta adicionais com homologias que variavam em relação a P120. Cada uma dessas parecia ser uma fusão com um segundo gene, enquanto que a sequência original da P102 tenha sofrido uma evolução significativa. Ainda, cada um dos parálogos fazia 48 ΡΕ1546357 parte de uma estrutura genética de dois genes, possivelmente organizados em operões. Em cada um dos casos, o parálogo de P102 era o segundo gene ou o gene a jusante. A análise da sequência de ADN para cada um dos parálogos de P102 mostrou que a homologia com relação a P102 era baixa, mas a homologia de aminoácidos era muito mais alta. As sequências de aminoácidos dos parálogos de P102 são apresentados nas Figuras 2, 6, 12, 14, 16, 18 e 20.

Exemplo A.10 - A marcação com biotina de proteínas de superfícies acessíveis identificou moléculas que pertencem a uma família de genes múltiplos

Foram realizados estudos para a identificação de todas as proteínas de superfícies acessíveis em M. hyopneumoniae reconhecidas através de soros de suínos convalescentes ou com hiperimunização. Através da combinação de biotinilação de superfície, análises de "imunoblotting" em duas dimensões, genómica e proteómica, mapeou-se um subconjunto destas moléculas de superfície na sequência do genoma de M. hyopneumoniae.

Inicialmente, a electroforese em gel bidimensio-nal de proteínas biotiniladas identificou grupos de proteínas expostas à superfície exposta, altamente expressas e que pareciam se resolver ao longo do gradiente de pi como uma série de pontos. As massas das moléculas de muitas dessas proteínas variavam a partir de 40 até 130 kDa. Muitas de tais proteínas foram reconhecidas pelo soro de 49 ΡΕ1546357 porcos convalescentes ou hiperimunes. Isso sugere que essas proteínas eram expressas durante a infecção por M. hyopneu-moniae e provocaram uma resposta imune que a acompanhou.

Fragmentos trípticos de manchas de proteínas individuais foram analisados por identificação de massas características de péptidos, e os espectros coincidiram aos produtos teóricos da clivagem de tripsina gerados a partir da base de dados do genoma de M. hyopneumoniae. Alguns dos pontos de massas moleculares diferentes mapearam para a mesma copia única do gene.

Exemplo A.11 - Identificação da massa característica de péptidos e estudos de biotinilação mostram que os parálogos de P102 são expressos

Muitas das proteínas identificadas através de biotinilação e identificação da massa característica dos péptido foram relacionadas com produtos a partir do operão de adesão ciliar (Hsu e Minion (1998) Infect. Immun. 66: 4762-4766). Além da adesina do cílio P97, os produtos génicos que representam a P102 e proteínas relacionadas foram identificados. A.12 - Resultados existia um numero que foram todos

Os resultados indicaram que surpreendente de parálogos de P102 expressos e localizados sobre a superfície do organismo. 50 ΡΕ1546357

Alguns dos parálogos da P102 tinham um maior grau de identidade de sequência com a P97, enquanto que outros parálogos de P102 não tinham. Nenhuma das sequências em torno dos para logos da P102 eram similares, o que sugere que os genes de P102 se duplicaram e se moveram de forma independente das sequências circundantes. A marcação diferencial de organismos cultivados in vitro e in vivo foi observada, sugerindo ainda que a P102 pode estar envolvida nas respostas do tipo hiperimune observadas durante a infecção. B. ESTUDOS DE P216

Exemplo B.l- Estirpes e culturas de Mycoplasma A fonte e as condições de cultura usadas para cultivar as estirpes J, Beaufort e 232 de M. hyopneumoniae são tal como descritas em Scarmaan et al., ((1997) Microbiology 143: 663-673). Recolheram-se Mycoplasmas por centrifugação a 10000 x g, lavaram-se três vezes com tampão TS (10 mM Tris, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,5), e os sedimentos finais das células foram congelados a -20°C até serem usados.

Exemplo B.2 - Electroforese preparativa

Os testes preliminares de vacina em suinos imunizados com antigénios fraccionados pelo tamanho de M. hyopneumoniae indicaram que os conjuntos de antigénios 51 ΡΕ1546357 existentes em duas fracções, fracções 2 (85 a 150 kDa) e 3 (70 a 85 kDa) proporcionaram uma protecção limitada contra um desafio com vírus (Djordjevic et al., (1997) Aust Vet J 75: 504-511). Para a determinação das sequências de aminoácidos das proteínas que permanecem nessas fracções de massas moleculares, os lisados de células inteiras da estirpe J de M. hyopneumoniae foram separadas usando uma coluna de resolução de poliacrilamida de 5-7% cada uma gel de empilhamento de 4% usando uma BioRad 491 Prep Cell como descrito em Scarmaan et al., ((1997) Microbiology 143: 663-673) . As proteínas que correspondem àquelas definidas para as fracções 2 e 3 foram recolhidas, concentradas por filtração e de novo suspensas em PBS. As fracções das proteínas foram digeridas com tripsina, separadas usando electroforese em gradientes de géis Tricina pré-moldados de 8-15% (Novex) e então corados sobre membranas de PVDF (BioRad, Califórnia, EUA) (Towbin et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 4350-4354). As fracções de proteína foram analisadas por (1) reacção com soros porcinos hiperimunes contra a estirpe J de M. hyopneumoniae e (2) coloração com negro de amido. Os fragmentos trípticos corados com o negro de amido que reagiram com os soros hiperimunes foram analisados através de sequenciação de aminoácidos pela extremidade N.

Exemplo B.3 - Clonagem do gene que codifica para P216

Para clonar os genes que codificam para as proteínas imunorreactivas, foram desenhadas sondas de 52 ΡΕ1546357 oligonucleótidos degenerados a partir de sequências de péptidos da extremidade N determinadas acima e usadas para sondar o ADN cromossómico digerido com EcoRI através de análise de Southern (Southern (1975) J. Mol. Biol. 98: 503-517) . O ADN cromossómico digerido com EcoRI a partir da estirpe de Beaufort foi separado numa coluna de agarose a 1% preparada numa Prep Cell 4 91 de acordo com a BioRad Technical Note #2203. As amostras de cada quinta fracção foram colocadas numa membrana de nylon e sondadas com as sondas de oligonucleótidos degenerados derivados a partir das sequências da extremidade N dos fragmentos tripticos. Os fragmentos de ADN a partir das fracções reactivas foram incubados com o fragmento de Klenow e AND polimerase Pfu para a geração de extremidades lisas. Os fragmentos de ADN foram ligados em pCR Script™ e transformados em XL-10 Gold como descrito nas instruções do fabricante (Stratagene).

Deste modo a análise da sequência da extremidade N de um fragmento tríptico de X kDa reconhecido por hiperimune porcino gerou a sequência ELEDNTKLIAPNIRQ (SEQ ID NO: 34) . Com base nessa sequência de aminoácido um oligonucleótido degenerado com a sequência 5'-GAA (T/C) T (T/A) GAA GAT AAT AC(C/A/T) AAA TTA ATT GC (T/A) CCT AAT-3' foi preparado e usado como uma sonda para a identificação de um fragmento hibridizante de 4,5 kb. O clone contendo esse fragmento de 4,6 quilobases foi designado como p216. ΡΕ1546357 53

