PT1444236E

PT1444236E - Separação de regioisómeros de ftalocianinas metálicas

Info

Publication number: PT1444236E
Application number: PT02787517T
Authority: PT
Inventors: Gabrio Roncucci; Giacomo Chiti; Francesca Giuntini; Donata Dei; Maria Paola De Filippis; Paolo Sarri; Marco Possenti; Valentina Paschetta
Original assignee: Molteni & C
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2007-11-08
Also published as: JP2005507940A; DE60221420T2; DE60221420D1; DK1444236T3; CA2465272A1; IL161650A0; CN1592748A; AU2002351793B2; ATE368081T1; CY1107774T1; WO2003037902A1; JP4560812B2; CN100360534C; EP1444236A1; EP1444236B1; ES2291521T3; CN101200469B; CA2465272C; US7265100B2; CN101200469A

Description

DESCRIÇÃO

SEPARAÇÃO DE REGIOISÓMEROS DE FTALOCIANINAS METÁLICAS A presente invenção refere-se a um processo de separação de regioisómeros de ftalocianinas metálicas de fórmula (I) aqui apresentadas de seguida, que são photosensitizer s caracterizados pela absorção e fluorescência na região do vermelho do espectro do visível.

Estado da técnica

Sabe-se que os macrociclos cromofluoróforos ftalocianina produzem espécies de oxigénio reactivas, em particular oxigénio singuleto ou radicais, através de interacção com luz visível. Estão em desenvolvimento compostos com uma estrutura ftalocianina básica numa perspectiva d eutilização em terapia fotodinâmica (TFD) e/ou para efeitos de diagnóstico assim como para muitas outras utilizações interessantes que abrangem uma gama alargada de campos tecnológicos. Em particular, descreveram-se recentemente ftalocianinas-Zn(II) e seus conjugados na Patente US No-5,965,598, no Pedido de Patente Europeia No. 00112654.9 e no Pedido de Patente Europeia No. 00106411.0, todos em nome do Requerente.

Mesmo limitando a discussão ao âmbito da TFD, as ftalocianinas representam um dos tipos mais interessantes de fotossensibilizadores, adequados para uma variedade de aplicações, e também adequados para a preparação de "fotossensibilizadores de segunda geração" para a aplicação terapêutica contra tumores e doenças hiperproliferativas assim como para efeitos anti-microbianos e biocidas. 1

Na literatura científica relatou-se recentemente que não só o número e a carga dos substituintes presentes nas porções de fotossensibilizadores afectam a fototoxicidade in vitro e in vivo dos compostos (N. Brasseur et al. J. Med. Chem. 1994, 37, 415-420), mas também a distribuição não-óptima e a fraca selectividade dos fotossensibilizadores de primeira geração está relacionada com características fisico-químicas dos fotossensibilizadores, estando assim também relacionados com as suas estruturas químicas.

Os fotossensibilizadores de ftalocianinas podem ser preparados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em C.C. Leznoff em Phtalocyanines. Properties and Applications, vols. I-III (Ed: A.B.P. Lever), VCH Publishers, Nova Iorque, 1989.

Tanto para algumas ftalocianinas não centrosimétricas como para ftalocianinas tetra substituídas a síntese orgânica estatística convencional conduziu à preparação de uma mistura de regioisóeros, cuja composição foi referida como sendo dependente tanto dos substituintes como do metal de coordenação. A condensação estatística na síntese de ftalocianinas tetrasubstituídas favorece, na ausência de outros factores motriz, é esperada a formação dos isómeros menos simétricos e uma mistura composta por 12,5% de D^m 25% de C2v, 50% de C5 6 12,5% de C411.

Para os objectivos de produção de espécies de oxigénio reactivas não causa qualquer problema a existência de uma mistura isomérica, mas em muitos outros casos nos quais são relevantes características ligadas a eficácia tais como um local ou um reconhecimento do ligando, ou características 2 hidrofílicas/hidrofóbicas, ou finalmente no caso de desenvolvimento terapêutico, é fundamental ter isómeros individuais caracterizados. +e necessária a obter os investigação a partir de foi obtido o substituídas (C.C. Leznoff Ibid. Chem.

Para os exemplos apresentados anteriormente, uma via de purificação selectiva de modo regioisómeros individuais. Vários grupos de tentaram obter isómeros puros directamente síntese regiosselectiva, mas deste modo só isómero C411 de f talocianinas tetra 1(4),8(11),15(18),22(25) com grupos impedidos e tal. Can. J. Chem. 1994, 72, 1990-1998;

Commun. 1996, 1245).

