PT1542014E

PT1542014E - Sensor óptico biodegradável para fazer in situ medições das substâncias a analisar

Info

Publication number: PT1542014E
Application number: PT05004258T
Authority: PT
Inventors: Anders Weber; Christopher John Stanley
Original assignee: Precisense As
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2007-01-31
Also published as: JP2002519164A; EP1542014B1; US6625479B1; NZ509716A; DE69927157D1; DE69927157T2; ES2245108T3; DE69933717T2; DK1095273T3; EP1095273A1; ATE304175T1; ATE343133T1; AU757642B2; CA2336397C; DK1542014T3; EP1095273B1; AU4632799A; CY1105923T1; CA2336397A1; ES2275246T3

Description

PE1542014 1 DESCRIÇÃO "SENSOR ÓPTICO BIODEGRADÁVEL PARA FAZER IN SITU MEDIÇÕES DAS SUBSTANCIAS A ANALISAR" O presente invento diz respeito a um método para a medição ou monitorização de substâncias a analisar em fluidos subcutâneos utilizando técnicas ópticas para interrogar um sensor injectado ou implantado. O sensor é particularmente apropriado para ser utilizado em situações nas quais os níveis da substância a analisar têm que ser rigorosamente monitorizados, por exemplo com medicamentos que têm que ser mantidos dentro de uma estrita janela terapêutica ou onde as medições da substância a analisar têm que ser feitas repetidamente, tal como no caso dos diabéticos de longo prazo.

No tratamento da diabetes, a medição regular da glucose no sangue é essencial a fim de assegurar a correcta dosagem da insulina. Além do mais, tem sido demonstrado que nos cuidados de longo prazo do doente diabético um melhor controlo dos níveis da glucose no sangue pode adiar, se não evitar o início dos problemas de retinopatia, os problemas circulatórios e outras doenças degenerativas frequentemente associadas à diabetes. Assim há uma necessidade de auto-monitorizar com fiabilidade e rigor os níveis de glucose no sangue pelos doentes diabéticos. 2 PE1542014

Correntemente, a glucose no sangue é monitorizada pelos doentes diabéticos com a utilização de tiras para um teste colorimétrico disponíveis comercialmente ou biossensores electromecânicos (e.g. eléctrodos de enzimas), requerendo ambos a utilização regular de um instrumento do tipo lanceta para retirar uma quantidade apropriada de sangue de cada vez que é feita uma medição. Em média, a maioria dos doentes diabéticos utilizarão tais instrumentos para fazer medições da glucose do sangue duas vezes por dia. Contudo, o National Institutes of Healt dos EUA recomendou recentemente que os testes de glucose no sangue deviam ser levados a cabo pelo menos quatro vezes por dia, recomendação esta que foi endossada para a American Diabetes Association. Este aumento da frequência dos testes da glucose no sangue impõe uma considerável sobrecarga sobre os doentes diabéticos, tanto em termos financeiros como em termos de sofrimento e desconforto, particularmente nos diabéticos de longa prazo que têm que fazer a utilização regular de uma lanceta para retirar o sangue das pontas dos dedos. Por isso, há claramente uma necessidade de um melhor sistema de monitorização da glucose de longo prazo que não implique a extracção de sangue do doente.

Houve um certo número de propostas recentes para técnicas de medição da glucose que não requerem a extracção de sangue do paciente. Foram feitas várias tentativas para construir dispositivos nos quais um biossensor de eléctrodo de enzima é colocado na ponta de uma agulha ou cateter que é inserido num vaso sanguíneo (Wilkins E and Atanasov P, 3 PE1542014

Med. Eg. Phys (1996) 18: 273-288). Enquanto que o próprio dispositivo sensor é colocado dentro de um vaso sanguíneo, a agulha ou o cateter mantêm a ligação com o meio ambiente exterior. Na prática, tais dispositivos não são dispositivos apropriados para serem utilizados em doentes humanos primeiramente porque a inserção de uma agulha ou cateter num vaso sanguíneo apresenta riscos de uma infecção e também por ser inconfortável para o doente e por isso não é apropriado para uma utilização contínua. Em segundo lugar, dispositivos deste tipo não obtiveram a aprovação para a utilização em doentes humanos porque foi sugerido que o próprio dispositivo, na extremidade de uma agulha ou cateter, pode ser responsável por derramamentos na circulação sanguínea do doente que podem causar tromboses. Isto obviamente tem riscos muito sérios para a saúde do doente.

Mansouri and Schulz (Biotechnology 1984), Meadows and Schulz (Anal. Chim. Acta. (1993) 280: pp21-30) e a Patente US n° 4344438 descrevem todos dispositivos para uma monitorização in situ de componentes de baixo peso molecular no sangue com meios ópticos. Estes dispositivos são concebidos para serem inseridos num vaso sanguíneo ou colocados subcutaneamente mas requerem ligações por meio de fibra óptica a uma fonte de luz exterior e a um detector exterior. Mais uma vez a localização destes dispositivos num vaso sanguíneo implica a associação dos riscos de promover a trombose e além disso, num modelo de realização em que haja a necessidade de manter ligações por meio de 4 PE1542014 fibra óptica ao meio ambiente exterior é impraticável para utilizações de longo prazo e implica os riscos de infecção.

Na procura de uma técnica de monitorização da glucose menos invasiva também se concentrou alguma atenção na utilização de espectroscopia com infra-vermelhos a fim de medir directamente a concentração de glucose nos vasos sanguíneos em tecidos tais como o lobo da orelha ou as pontas dos dedos os quais são relativamente "transparentes à luz" e têm vasos sanguíneos situados perto da superfície da pele (Jaremko J and Rorstad O, Diabetes Care 1998 21:, 444-450 e Fogt EJ, Clin. Chem. (1990) 36:, 1573- 80). Esta abordagem é obviamente minimamente invasiva, mas tem provado ser de pouco valor prático devido ao facto do espectro de infra-vermelho da glucose no sangue ser tão semelhante à do tecido circundante que em termos práticos é virtualmente impossível a resolução dos dois espectros.