Exemplo B.4 - Análise da sequência de ADN

Para a analise da sequência foi usado o plasmídeo purificado ADN (Qiagen) ou o produto de PCR purificado a partir de agarose usando o kit BRESA-CLEAN™ (Bresatech, Adelaide, Austrália). Os iniciadores oligonucleotidicos foram comercialmente (Sigma) e o BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) foi usado para as reacções de sequenciação. Os resultados foram analisados com um sequenciador automático Applied Biosystems Modelo 377 . A analise da sequência do fragmento clonado em p216 a partir da estirpe Beaufort revelou uma grande ORF que não coincidiu significativamente com as sequências depositadas no GenBank. O fragmento foi a extremidade carboxilica de uma ORF maior na medida em que o fragmento tinha um codão de terminação mas não tinha um codão de iniciação AGT. A sequência adicional a montante foi obtida através de PCR inversa e a sequência final da extremidade N foi obtida por PCR com a utilização de iniciadores desenhados a partir das sequências genómicas da estirpe 232. A ORF completa (C28-mhp545; ver Figura 7) tinha um comprimento de 5637 pares de bases e codificou para uma proteína de 216 kDa designada P216 (C28-MPH545; ver Figura 8). A ORF continha 17 codões TGA, 12 dos quais apareciam na extremidade carboxilica de 85 kDa. A análise de Blastp da sequência completa do gene 54 ΡΕ1546357 revelou uma identidade próxima com a sequência parcial do gene YX2 (Numero de Acesso ao GenBank AF279292) da estirpe 232 de M. hyopneumoniae e uma homologia limitada de sequência com a adesina do cilio P97 (Numero de Acesso ao GenBank U50901) com 21 % de identidades, 38% positivas e 19% de intervalos (Esperado = 4e-18) . As comparações da sequência nucleotidica e da sequência de proteina derivada com a base de dados foram executadas com a utilização do pacote do University of Wisconsin Genetics Group (GCG) Versão 7, acedido através da Australian National Genomic Information Service (ANGIS, Universidade de Sydney) e MacVector (Scientific Imaging Systems, Eastman Kodak Co. New Haven, Conn.). A sequência de ADN que identifica o homologo P216 a partir da estirpe 232 de M. hyopneumoniae foi obtida como uma parte de um projecto de sequenciação de genoma. A análise por "Southern blotting" usando uma sonda de oligonucleótido a partir da extremidade carboxílica mostrou que o genoma de M. hyopneumoniae continha uma única copia do gene que codifica para a proteina de 216 kDa. A análise de Blastn com p216 e a base de dados do genoma de M. hyopneumoniae também identificou uma única copia. A proteína tem 1879 aminoácidos, um pi de 8,51 e é altamente hidrofílica. Uma procura por um padrão de proteína usando o algoritmo Prosite no servidor ISREC Profile Scan (www.isrec.isb-sib.ch/software/PFSCAN_form.html) identificou um domínio de ligação nuclear bipartido (BNBD) entre os aminoácidos 1012-1029. 55 ΡΕ1546357

As sequências de nucleótidos do gene p216 de M. hyopneumoniae das estirpes J e 232 são apresentadas, respectivamente, nas Figuras 7 e 19.

Exemplo B.5 - Geração de anti-soros contra a estirpe 232 de M. hyopneumoniae A preparação de soro porcino hiperimune contra M. hyopneumoniae é tal como está descrito em Scarman et al. (1997) Microbiology 143: 663-673). Resumidamente, suínos isentos de M. hyopneumoniae foram testados com uma preparação da estirpe 232 de M. hyopneumoniae emulsificada no adjuvante completo de Freund, e aqueles suínos foram submetidos a uma segunda exposição um mês depois com a mesma preparação no adjuvante incompleto de Freund. As respostas no soro foram monitorizadas até que fosse confirmada uma resposta anti-M. hyopneumoniae através de uma análise imunossorvente associada a enzima (ELISA).

Exemplo B.6 - Geração do anti-soro policlonal de P126

Para a geração de anti soros policlonais mono-específicos para P216, a sequência de ADN que codifica para P216 da estirpe 232 foi examinada em relação à presença de codões TGA, uma vez que os codões TGA codificam para triptofanos em Mycoplasmas. Uma região não contendo codões TGA e codificando para uma proteína de 30 kDa (aminoácidos 1043-1226) foi identificada. Os iniciadores de PCR foram 56 ΡΕ1546357 desenhados para amplificar e clonar essa região no pCR Scipt™ formando o plasmídeo p216.1. 0 fragmento clonado foi então clonado de forma direccional em pQE9 (Qiagen) por ligação do ADN de p216.1 digerido com BamEI e HindiII para formar p216.2. A mistura de ligação foi transformada em Escherichia coli M15 [pREP4] de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). A hibridação de colónia com a utilização do sistema DIG (Roche) foi usada para a identificação dos transformantes que continham o fragmento apropriado.

As culturas dos transformantes que continha p216.2 foram crescidas em meio LB (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NI) contendo ampicilina (100 yg/ ml) e canamicina (25 yg/mL) a 37°C com agitação. Para a expressão a partir de p216.2, as culturas foram tratadas com 1 mM de isopropil-p-D-tiogalactopira-nósido (IPTG) depois de ter alcançado uma OD600 de 0,6. Depois da indução durante 4 horas, as células foram recolhidas por centrifugação a 4000 x g durante 20 minutos. A purificação da proteína recombinante marcada com His foi conseguida com a utilização de resina Ni-NTA sob condições de desnaturação como descrito nas instruções do fabricante (Qiagen). A proteína recombinante purificada foi dialisada contra PBS contendo 5% de glicerol e concentrada usando polivinil pirrolidona (Sigma). Emulsificou-se aproximada- 57 ΡΕ1546357 mente 5 mg de proteína purificada num volume de 250 μΐ com um volume igual de adjuvante incompleto de Freund (Sigma). A preparação foi administrada por via subcutânea a coelhos em dois locais e uma imunização de reforço, preparada de forma similar, foi administrada três semanas mais tarde. A resposta no soro contra o antigénio de imunização foi confirmada através de análise por "imunoblot".

De forma similar, o anti-soro de coelho contra a sequência da extremidade N de P216 foi gerado por imunização com o péptido DFLTNNGRTVLE (SEQ ID NO: 36) (aminoácidos 94-105 de P216) conjugado com a hemocianina da lapa gigante Megathura crenulata. As imunizações dos coelhos foram realizadas tal como descritas em (Scarman et al., (1997) Microbiology 143: 663-673).

Exemplo B.7 - Analises eletroforética e por "imunoblot" A electroforese sobre gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e a análise por "imunoblot" foram realizadas tal como descrito em Laemmli (1970) Nature 227: 680-685 e Towbin et al. , (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76: 4350-4354, respectivamente. Os géis eletroforéticos analíticos contendo as proteínas da estirpe 232 de M. hyopneumoniae foram marcados com prata (Rabilloud et al., (1992) Electrophoresis 13: 264-266).Os géis preparativos foram marcados com Coomassie Briliant Blue G-250 coloidal (0,1% de Coomassie Briliant Blue G-250 p/v, 17% p/v de sulfato de amónio, 34% de metanol v/v, 3% 58 ΡΕ1546357 v/v de ácido orto-fosfórico) . A coloração dos géis foi removida em 1 % v/v de ácido acético durante 1 hora. A analise por "imunoblot" foi usada para determinar se a P216 é reconhecida por anticorpos estimulados durante a infecção natural usando soro de porcos obtido no campo que continham os anticorpos contra M. hyopneumonlae (Djordjevic et al., (1994) Vet. Microbiol 39: 261-273). A proteina recombinante de 30 kDa que representa os aminoácidos 1043-1226 de P216 foi usada como um antigénio nestas experiências. Outras análises de "imunoblot" incluíram coloração mono- e bidimensionais de células inteiras de M. hyopneumoniae com a utilização de conjuntos de soros de suínos convalescentes (manchas 2D) e soros de suínos individuais (manchas 1D) . Os soros de porcos hiperimunes também foram usados para o rastreio de proteínas imunorreactivas em análises de "imunoblot" mono-e bidimensionais. Os anti-soros de coelhos gerados contra a proteína recombinante de 30 kDa e o péptido DFLTNNGRTVLE (SEQID NO: 36) específicos para P130 também foram usados para investigar o processamento de P216 em experiências de imunoblot mono-dimensional.