Foi também empreendida recentemente uma tentativa de purificação de derivados de ftalocianinas metálicas, no entanto foram publicados muito poucos artigos relativamente a este assunto. Os isómeros C2V e Cs de 2(3),9(10),16(17),23(24) tetra-tert-butil-ftalocianinato Ni (II) foram enriquecidos com HPLC e MPLC em sílica (M. Hanack et al J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 58-60).

Foi conseguida uma separação completa para uma 1(4),8(11),15(18),22(25) ftalocianina Ni(II) alquiloxi-substituída por HPLC e MPLC utilizando uma fase estacionária de nitrofenilo e de sílica, respectivamente (M. Hanack et al. Angew. Chem. 1993, 32, 1422-1424).

Além disso, a separação de 2(3),9(10),16(17),23(24) de ftalocianinas (Ni(II), Cu(II) ou Zn(II)) alquiloxi-substituídas requer uma fase de HPLC especificamente desenvolvida, cuja escala não pode ser aumentada, de acordo com M. Sommerauer et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10085-10093. B. Gorlach et al. ICPP-1 2000, Póster 413; de facto, esta fase estacionária é preparada a partir de 3 sílica gel disponível comercialmente, que é então submetida a pelo menos duas reacções, com 4-aminobutil-dimetilmetossisilano e depois com ácido 2-fenilquinolina-4-carboxílico, de modo a introduzir cadeias espaçadoras específicas na sílica. Tal procedimento, além de caro, invalida a reprodutibilidade desta fase estacionária.

Os isómeros do complexo Cu(II) de uma ftalocianina tetra substituída nitrofenoxi foram também separados por HPLC com a utilização de uma coluna RP-Cis (M.I. Uvarova et al. J. Anal. Chem. 2000, 55, 910-925).

Em conclusão, até à data foram necessárias fases cromatográficas adequadamente desenvolvidas de modo a separar regioisómeros de ftalocianinas metálicas, e não foram ainda encontradas condições adequadas para a separação quer em baixa escala como em larga escala, em particular para ftalocianinas Zn contendo grupos amino.

Existe assim uma necessidade de se desenvolver processos de separação de regioisómeros, adequados tanto para preparação à escala laboratorial como em larga escala.

Resumo da invenção

Apesar daquilo referido na literatura acima citada relativamente a estudos anteriores sobre a separação de regioisómeros da ftalocianina, o Requerente descobriu surpreendentemente que por intermédio de um método de separação cromatográfica em coluna em fases estacionárias convencionais, tais como sílica e óxido de alumínio comercialmente disponíveis, e com as fases de eluição apropriadas, podem ser levadas a cabo resoluções óptimas de misturas regioisoméricas que derivam da substituição em 4 posições específicas do macrociclo ftalocianina, com uma varieadade de ftalocianinas amino substituídas, em particular ftalocianinas Zn(II) amino substituídas.

Apesar da presença do zinco e dos grupos amino nas posições periféricas da estrutura da ftalocianina, que normalmente causam o aparecimento de caudas significativas nos picos cromatográficos, o presente processo demonstrou ser eficiente para a separação de ftalocianinas de fórmula (I), mesmo em fases estacionárias convencionais.

Além disso, o Requerente descobriu que era possível determinar a ordem da eluição, e consequentemente obter também misturas regioisoméricas enriquecidas nos isómeros menos simétricos (C2v e Cs) . 0 objecto da presente invenção é deste modo o processo para a separação de misturas regioisméricas de ftalocianinas metálicas de fórmula geral (I) 5

na qual

Me é seleccionado do grupo que consiste em Zn, Si (0¾) 2, Ge(OR4)2 e A10R4, em que R4 é escolhido entre o grupo que consiste em H e alquilo C1-C15; n = 0, 1; R e Ri são seleccionados de substituintes de fórmula geral (II)

q

em que X é seleccionado do grupo que consiste em 0, S, NHCO, -CH2-, C=C e C^C; 6 Z é seleccionado de fenilo, arilo, arilalquilo e grupos cicloalifáticos; e Y e Y', iguais ou diferentes uns dos outros, são seleccionados entre grupos alquilo C1-C15; q = 0, 1; R2 e R3 são seleccionados entre H e substituintes de fórmula geral (II) tal como definida acima, com a ressalva que pelo menos um de R2 e R3 é sempre diferente de H; e quando n = 0: a) R2 e R3, idênticos ou diferentes um do outro, são ambos diferentes de H, ou b) R2 = H e R3 é igual ou diferente de R2; e quaisquer seus sais farmaceuticamente aceitáveis; consistindo o referido processo numa separação cromatográfica seleccionada entre cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC) e cromatografia líquida de média pressão (MPLC), compreendendo os seguintes passos: i) aplicação da mistura a uma coluna de separação contendo a fase estacionária compreendendo um suporte sólido seleccionado do grupo consistindo em óxido de alumínio, sílica e sílica à qual foram ligados grupos alifáticos e/ou aromáticos; ii) separação da referida mistura através da eluição da referida coluna com um solvente seleccionado do grupo que consiste em diclorometano, tetra-hidrofurano, metanol, n-hexano, acetonitrilo e suas misturas, opcionalmente em combinação com uma solução aquosa tamponada de um reagente com um par iónico. 7