Tem sido observado que a concentração das substâncias a analisar em fluidos subcutâneos correlaciona-se com a concentração dos referidos substâncias a analisar no sangue, consequentemente houve vários relatórios de utilização de dispositivos de monitorização da glucose que são colocados numa localização subcutânea. Em particular, Atanasov e outros (Med. Eng. Phys. (1996) 18: pp632-640) descrevem a utilização de um dispositivo (dimensões de 5,0 x 7,0 x 1,5 cm) que se pode implantar que pressente a glucose para monitorizar a glucose nos fluidos subcutâneos de um cão. O dispositivo consiste num sensor da glucose por 5 ΡΕ1542014 medição da amperagem da glucose, um potencióstato em miniatura, um transmissor de sinal FM e um alimentador de potência que pode ser interrogado remotamente, através de uma antena e de um receptor ligados a um sistema com um computador que faça a aquisição de uma base de dados, que não necessita de uma ligação ao meio ambiente exterior. Contudo, as grandes dimensões deste dispositivo torná-lo-ão obviamente impraticável para ser utilizado por um doente humano.

Na WO 91/09312 são descritos um método e um dispositivo subcutâneos como utilizando um avaliador por afinidade para a glucose que é interrogado remotamente com meios ópticos. Na WO 97/19188 é descrito mais um exemplo de um sistema de avaliação da glucose que se pode implantar o qual produz um sinal óptico que pode ser lido remotamente. Os dispositivos descritos na WO 91/09312 e na WO 97/19188 persistirão no corpo por extensos períodos depois da avaliação química ter falhado de funcionar correctamente e isto é a maior desvantagem para as aplicações crónicas. A remoção do dispositivo requererá um processo cirúrgico.

Assim permanece uma necessidade clara de técnicas de monitorização da glucose no sangue precisas e sensíveis que não requeiram a extracção regular de sangue do doente, que não impliquem o risco de infecções ou desconforto e que não tenham as desvantagens práticas dos dispositivos que se podem implantar, anteriormente descritos. 6 ΡΕ1542014

Consequentemente, num primeiro aspecto o presente invento proporciona um método para a detecção ou a medição quantitativa de uma substância a analisar em fluidos subcutâneos de um mamífero, método este que compreende as seguintes fases: (a) permitir uma avaliação de um sensor injectado ou implantado subcutaneamente para a detecção ou medição quantitativa de uma substância a analisar num fluido subcutâneo de modo a alcançar o equilíbrio termodinâmico, sendo o referido sensor caracterizado por ele poder funcionar numa localização subcutânea sem ligação física ao meio ambiente exterior, incorporando o referido sensor uma avaliação da referida substância a analisar cuja leitura é um sinal óptico detectável ou mensurável, sinal óptico este que pode, quando o sensor estiver a funcionar numa localização subcutânea, ser interrogado transcutaneamente por meios ópticos exteriores e sendo o referido sensor biodegradável e hidrolisável in vivo. (b) interrogar a leitura da referida avaliação utilizando meios ópticos; e (c) relatar a medição obtida em (b) da concentração da substância a analisar. 0 sensor do invento incorpora meios de avaliação para detectar uma substância a analisar ou para medir a quantidade de uma substância a analisar, sendo a leitura do 7 ΡΕ1542014 ensaio um sinal óptico. Porque o sensor está localizado precisamente por baixo da pele, um sinal óptico gerado no sensor pode ser detectado transcutaneamente (i.e. através da pele) obviando-se assim a necessidade de qualquer conexão directa entre o sensor e o meio ambiente exterior. Uma vez que o sensor esteja no devido lugar numa localização subcutânea as medições da substância a analisar podem ser feitas tão frequentemente quanto for necessário sem efeitos adversos. Isto é particularmente vantajoso em relação aos cuidados de longo prazo dos doentes diabéticos porque se as medições da glucose forem feitas mais frequentemente, um controlo mais apertado pode ser mantido sobre o nível da glucose no sangue e o risco do desenvolvimento de condições relacionadas com uma deficiente regulação da glucose no sangue, tais como a retinopatia, as artrites e a má circulação serão reduzidas.

Porque o sensor do invento não contém ele próprio qualquer dos componentes ópticos requerido para interrogar a leitura da avaliação (sendo isto proporcionado separadamente e localizado fora do corpo) o sensor pode facilmente ser proporcionado sob uma forma que seja injectável com um minimo desconforto para o doente. Num modelo de realização preferencial os componentes para a avaliação são incorporados no material de matriz que é permeável aos fluidos subcutâneos permitindo assim que as substâncias a analisar tais como a glucose entrem no sensor por difusão e interajam com os componentes para a avaliação. 0 material de matriz pode ter uma formulação PE1542014 injectável que forme um gel no ponto de injecção por baixo da pele do doente. Em alternativa, o sensor pode ser formado a partir de um material de matriz polimérica sólido incorporando os componentes para avaliação que são mais uma vez injectados subcutaneamente, tendo o material polimérico uma dimensão apropriada para a injecção através de uma agulha de pequeno calibre a fim de minimizar o desconforto do doente. Quando colocado subcutaneamente o material polimérico sólido absorve água e expande-se de modo a formar um gel hidratando assim os componentes para a avaliação. O dispositivo do presente invento é biodegradável ou hidrolisável in vivo. Em funcionamento este sensor é colocado num local subcutâneo mas em seguida degrada-se lentamente durante um determinado período de tempo. Uma vez que o sensor se tenha degradado em determinado medida de modo a que ele tenha deixado de estar a funcionar eficientemente na monitorização das substâncias a analisar, um novo sensor pode ser simplesmente injectado e não há necessidade do antigo sensor ser removido cirurgicamente. Por razões de segurança, é desejável que o sensor se degrade num material que seja completamente eliminado do corpo. Na prática, isto requer que o sensor se degrade em materiais que possam passar através da membrana do rim humano para ser excretado na urina ou que possa ser metabolizado pelo corpo.