Exemplo B.8 - Electroforese em gel bidimensional

Levou-se a cabo electrof orese em gel bidimensional essencialmente tal como descrito em Guerreiro et al. ((1997) Mol Plant Microbe Interact. 10: 506-516). 59 ΡΕ1546357

Prepararam-se tiras de gradiente de pH imobilizadas (IPG) de primeira dimensão (180 mm, pH 3-10 lineares e não lineares e pH 4-7 linear; Pharmacia-Biotechnology, Uppsala, Suécia) para focagem através de submersão de um dia para o outro em tampão de reidratação (8 M ureia, 0,5% p/v CHAPS, 0,2% p/v DTT, 0,52% p/v Bio-Lyte e vestígios de azul de bromofenol). Diluíram-se proteínas de células inteiras de M. hyopneumonlae 232 (100 yg para géis analíticos, 0,5-1,0 mg para géis preparativos e imunoblots) com tampão de amostra (8 M ureia, 4% p/v CHAPS, 1% p/v DTT, 0,8% p/v Bio-Lyte, 35 mM TRIS e 0,02% p/v de azul de bromofenol) até um volume de 50 a 100 μΐ para aplicação à extremidade anódica de cada uma das tiras de IPG. A focagem isoelétrica foi levada a cabo com o kit Immobiline DryStrip numa unidade de electroforese Multiphor II (Pharmacia-Biotechnology) durante 200 kVh. As tiras IEF foram subsequentemente preparadas para a electroforese de segunda dimensão sobre gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) por equilíbrio em Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) contendo 6 M de ureia, 30% p/v de glicerol, 2% p/v de dodecil sulfato de sódio (SDS), 2% p/v de DTT e 0,02% de azul de bromofenol. As tiras equilibradas foram colocadas sobre Pharmacia ExcelGels (T = 12 a 14% de acrilamida) para separação de massa molecular das proteínas de M. hyopneumonlae numa unidade Multiphor II. As condições da electroforese consistiram de 200 Volts durante 1,5 horas seguidas por 4 horas a 600 Volts. Os géis foram permanentemente mantidos a 5°C. 60 ΡΕ1546357

Exemplo B.9 - Identificação da massa característica do péptido - espectrometria de massa

Manchas de proteína foram excisadas manualmente colocadas numa microplaca de 96 poços. As condições usadas para a digestão com tripsina e para a geração das massas características dos péptidos são descritas em Nouwens et al., (2000) Electrophoresis 21: 3797-3809. Uma etapa de purificação foi realizada sobre os péptidos trípticos para proteínas com um deficiente identificação de massas características de péptidos tal como descrita em Gobom et al., (1999) J. Mass Spectrom. 34: 105-116. As identificações das proteínas foram atribuídas através da comparação a lista de picos gerada a partir da dos dados de identificação de massas características do péptido com relação a uma base de dados que continha as digestões trípticas teóricos da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. O pacote Protein-Lynx (Micromass, Manchester, UK) foi usado para a pesquisa da base de dados.

Exemplo B.10 - Processamento da imagem

Os géis e os imunoblots foram digitalizados a 600 dpi com um digitalizador de lâmpada UMAX PS-2400X usando Photoshop 3.0 (Adobe, Mountain View, CA). A detecção de manchas e a correspondência dos pontos de proteína de gel para gel foram realizados com o programa informático MELANIE II (BioRad, Hercules, CA) corrido sobre OpenWindows 3.0. As massas moleculares aparentes foram determinadas 61 ΡΕ1546357 através de co-electroforese com padrões de proteínas (Pharmacia- Biotechnology).

Exemplo B.ll - Resultados da electroforese bidimensional e análise de identificação da massas características de péptido A análise dos eletroferogramas bidimensionais identificou duas aglomerações de pontos que se posicionaram ao longo do gradiente pi de um modo não usual. A análise da identificação da massa características de péptido das manchas dentro de cada uma das aglomerações mostrou que as manchas tinham identificações de massas características idênticas e eram por esse motivo derivadas da mesma molécula. A aglomeração 1 com uma massa aproximada de 130 kDa foi mapeada para a região da extremidade N de P216 da sequência do genoma da estirpe 232 de M. hyopneumoniae. A aglomeração 2, de aproximadamente 85 kDa foi mapeada para a extremidade carboxílica da mesma ORF. As proteínas foram designadas como P130 e P85, respectivamente. O pi da aglomeração 1 variou desde 9,5 até 8,0 enquanto que o pi da aglomeração 2 variou desde 9,0 até 6,5. A análise por espectrometria de massa indicou que a P216 foi clivada entre os aminoácidos 1004 e 1090, gerando os dois fragmentos de 130 e de 85 kDa.

Exemplo B 12 - Resultado na analise por "imunoblot"

Imunoblots bidimensionais reagindo com soros 62 ΡΕ1546357 porcinos hiperimunes revelaram um padrão complexo de manchas, duas das quais correspondiam a P130 e a P85. A P85 foi também fortemente reconhecida por um conjunto de soros de convalescentes mostrando que era um antigénio importante durante a doença. Para investigar este aspecto em maior profundidade, uma região de 30 kDa abrangendo os aminoácidos 1042-1226 em P85 foi expressa, purificada por cromatografia de afinidade com níquel e aplicadas sobre uma membrana de PVDF. Soros individuais de convalescentes a partir de suínos que se sabia serem positivos num ELISA especifico para M. hyopneumoniae reagiram com a proteína de 30 kDa confirmando que a P216 é uma molécula importante reconhecida pela resposta imune do hospedeiro durante o decurso normal da infecção. Os anticorpos estimulados em relação a um péptido de 30 kDa englobando os aminoácidos 1042-1226 reagiram apenas com o produto da clivagem do 85 kDa sugerindo que a clivagem ocorreu entre os aminoácidos 1004 e 1042. O soro estimulado para o péptido da extremidade N de P216 reconheceu apenas P130.

Exemplo B.13 - Processamento pós-tradução de P216 entre diferentes estirpes de M. Hyopneumoniae.

Para investigar os padrões dos fragmentos de P216 em estirpes diferentes de M. hyopneumoniae, foram realizadas análises por "imunoblot" com o péptido da extremidade N anti-P130 e anti soro anti-P130. Os estimulados contra o péptido da extremidade N reconheceram P130 e diversos péptidos de massa molecular mais baixa em "imunoblots" mono-dimensionais de lisados de células inteiras das 63 ΡΕ1546357 estirpes J e 232. 0 padrão das proteínas reconhecidas por estes anti-soros foi diferente entre as duas estirpes. Os anti-soros estimulados contra o péptido de 30 kDa reconheceram fortemente um antigénio de 85 kDa em ambas as estirpes J e 232, mas também reagiram com uma quantidade de proteínas fracamente reactivas. De modo similar, o padrão reconhecido com os soros anti-30 kDa foi diferente entre as estirpes J e 232.

Para determinar se estavam a ocorrer eventos de clivagem pós-tradução entre outras estirpes de M. hyopneumoniae, uma colecção de estirpes de origens geográficas diferentes foi examinadas por "imunoblot". Os soros anti-30 kDa reagiram fortemente a um antigénio de 85 kDa e a outras proteínas de massa molecular mais baixa em "imunoblots" de lisados de células inteiras de estirpes diferentes de M. hyopneumoniae. Essas estirpes representaram isolados recuperados de localizações geográficas diferentes no interior da Austrália e de países diferentes incluindo os EUA, a Grã Bretanha e França. No entanto, os soros anti-30 kDa não reagiram contra os antigénios em "imunoblots" de lisados de células inteiras de Mycoplasmas porcinos relacionados, como por exemplo Mycoplasma hyorhinis e Mycoplasma flocculare, sugerindo que a P216 é um antigénio específico para a M. hyopneumoniae.

Os soros convalescentes de suínos diferentes também reconheceram a P30 recombinante purificada indicando que a P216 é expressa in vivo. 64 ΡΕ1546357

Exemplo B.14 - Estudos de localização na superfície

Diversas abordagens foram tomadas para determinar se P216 e os seus produtos de clivagem estavam associadas com a superficie da membrana externa. Essas abordagens incluíram a digestão por tripsina e a biotinilação da superfície da célula.

Para os estudos da digestão com a tripsina, todas as soluções e as reservas de células de M. hyopneumoniae foram previamente equilibrados a 37°C. As células de M. hyopneumoniae (200 mg/mL em PBS) foram divididas em alíquotas (300 μΐ) em tubos de Eppendorf estéreis a 37°C e adicionou-se tripsina até uma concentração final na gama 0,1 - 1000 pg/mL. As suspensões foram suavemente invertidas e incubadas a 37°C durante 20 minutos. Imediatamente depois da incubação, as células foram lisadas num tampão de Laemmli, aquecidas para 95°C durante 10 minutos e analisadas por SDS PAGE e "imunoblotting". A tripsina digeriu tanto a P85 e a P130 de um modo dependente da concentração, mas não digeriu a enzima intracelular lactato desidro-genase, um controlo para a lise espontânea de células (Strasser et al., (1991) Infect. Immun. 59 1217-22) . Isto sugere que ambas as porções de P216 são acessíveis na superfície e sensíveis à digestão com tripsina.

