PT1495056E

PT1495056E - Métodos de análise

Info

Publication number: PT1495056E
Application number: PT03745158T
Authority: PT
Inventors: Ned M Mozier; Robert L Dufield; Jianming Mo; Gary S Bild
Original assignee: Ucb Pharma Sa
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2011-03-29
Also published as: JP5352761B2; JP2009153528A; DK1495056T3; ES2358505T3; DE60336214D1; JP2006505497A; AU2003225900A1; US20060171940A1; ATE500273T1; WO2003080674A1; EP1495056B1; JP4441269B2; EP1495056A4; EP1495056A1

Description

ΡΕ1495056 1

DESCRIÇÃO

"ISÓMEROS DE DISSUFURETO DE ANTICORPOS, SUA UTILIZAÇÃO E MÉTODOS DE ANÁLISE"

CAMPO DO INVENTO O presente invento está relacionado com isómeros de dissulfureto de proteínas recombinantes e métodos analíticos de detecção dos isómeros de dissulfureto e formas metionilo oxidadas. Mais especificamente, está relacionado com isómeros de dissulfureto de um anticorpo tendo especificidade para determinantes antigénicos do factor de necrose tumoral alfa (TNFa) humano. O presente invento está igualmente relacionado com métodos analíticos de detecção dos isómeros de dissulfureto de anticorpos contra TNFa e formas metionilo oxidadas dos anticorpos contra TNFa. O presente invento também está relacionado com composições compreendendo os isómeros e utilizações terapêuticas do anticorpo.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Numa molécula de anticorpo, existem duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada uma das cadeias pesadas e cada uma das cadeias leves possui no seu extremo N um domínio variável. Cada domínio variável é composto por qua- 2 ΡΕ1495056 tro regiões estruturais (FRs) alternando com três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os resíduos nos domínios variáveis são convencionalmente numerados de acordo com um sistema estabelecido por Kabat et ai. Este sistema está descrito em Kabat et al., 1987, em "Sequences of proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, NIH, USA (daqui em diante "Kabat et al. {supra)". Este sistema de numeração é usado na presente especificação, excepto se de outra forma for indicado.

As designações de resíduos Kabat nem sempre correspondem directamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos linear actual pode conter menos ou mais aminoácidos do que a numeração Kabat estrita correspondendo a um encurtamento ou à inserção de um componente estrutural, quer região estrutural quer CDR, da estrutura básica do domínio variável. A numeração Kabat correcta dos resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo através do alinhamento de resíduos homólogos na sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat padrão.

As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão situadas nos resíduos 31-35 (CDRHl), resíduos 50-65 (CDRH2) e resíduos 95-102 (CDRH3) de acordo com a numeração Kabat.

As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão 3 ΡΕ1495056 situadas nos resíduos 24-34 (CDRLl), resíduos 50-56 (CDRL2) e resíduos 89-97 (CDRL3) de acordo com a numeração Kabat. A construção dos anticorpos com CDRs enxertadas está descrita no Pedido de Patente Europeia EP-A-0239400, a qual descreve um processo em que as CDRs de um anticorpo monoclonal de ratinho foram enxertadas nas regiões estruturais dos domínios variáveis de uma imunoglobulina humana por mutagénese dirigida usando oligonucleótidos longos. As CDRs determinam a especificidade de ligação ao antigénio dos anticorpos e são sequências peptídicas relativamente curtas situadas nas regiões estruturais dos domínios variáveis. 0 trabalho inicial da humanização de anticorpos monoclonais por enxerto de CDRs foi realizado em anticorpos monoclonais que reconhecem antigénios sintéticos, tais como NP.

No entanto, exemplos em que um anticorpo monoclonal de ratinho que reconhece lisozima e em que um anticorpo monoclonal de rato que reconhece um antigénio das células T humanas foram humanizados por enxerto de CDR foram descritos por Verhoeyen et ai., (Science, 239, 1534-1536, 1988) e Riechmann et ai., (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.