Outro objecto da presente invenção é os regioisómeros separados C4h, D2h, C2v e Cs das ftalocianinas metálicas de fórmula (I) em forma substancialmente pura, assim como a mistura de regioisómeros C2v e Cs das ftalocianinas metálicas de fórmula (I) em forma substancialmente pura.

Outro objecto da invenção são as novas ftalocianinas metálicas de fórmula (I) nas quais n = 0 e 1¾ e R3 são ambos diferentes de H.

As características e vantagens do presente processo para a separação de misturas regiosioméricas de ftalocianinas de fórmula (I) serão ilustradas em detalhe na descrição seguinte.

Breve descrição das figuras A Figura 1 representa o cromatograma de MPLC para a separação do composto 1 de ftalocianina Zn(II) tetra substituída (mistura isomérica), obtido nas condições operatórias descritas no Exemplo 1. A Figura 2 representa o cromatograma de HPLC do composto 1 (mistura isomérica); obtido nas condições descritas no Exemplo 1. A Figura 3 apresenta o espectro de 1H-RMN (particular da gama de ressonância dos protões aromáticos) do oomposto 1 (mistura isomérica) e dos isómeros separados por MPLC tal como descrito no Exemplo 1; os espectros foram registados em soluções de aproximadamente 1 mg mL"1 em [dôJDMSO, utilizando uma análise com um espectrómetro Bruker a 200 MHz. 8 A Figura 4 apresenta a cromatografia em camada fina dos compostos 1 (linha A), 2 (linha B) e 3 (linha C) em Alugram Sil G/UV254 (espessura 0,20 mm) com os seguintes eluentes : Eluente 1: 60% n-hexano - THF 40%

Eluente 2: 71% CH2C12, 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeoH. Eluente 3: 66% CH2C12, 25% n-hexano, 6,5% THF e 2,5%

MeoH.

Eluente 4: 75,5% CH2C12, 25% n-hexano, 8% THF e 1,5%

MeoH.

Eluente 5: 60% CH2C12, 25% n-hexano, 12,5% THF e 2,5%

MeoH. A Figura 5 apresenta a cromatografia em camada fina dos compostos 1 (linha A) e 4 (linha B) em Alugram Sil G/UV254 (espessura 0,20 mm) com os seguintes eluentes:

Eluente 1: 73% CH2C12, 24% n-hexano, 2% THF e 0,5%

MeoH;

Eluente 2: 71% CH2C12 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeoH. A Figura 6 apresenta a cromatografia em camada fina dos compostos 1 (linha A) e 5 (linha B) em Alugram Sil G/UV254 (espessura 0,20 mm) com os seguintes eluentes:

Eluente 1: 60% n-hexano - THF 40%.

Eluente 2: 71% CH2C12, 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeoH. Eluente 3: 73% CH2C12, 24% n-hexano, 2% THF e 0,5%

MeoH. A Figura 7 representa os cromatogramas RP-HPLC para a separação do composto 1 de ftalocianina Zn(II) tetra substituída (mistura isomérica), obtido com as condições operatórias descritas no Exemplo 5, em que: (A) é o isómero D2h purificado por MPLC (60 ng/pL), (B) isómeros C8+C2v purificado por MPLC (47,5 ng/pL), (C) é o isómero Qh 9 purificado por MPLC (50 ng/pL), e (D) é a mistura obtida em DMF como solvente. A Figura 8 apresenta um cromatograma RP-HPLC numa coluna Fenilo-Hexilo para a separação do composto 1 ftalocianina Zn(II) tetra substituído (mistura isomérica). A Figura 9 apresenta um cromatograma RP HPLC de PAR IÓNICO para a separação do composto 1 de ftalocianina Zn(II) tetra substituído (mistura isomérica). A Figura 10 apresenta um cromatograma de RP HPLC de PAR IÓNICO para a separação do composto 6 ftalocianina Zn(II) tetra substituído (mistura isomérica).