Para mais clarificar este aspecto, foi realizada a biotinilação de superfície de M. hyopneumoniae. Foi usado o método descrito por Meier et al. ((1992) Anal. Biochem. 65 ΡΕ1546357 204: 220-226) com as seguintes modificações. Todas as soluções foram pré-arrefecidas a 4°C e todas as manipulações foram executadas em gelo. Ressuspenderam-se sedimentos de M. hyopneumoniae (200 mg de peso húmido) foram de novo suspensas em 4 mL de tampão BOS (10 mM de tetraborato de sódio em 0,15 M NaCl, pH 8,8). Imediatamente após a adição de 5 de NHS-biotina (10 mg/mL em dime-tilsulfóxido), deixou-se a reacção continuar durante 1 a 8 minutos agitação. Para determinar o tempo de reacção mais adequado, foram removidas aliquotas em intervalos de 1 minuto durante 15 minutos. Um tempo de reacção de 5 minutos foi escolhido para todos os estudos que se seguiram excepto quando especificado. A biotinilação foi parada com a adição de 2 mL de 0,1 M NH4C1 que serviu para a saturação da NHS-biotina não ligada. As células foram recolhidas por centrifugação (8500 x g, 10 minutos) e lavadas duas vezes em tampão TKMS (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KC1, 5 mM MgCl2 e 0,15 M NaCl em PBS) . Os produtos foram resolvidos por electroforese bidimensional.

Tanto a P130 como a P85 foram rapidamente bio-tiniladas, confirmando que todas as partes da P216 eram acessíveis pela superfície.

Exemplo B.15 - Extracções de Triton X-100 e X-114

As proteínas integrais da membrana de 200 mg de peso húmido de células inteiras foram extraídas com TX-114, essencialmente como descrito por Bordier ((1981) J. Biol, 66 ΡΕ1546357

Chem. 182: 1356-1363). As fases aquosa e de detergente resultantes foram recolhidas e analisadas por SDS-PAGE e "imunoblotting". A actividade de partição de fases do Triton X-114 causa a separação de moléculas hidrofóbicas no interior da fase detergente. Quando tratada com Triton X-114 a P85 permanece no sedimento insolúvel que consiste em estruturas complexas de elevado peso molecular que (1) estavam associadas à membrana e (2) não possuíam a solubilidade das proteínas citossólicas normais.

Para a extracção com Triton X-100, células de M. hyopneumoniae (estirpes J e Beaufort) (200 mg de peso húmido) sedimentadas foram novamente suspensas em 10 mL de tampão TS contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo. As proteínas foram extraídas pela adição de 2% de Triton X-100 (Amersham Pharmacia Biotechnology) e incubadas a 37°C durante 30 minutos como descrito por Stevens e Krause ((1991) J. Bacteriol. 173: 1041-1050). Resumidamente, as suspensões de células de M. hyopneumoniae foram centrifugadas (14000 x g, 30 minutos) a 4°C. A fase aquosa foi removida e o sedimento foi re-extraído tal como descrito acima. O sedimento insolúvel e ambas as fases aquosas foram analisadas por SDS-PAGE e por "imunoblotting" usando anti-30 kDa e soros estimulados contra o péptido DFLTNNGRTVLE (SEQ ID NO: 36).

Com o fraccionamento com Triton X-100 as proteínas do tipo citoesqueléticas de elevado peso molecular permanecem insolúveis, mas não ocorre a partição de fases. 67 ΡΕ1546357

Quando tratadas com Triton X-100, a P85 particionou-se primeiramente para a fase aquosa que continha o detergente, mas cerca de 30% permaneceu no sedimento. Estes dados indicam que a P216 pode formar estruturas oligoméricas extracelulares. A presença de domínios em hélice enrolados em ambos os fragmentos da P216 também sustenta esta hipótese. C. ESTUDOS DE P97

Exemplo C.l - Estirpes bacterianas e plasmídeos

As estirpes de M. hyopneumoniae 232 (estirpe parental virulenta), 232_91.3 (clone de elevada aderência), 232 60.3 (clone de baixa aderência) e estirpe do tipo J (NCTC 10110) foram cultivadas num meio de cultura de Friis modificado e recolhidas como descrito por Zhang et al., ((1995) Infect Immun 63: 1013-1019) e Djordjevic et al. ((1994) Vet Microbiol 39: 261-273), respectivamente. Todos os meios de cultura foram esterilizados por filtração através de filtros de 0,22 ym, os quais removeram a maioria da matéria em partículas. Os micoplasmas foram recolhidos por centrifugação e lavados extensivamente para remover os contaminantes de meio remanescentes. Cresceu-se Escherichia coli TOP10 contendo pISM405 em agar Luria Bertani (LB) ou em meio LB (Sambrook et al, 1989) contendo 100 yg mL-1 de ampicilina. A indução por isopropil-β-D-tiogalactopiranó-sido (IPTG) foi executada através da adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM. As culturas bacterianas foram 68 ΡΕ1546357 cultivadas de forma rotineira a 37°C e as culturas liquidas foram arejadas por agitação a 200 rpm.

Exemplo C.2 - Construção e expressão de proteína de fusão adesina

As proteínas de fusão hexa-histidilo P97 foram construídas com a utilização do vector de clonagem pTrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os iniciadores FMhp3 (5'-GAA CAA TTT GAT CAC AAG ATC CTG AAT ATA CC-3'(SEQ ID NO: 37)) e RMhp4 (5'-AAT TCC TCT GAT CAT TAT TTA GAT TTT AAT TCC TG-3' (SEQ ID NO: 38)), foram usados para amplificar um fragmento de 3013 pb representando os pares de bases 315-3321 da sequência do gene contendo os aminoácidos 105-1107. O fragmento foi digerido com Bell (sequência sublinhada) e inserido no local BamHI do vector pTrcHisA. Um construção com a orientação apropriada do fragmento foi identificada por digestões de restrição. A proteína de fusão P97-poli-histidina recombinante de 116 kDa resultante continha as regiões de repetição RI e R2 assim como o local de clivagem principal no aminoácido 195 na sequência P97.

Exemplo C.3 - Anti-soros O Mab F1B6 foi descrito ( (Zhang et al., (1995) Infect. Immun. 63: 1013-1019). O Mab F1B6 liga-se à região Rl da adesina do cílio que tem pelo menos 3 sequências repetidas (Minion et al. (2000) Infect. Immun. 68: 3056-

3060). Péptidos com as sequências TSSQKDPST (ΔΝΡ97) (SEQ ID 69 ΡΕ1546357 NO: 39) e VNQNFKVKFQAL (NP97) (SEQ ID NO: 40) foram usados para estimular anticorpos contra P97/P66 e P22, respectivamente. Os péptidos foram ligados à hemocianina da lapa gigante Megathura crenulata com o Pierce Imjet Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce Chemical Co., Rockfort, IL) . Esses conjugados foram então usados para gerar anti-soro hiperimune de ratinho pelo método de Luo e Lin ((1997) Βίο Techniques 23: 630-632). Os anti-soros resultantes foram testados através da análise imunossorbente associada a enzima (ELISA) com a utilização do conjugado de ovalbumina-péptido e antigénios P97 recombinantes purificados, e por imunização com o antigénio recombinante P97. Os anti-soros estimulados contra da extremidade C de 28 kDa (soro R2) da adesina do cilio da estirpe J foi descrito (Wilton et al., (1998) Microbiology 144: 1931-1943). O Mab 2B6-D4 do ratinho estimulado contra a fibronectina humana foi adquirido comercialmente (BD Biosciences, Pharmingen), como foram os anticorpos de cabra anti-ratinho Ig (H+L) conjugados com fosfatase alcalina (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, AL). O IgG + IgM de cabra anti ratinho marcado com partículas de ouro coloidais de 10 nm (EY Laboratories, Inc. San Mateo, CA) foi usado em estudos de microscopia electrónica de imunomarcação com ouro.