Riechmann et ai., encontraram que a transferência das CDRs por si sós (como definido por kabat (Kabat et al., 4 ΡΕ1495056 (supra) e Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) não foi suficiente para proporcionar actividade de ligação ao antigénio satisfatória no produto com CDRs enxertadas. Encontrou-se que uma série de resíduos estruturais tem de ser alterada de forma a corresponderem às da região estrutural do dador. Os critérios propostos para a selecção de quais os resíduos estruturais é necessário alterar estão descritos no Pedido de Patente Internacional wo 90/07861.

Foi publicada uma série de revisões que descrevem os anticorpos enxertados com CDRs, incluindo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998) . TNFa é uma citocina pró-inflamatória produzida por células do sistema imune e que interage com as mesmas. Assim, TNFa é produzido por macrófagos que foram activados por lipopolissacáridos (LPS) de bactérias gram negativas. Como tal, TNFa parece ser um mediador endógeno de importância central envolvido no desenvolvimento e patogénese de choque endotóxico associado a sépsis bacteriana. Também foi demonstrado que TNFa é regulado de forma positiva numa série de doenças humanas, incluindo doenças crónicas tais como artrite, doença de Crohn, colite ulcerativa e escle-rose múltipla. Os ratinhos transgénicos para TNFa humano produzem constitutivamente níveis elevados de TNFa e desenvolvem uma poliartrite espontânea destrutiva que se assemelha a artrite reumatóide (Kaffer et al., EMBOJ.,10, 4025-4031, 1991) . TNFa é assim referido como uma citocina pró-inflamatória. 5 ΡΕ1495056

Em trabalhos anteriores foram descritos anticorpos monoclonais contra TNFa. Meager et al., (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) descrevem anticorpos monoclonais murinos contra TNFa recombinante. Fendly et al.r (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) descrevem a utilização de anticorpos monoclonais de ratinho contra TNFa recombinante ao definir epitopos neutralizantes em TNF. Shimamoto et al., (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) descrevem a utilização de anticorpos monoclonais murinos contra TNF7 e a sua utilização na prevenção de choque endotóxico em ratinhos. Ainda, no Pedido de Patente Internacional WO 92/11383, são descritos anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos enxertados com CDR, específicos para TNFa. Rankin et al., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) descrevem a utilização de tais anticorpos com CDRs enxertadas no tratamento de artrite reumatóide. US-A-5 919 452 descreve anticorpos quiméricos anti-TNF e a sua utilização no tratamento de patologias associadas à presença de 5 TNF.

Os anticorpos contra TNFa foram propostos para a profilaxia e tratamento de choque endotóxico (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et al., (Criticai Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) e Wherry et al., (Criticai Care Medicine, 21, S436S440, 1993) discutem o potencial terapêutico de anticorpos anti-TNFa no tratamento de choque séptico. A utilização de anticorpos anti-TNFa no tratamento de choque séptico está também discutida 6 ΡΕ1495056 por Kirschenbaum et al., (Criticai Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998) . A artrite induzida por colagéneo pode ser tratada eficazmente usando um anticorpo monoclonal anti-TNFa (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)). Níveis aumentados de TNFa são encontrados no fluido sinovial e no sangue periférico de doentes que sofrem de artrite reumatóide. Quando os agentes bloque-adores de TNFa são administrados a doentes que sofrem de artrite reumatóide, reduzem a inflamação, melhoram os sintomas e retardam a destruição das articulações (McKown et al. (Arthritis Rheum., 42,1204-1208, 1999). A utilização de anticorpos anti-TNFa no tratamento de artrite reumatóide e doença de Crohn está discutida em Feldman et al., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) e em Feldman et al., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997) . Os anticorpos contra TNFa usados em tais tratamentos são geralmente anticorpos quiméricos, tais como os descritos em US-A5919452.