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a uma separação cromatográfica de misturas regioisoméricas de ftalocianinas metálicas de fórmula geral (I) acima referidas, por intermédio de um método de separação cromatográfica realizado numa coluna contendo um suporte sólido como fase estacionária. O método de separação cromatográfica de acordo com a presente invenção é seleccionado do grupo que consiste em cromatográfia líquida de elevada pressão (HPLC) e cromatográfia líquida de média pressão preparativa (MPLC). Os métodos de HPLC de utilização possível de acordo com a invenção podem ser escolhidos, por exemplo, de HPLC de Fase Normal (NP-HPLC), HPLC de Fase Reversa (RP-HPLC) e HPLC de Fase Reversa de PAR IÓNICO (RP-HPLC DE PAR IÓNICO). 10

De acordo com a presente invenção, o suporte sólido a ser utilizado como fase estacionária é seleccionado do grupo que consiste em óxido de alumínio, sílica e sílica na qual estão ligados grupos alifáticos e/ou aromáticos, tais como octilo, octadecilo e quantidades equimolares de fenilo e hexilo, gerlamente denominadas como fase de sílica ligada a C8, fase de sílica ligada a Ci8 e fase de sílica ligada a fenilo/hexilo. A coluna de separação é eluída com a fase móvel que consiste num solvente seleccionado do grupo que consiste em diclorometanol tetra-hidrofurano, metanol, n-hexano, acetonitrilo e suas misturas, opcionalmente em combinação com uma solução aquosa tamponada de um reagente de par iónico. Quando se utiliza um método RP-HPLC DE PAR IÓNICO de acordo com a presente invenção, adiciona-se à fase móvel um reagente de par iónico, tal como pentano sulfonato de sódio.

De acordo com uma realização particular da presente invenção, as misturas isoméricas das presentes ftalocianinas de fórmula (I) são primeiramente dissolvidas no eluente inicial, preferentemente consistindo na mistura CH2CI2:THF:MeOH 94:5:1; a solução assim obtida é então aplicada à coluna e a separação é levada a cabo através da eluição da coluna com uma fase móvel com uma composição que varia preferentemente durante a separação cromatográfica; por exemplo, o seguinte sistema de eluição compreende dois eluentes A e B e o seguinte gradiente de eluição pode ser utilizado:

Eluente A = CH2C12:THF:MeOH 94:5:1;

Eluente B = n-hexano; 11

Calendarização do gradiente (% eluente B) : 60-30% em 15 min, 30-0% em 5 min, 0% durante 10 min.

De acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas fases estacionárias normais ou reversas, solventes anidros ou de grau HPLC comercialmente disponíveis para realizar o presente processo de separação utilizando HPLC e MPLC. São preferentemente submetidas ao presente processo de separação misturas regioisoméricas de Zn(II)-ftalocianinas.

De acordo com uma realização preferida do presente processo, misturas regioisoméricas de 1(4), 8(11), 15(18), 22(25) ftalocianinas Zn(II) tetra-substituídas de amino e amónio são submetidas ao presente processo, em que X é preferencialmente seleccionado entre = e S, Zé preferentemente fenilo, e Y e Y' são preferencialmente seleccionados de metilo e etilo.

Submetendo ao presente processo misturas isoméricas das ftalocianinas metálicas de fórmula (I), obtêm-se os isómeros separados correspondentes C4h e D2h em forma substancialmente pura e os outros isómeros separados C2v e Csr ou uma mistura destes isómeros C2v e Cs, numa forma substancialmente pura.

As ftalocianinas metálicas centrossimétricas de fórmula (I) na forma de misturas regioisoméricas utilizadas no processo de acordo com a presente invenção, isto é, os compostos de fórmula (I) nos quais quando n = 1, R = 1¾ e Ri = R3, e os compostos de fórmula (I) nos quais, quando n = 0, 1¾ é H e R3 = Ri, podem ser preparados tal como descrito na Patente US No. 5,965, 598, que aqui se incorporam por referência; enquanto as presentes ftalocianinas metálicas não 12 centrossimétricas de fórmula (I), isto é os presentes compostos de fórmula (I) com exclusão dos compostos centrossimétricos acima mencionados, podem ser preparados tal como descrito no Pedido de Patente Europeia No. 01106411.0, que aqui se incorpora por referência.

Os isómeros separados foram caracterizados e identificados sem ambiguidades com base na cromatografia em camada fina, espectrometria de massa, espectrometria UV-Vis e 1H-RMN. 13 EXEMPLO 1

Sepração regioisomérica de 1(4), 8(11), 15(18), 22(25)-tetraquis[(3-(dimetilamino) fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 1)

Dissolveu-se 70 mg do composto 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3-(dimetilamino) fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 1) preparado tal como descrito em US 5,965,598 em 15 mL de eluente inicial que consiste na mistura CH2CI2:THF:MeOH 94:5:1, e foi carregado numa coluna (460 x 26 mm) de sílica (Merck) LiChroprep Si60 (12-25 pm), e depois eluído com o seguinte sistema de eluição por gradiente a 46 mL min-1 com um sistema de MPLC: eluente A: CH2C12:THF:MeOH 94:5:1; eluente B: n-hexano; calendarização do gradiente (% eluente B) : 60-30% em 15 min, 30-0% em 5 min, 0% durante 10 min.