Tal como é aqui utilizado o termo "biodegradável" 9 PE1542014 deve ser entendido como significando que o dispositivo do sensor do invento se degrada dentro do corpo em materiais que possam ser substancial e completamente eliminados do corpo não deixando resíduos e que, uma vez o sensor do invento colocado no corpo, ele degrada-se até ao ponto em que venha a ser substancial e completamente eliminado do corpo numa escala de tempo relativamente razoável tendo em conta o tempo da vida activa dos respectivos componentes reagentes incorporados no dispositivo. Por outras palavras, o dispositivo sensor do invento idealmente será completamente eliminado do corpo, pouco tempo depois dele ter cessado de ser eficiente na medição com precisão/monitorização da substância a analisar. Assim uma vez que o sensor cesse de ser eficiente, um novo sensor pode simplesmente ser posto no seu lugar e o problema da acumulação de dispositivos antigos ou gastos dentro do corpo será evitado. De preferência, o sensor do invento degradar-se-á de modo tal que ele seja substancial e completamente eliminado do corpo após um período de menos de um ano, mais preferencialmente durante um período de vários meses.

Os materiais apropriados para a construção de um tal sensor biodegradável incluem blocos de copolímeros biodegradáveis tais como os que são descritos por Jeong e outros, Nature 388: pp 860-862. As soluções aquosas destes materiais são termo-sensíveis, exibindo uma dependência da temperatura nas transições reversíveis gel-solução. O material polímero pode ser carregado com os componentes 10 PE1542014 para a avaliação a uma temperatura elevada em que o material forma uma solução coloidal. Sob esta forma o material é injectável por meio de uma injecção subcutânea e com o subsequente rápido arrefecimento para a temperatura do corpo o material forma uma matriz de gel. Os componentes para a avaliação ficam em suspensão nessa matriz de gel a qual constitui assim um sensor apropriado para detectar ou medir as substâncias a analisar num fluido subcutâneo. As substâncias a analisar com baixo peso molecular tais como a glucose, podem-se difundir livremente na matriz de gel do fluido subcutâneo circundante. Este modelo de realização do invento em particular tem a vantagem de não haver a necessidade de um processo cirúrgico para implantação do sensor. A injecção subcutânea do material na fase de solução coloidal não causa nem dor significativa nem danificação dos tecidos.

Como alternativa ao sensor com base no gel acima descrito o sensor pode ser construído a partir de um sólido ou de um material de matriz semelhante a um gel de um polímero biodegradável dentro da qual os componentes para a avaliação são distribuídos. Quando injectado ou implantado subcutaneamente este sensor de polímero sólido hidrata-se, dilata-se e a substância a analisar penetra através da sua estrutura para ir ao encontro dos componentes para a avaliação.

Num outro modelo de realização o sensor pode ser construído sob a forma de uma câmara oca, sendo as paredes 11 PE1542014 da câmara construídas a partir de um material sólido de um polímero biodegradável ou de um tubo capilar solúvel e definindo um espaço central no qual os componentes para a avaliação estão contidos. Os substâncias a analisar de baixo peso molecular são capazes de se difundir através das paredes da câmara, ou através de um obturador permeável da extremidade, para dentro do espaço central e assim virem ao contacto com os componentes a serem avaliados. Estas paredes da câmara oca degradar-se-ão gradualmente ao longo do tempo.

Tanto os sensores de polímeros sólidos como os sensores de câmara oca podem ser introduzidos numa localização subcutânea por implantação ou injecção, sendo a injecção preferida para os sensores com um diâmetro menor do que 2 mm. Ambos os tipos de sensores podem ser formados por uma larga variedade de formas geométricas antes da injecção ou implantação tal como se desejar, sendo os sensores cilíndricos particularmente preferidos.

Os materiais biodegradáveis apropriados para serem utilizados na construção das câmaras ocas e os sensores de polímeros sólidos incluem proteínas com ligações cruzadas tal como a albumina humana, geles de fibrina, polissacaridos tais como amido ou a agarose, poli (DL-lactido) e poli (DL-glicolido), polianidridos, misturas de ácido gordo/colesterol que formam derivados semi-sólidos, hialuronates e cristais líquidos de mono-oleína e agua. 12 ΡΕ1542014

Ainda num outro modelo de realização, o sensor pode ser formado como uma suspensão de micro partículas com um diâmetro preferencial <100 μιη cada um dos quais contém o componente para a avaliação quer encapsulado dentro de uma micro partícula oca, quer disperso dentro do material de uma micro partícula sólida. Uma tal suspensão de micro partículas é facilmente injectada subcutaneamente. De preferência as micro partículas são formadas a partir de um material que é biodegradável ou hidrolisável in vivo. Em alternativa, lipossomas que contêm os componentes para a avaliação podem ser utilizados. Tem-se demonstrado que Lipossomas com um diâmetro de 0,3 a 2,0 μιη permanecem no local da injecção (Jackson AJ., Drug Metab. Dispôs. 1981 9.535-540) pelo que eles serão apropriados para serem utilizados no sensor. Num outro modelo de realização o sensor inclui uma multiplicidade de eritrócitos vazios os quais foram carregados com os componentes para a avaliação e que em seguida são injectados subcutaneamente. Os eritrócitos vazios também conhecidos por eritrócitos fantasmas, podem ser preparados expondo eritrócitos intactos a uma solução hipotónica de modo a que eles inchem e rebentem de forma a libertarem os seus conteúdos citoplásmicos. Os eritrócitos vazios podem ser em seguida carregados com os componentes para a avaliação antes de se permitir que as membranas de plasma se voltem a tornar estanques.