Dois produtos bloqueadores de TNFa estão actual-mente autorizados para o tratamento de artrite reumatóide. O primeiro, designado "etanercept", é comercializado por Immunex Corporation como Enbrel™. É uma proteína de fusão recombinante compreendendo dois domínios do receptor de tnf solúvel p75 ligados à porção Fc de uma imunoglobulina humana. O segundo, designado "infliximab", é comercializado 7 ΡΕ1495056 por Centocor Corporation como Remicade™. É um anticorpo quimérico tendo domínios variáveis murinos anti-TNFa e domínios constantes de IgGl humana.

Em trabalhos anteriores, as moléculas recombi-nantes de anticorpos anti-TNFa geralmente possuem uma afinidade reduzida para TNFa comparativamente com os anticorpos a partir dos quais as regiões variáveis ou CDRs derivam, geralmente têm de ser produzidos em células de mamífero e são de produção dispendiosa. Anticorpos anti-TNFa anteriores estão descritos em Stephens et ai., (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 e GB-A-2297 145 . WOOl/94585 descreve moléculas de anticorpo tendo elevada afinidade para TNFa e baixa imunogenicidade em humanos, as quais podem ser usadas repetidamente e produzidas facilmente e eficazmente, para tratar doenças inflamatórias crónicas.

Foi descrito um método para proteólise em sistemas mistos de solventes orgânicos-aquosos (Russell, WK et ai., Anal. Chem. 73:2682-2685, 2001). No entanto, a proteólise dos fragmentos de anticorpos tais como Fabs apresenta problemas únicos. A diferença entre o método do presente invento e o método de Russell et ai. é a ordem da adição dos solventes. No presente método, Fab foi dissolvido directamente em acetonitrilo e depois adicionou-se tampão de digestão e enzima. O método de Russell et ai., 8 ΡΕ1495056 misturaria primeiro solvente orgânico e tampão, depois eram adicionadas a proteina e a enzima à solução. No entanto, o método de Russell et al. não digeriria eficazmente Fab devido à estrutura Fab enrolada compacta.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos das cadeias leve e pesada de CDP870, o emparelhamento dis-sulfureto intramolecular, o emparelhamento intermolecular predominante entre as cadeias leve e pesada e a cisteína para a conjugação de PEG. A Figura 2 mostra o par dissulfureto do fragmento Lys-C de CDP870 e o par dissulfureto isómero do fragmento Lys-C de CDP870, onde os resíduos críticos (cis-214 da cadeia pesada e cis-227 da cadeia pesada estão postos em evidência). As setas indicam o padrão de clivagem de Lys-C. A Figura 3 mostra os fragmentos trípticos contendo metionina de CDP870 a verde. A Figura 4 mostra o Mapa Tríptico de Oxidação de metionina para CDP870. Os fragmentos trípticos em que os resíduos metionilo estão oxidados são descritos como 01-05. Por exemplo, o fragmento tríptico Ml, quando oxidado, está descrito como 01, M2 como 02, etc. A Figura 5 mostra o Mapa Lys-C de isómeros de 9 ΡΕ1495056 dissulfureto para CDP870. A evidência da maior abundância do fragmento 1260.5 amu relativamente ao fragmento 1411.6 amu é aparente.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento está relacionado com um método de detecção de isómeros dissulfureto de anticorpo compreendendo os passos de pré-tratamento do anticorpo com um solvente orgânico, digestão do anticorpo com uma protease e resolução dos fragmentos. O presente invento também está relacionado com métodos analíticos de detecção dos isómeros de dissulfureto e formas metionilo oxidadas dos anticorpos TNFa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento proporciona a reivindicação 1.