Exemplo C.4 - Análise por "imunoblots"

Realizou-se a electroforese em gel de poliacri-lamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e a análise 70 ΡΕ1546357 por "imunoblot" como descrito por Laemmli ( (1970) Nature 227: 680-685) e Towbin et al. ((1979) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 76: 4350-4354, respectivamente. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF (Micron Separations Inc.). Para as experiências de controlo de meio, a P97 recombinante purificada foi incubada com meio de Friis fresco e esgotado. O meio esgotado foi preparado a partir de uma cultura de fase log inicial que foi centrifugada e filtrada através de um filtro de 0,1 ym. A P97 recombinante purificada (2,5 yg) em 20 yL de tampão fosfato salino foi diluída a 1:1 em meio fresco ou esgotado e incubada de um dia para o outro a 37°C. Dez yL da mistura foram carregados em géis de SDS-PAGE, aplicados em nitrocelulose e revelados com Mab F1B6. Para a coloração do ligante, transferiram-se manchas de PVDF, bloquearam-se e lavaram-se como descrito anteriormente (Wilton et al. (1998) Microbiology 144: 1931-1943). As manchas foram expostas a fibronectina humana (5 yg mL_1) , dissolvidas em tampão TS (tampão TS: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) durante 1,5 h, lavadas e expostas a 0,4 yg mL-1 de Mabs de fibronectina anti-humana durante 1 hora à temperatura ambiente. As manchas foram lavadas e reveladas como descrito acima.

Exemplo C.5 - Tratamento de M. hyopneumoniae com tripsina Células de M. hyopneumoniae (0,5 g) foram tratadas com tripsina essencialmente como descrito anterior- 71 ΡΕ1546357 mente (Wilton et al. (1998) Microbiology 144: 1931 a 1943). Em resumo, a tripsina foi adicionada a suspensões celulares de M. hyopneumoniae a 0, 0,3, 0,5, 1,0, 3,0, 10, 50, 300 e 500 yg mL”1 a 37°C durante 15 minutos. Imediatamente depois da incubação, as suspensões celulares foram lisadas em tampão de Laemmli e aquecidas até 95°C durante 10 minutos. Os lisados foram analisados por SDS-PAGE e procedeu-se a "imunoblotting" com Mab F1B6.

Exemplo C.6 - Electroforese em gel bidimensional A electroforese em gel bidimensional sobre gel (2-DGE) foi levada a cabo essencialmente como descrito por Cordwell et al. ((1997) Electrophoresis 18: 1393-1998). Prepararam-se tiras imobilizadas gradiente de pH imobilizadas (IPG) de primeira dimensão (180 mm, pH linear 6-11; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) para focagem por submersão de um dia para o outro num tampão de amostra compatível para 2-DGE (5 M de ureia, 2 M de tioureia, 0,1 de anfolitos transportadores 3-10, 2% p/v de CHAPS, 2% p/v de sulfobetaína 3-10, 2 mM de tributil fosfina (TBP; BioRad, Hercules EUSA)). A proteína de células inteiras de M. hyopneumoniae (250 yg) ) foi diluída com tampão de amostra até um volume de 100 yl para aplicação à extremidade anódica de cada uma das tiras de IPG através de uma taça de aplicação. A focagem isoelétrica foi realizada com uma unidade de electroforese Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech) durante 85 kVh a 20°C. Mudou-se o detergente às tiras IGP, reduziu-se e alquilou-se num 72 ΡΕ1546357 tampão contendo 6 M de ureia, 2% de SDS, 20% de glicerol, 5 mM de TBP, 2,5% v/v de monómero de acrilamida, quantidades vestigiais de corante azul de bromofenol e 375 mM de Tris-HC1 (pH 8,8) durante 20 minutos antes de carregar as tiras de IPG mo topo de um gel de poliacrilamida de 20 cm x 20

cm, de 8 a 18% T, 2,5% C (diacrilamida de piperazina) . A electroforese de segunda dimensão foi executada a 4°C usando 3 mA/gel durante 2 horas seguida por 20 mA/gel até que o corante de azul de bromofenol tivesse saido da extremidade do gel. Os géis foram fixados em 40% de metanol, 10% de ácido acético durante 1 hora e então corados de um dia para o outro em Sypro Ruby (Molecular Probes, Eugene, OR). As imagens foram adquiridas utilizando um Molecular Imager Fx (Bio-Rad). Os géis foram então duplamente corados em Coomassie Blue G-250.

Exemplo C.7 - Análises pós-separação

As manchas de proteína foram excisadas dos géis usando um bisturi estéril e colocaram-se nua microplaca de 96 poços (Gobon et al., (1999) J. Mass. Spectrom. 34: 105- 116). Os pedaços de gel foram lavados com 50 mM de bicarbonato de amónio/100% acetonitrilo (60:40 v/v) e depois secos num Sped Vac (Savant Instruments, Holbrook, NY) durante 25 minutos. Os pedaços de gel então foram hidratados em 12 μΐ de 12 ng μΐ-1 de tripsina modificada de grau de sequenciação (Promega, Madison, WI) durante lha 4°C. O excesso da solução de tripsina foi removido e os pedaços de gel foram imersos em 50 mM de bicarbonato de 73 ΡΕ1546357 amónio e incubados de um dia para o outro a 37°C. Os péptidos eluidos foram concentrados e dessalinizados com a utilização de Zip-Tip™ Cis (Milipore Corp., Bedford, MA). Os péptidos foram lavados numa coluna com 10 pL de ácido fórmico a 5%. Os péptidos ligados foram eluidos a partir do Zip-Tip™ em solução de matriz (10 mg ml-1 de ácido a-ciano-4-hidróxicinâmico (Sigma) em acetonitrilo a 70%) directa-mente sobre a placa alvo. Espectros de massa de espectro-metria de massa de tempo de voo de desabsorção/ionização com laser auxiliado por matriz (MALDI-TOF MS) foram adquiridos com a utilização ou de um PerSeptive Biosystems Voyager DE-STR (Framingham, MA) ou de um Micromass TofSpec2E (Micromass, Manchester, UK). Ambos os instrumentos estavam equipados com lasers de azoto de 337 nm. Todos os espectros foram obtidos no modo de extracção de reflexão/retardado, com uma media de 256 incidências de laser por amostra. Uma calibração interna de dois pontos dos espectros foi realizada com base nos péptidos da autólise interna da tripsina porcina (iões 842,5 e 2211,10 [M+H]+) . Uma relação de picos monoisotópicos correspondentes à massa dos péptidos trípticos gerados foi usada para a pesquisa de uma versão modificada traduzida do genoma de M. hyopneumoniae. As identificações com sucesso foram baseadas no número de massas de péptido coincidentes e na percentagem de cobertura da sequência permitidas por essas coincidências. A sequenciação de Edman da extremidade N foi realizada como descrito anteriormente (Nouwens et al., (2000) Electrophoresis 21: 3797-3809). 74 ΡΕ1546357

Exemplo C.8 - Microscopia imunoelectrónica Células da estirpe 232 de M. hyopneumoniae foram cultivadas até meio da fase log, sedimentadas por centrifugação e lavadas uma vez com tampão fosfato salino (PBS). Os sedimentos finais de células foram fixadas com 3% de glutaraldeido em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio (pH 7,2) a 4°C de um dia para o outro. Os sedimentos foram lavados três vezes com 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio, 15 minutos entre as mudanças, e pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1% em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio durante 2 horas à temperatura ambiente. Os sedimentos foram então lavados com água destilada, passados através de uma série de acetona e embebidos em Embed 812 e Araldite (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) . Secções finas (80 a 90 nm) foram então lavadas seis vezes com tampão TS e postas em reacção com fluido de ascites F1B6 (diluído 1:50), fluido de ascites anti-ANP97 (diluído de 1:10) fluido de ascites anti-NP97 (diluído 1:10) ou fibronectina anti-humana de ratinho (diluída 1:25) de um dia para o outro a 4°C. As grelhas foram lavadas cinco vezes com tampão TS e então postas em reacção com IgG + IgM de cabra anti-ratinho marcados com partículas de 10 nm de ouro coloidal (EY Laboratories, Inc.) diluídas a 1:25, durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram então lavadas 5 vezes com tampão TS, secas, contrastadas com vapores de ósmio durante 2 minutos e coradas com acetato de uranilo/citrato de chumbo. As secções foram examinadas num Hitachi 500 a 75 kV. 75 ΡΕ1546357