Nos modelos de realizaçao preferenciais do sensor (i.e. gel de polímeros sólidos, câmaras ocas ou micro 13 PE1542014 partículas) é vantajoso para os componentes para a avaliação que haja uma difusão restrita tendo em vista minimizar as suas perdas a partir do sensor. Isto pode ser alcançado assegurando que o gel ou o material biodegradável tem uma dimensão dos poros tal que permite a difusão das substâncias a analisar de baixo peso molecular mas não dos próprios componentes para a avaliação. Estes só se perdem à medida que o material ou gel se for degradando ao longo do tempo. Os componentes para a avaliação têm de preferência um elevado peso molecular, tais como as proteínas ou os polímeros, a fim de restringir as suas perdas no sensor. Há vários mecanismos diferentes por meio dos quais um sensor biodegradável se pode degradar em materiais que podem ser eliminados do corpo, incluindo hidrólises, dissolução e clivagem de ligações susceptíveis pela acção das enzimas, incluindo a acção dos componentes do sistema imunitário. O mecanismo de degradação está fundamentalmente dependente da natureza do material a partir do qual o sensor é construído. Por exemplo, os materiais polímeros mais biodegradáveis tais como os polilactidos e os poliglicolidos, que são hidrolisáveis com a água. Num dispositivo sensor que inclui uma matriz de polímero hidrolisável no qual os componentes reactivos para a avaliação que penetraram, degradando-se assim como um resultado da hidrólise da matriz, libertando gradualmente os componentes reactivos. A totalidade do tempo gasto para a matriz se degradar poderá, de uma maneira geral, estar dependente da concentração do polímero no material da 14 PE1542014 matriz e da dimensão total do sensor. Uma vez libertados do material de matriz, os componentes reactivos para a avaliação sendo baseados em proteína ou carbohidrato são também apanhados pelo fígado e assim são removidas ou quebrados in situ pela acção das enzimas.

As avaliações apropriadas para serem utilizadas no sensor incluem as reacções tais como a hidrólise e a oxidação que conduzem a uma alteração detectável opticamente i.e. o aumento da fluorescência ou a extinção que pode ser observada transcutaneamente. Uma avaliação preferencial para ser utilizada no sensor do invento é uma avaliação por ligação, cuja leitura seja detectável ou que dê um sinal óptico mensurável que possa ser interrogado transcutaneamente utilizando meios ópticos. A avaliação por ligação que gera o sinal óptico será preferencialmente reversível de modo tal que uma monitorização que continue com níveis variáveis da substância a analisar possa ser alcançada. Esta reversibilidade tem uma particular vantagem na utilização de um formato de avaliação por ligação na qual os componentes para a avaliação não são consumidos. As avaliações por ligação são também preferidas para serem utilizadas no sensor do invento por razões de segurança uma vez que elas não podem gerar quaisquer produtos indesejáveis tal como os que podem ser gerados numa reacção enzimática ou electroquímica.

As configurações preferidas para a avaliação por ligação para ser utilizada no sensor do invento incluem uma 15 PE1542014 avaliação por ligação de reversibilidade competitiva, de reacção limitada, cujos componentes incluem uma substância a analisar análoga e um agente de ligação da substância a analisar capaz de uma ligação reversível tanto para a substância que interessa analisar como para a análoga da substância a analisar. A substância que interessa analisar e a substância análoga a analisar competem para a ligação no mesmo local de ligação com o agente de ligação da substância a analisar. Tais configurações da avaliação por ligação competitiva são bem conhecidas na técnica de diagnósticos clínicos e são descritas, a título de exemplo, na The Immunoassay Handbook, ed. David Wild, Macmillan Press 1994. Como agentes apropriados de ligação da substância a analisar para serem utilizados na avaliação incluirão os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos os quais mantêm um local de ligação da substância a analisar (e. g. fragmentos Fab), lectinas (e.g. concanavalina A), receptores das hormonas, receptores de medicamentos, aptâmeros e polímeros molecularmente marcados. De preferência a substância a analisar análoga será uma substância de peso molecular mais elevado do que o da tal substância a analisar de modo que não se pode difundir livremente para fora do sensor. Por exemplo, uma avaliação para a glucose pode utilizar um polímero da glucose de elevado peso molecular tal como o dextrano como a análoga da substância a analisar.