Recolheram-se três fracções que foram submetidas e uma purificação suplementar por MPLC com programas de eluição ligeiramente diferentes: primeira fracção (%B): 60-30% em 10 min, 30-0% em 5 min, 0% durante 10 min; segunda fracção (%B): 50-30% em 5 min, 30-0% em 5 min, 0% durante 10 min; terceira fracção (%B) : 30% em 5 min, 30-0% em 5 min, 0% durante 10 min. O cromatograma MPLC do composto 1 é apresentado na Figura 1. 14 A mistura isomérica inicial assim como o presente processo de purificação foram avaliados através da utilização de sistemas de cromatografia em camada fina, HPLC e ESI-MS nas seguintes condições operatórias:

Cromatograf ia em camada fina: Alugram Sil G/UV254 (espessura 0,20 mm); eluente 71% CH2C12, 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeOH; manchas Rf: 0, 75, 0, 70 (D&h), 0,5, 0,36 (Cs+C2v), 0,24 (C4h), 0,15. O resultado da cromatografia em camada fina é apresentado na parte direita da Figura 5 (linha 2A). HPLC numa coluna Zorbax RXSIL (4,6 x 25 mm); calendarização do gradiente do eluente (%B): 60-40% em 10 min, 40-0% em 5 min (os mesmos eluentes utilizados para a separação MPLC acima); caudal: 1 mL min-1; injecção 5 pL de uma solução 0,2 mg/mL de composto 1 no eluente inicial. O cromatograma de HPLC do composto 1 (mistura isomérica) é apresentado na Figura 2. ESI-MS: Espectrómetro de massa API 365 PESCIEX (infusão 5 pL/min). Os valores m/z para [M+H]+ dos quatro isómeros do composto 1 são apresentados na Tabela 1 seguinte:

Tabela 1

Isómero £2h Cg +Ciy Céh m/z 1119,5 1119,5 1119,5

Os espectros UV-Vis foram também registados em soluções de DMF para os quatro isómeros do composto 1; na Tabela 2 seguinte apresentam-se os valores Twx (nm) da banda-Q. 15

Tabela 2

Isómero D2h Cg+Cív Cu, λ-max ( ) 691 697 702

Os espectros de 1H-RMN do composto 1 (mistura isomérica) e dos isómeros separados por MPLC foram também registados em soluções de aproximadamente 1 mg mli1 em [deJDMSO, utilizando uma análise com um espectrómetro Bruker a 200 MHz. Na Figura 3 a gama de ressonância dos protões aromáticos nestes espectros foi apresentada.

Os dados de 1H-RMN dos quatro isómeros do composto 1 são apresentados na Tabela 3 seguinte, em que H' = protão do isómero Cs, e H" = protão do isómero C2v·

Tabela 3

Isómero Dgh Cs+C2r Clh δ (hVh13' ) 8, 91 (d, 9,30 (d, 3 J= 7,4 Hz, 9,17 (d, 3J=7 , 4 H'+2H") NI r- II Cl , 4H) Hz, 4H) 9,16 (d, 3J=7,4 Hz, H' 8,91 (d, 3J=7,4 Hz, H' 8,75 (d, 3J=7,4 Hz, H' ) ) ) δ (Ha') 8, 12 (dd, 8,29-8,22 (dd, 3J=7,4 Hz, 8,13 (dd, 3J=7,4 Hz , 4H) H' + 2 " ) 8,17-8,07 (m, 2H') 8,01-7,93 (dd, 3J=7,4 H' + 2 H ") Hz, 3J= 7 , 4 Hz , 4H) δ (Ha) 7, 78 (d, 7,84-7,75 (m, 2H'+2H") 7,51 (d, 3J=7, 4 7,52-7,42 (m, 2H'+2H") 3J=7, 4 Hz, 4H) Hz, 4H) δ (He) 7, 15 (d, 7,25-7,09 (m, 4H'+4H") 7,21 (d, 3J=8, 1 3J=8, 1 Hz, 4H) Hz, 4H) δ (Hc) 7,03 (s, 4H) 7,09-7,01 (m, 2H'+2H") 6,58 (s, 4H) 6,62-6,50 (m, 2H'+2H") 16 δ(Ηα, 6,60-6,50 (m, 7,09-7,01 (m, 4H'+4H") 6,66-6,56 (m, Hf) 8H) 6,62-6, 50 (m, 4H'+4H") 8H) δ (Hm) 3,05 (s, 24H) 3,07-2,85 (m, 25H'+24H") 2,87 (s, 24H) EXEMPLO 2