Uma outra realização do presente invento é um método de análise para a caracterização e quantificação de isómeros de dissulfureto, oxidações de metionilo, trunca-gens, desamidação de asparaginas, incorporações erradas, extensões ou outras degradações de proteína comuns ou impurezas proteicas em proteínas recombinantes. De preferência, a proteína é um anticorpo. Mais preferencialmente, o anticorpo tem especificidade para TNFa. Mais de preferência, o anticorpo contra TNFa é CDP870 como descrito em WO 01/94585. 10 ΡΕ1495056 O presente invento é uma nova abordagem à digestão de fragmentos de PEG-anticorpo para caracterização analítica, incluindo mas não estando limitado a Fab, Fab modificado, Fab', F(ab'h ou fragmento Fv; um monómero ou dímero da cadeia leve ou da cadeia pesada; um anticorpo de cadeia simples e neste caso CDP870. Estes compostos são muito difíceis de digerir por proteases convencionais devido ao facto de PEG aparentemente esconder o acesso das enzimas proteolíticas ao esqueleto da proteína. Isto foi resolvido através da avaliação do efeito dos solventes orgânicos, em quantidades precisas, na mistura de reacção. Descobriu-se que o acetonitrilo e outros são capazes de modificar a estrutura tridimensional suficientemente para permitir a digestão completa. Com base neste resultado, CDP870 poderá ser digerido por uma série de proteases, incluindo Lys C e a proteína clivada analisada por HPLC, espectrometria de massa e outros meios. Esta técnica foi aplicada a CDP870 e uma isoforma de dissulfureto foi encontrada em aproximadamente 10-20% do material em que o resíduo cisteína C-terminal da cadeia leve foi ligada ao resíduo cisteína 227 da cadeia pesada. O método de análise compreende os passos de pré-tratamento da proteína recombinante com solvente orgânico, digestão da proteína pré-tratada com uma protease na presença do solvente orgânico e um meio de resolver os fragmentos da digestão com protease. De preferência, o solvente orgânico é acetonitrilo. De preferência a protease 11 ΡΕ1495056 é tripsina para oxidação dos resíduos de metionilo e Lys-C para isómeros dissulfureto.

De preferência, o meio de resolução é HPLC de fase reversa. 0 método de análise foi usado para analisar e quantificar isómeros de dissulfureto e oxidações de metionilo, mas poderá também ser usado para análise de trun-cagens, desamidação de asparaginas, incorporações erradas, extensões ou outras degradações proteicas ou impurezas proteicas comuns.

Apesar do invento descrito ter sido descrito detalhadamente com fins ilustrativos e de exemplificação por questões de clareza da compreensão, será facilmente aparente para os familiarizados com a matéria face aos ensinamentos deste invento que podem ser feitas alterações e modificações sem afastamento do âmbito do presente invento. Os exemplos que se seguem são proporcionados para fins de exemplificação apenas e não se destinam a limitar o âmbito do invento, o qual foi descrito atrás em termos latos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Método para a detecção do isómero dissulfureto

Uma solução proteica stock foi preparada através 12 ΡΕ1495056 da diluição de CDP870 para 20 mg/ml ou CDP870 Fab' para 10 mg/ml em tampão acetato 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5,5. Lys-C foi adquirido à Wako (Osaka, Japão), preparado a 1 mg/ml em Tris 100 mM, pH 8,5

Pré-tratamento com acetonitrilo 20 μΐ da amostra diluída foram misturados com 40 μΐ de acetonitrilo, agitados rapidamente com vortex e deixados em repouso durante 5 minutos.

Digestão com Lys-C 130 μΐ de Tris-HCl 100 mM, pH 8,5 foi adicionado, misturado, depois combinado com 10 μΐ da solução stock de Lys-C. A mistura de digestão de Lys-C foi incubada a 37°C durante cerca de 12-16 horas. HPLC de fase reversa A digestão não é parada e 50 μΐ foi injectado directamente na coluna de HPLC (Phenomenex Júpiter 300 angstroms, 5 μ, 2,1 mm x 250 mm) usando uma velocidade de fluxo de 0,5 ml/minuto. O comprimento de onda de detecção foi de 214 nm. A fase móvel foi A, 0,1% TFA em água e B, 0,1% TFA em acetonitrilo. O gradiente (sistema binário) foi como se segue: 13 ΡΕ1495056

Tempo_ 0 min 3 min 8 min 9 min 21 min 21,lmin 27 min 27,1 min A Figura 5 mostra dissulfureto para CDP870.