Os sinais ópticos desejáveis que podem ser utilizados como uma leitura da avaliação de acordo com o 16 ΡΕ1542014 invento incluem qualquer sinal óptico que possa ser gerado por uma avaliação de proximidade, tais como aqueles que são gerados pela transferência da energia de fluorescência, polarização da fluorescência, extinção da fluorescência, técnicas de fosforescência, aumento da luminescência, extinção da luminescência, difracção ou ressonância de plásmon, sendo todos eles conhecidos per se no estado da técnica. 0 modelo de realizado mais preferido do sensor do invento incorpora uma avaliação por ligação de reacção limitada, competitiva que gera uma leitura óptica utilizando a técnica de transferência da energia da fluorescência. Neste formato da avaliação a análoga da substância a analisar é classificada como um primeiro cromóforo (daqui em diante referido como o cromóforo dador) e o agente de ligação da substância a analisar está classificado como o segundo cromóforo (daqui em diante referido como o cromóforo receptor). É uma caracteristica essencial da avaliação que o espectro de emissão da fluorescência do cromóforo dador fique sobreposto com o espectro de absorção do cromóforo receptor, de tal forma que quando os cromóforos dador e receptor são levados até uma estreita proximidade pela ligação da análoga da substância a analisar ao agente da ligação da substância a analisar uma proporção do sinal de fluorescência emitida pelo cromóforo dador (a irradiação que segue com a radiação incidente com um comprimento de onda absorvido pelo cromóforo dador) será absorvida pelo cromóforo receptor 17 ΡΕ1542014 mais próximo, um processo conhecido no estado da técnica como transferência da energia de fluorescência, com o resultado de uma proporção do sinal fluorescente emitido pelo cromóforo dador é extinta e, em certas circunstâncias, o cromóforo receptor emite fluorescência. A transferência da energia de fluorescência só ocorrerá quando os cromóforos dador e receptor são levados a uma estreita proximidade pela ligação da análoga da substância a analisar ao agente da ligação da substância a analisar. Assim, na presença da substância a analisar, a qual compete com a análoga da substância a analisar para a ligação ao agente de ligação da substância a analisar, sendo reduzida a quantidade da extinção (resultando num aumento mensurável na intensidade do sinal fluorescente emitido pelo cromóforo dador ou uma queda da intensidade do sinal emitido pelo cromóforo receptor) tal como a análoga da substância a analisar classificada é deslocada da ligação ao agente de ligação da substância a analisar. A intensidade do sinal fluorescente emitido pelo cromóforo dador está assim correlacionada com a concentração da substância a analisar no fluido subcutâneo que banha o sensor.

Uma caracteristica vantajosa adicional do formato da avaliação com transferência da energia de fluorescência resulta do facto de que qualquer sinal fluorescente emitido pelo cromóforo receptor seguindo-se à excitação com um feixe de radiação incidente com o comprimento de onda dentro do espectro da absorção do cromóforo receptor não é afectado pelo processo de transferência da energia de 18 ΡΕ1542014 fluorescência. É por isso possível utilizar a intensidade do sinal fluorescente emitido pelo cromóforo receptor como um sinal de referência interna, por exemplo, na calibração contínua do sensor ou para o monitor na medida em que o sensor se tiver degradado e indicado assim a necessidade de implantar ou injectar um novo sensor. À medida que o sensor se degrada, a quantidade de cromóforo receptor presente no sensor decrescerá e por isso a intensidade do sinal florescente detectado na excitação do cromóforo receptor também decrescerá. A queda deste sinal abaixo de um nível aceitável em relação ao nível de uma linha de base indicará a necessidade de implantar ou injectar um novo sensor. São conhecidas na técnica as avaliações por ligação competitiva utilizando a técnica da transferência da energia de fluorescência que são capazes de se adaptar à utilização no sensor do invento. A Patente US N° 3996345 descreve imuno-avaliações empregando anticorpos e a transferência da energia de fluorescência entre um par cromofórico fluorescedor-temperador. Meadows e Schultz (Anal. Chim. Acta (1993) 280: pp21-30) descreve um método de avaliação homogéneo para a medição da glucose baseado na transferência da energia de fluorescência entre uma análoga da glucose classificada (FITC labelled dextran) e um agente de ligação da glucose classificado (rodamina classificada de concanavalina A). Em todas estas configurações os cromóforos/temperador receptor e dador podem ser ligados quer ao agente de ligação quer à análoga da substância a analisar. 19 ΡΕ1542014

Uma alternativa à transferência de energia de fluorescência é a técnica de extinção da fluorescência. Neste caso um composto com capacidade de extinção da fluorescência é utilizado em vez do cromóforo receptor especifico e o sinal óptico numa avaliação por ligação competitiva aumentará com o aumento da substância a analisar. Um exemplo de um temperador da fluorescência potente e não especifico é dada por Tyagi e outros Nature Biotechnology (1998) 18: p49. 0 sensor do invento pode ser adaptado para a detecção ou medição guantitativa de gualguer substância a analisar presente nos fluidos subcutâneos. As substâncias a analisar preferidas incluem a glucose (em ligação com a monitorização de longo prazo de diabéticos), a ureia (em ligação com as doenças ou as disfunções dos rins), o lactato (em ligação com o contributo para a eficiência muscular na medicina desportiva), iões tais como sódio, cálcio ou potássio e medicamentos terapêuticos cuja concentração no sangue tenha que ser rigorosamente monitorizada, tais como, por exemplo, a digoxina, a teofilina ou os medicamentos imunossupressores. As substâncias a analisar foram atrás postas numa lista apenas a titulo de exemplo e dever-se-á entender que a natureza precisa da substância a analisar a ser medida não faz parte da matéria do presente invento. 0 sensor é interrogado transcutaneamente utilizando meios ópticos i.e. não é necessária ligação 20 PE1542014 física entre o sensor e os meios ópticos. Quando o sensor incorpora uma avaliação por ligação competitiva, com limitação do reagente, utilizando a técnica de transferência da energia fluorescente, os meios ópticos fornecerão um primeiro feixe de radiação incidente com um comprimento de onda dentro do espectro de absorção do cromóforo dador e preferencialmente um segundo feixe de radiação incidente com um comprimento de onda dentro do espectro de absorção do cromóforo receptor. Além disso os meios ópticos poderão ser capazes de medir os sinais ópticos gerados no sensor em dois comprimentos de onda diferentes; o comprimento de onda 1 dentro do espectro de emissão do cromóforo dador (o sinal gerado em ligação com a medição da substância a analisar) e o comprimento de onda 2 dentro do espectro de emissão do cromóforo receptor (o qual poderá ser o sinal da substância a analisar ou a referência interna ou o sinal de calibração).