Apresenta-se a separação por cromatografia em camada fina (em folhas de sílica Alugram SilG) dos isómeros dos presentes compostos: 1(4),8(11),15(18),22 (25)-tetraquis[(3-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 1); 1(4),8(11),15(18),22 (25)-tetraquis[(4-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 2) ; 1(4),8(11),15(18),22 (25)-tetraquis[(2-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 3) .

Os compostos 1, 2 e 3 são preparados tal como descrito na Patente US 5,965,598 e apresentam uma diferença na posição dos grupos dimetilamino nos anéis fenoxi periféricos. São utilizadas como fases móveis misturas de tetra-hidrofutano/n-hexano e diclorometano/n-hexano/tetra-idrofurano/metanol. 0 eluente óptimo para o composto 1, tal como apresentado no Exemplo 1, é constituído por 71% CH2CI2, 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeOH. São observadas três manchas principais com os seguintes factores de retenção (Rf): 0,70 (¾¾)/ 0,36 (C3+C2v) r 0,24 (C4h). 17 0 eluente óptimo para o composto 2 é composto por 60% CH2C12, 25% n-hexano, 12,5% THF e 2,5% MeOH. São observadas três manchas principais com os seguintes factores de retenção (Rf): 0,85, 0,58 e 0,40. O composto 3 apresenta manchas separadas com 60% n-hexano -40% THF (Rf 0,60, 0,52, 0, 47) e com 60% CH2C12, 37,5% n- hexano, 2% THF e 0,5% MeOH. As manchas principais observadas têm os seguintes factores de retenção (Rf): 0,30, 0,21 e 0,15. EXEMPLO 3

Apresenta-se a separação por cromatografia em camada fina (em folhas de silica Alugram SilG) dos isómeros dos seguintes compostos: 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3- (dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto D ; 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(4-(dietilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 4) .

Os compostos 1 e 4 são preparados tal como descrito na Patente US 5,965,598 e são representativos da variação dos substituintes alquilo dos grupos amino. São utilizadas como fases móveis misturas de diclorometano/n-hexano/tetra-idrofurano/metanol. O eluente óptimo para o composto 1, tal como apresentado no Exemplo 1, é constituído por 71% CH2CI2, 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeOH. São observadas três manchas principais com 18 os seguintes factores de retenção (Rf): 0,70 (¾¾), 0,36 (Cs+C2v), 0,24 (C4h). O eluente é também óptimo para a separação do composto 4 (Valores Rf: 0, 76, 0,59, 0, 52); no entanto é também obtido um bom resultado cromatográf ico com uma mistura de 73% CH2C12, 24% n-hexano, 2% THF e 0,3% MeOH (Valores Rf: 0,35, 0,17, 0,08). EXEMPLO 4

Apresenta-se a separação por cromatografia em camada fina (em folhas de silica Alugram SilG) dos isómeros dos seguintes compostos: 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto D ; 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[ ( (3-(dimetilamino)fenil)sulfanil) ftalocianinato] zinco(II) (composto 5).

Os compostos 1 e 5 são preparados tal como descrito na Patente US 5,965,598 e são representativos da variação do átomo que faz ponte entre o anel ftalocianina e o grupo substituinte fenilo. São utilizadas como fases móveis misturas de tetra-hidrofurano/n-hexano e diclorometano/n-hexano/tetra-idrofurano/metanol. 0 eluente óptimo para o composto 1, tal como apresentado no Exemplo 1, é constituído por 71% CH2C12, 24% n-hexano, 4% THF e 1% MeOH. São observadas três manchas principais com os seguintes factores de retenção (Rf): 0,70 (Ekh), 0,36 (C3+C2v), 0,24 (C4h). 19 0 eluente óptimo para a separação do composto 5 é constituído por 73% CH2C12, 24% n-hexano, 2% THF e 0,5%