Fase Móvel B 0% 6% 10% 11% 15% 95% 95% 0% o mapa de Lys-C do isómero de EXEMPLO 2 Método para a detecção da oxidação de metionina

Uma solução stock de proteína foi preparada através da diluição de CDP870 para 20 mg/ml ou CDP870 Fab' para 10 mg/ml em tampão acetato 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5,5. A solução de tripsina foi adquirida à Promega (Madison WI) com uma concentração de tripsina de 0,4 mg/ml em tampão de ácido acético 50 mM.

Pré-tratamento com acetonitrilo 200 μΐ da amostra diluida foi misturado com 200 μΐ de acetonitrilo, agitado com vortex brevemente e deixado em repouso durante 5 minutos. 14 ΡΕ1495056

Digestão com tripsina 500 μΐ de tampão de digestão (Tris-HCl 50 mM, Cacl2 1 mM, pH 8,5) foi adicionado , misturado e depois combinado com 100 μΐ de solução stock de tripsina. A mistura de digestão com tripsina foi incubada a 37°C durante cerca de 12-16 horas. HPLC de fase reversa A digestão foi parada com 100 μΐ de HC1 1,0 N e foi injectada directamente na coluna de HPLC (Zorbax 300SB-C18 (Bodman; Aston, PA), 3,5 μ, 4,6 mm x 15 cm) usando uma velocidade de fluxo de 0,5 ml/minuto. O comprimento de onda de detecção foi 214 nm. A fase móvel foi A, 0,1% TFA em água e B, 0,1% TFA em acetonitrilo. O Gradiente (sistema binário) foi como se segue:

Tempo_Fase Móvel B 0 min. 16% 15min. 25% Linear 25 min. 27% Linear 50 min. 42% Linear 52 min. 90% Linear 60 min. 90% Constante 63 min. 16% Linear 78 min. 16% Constante A Figura 4 mostra o Mapa Tríptico de Oxidação de metionina para CDP870. ΡΕ1495056 15 EXEMPLO 3