Os meios ópticos apropriados para serem utilizados na interrogação remota do dispositivo do invento inclui um simples fluorómetro de elevada capacidade de produção que inclui uma fonte de luz de excitação tal como, por exemplo, um díodo emissor de luz (azul, verde ou vermelha > 1000 mCa), um filtro da luz de excitação (filtro dicróico), um filtro para a luz fluorescente (dicróico ou filtro de cor) e um detector da luz fluorescente (com a configuração de díodo PIN). Um fluorómetro com estas características pode exibir uma sensibilidade de concentração fluorófora entre o picomolar e femtomolar. 21 PE1542014 O estabelecimento de um fluorómetro apropriado mostra-se na Figura 1 junta e é descrita nos Exemplos aqui incluídos. O fluorómetro mede separadamente os seguintes parâmetros:

No comprimento de onda 1 (cromóforo dador)

Intensidade da luz de excitação, I (1, 0) Intensidade da luz ambiente, I (1,1) Intensidade da luz fluorescente e ambiente combinadas, I (1, 2)

No comprimento de onda 2 (cromóforo receptor) Intensidade da luz de excitação, I (2, 0)

Intensidade da luz ambiente, I (2, 1) Intensidade da luz fluorescente e ambiente combinadas, I (2, 2)

As medições são feitas mantendo o fluorómetro perto da pele e em alinhamento com o sensor. Quando se fazem medições transcutâneas dos sinais fluorescentes gerados no sensor é necessário ter em conta a absorção do sinal pela pele, sendo a capacidade de absorção da pele humana determinada experimentando de modo a que seja a mais baixa na gama que vai desde 400 nm até 900 nm. A saída final que se proporciona é a relação normalizada entre a intensidade fluorescente dos dois fluoróforos, definida pela seguinte relação (Equação 1): ΡΕ1542014 22 (I (1, 2) 1—1 H 1 D ) I (2, 0) (I (2, 2) - I (2, D ) I d, 0) A saída final dos meios ópticos (e.g. o fluorómetro) tal como é dado pela Equação 1 acima é convertida para a concentração da substância a analisar de preferência por meio de um computador que utilize os dados de calibração que podem ser obtidos a fim de começar com base nos princípios que se estabelecem a seguir.

Uma curva de calibração pode ser estabelecida empiricamente medindo a resposta versus a concentração da substância a analisar para uma gama fisiologicamente relevante das concentrações da substância a analisar. De preferência isto tem lugar in vitro como parte da produção do dispositivo sensor. 0 processo de calibração pode ser consideravelmente simplificado utilizando a relação matemática entre uma resposta e uma concentração da substância a analisar num sensor com afinidade competitiva a qual se obtém como se segue: A resposta do sensor com afinidade competitiva é regulada pelas reacções:

RC -> R + C RL —^ R + L designando a dissociação dos complexos RC e RL, formados pela combinação do agente de ligação (R) da substância a 23 ΡΕ1542014 analisar com a substância a analisar (L) ou a análoga (C) da substância a analisar. A correspondente dissociação das constantes de equilíbrio são:

Crc

L

Ki e, K2 onde C designa o número de moles da espécie no sensor dividido pelo volume do sensor. Utilizando esta medição da concentração ambas as espécies imobilizadas e as espécies em solução são tratadas de forma semelhante.

As equações do balanço da massa são:

Tc = Cc + Crc para a concentração total da análoga da substância a analisar e,

Tr — Cr + Crc + Crl para a concentração total do agente de ligação da substância a analisar.

Utilizando a expressão acima, a relação entre a ΡΕ1542014 - 24 - resposta e a concentração da substância a analisar obtém-se :

Tr-Cc T,,-(Tc-Cc) _Ç-ç_K _R—\_ç-ÇJ_ (2)

Cc 1+ (CL /K2)

Utilizando esta relação a quantidade de dados necessários para a calibração pode ser reduzida para dois parâmetros chave: Concentração total do agente de ligação da substância a analisar e concentração total da análoga da substância a analisar. A curva de calibração é assim determinada por dois pontos da curva. 0 presente invento poderá ser melhor compreendido fazendo referência aos seguintes Exemplos não limitativos, em conjunto com as Figuras juntas nas quais: A Figura 1 é um diagrama esquemático da parte óptica de um fluorómetro de fibra óptica. A Figura 2 é um diagrama esquemático de um circuito accionador/amplificador utilizado em conjunção com a parte óptica de um fluorómetro de fibra óptica.

Exemplo 1

Uma avaliação de glucose de acordo com Meadows and Schultz (Talanta, 35, 145-150, 1988) foi desenvolvida

utilizando concanavalina A - rodamina e dextrano - FITC 25 PE1542014 (ambos de Molecular Probes Inc. Oregon, USA). O princípio da avaliação é a transferência da energia da ressonância da fluorescência entre os dois fluoróforos quando eles estão em estreita proximidade; na presença da glucose a transferência da energia de ressonância fica inibida e o sinal fluorescente de FITC (fluoresceina) aumenta. Assim o aumento da fluorescência correlaciona-se com o aumento da glucose. Verificou-se que a avaliação da glucose responde à glucose, tal foi relatado por Schultz, com aproximadamente 50% de recuperação do sinal de fluorescência da fluoresceina com 20 mg/dL de glucose. A fluorescência foi medida num fluorómetro Perkin Elmer, adaptado para a medição do fluxo de atravessamento utilizando um dispositivo de "sipping".

Exemplo 2

Os componentes para a avaliação da glucose Exemplo 1 foram adicionados a soluções agitadas (1 ml) de 1%, 1,5% e 2% p/v de uma agarose de baixa temperatura de fusão (Type IX, Sigma, St. Louis, USA) a 45°C. Depois da dispersão, a temperatura foi reduzida para 20°C e a agitação parou. Quando o gel tomou forma (após aproximadamente 3 horas) ficou colocado numa argamassa cerâmica e foi moído para partículas com uma dimensão de 50 a 100 μιη, com referência visual à preparação de uma cama de polistireno com 0 mesmo diâmetro. A preparação das partículas foi suspensa a 0,9% p/v salina e filtrada através de uma rede de nylon para remover as maiores 26 PE1542014 partículas. As partículas que passaram através da rede foram então centrifugadas numa centrifugadora de contentor (do inglês "bench") com 500 g e o sobrenadante que contenha o material fino foi descartado. Durante o processo as partículas retiveram a sua fluorescência por inspecção visual e por meio da medição da fluorescência da rodamina no fluorómetro “Perkin Elmer". Juntando glucose a 20 mg/dL a uma amostra das partículas em suspensão tal resultou num aumento no sinal do fluorescência da fluoresceína durante um período acima de 30 minutos. Assim os componentes para a avaliação contidos no gel de agarose responderam à glucose.