MeOH (Valores Rf: 0,49, 0,36, 0,30). EXEMPLO 5

Separação regioisomérica de 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 1) por intermédio de RP-HPLC numa coluna C18 A separação regioisomérica para o composto 1 foi realizada também por RP-HPLC por intermédio de uma coluna Cl8 com as seguintes características: Coluna Phenomenex LUNA C18 (4,6 x 15 0 mm, tamanho de partícula 5 pm) ; temperatura da coluna, temperatura ambiente; caudal, 1 mL/min; eluição isocrática com MeOH; volume de injecção, 10 pL; amostras dissolvidas em MeOH/DMF (9-1, v/v); λ de 695+20 nm para quantificação do isómero, 254 nm para análise de pureza e uma gama de λ de 190-800 nm para análise qualitativa. A ordem da eluição foi a mesma observada em NP-HPLC, indicando uma separação baseada em impedimentos estéricos: moléculas sem grupos substituintes expostos e assim mais planares foram mais retidas. A atribuição de picos de HPLC foi realizada através da adição de padrões aos isómeros puros (previamente separados por MPLC preparativa) e a partir de espectros UV-Vis dos picos cromatográficos. Na Figura 7 apresentam-se cromatogramas RP-HPLC de isómeros purificados por MPLC e para uma mistura sintetizada em DMF como solvente. Os parâmetros cromatográficos na coluna LUNA C18 são 20 apresentados na Tabela 4 seguinte, na qual os tempos médios de retenção foram calculados com n = 10, e o tempo morto da coluna foi medido pelo pico positivo de DMF.

Tabela 4

Isómero Tr (min) K' Declive (mAU·pL/ng) Ordenada na origem (mAU) D212 15,7±0,2 8, 29 50,9±0,4 -47±18 >0,999 Cs + C2v 17,5±0,1 9, 36 49,8±0,5 -30±20 >0,999 Céh 17,8±0,1 9, 53 48,4±0,3 -42±15 >0,999 [0061] Todas as soluções injectadas foram preparadas em MeOH/DMF (9-1, v/v), excepto aquelas do isómero /¾¾ que, devido à sua menor solubilidade em MeOH, foram realizadas em MeOH/DMF (1-1, v/v). A linearidade foi verificada para cada isómero com uma calibração de 6 pontos na gama 0,5-100 ng/pL (cada solução foi testada três vezes). Os isómeros separados apresentaram declives de calibração muito semelhantes; tal indica que a recolha da totalidade da banda-Q da ftalocianina (695±20 nm) conduziu a uma quantificação relativa fiável dos isómeros em misturas complexas. De facto, a utilização desta detecção a elevado comprimento de onda, no qual a molécula possui um coeficiente de extinção muito elevado (ε=3·105 M/cm), diminui as interferências e aumenta a sensibilidade (os declives da calibração são 2,49 mais elevados do que aqueles observados com uma detecção de 254 nm) . 0 limite inferior de determinação e o limite inferior de quantificação, calculados com uma razão sinal-ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente, foram de 0,4 ng/pL e 1,2 ng/pL. 21 0 método de separação apresentado acima pode ser facilmente transferido para uma escala preparativa, ou seja, por uma separação por MPLC, por intermédio de procedimentos bem conhecidos na técnica. EXEMPLO 6

Separação_regioisomérica_de_isómeros_de 1(4),8(11),15(18),22 (25)-tetraquis[(3-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 1) por intermédio de RP-HPLC numa coluna Fenilo-Hexilo A separação dos isómeros para o composto 1 por RP-HPLC foi melhorada por intermédio de uma coluna Fenilo-Hexilo com os seguintes parâmetros: Coluna Phenomenex LUNA Phenyl-Hexyl (4,6 x 150 mm, tamanho de partícula 5 pm); temperatura da coluna, temperatura 15, 20 ou 30°C; caudal, 1 mL/min; eluente, eluição isocrática com misturas de MeOH/CH3CN/CH2C12 ou MeOH/CH3CN/THF (ver Tabela 4); volume de injecção, 10 pL; amostras dissolvidas no eluente; λ de 695±20 nm para quantificação do isómero, 254 nm para análise de pureza e uma gama de λ de 190-800 nm para análise qualitativa. A ordem da eluição foi, de novo, a mesma observada em NP-HPLC, indicando uma separação baseada em impedimentos estéricos. A atribuição de picos de HPLC foi realizada através da adição de padrões aos isómeros puros (previamente separados por MPLC preparativa) e a partir de espectros UV-Vis dos picos cromatográficos. A Figura 8 apresenta um cromatograma HPLC para a mistura isomérica para o composto 1 sintetizado em DMF como solvente. 22

Os parâmetros cromatográficos na coluna LUNA Phenyl-Hexyl são apresentados na Tabela 5 seguinte.