O método de afinidade para TNF A coluna de afinidade para TNFa foi preparada através da acoplagem de TNFa recombinante humano (Bio-source International, CA*) a Meio UltraLink™Biosupport (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do produto. TNFa foi dissolvido em tampão de acoplagem, citrato de sódio 0,6 M, CHES 50mM, pH 9,0. Para preparar uma coluna de 1 ml, 0,126 g (peso seco) de UltraLink™Bio-support foi incubado com 750 μΐ de TNFa em tampão de acoplagem. A reacção foi incubada durante 72 horas à temperatura ambiente com mistura. As esferas foram centrifugadas usando uma microcentrífuga Eppendorf 5415 a 1000 rpm, 4°C durante 5 minutos. O sobrenadante foi decantado e a resina foi ressuspensa em 10 ml de tampão de paragem para incubação durante 2,5 horas à temperatura ambiente num tubo cónico de 15 ml, com tampa de rosca, com inversão suave como anteriormente descrito. O tampão de paragem foi etanolamina 3M, pH 9,0. Após paragem o tubo cónico foi centrifugado durante 10 minutos (como atrás) e o sobrenadante decantado e a resina ressuspensa em 10 ml de soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS), pH 7,4 (Invitrogen™ Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 20 minutos à temperatura ambiente com inversão suave. As esferas lavadas foram centrifugadas durante 10 minutos (como atrás), o sobrenadante decantado e as esferas ressuspensas em 10 ml de cloreto de sódio 1M e incubado 16 ΡΕ1495056 durante 20 minutos à temperatura ambiente com mistura suave. As esferas foram centrifugadas novamente, o sobrenadante foi decantado e as esferas ressuspensas em 10 ml de PBS, pH 7,4. Isto foi misturado durante 20 minutos e este passo repetido mais uma vez. As esferas foram então ressuspensas em 4 ml de PBS, pH 7,4 e vertidas numa coluna HR5/5. A coluna de 1 ml resultante foi equilibrada em 50 volumes de coluna (cv) de tampão A. O tampão A é HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. A coluna foi equilibrada, aplicada a amostra, lavada, eluida e limpa a 0,5 ml/min em linha num AKTA Explorer 100 Air com medidores de pH, temperatura e condu-tividade UV900 e o sistema operativo e programa informático de análise Unicom 4. A coluna foi equilibrada e lavada em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Na coluna foi aplicada a amostra CDP870 (36426803, stock 200mg/ml) a qual foi diluída para 2 mg/ml com Tampão A e injectada a 0,5 ml/corrida. A coluna foi eluida isocraticamente com glicina 100 mM, pH 3,4. A coluna foi limpa com HEPES 10 mM, NaCl 2M, pH 7,4. Após aplicação, foi colhido o material não retido na coluna (não ligado) e também as fracções eluídas (ligadas) e também a fracção eluida (ligada). Estas duas fracções e o material aplicado na coluna foram analisados por digestão com Lys C seguido de espectrometria de massa. O perfil do mapa de péptidos mostrou quantidades similares de péptidos correspondendo ao Isómero #1 em todas as amostras, sugerindo que as espécies do Isómero #1 não eram diferentes da parental relativamente à ligação a TNFa. 17 ΡΕ1495056

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> CELLTECH R&D LIMITED

<120> ISÓMEROS DE DISSULFURETO DE ANTICORPOS, SUA UTILIZAÇÃO E MÉTODOS DE ANÁLISE

<130> P037674EP <140> 03745158.0 <141> 2003-03-20 <150> U.S. 60/366350 <151> 2002-03-20 <160> 2 <170> SeqWin99, versão 1.02

<210> 1 <211> 214 <212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> CDP870 cadeia leve <400> 1

Asp He Gin Met Thr Glrt Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg val Thr Ué Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Asn 20 25 30 Va! Ala Trp Tyx Gin Gin Lys Pr o Gly Lys Aia Pro Lys Ala Leu He 35 40 45 fyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Vai Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lis Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GU Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 'l'hr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Gin Ue Lys Arg Thr Vai Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Vsl Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Girs Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg: Glu Ala 130 Π5 140 Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 18 ΡΕ1495056

Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser IíBVJ Ser 165 17 D 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser hys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr ISO 185 190 Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Set Pro Vai Thr Lys Ser 1.95 200 205 Phe hs n ftrg 61 y Glu Cyâ 210

< 210 > 2 <211> 229 <212 > PRT <213> sequência artificial <220> <223> CDP870 cadeia pesada <400> 2

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Léu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Vai Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met. 35 40 45 Gly Trp tle Asn Thr Tyr lie Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp iifír Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Aid Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Á.l. a Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala ftrg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin G.ly Thr 100 105 110 Le« Vai Thr Vai Ser Ser Ais Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 1.15 120 1.25 Leu Ai a Pro Ser Ser Ly s Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ai a Leu Gly no 135 140 Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr VaX Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Léu Thr Ser Gly Vai 15 ís Thr Phe Pro Ala Vai Leu Glh 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser 180 165 190 19 ΡΕ1495056

Ser Lsu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai A:>n Bis Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys Vai Asp Lys Ly.s Vai Glo Pro Lys Ser Cy.s Asp Lys Thr 210 215 220