Os componentes da avaliação química da glucose são inerentemente biodegradáveis (ou excretáveis) no corpo humano uma vez que se baseiam em materiais péptidos e carbohidratos. A degradação pela digestão com enzimas e/ou pelo simples transporte para o fígado ou para os rins assegurará que os componentes para a avaliação serão removidos do corpo a seguir à implantação ou injecção subcutânea.

Exemplo 3

Uma amostra de 1 ml de partículas de agarose em suspensão contendo os reagentes para a avaliação da glucose (descritos no Exemplo 2) foram colocados num banho de água a 3 7°C a fim de simular a temperatura do corpo humano. Durante as seis semanas seguintes a estrutura das partículas foi-se perdendo à medida que a estrutura se 27 ΡΕ1542014 degradava, com os geles com uma elevada concentração exibiu-se uma degradação mais lenta. A medição do sinal da luz dispersa utilizando o fluorómetro também caiu à medida que as partículas se dispersavam, indicando a degradação das partículas. Esta experiência simula as condições no corpo humano - é esperado que as partículas eventualmente se libertem do local da injecção e os componentes químicos para a avaliação serão degradadas quer in situ quer transportadas para o fígado onde serão posteriormente processadas, quer excretados na urina.

Exemplo 4

Um espectrómetro de fibra óptica foi montado como se segue: A parte óptica de um fluorómetro de fibra óptica foi feita com componentes normalizados num micro contentor (bench) . A implantação, incluindo como fonte de luz um díodo emissor de luz (do inglês "LED light-emmiting diode") vermelha, lentes, um separador do feixe dicróico e filtros e díodos detectores, foi tal como se mostra na Figura 1. Resumidamente, o fluorómetro inclui um díodo (1) emissor de luz proporcionando um feixe de luz de excitação o qual passa através de um condensador (2) que contém um filtro de excitação (3) e é incidente num separador do feixe (4). Parte do feixe excitador é assim deflectido dentro das ópticas de lançamento (5) e entra numa fibra óptica (6) . Quando o fluorómetro está a ser utilizado na interrogação 28 PE1542014 de um sensor localizado subcutaneamente a extremidade da fibra óptica (6) fica posicionada perto da superfície da pele, alinhado com o sensor subcutâneo, de modo a que o feixe de luz excitadora é incidente no sensor. Uma parte do sinal óptico emitido a partir do sensor seguindo a excitação entra na fibra óptica (6) e é assim transportado para dentro do fluorómetro onde ele passa através de um filtro de bloqueio (8) e é medido por um díodo detector (7) do sinal. O fluorómetro também contém um díodo detector de referência (9) o qual proporciona uma medição de referência da luz de excitação emitida a partir do LED (1) . As extremidades de uma fibra óptica Ensign Beckford com 1 m de comprimento, 0,5 mm de diâmetro, abertura numérica de 0,65, foram ligadas à terra para um acabamento de espelho utilizando uma pasta de diamante numa pasta de vidro. Uma extremidade da fibra foi montada num suporte X Y Z em frente de uma objectiva 20x de um microscópio. Os díodos (LED (1) e os díodos detectores (7) e (9)) foram ligados a um circuito habitual feito por meio de um circuito accionador/amplificador tal como se mostra na Figura 2. 0 circuito inclui um transmissor (10), os amplificadores de corrente (11) e (12), os mult iplexadores (13) e (14), os integradores (15) e (16) e o divisor analógico (17) . 0 circuito de accionamento foi estabelecido para accionar o LED (1) a 238 Hz e os sinais dos díodos detectores (7) e (9) foram comutados entre a terra e os condensadores de armazenamento (integradores com uma constante de tempo de 1 segundo) sincronizados com o sinal de accionamento. Os dois sinais integrados correspondem ao sinal fluorescente de 29 ΡΕ1542014 fundo-corrigido e o nível de luz de excitação de fundo corrigido (intensidade LED). 0 primeiro dividido pelo último foi suportado por um divisor analógico tal como se mostra na Figura 2. Para as finalidades do teste a extremidade distai da fibra (6) foi mergulhada em soluções diluídas de rodamina e as ópticas foram ajustadas para um sinal máximo do divisor analógico. 0 fluorómetro/espectrómetro funciona com bateria (consumo típico de energia 150 mA a 9 V) e por conveniência pode ser construído com a forma e dimensões de um estilete.

Exemplo 5

Partículas de agarose de 1,5% p/v com aproximadamente 5 0 μιη de diâmetro que contêm os componentes para a avaliação (tal como se descreveu no Exemplo 2) foram lavadas várias vezes centrifugando-as e voltando a ser postas em suspensão numa solução salina de 0,9% p/v. Este processo de lavagem remove o excesso de reagentes que não foram apanhados dentro da estrutura do gel. As partículas permanecem altamente fluorescentes durante este processo. Em seguida a suspensão de partículas foi carregada numa seringa descartável normalizada (Becton Dickinson, USA) e foi injectada subcutaneamente por baixo da pele na parte de trás da mão de um voluntário humano. Um espectrómetro de fibra óptica (ver exemplo 4) foi dirigido para a pele e foi obtido um sinal de fluorescência de rodamina, indicando que as medições transdérmicas podem ser feitas nos sensores 30 ΡΕ1542014 biodegradáveis implantados.