Para as secções de traqueia, porcos isentos de micoplasma foram inoculados por via intra-traqueal, com a estirpe 232 de M. hyopneumoniae. Aos dias 10 e 21, os porcos foram sacrificados e as traqueias foram removidas e blocos de 1 cm de tecido foram fixados com 1% de glutaraldeido de um dia para o outro, desidratados numa série de acetona e embebidos como acima. Secções espessas (1 a 2 pm) foram coradas com policromo de azul de metileno e examinadas por microscopia para regiões que contivessem epitélio ciliado. Secções delgadas (80 a 90 nm) foram então preparadas para marcação. As secções foram pré-tratadas com cloreto de amónio (1%) durante uma hora, 0,05 M de glicina em PBS durante 15 minutos, bloqueadas durante 30 minutos em 2% de gelatina de peixe + 2% de albumina de soro bovino em tampão TS (10 mM Tris, 100 ml NaCl, pH 7,5) . Os anticorpos primários foram diluídos em tampão TS e postos em reacção com as secções durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram lavadas seis vezes com o tampão TS e então incubadas com IgG + IgM de cabra anti-ratinho marcados com partículas de ouro 10 nm (diluídas de 1:2) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Ambos os anticorpos primários como os conjugados foram diluídos e centrifugados rapidamente (12000 x g durante 5 minutos) antes de serem usados. As secções foram então lavadas seis vezes com tampão TS, secas, contrastadas com vapores de ósmio durante 2 minutos, e coradas com acetato de uranilo-citrato de chumbo. As secções foram examinadas num Hitachi 500 a 75 kV. 76 ΡΕ1546357

Exemplo C.9 - Análise de ligação da fibronectina

Placas de 96 poços Immunolon 2 (Dynatech Laboratories, Inc.) foram revestidas com 100 μΐ de fibronectina humana (Sigma, F0 8 95) a uma concentração de 5 yg mL"1 em 0,1 M de carbonato de sódio. As placas foram incubadas a 4°C de um dia para o outro, lavadas três vezes com PBS, e bloqueadas com 1 % de albumina de soro bovino em PBS durante 2 horas. As placas foram então incubadas com P97 recombinante purificada com ou sem inibidor numa concentração de 10 yg mL-1. Os inibidores testados foram a fibronectina humana intacta, um fragmento proteolítico de 45 kDa de fibronectina (Sigma, F 0162), um fragmento proteolítico de 30 kDa de fibronectina (Sigma, F 9911) e um polímero RGD modificado (Sigma, 5022). Foram adicionados a tubos do tipo Eppendorf com P97 recombinante purificada (10 yg mL-1) a concentrações de 37,5 yg mL-1, 7,5 yg mL-1 e 1,5 yg mL-1 e incubados a 37 °C durante uma hora. A P47

recombinante mais o inibidor foram então transferidos para uma placa revestida com fibronectina, que foi então incubada a 37 °C durante 2 horas. A ligação da P97 à fibronectina foi avaliada por ELISA com Mab F1B6. A densidade óptica a 405 nm foi indicativa da ligação da P97 aos poços revestidos com fibronectina. Testaram-se três réplicas por tratamento de três experiências diferentes. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo General Linear Model com um contraste linear baseado nas variações reunidas. 77 ΡΕ1546357

Exemplo C.10 - Resultados de electroforese em gel bidimensional e espectrometria de massa

Estudos anteriores demonstraram que o produto do gene para a adesina do cílio da estirpe 232 (pré-proteína de 126 kDa, 1036 aminoácidos) sofre uma clivagem no aminoácido 195 para resultar aquilo que se pensou ser a molécula "madura" (Hsu et al., (1997) J. Bacteriol. 179: 1317-1323). Durante os estudos do mapeamento de massa de péptidos das proteínas da estirpe J, identificaram-se quatro machas de 22, 28, 66 e 94 kDa (em seguida referidas, respectivamente, como P22, P28, P66 e P94) que representam fragmentos diferentes da adesina. As sequências da extremidade N para estas proteínas permitiram um alinhamento inequívoco com a proteína adesina do cílio. A P94 da estirpe J, o homólogo de P97 na estirpe 232, mapeada para uma região que se inicia imediatamente a jusante do aminoácido 195 até o final da OFR. Duas proteínas proximamente espaçadas a 66 kDa tinham mapas de massa idênticos e corresponderam a uma região que se inicia imediatamente a jusante do aminoácido 195 da adesina e que termina próximo da repetição RI. A análise da sequência da extremidade N da P 66 mostrou uma sequência de ADEKTSS (SEQ ID NO: 41) que é idêntica àquela da P94. Os resultados do "imunoblotting" com a utilização de Mab F1B6 confirmaram que P66 contém RI. Assim, o evento de clivagem deve ocorrer imediatamente a jusante da região de repetição RI. Esses dados sugerem que um fragmento com um tamanho de aproximadamente 28 kDa foi 78 ΡΕ1546357 removido da extremidade C nalgumas, mas não na totalidade das moléculas de P94. Esta observação foi confirmada quando um fragmento de 28 kDa foi identificado e que foi mapeado relativamente à extremidade C de P94. Igualmente, "imunoblots" mono- e bidimensionais de proteínas da estirpe J sondadas com os anti-soros estimulados contra uma proteina recombinante de 28 kDa contendo R2 mas não RI (Wilton et al., (1998) Microbiology 144: 1931-1943) reconheceram ambas as proteínas P28 e P94. Anteriormente foi mostrado que os anti-soros levantados contra um péptido recombinante de 29 kDa da extremidade C da adesina reconheceu a forma madura deste antigénio (93-97 kDa) em estirpes diferentes de M. hyopneumoniae e um fragmento de 28 kDa apenas na estirpe J (Wilton et al., (1998) Microbiology 144: 1931-1943). 0 mapeamento de massas do péptido triptico mostrou que péptidos a partir da P22 mapearam para os primeiros 190 aminoácidos da pré-proteína de adesão de 123 kDa. A sequência da extremidade N de P22 (SKKSKTF (SEQ ID NO: 42)) alinhou-se com os aminoácidos 2-8 na extremidade N da proteína 123 kDa sugerindo que a clivagem do péptido líder hidrofóbico (aminoácidos 8-22) não é necessária para a translocação da adesina do cílio através da membrana.

Os estudos comparativos do mapeamento de massas de péptidos da estirpe 22 identificaram duas manchas de 70 e de 97 kDa, subsequentemente identificados como P70 e P97, respectivamente. Os mapas de massa representativos do P97 corresponderam a uma região que se inicia imediatamente a 79 ΡΕ1546357 jusante do aminoácido 195 até o final da ORF e que correspondeu ao produto mais abundante do gene da adesina da estirpe 232 (Zhang et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1013-1019) . De forma interessante, os mapas de massa representativos de P70 corresponderam a uma região que se inicia imediatamente a jusante do aminoácido 195 e que termina próximo da repetição Rl, um mapa que foi virtualmente idêntico a Ρββ na estirpe J. A presença de seis cópias suplementares da repetição Rl é a explicação mais provável para a diferença em massas entre P66 e P70 nas estirpes J e 232, respectivamente. De forma consistente com estes dados, os imunoblots sondados com um anti-soro estimulado contra uma proteina recombinante de 28 kDa contendo R2 mas não Rl (Wilton et al. (1998) Microbiology 144: 1931-1943) reconheceu P47 mas não P70 ou a P28. Além disso, P28 e P22 não puderam ser identificadas nos géis de 2D das proteínas de 232 resolvidas pela electroforese 2D em gel nas regiões nas quais elas foram identificadas na estirpe J. Essa variação não foi devida a diferenças na sequência uma vez que as sequências da P22 eram idênticas nas duas estirpes. Isto, no entanto, não foi verdade para as sequências da P28. A massa prevista e o pi para a P28 da estirpe 232 foi de 24,6 kDa e 5,88, respectivamente e para a P28 da estirpe J foi de 26,0 kDa e 8,39. Foi possível que a P28 não tenha sido encontrada na estirpe 232 devido à mudança em pi causando um desvio na localização da proteína no gel. Também foi possível que a clivagem adicional de P22 que ocorreu na estirpe 232 não tenha ocorrido na estirpe J. 80 ΡΕ1546357

Para eliminar a possibilidade de que a clivagem tenha resultado de uma actividade proteolitica no meio usado para a cultura de M. hyopneumoniae, a P97 recombinante purificada foi incubada com meio fresco e meio esgotado e então examinada relativamente à clivagem proteolitica através de "imunoblot". Uma vez que o meio continha 20% de soro de porco, grandes quantidades de imunoglobulinas de porco estavam presentes nas amostras de proteína o que ocasionou alguma coloração de fundo com o conjugado anti-ratinho. Foi, no entanto, ainda claro que nem o meio fresco nem o meio esgotado continham actividade proteolitica capaz de clivar a P97 recombinante depois de 12 horas de incubação a 37°C. Assim, a clivagem da adesina do cílio foi mediada por actividades codificadas pelo micoplasma e não devida ao soro porcino ou a outros componentes do meio.