Bis Thr Cys Ala Ala 22 S

Lisboa, 22 de Março de 2011

Claims

ΡΕ1495056 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de análise para a caracterização e quantificação de isómeros de dissulfureto de fragmentos de anticorpo compreendendo os passos de: (a) pré-tratamento do fragmento de anticorpo com um solvente orgânico, (b) digestão do fragmento de anticorpo pré-tratado com uma protease na presença do solvente orgânico e (c) resolução dos fragmentos da digestão com protease. 2. 0 método da reivindicação 1, em que o referido solvente orgânico é acetonitrilo. 3. 0 método da reivindicação 2, em que a referida concentração de acetonitrilo no passo de pré-trata-mento (a) está entre cerca de 40% e 80%.
4. O método da reivindicação 3, em que a referida concentração de acetonitrilo no passo de pré-tratamento (a) é cerca de 67%.
5. O método da reivindicação 2, em que a referida concentração de acetonitrilo no passo de digestão com protease (b) está entre cerca de 20% e 50%.
6. O método da reivindicação 3, em que a referida concentração de acetonitrilo no passo de digestão com protease (b) é cerca de 20%. 2 ΡΕ1495056
7. O método da reivindicação 1, em que a referida protease é Lys-C ou tripsina. 8. 0 método da reivindicação 1, em que os fragmentos da digestão com protease são resolvidos usando HPLC de fase reversa. 9. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o referido fragmento de anticorpo é selec-cionado do grupo consistindo em: um Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 ou fragmento Fv; um monómero ou dimero da cadeia leve ou da cadeia pesada; e um anticorpo de cadeia simples.
10. O método da reivindicação 9, em que o referido fragmento de anticorpo é Fab.
11. O método da reivindicação 10, em que o referido Fab é CDP870.
12. Um método de análise para a caracterização e quantificação dos produtos da degradação de fragmentos de anticorpos e impurezas de fragmentos de anticorpos nas proteínas recombinantes seleccionados do grupo consistindo em oxidações de metionilo, truncagens, desamidação de asparaginas, incorporações incorrectas, extensões ou outras degradações comuns às proteínas ou impurezas de proteínas compreendendo os passos de: (a) pré-tratamento da proteína 3 ΡΕ1495056 com um solvente orgânico, (b) digestão da proteína pré-tratada com uma protease na presença do solvente orgânico e (c) resolução dos fragmentos de digestão com protease. 13. 0 método da reivindicação 12, em que a referida concentração de acetonitrilo no passo (b) de digestão com protease é cerca de 50%.
14. O método da reivindicação 13, em que a referida concentração de acetonitrilo no passo (b) de digestão com protease é cerca de 20%. Lisboa, 22 de Março de 2011 ΡΕ1495056 1/5 Μ Bèíí o*· O & Ϊ5 >· O» O» > t** áf É ta s» > '®3

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1 ΡΕ1495056 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * GB 2297145 A * WO 3184535 A - US -33745453 A * useoseessos * EPS2394SOÂ « M5S0S73S1Â - Μ3 8211383 A « USS918Í52A * GB224S57SA Literatura que não é de patentes citada na Descrição ♦ BasjíiaretaS 1983 «4 234 479.5741855 - Bodjwar st st .Q®atf €m 198¾ sai.. 21< S441-S44S . Wtwrry as ai. i C®e Ueiikfm. Í9S3, voi. 51, S438S440 * Kirar.harvbaiíro et st lé^Maááxs, im vs$. 28.1528-1626 « W»U«ns st sf PmsííSA 1§|2, «3. % 3754-97S819S·: » Metown «t ai Wtèsjçti. 4333, vai, '42, Í2041208 • Fettosn «t ai. TmtapánMíSWPnkieecáigs, 1338,, vai. 30, 41254127 » M&fM st st Trm$s $ ímnmkg^ Τφ&&> 1357, vai. 15, 203-211 * Fstáisafjst ah Aíhzmxs·.«vei; 84. 553-050 • Síepfteas st st ímsmáw- tSSfe, vsí.35,883-574 » RsísssSl, m já ,sL 'Mé. cm14 .:20(51^ vet 73,: .2882-2685/