Exemplo 6

Um tubo capilar com as dimensões de 10 mm x 2 mm composto de um tubo capilar solúvel com base num fosfato (Pilkington CRS, Wrexham, UK) foi parcialmente cheio com uma solução dos reagentes para a avaliação da glucose. As extremidades do tubo capilar foram então vedadas mergulhando-as numa solução de 1% p/v de agarose de baixo ponto de fusão aquecida a 45°C e em seguida arrefecida para a temperatura ambiente (22°C). Ambas as extremidades do tubo capilar foram vedadas por este processo. O tubo capilar vedado foi colocado numa superfície plana e o espectrómetro de fibra óptica (ver Exemplo 4) foi posicionado para obter uma leitura da fluorescência dos conteúdos. A forte fluorescência da rodamina indicou que os reagentes tinham sido incorporados no tubo capilar. O tubo capilar foi então colocado no topo de uma solução salina uniformemente mexida de 20 mg/dL de glucose a 0,9% p/v durante 16 horas à temperatura ambiente (22°C). O tubo capilar foi então retirado da solução de glucose, sendo a sua superfície exterior seca e o tubo capilar foi colocado sobre uma superfície plana. Uma leitura feita com o espectrómetro de fibra óptica indicou que tinha ocorrido um aumento na fluorescência da fluoresceína, mostrando que a glucose tinha penetrado no tubo capilar pela difusão através das cápsulas do gel de agarose. O tubo capilar foi então recolocado no topo da solução salina a 0,9% p/v a 31 ΡΕ1542014 37°C, uniformemente mexida. Após 200 horas a estrutura do tubo capilar começou a aluir à medida que a parede do tubo capilar de fosfato abria brechas e os conteúdos eram libertados para dentro do fluido envolvente. Após os 20 dias seguintes nenhum resíduo da estrutura do tubo capilar permaneceu e a cápsula do gel de agarose também se dissolveu. Assim mostrou-se que a totalidade do sensor com base num tubo capilar é totalmente degradável sob condições fisiológicas.

Lisboa, 2 de Janeiro de 2007

Claims

ΡΕ1542014 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para detectar ou medir quantitativamente uma substância a analisar em fluidos subcutâneos de um mamifero, método este que compreende as fases: (a) permitir uma avaliação de um sensor injectado ou implantado subcutaneamente para a detecção ou a medição quantitativa de uma substância a analisar num fluido subcutâneo alcançar um equilíbrio termodinâmico, sendo o referido sensor caracterizado por ele poder funcionar em locais subcutâneos sem ligação física com o meio ambiente exterior, o referido sensor incorpora uma avaliação da referida substância a analisar cuja leitura é um sinal óptico detectável ou mensurável, cujo sinal óptico pode, quando o sensor está em funcionamento num local subcutâneo, ser interrogado por via transcutânea com meios ópticos exteriores e sendo o referido sensor biodegradável ou hidrolisável in vivo. (b) interrogar a leitura da referida avaliação utilizando meios ópticos, e (c) relacionar a medição obtida em (b) com a concentração da substância a analisar.
2. Método tal como é reivindicado na Reivindicação 1, em que a referida avaliação é uma 2 ΡΕ1542014 avaliação por ligaçao, sendo a sua leitura um sinal óptico detectável ou mensurável.
3. Método tal como é reivindicado na Reivindicação 2, em que a referida avaliação por ligação é uma avaliação por ligação competitiva cujos componentes incluem um agente de ligação da substância a analisar e uma análoga da substância a analisar.
4. Método tal como é reivindicado na Reivindicação 3, em que a referida análoga da substância a analisar é marcada com um primeiro cromóforo e o referido agente de ligação da substância a analisar é marcado com um segundo cromóforo, sendo o espectro de emissão do referido primeiro cromóforo sobreposto ao espectro de absorção do referido segundo cromóforo.
5. Método tal como é reivindicado na Reivindicação 3 ou na Reivindicação 4, em que o agente de ligação é um anticorpo, um fragmento FAB, uma lectina, um receptor hormonal, um receptor de medicamento, um aptâmero ou um polímero molecularmente marcado.
6. Método tal como é reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 2 a 5, em que o referido sinal óptico detectável ou mensurável é gerado pela transferência de energia de fluorescência, a polarização da fluorescência, a extinção da fluorescência, a fosforescência, o aumento da luminescência, a extinção da luminescência, a 3 PE1542014 difracção ou a ressonância plásmon.
7. Método tal como é reivindicado em qualquer uma das Reivindicações precedentes em que o sensor inclui um material de matriz injectável ou implantável, sendo os componentes da referida avaliação suspensos no referido material da matriz.
8. Método tal como é reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, em que o sensor inclui uma multiplicidade de micro partículas.
9. Método tal como é referido na Reivindicação 8, em que as referidas micro partículas são micro partículas sólidas e os componentes da referida avaliação são uniformemente dispersos nas referidas micro partículas sólidas.
10. Método tal como é referido na Reivindicação 8, em que as referidas micro partículas são micro partículas ocas e os componentes da referida avaliação são encapsulados dentro das referidas micro partículas ocas.
11. Método tal como é reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, em que o sensor inclui uma multiplicidade de lipossomas, sendo os componentes da referida avaliação encapsulados dentro dos referidos lipossomas. 4 ΡΕ1542014
12. Método tal como é reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, em que o sensor inclui uma câmara oca que tem uma parte da parede que cerca um espaço central que contém os componentes dos referidos meios de avaliação.
13. Método tal como é reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, em que o sensor inclui uma multiplicidade de eritrócitos ocos que foram carregados com os componentes para a referida avaliação. Lisboa, 2 de Janeiro de 2007