Exemplo C.ll - Sensibilidade à tripsina de RI contendo produtos de clivagem

As analises por "imunoblot" de células das estirpes J e 232 digeridas com concentrações diferentes de tripsina foram usadas para a investigação da localização celular de fragmentos de clivagem que continham RI. O Mab F1B6 reconheceu tipicamente proteínas com massas de 35, 66, 88, 94 e 123 kDa na estirpe J e um padrão similar foi mostrou uma perda

observado para a estirpe 232. A exposição de M. hyopneumoniae intacta a concentrações de tripsina que variaram na gama de 0,1-10 yg mL 81 ΡΕ1546357 gradual das proteínas de massas mais elevadas. As concentrações entre 10 e 50 yg mlT1 resultaram na perda de todas as proteínas imunorreactivas (excepto uma de 35 kDa) indicando que os fragmentos de adesina contendo RI são acessíveis através da superfície. O padrão de digestão de fragmentos de adesina contendo Rl foi consistente em experiências repetidos excepto que o fragmento de 35 kDa não foi resistente de forma fiável à tripsina a concentrações acima de 10 yg rnL-1. Manchas idênticas reagiram com o anti-soro estimulado para a lactato desidrogenase de M. hyopneumoniae (previamente mostrada residir no citossol) (Strasser et al. (1991) Infect. Immun. 59 1217-1222) e a anti soro estimulado para fragmentos recombinantes de subunidades A e D de piruvato desidrogenase mostrando que essas proteínas permaneceram detectáveis com concentrações de tripsina de até 500 yg mL“ 1. Em experiências de controlo nas quais as células lisadas foram expostas a tripsina, a subunidade D da lactato desidrogenase e da piruvato desidrogenase foram rapidamente degradadas.

Exemplo C.12 - Resultados da microscopia electrónica com imunodetecção com ouro

Estudos de transmissão por microscopia electrónica mostraram que estirpes e alta e baixa aderência de M. hyopneumoniae diferiam nas suas estruturas de membrana externa. Os clones de alta aderência possuíam fibrilas na superfície exterior que pareciam se interligar 82 ΡΕ1546357 às células adjacentes; estas fibrilas foram raramente observadas em clones de baixa aderência (Young et al. (1994) Isolation and characterization of high and low adherence clones of Mycoplasma hyopneumoniae. Em IOM Letters, 10th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology. Vol 3 Bordéus, França, pp 684-685). Os anti-soros gerados contra regiões especificas da adesina permitiram a análise da clivagem in vivo com a utilização de microscopia imunoelectrónica com marcação com ouro. A estirpe virulenta 232 foi usada nesses estudos uma vez que esses resultados poderiam ter o impacto mais significativo na compreensão dos mecanismos patogénicos. 0 Mab F1B6 especifico para RI e os anti-soros estimulados para os péptidos TSSQKDPST (ΔΝΡ97) (SEQ ID NO: 39) e VNQNFKVKFQAL (anti-soro NP97) (SEQ ID NO: 40) foram usados nestes estudos. O Mab F1B6 permaneceu associado com a membrana do micoplasma, mas não intimamente associado com a célula confirmando um relatório anterior (Zhang et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1013-1019) e os estudos com tripsina acima. O anti-soro ΔΝΡ97 mostrou que essa porção da molécula está localizada em posição distai relativamente à membrana, em associação com material extracelular de composição desconhecida. Nalguns casos, os anticorpos pareceram definir estruturas do tipo fibrial ainda ligadas à membrana da célula do micoplasma. Os anticorpos NP97 aglomeraram-se em agregados a localizações no citossol, intimamente à superfície da membrana, e também foram observados em sitios distantes da superfície extracelular da membrana celular. 83 ΡΕ1546357

Exemplo C.13 - Resultados de ligação da fibronectina

Uma vez que a clivagem da adesina do cílio ocorre na posição do aminoácido 195 (Hsu et al. (1997) J.

Bacteriol. 179: 1317-1323), não se tornou aparente com facilidade como a adesina restante poderia permanecer associada com a célula e se ligar directamente aos cílios porcinos. Estudos em imunomarcação com ouro mostraram que todos os epitopos de RI que se ligam aos cílios permaneciam associados à célula na ausência da sequência hidrofóbica da extremidade N, mas aparentemente não estão inseridos directamente na membrana. Isso não é surpreendente, uma vez que nenhuma outra região da proteína tem uma hidrofobicidade suficiente para direccionar a inserção directa na membrana (Hsu et al., (1997) J. Bacteriol. 179:

1317-1323). A possibilidade de que outras proteínas podem desempenhar um papel na ligação de fragmentos de proteína da adesina do cílio contendo RI à membrana através de interacções proteína-proteína foi examinada. A análise da sequência de proteína prevista da pré-proteína adesina de 123 kDa com o programa de computador COILS (http://www.ch.embnet.org) revelou que a proteína continha três domínios de hélice enrolado. Um desses domínios residia entre os aminoácidos 180 a 195 em P22 (parâmetros de janela de 14-, 21 e 28 aminoácidos) e dois estavam

localizados na P97 entre os aminoácidos 367 e 387 (parâmetro de janela 14) e 780-805 (parâmetros de janela 14 e 21) . Sabe-se que estes domínios medeia, as interacções proteína-proteína. Além disso, pensou-se que os domínios RI 84 ΡΕ1546357 e R2 também podem representar um papel nas interacções com outras proteínas. Uma proteína óbvia para o teste foi a fibronectina, uma proteína encontrada em abundância no hospedeiro e mostrou participar noutras interacções bactéria-hospedeiro (Probert et al. (2001) Infect. Immun. 69: 4129-4133); Talay et al., (2000) Cell Microbiol. 2: 521-535; Rocha e Fischetti (1999) Infect Immun. 67: 2720-2728; e Schorey et al., (1996) Mol. Microbiol. 21: 321- 329) .

Estudos de "blotting" de ligando confirmaram que a P97 recombinante se liga à fibronectina porcina. Outras proteínas que se ligam à fibronectina foram também identificadas em lisados de variantes pouco (faixa 1) e muito aderentes (faixa 2) da estirpe 232 e na estirpe J (faixa 3) de M. hyopneumoniae. As estirpes de baixa e elevada aderência de 232 são diferentes pela ausência de uma banda de ligação com a fibronectina a aproximadamente 50 kDa, a qual também estava presente na estirpe J.

Também foram realizados ensaios de ligação da fibronectina com a fibronectina humana e a adesina de cílio recombinante purificada. O máximo de inibição ocorreu com o domínio RGD modificado na totalidade das três concentrações testadas (p < 0,001). A inibição também ocorreu com a fibronectina intacta (p < 0,001) tal como esperado. De modo interessante, o fragmento purificado de 45 kDa da fibronectina aumentou a ligação na concentração mais elevada testada. 85 ΡΕ1546357

Para investigar o ou os papéis que a fibronectina pode desempenhar na ligação de M. hyopneumoniae às células epiteliais respiratórias porcinas, anticorpos anti-fibronectina foram aplicados a secções de pulmão que apresentavam a estirpe 232 de M. hyopneumoniae em associação próxima com os cílios epiteliais respiratórios. Partículas de ouro foram localizadas em regiões nas quais as células de M. hyopneumoniae estavam associadas de forma intima com os cílios, sobre a superfície dos cílios e à superfície das células de M. hyopneumoniae.

D. DETECÇÃO DE INFECÇÃO E COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS

Exemplo D.l - Detecção de infecção por M. hyopneumoniae em suínos

Os polipéptidos que apresentam antigenicidade relativamente a M. hyopneumoniae desta invenção podem ser usados em métodos e em kits desenhados para detectar a presença de infecção por M. hyopneumoniae em varas de suínos e dessa forma reconhecer suínos numa vara que tenham sido infectados por esta bactéria. Por exemplo, os antigénios produzidos por hospedeiros transformados em moléculas de ácido nucleico recombinante desta invenção, ou anticorpos estimulados contra os mesmos, podem ser usados em RIA ou em ELISA para esses fins. Num tipo radioimuno-ensaio, anticorpos contra um ou mais dos antigénios desta invenção, estimulados num animal de laboratório (por exemplo, coelhos), é fixado a uma fase sólida, por exemplo 86 ΡΕ1546357 a parte interna de um tubo de ensaio. 0 antigénio e então adicionado ao tubo para se ligar com o anticorpo.

Uma amostra de soro suino, recolhida de 1 de cada 10 a 20 porcos por vara, em conjunto com uma quantidade conhecida de anticorpo para o antigénio marcado com um isótopo radioactivo, tal como o iodo radioactivo, é então adicionado ao tubo revestido com o complexo de antigénio-anticorpo. Qualquer anticorpo para antigénio (um marcador para a infecção por M. hyopneumoniae) no soro do suino irá competir com o anticorpo marcado em relação aos sitios de ligação livres no complexo antigénio-anticorpo. Uma vez que se deixa o soro interagir, o liquido em excesso é removido, o tubo de ensaio é lavado, e a quantidade de radioacti-vidade é medida. Um resultado positivo, isto é, que o soro do suino testado contém o anticorpo de M. hyopneumoniae é indicado por uma contagem radioactiva baixa.

Num tipo de teste de ELISA, uma microplaca é revestida com um ou mais antigénios desta invenção e a esta é adicionada uma amostra de soro de suino, de novo, a partir de 1 em cada 10 ou 20 suinos numa vara. Depois de um período de incubação que permita a interacção de qualquer anticorpo presente no soro com o antigénio, a placa é lavada e uma preparação de anticorpos para o antigénio, estimulados num animal de laboratório e ligados a uma marcação enzimática, é adicionado, incubado para permitir a ocorrência da reacção, e a placa é de novo lavada. Depois, adiciona-se um substrato enzimático à microplaca e incuba- 87 ΡΕ1546357 se durante um período de tempo para permitir que a enzima actue sobre o substrato, e mede-se absorvância da preparação final. Uma mudança grande na absorvância indica um resultado positivo, isto é, o soro do porco testado tinha anticorpos para M. hyopneumoniae e estava infectado com aquela bactéria.

Exemplo D.2 - Composições imunogénicas

Podem ser usados métodos convencionais conhecidos pelos peritos na técnica para a preparação de composições imunogénicas de polipéptidos e de ácidos nucleicos da presente invenção para a administração a suínos. Por exemplo, o polipéptido de escolha pode ser dissolvido em solução salina estéril. Para um armazenamento a longo prazo, o polipéptido pode ser liofilizado e então reconstituído com solução salina estéril imediatamente antes de ser administrado. Antes da liofilização, podem ser adicionados conservantes e outros aditivos convencionais tais como aqueles para proporcionar volume, por exemplo, glicina ou cloreto de sódio. Um adjuvante compatível também pode ser administrado com a composição.

Além disso, podem ser preparadas composições com a utilização de anticorpos estimulados contra os péptidos desta invenção em animais de laboratório, tais como coelhos. Essa vacina "passiva" pode então ser administrada a suínos para a sua protecção contra a infecção por M. hyopneumoniae. A incorporação directa de sequências de 88 ΡΕ1546357 ácido nucleico dentro de células hospedeiras também pode ser usada para a introdução das sequências em células animais para a expressão do antigénio in vivo. A descrição acima, os desenhos e exemplos são apenas ilustrativos das realizações preferidas que conseguem os objectivos, características e vantagens da presente invenção. Não se pretende que a presente invenção seja limitada às realizações ilustradas.

Lisboa, 4 de setembro de 2013

Claims

ΡΕ1546357 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido imunogénico purificado com 8 a 30 aminoácidos de comprimento, compreendendo a sequência de aminoácidos do qual pelo menos oito residuos consecutivos da SEQ ID NO: 8 ou um mutante do referido polipéptido imunogénico em que o referido mutante tem uma variação de aminoácido conservativa em comparação com o polipéptido nativo e em que o polipéptido mutante retém imunogeni-cidade.
2. O polipéptido imunogénico da reivindicação 1, cuja sequência de aminoácidos compreende pelo menos 10 residuos consecutivos da SEQ ID NO: 8.
3. O polipéptido imunogénico da reivindicação 1, cuja sequência de aminoácidos compreende pelo menos 12 residuos consecutivos da SEQ ID NO: 8.
4. O polipéptido imunogénico da reivindicação 1, cuja sequência de aminoácidos compreende pelo menos 15 residuos consecutivos da SEQ ID NO: 8.
5. O polipéptido imunogénico da reivindicação 1, cuja sequência de aminoácidos compreende pelo menos 20 residuos consecutivos da SEQ ID NO: 8.
6. O polipéptido imunogénico da reivindicação 2 ΡΕ1546357 1, cuja sequência de aminoácidos compreende pelo menos 25 resíduos consecutivos da SEQ ID NO: 8.
7. Uma composição que compreende o polipéptido imunogénico ou mutante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Um ácido nucleico isolado consistindo numa sequência nucleotídica que codifica para o polipéptido imunogénico de qualquer uma das reivindicações 1-6.
9. 0 ácido nucleico da reivindicação 8, em que a referida sequência nucleotídica é um fragmento d SEQ ID NO: 7 .
10. Um vector compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 8 ou 9.
11. O vector da reivindicação 10, em que o referido ácido nucleico está operacionalmente ligado a uma sequência de controlo da expressão.
12. Uma célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 10 ou 11.
13. Uma composição compreendendo o vector da reivindicação 11 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 3 ΡΕ1546357
14. A composição da reivindicação 7 ou 13 para utilização no estimulo de uma resposta imune num animal.
15. A composição da reivindicação 14, em que a referida composição é para administração por via oral, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa.
16. A composição da reivindicação 14 ou 15, em que o referido animal é um suino.
17. Um polipéptido imunogénico purificado tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização como um antigénio para provocar uma resposta imune num animal.
18. Um ácido nucleico tal como reivindicado na reivindicação 8 ou 9 para utilização na geração de uma resposta imune.
19. Um método para a determinação se um animal tem ou não um anticorpo reactivo ao polipéptido imunogénico de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo o referido método: contactar uma amostra de teste de um referido animal com o referido polipéptido imunogénico sob condições permissiveis para a ligação especifica do referido polipéptido imunogénico com o referido anticorpo; e detectar a presença ou a ausência da referida 4 ΡΕ1546357 ligação específica, em que a referida presença de ligação específica indica que o referido tem o referido anticorpo, e em que a referida ausência de ligação específica indica que o referido animal não tem o referido anticorpo.
20. O método da reivindicação 19, em que a referida amostra de teste é um fluido biológico.
21. 0 método da reivindicação 20, em que o referido fluido biológico é seleccionado a partir do grupo que consiste de sangue, fluido nasal, fluido da garganta e fluido do pulmão.
22. 0 método da reivindicação 19, no qual o referido polipéptido imunogénico está fixado a um suporte sólido.
23. 0 método da reivindicação 22, no qual o referido suporte sólido é uma microplaca ou esferas de poliestireno.
24. O método de qualquer uma das reivindicações 19 a 23, em que o referido polipéptido imunogénico é marcado.
25. 19 a 24, em 0 método de qualquer uma das reivindicações que a referida detecção é através de um radioimunoensaio (RIA), um imunoensaio enzimático (EIA), ou um ensaio de imunossorção associado a enzima (ELISA). 5 ΡΕ1546357
26. Um kit para diagnostico para a detecção da presença de um anticorpo numa amostra de teste, no qual o referido anticorpo é reactivo ao polipéptido imunogénico de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo o referido kit o polipéptido imunogénico de qualquer uma das reivindicações 1 a 6. Lisboa, 4 de setembro de 2013