Tabela 5

Composição do eluente T (°C) Tr (min) isómero D2h Tr (min) isómeros cs+c2v Tr (min) isómero C4h MeOH/CH3CN/THF (80/12,5/7,5, v/v/v) 20 16,3 17, 8 18, 5 MeOH/CHsCN/THF (67, 5/25/7,5, v/v/v) 20 11,6 13, 0 13, 8 MeOH/CH3CN/THF (70/25/5, v/v/v) 20 14, 8 16, 6 17, 8 MeOH/CH3CN/THF (70/25/5, v/v/v) 30 11, 9 13, 4 14, 4 MeOH/CH3CN/THF (48/48/4, v/v/v) 30 9,9 11, 9 13, 4 MeOH / CH3CN/CH2C12 (70/25/5, v/v/v) 30 13, 6 15, 7 16, 9 MeOH/CH3CN/CH2Cl2 (70/25/5, v/v/v) 15 19, 4 22, 2 23, 9 EXEMPLO 7

Separação regioisomérica de 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3-(dimetilamino)fenoxi)ftalocianinato]zinco(II) (composto 1) por intermédio de RP-HPLC DE PAR TÓNICO A separação dos isómeros para o composto 1 por RP-HPLC foi conseguida utilizando uma coluna C18 com os seguintes parâmetros: Coluna Phenomenex LUNA C18 (4,6 x 150 mm, tamanho de partícula 5 pm) ; temperatura da coluna, 25°C; caudal, 1 mL/min; eluente, eluição isocrática com um eluente contendo um reagente de par iónico, tal como a 23 mistura de penatnossulfontato de sódio a 60 mM em água (tamponizada a pH 3 com fosfato a 10 mM) /MeOH/THF (20/48/32, v/v/v); volume de injecção 20 pL; amostras dissolvidas no eluente; λ de detecção 254±20 nm e 695±20 nm e uma gama de λ de 190-800 nm para análise qualitativa. A ordem da eluição foi o isómero C4h, a mistura de isómeros Ca+C2v e o isómero D2h. Tal significa que os isómeros ccm os grupos amino mais acessíveis ao reagente de par iónico foram mais retidos. A atribuição de picos de HPLC foi realizada através da adição de padrões aos isómeros puros (previamente separados por MPLC preparativa) e a partir de espectros UV-Vis dos picos cromatográficos. A Figura 9 apresenta um cromatograma HPLC para a mistura isomérica para o composto 1 sintetizado em DMF como solvente.

Os parâmetros cromatográficos da coluna C18 RP-HPLC DE PAR IÓNICO para os isómeros do composto 1 são apresentados na Tabela 6 seguinte.

Tabela 6

Isómero Tr (mln) RRT Xggax (nm) C 4h 30,1 0,91 702 Cs + C2v 33,2 1,00 694 E>2h 36,0 1,08 690 EXEMPLO 8

Separação regioisomérica de 1(4), 8(11), 15(18), 22(25)-tetraquis [ ((3- trimetil)amónio)fenoxi)ftalocianinato]zinco(II) (composto

6) por intermédio de RP-HPLC DE PAR IÓNICO 24 A separação completa dos isómeros para o derivado tetracatiónico de ftalocianina composto 6 preparado como descrito em US 5,965,598 por RP-HPLC foi realizada utilizando uma coluna C18 com os seguintes parâmetros:

Coluna Phenomenex LUNA C18 (4,6 x 150 mm, r tamanho de partícula 5 pm) ; temperatura da coluna, 35° C; caudal, 1 mL/min; eluição isocrática com um eluente contendo um reagente de par iónico, tal como a mistura de penatnossulfontato de sódio a 120 mM em água (tamponizada a pH 3 com fosfato a 10 mM) /MeOH (35/65, v/v) ; volume de injecção 10 pL; amostras dissolvidas no eluente; λ de detecção 254±20 nm e 695±20 nm e uma gama de λ de 190-800 nm para análise qualitativa. A eluição conduziu a uma separação completa dos isómeros e a ordem de eluição foi o isómero C4h, o isómeros D2h, o isómero Cs e o isómero C2V- A atribuição de picos de HPLC foi realizada através da adição de padrões aos isómeros puros (previamente separados no composto não catiónico 1 por MPLC preparativa e alquilados com Mel), por comparação com os espectros 1H-RMN e dos espectros UV-Vis dos picos cromatográficos. A Figura 10 apresenta um cromatograma HPLC para uma mistura de compostos 6.

Os parâmetros cromatográficos da coluna Cl 8 RP-HPLC DE PAR IÓNICO para os isómeros do composto 6 são apresentados na Tabela 7 seguinte.

Tabela 7

Isómero Tr (min) RRT Xmax (nm) O \—1 'Ní 0,54 696 Céh 17,5 0,90 684 25 19,5 1,00 688 C2v 29,2 1,50 688

Os Exemplos apresentados acima mostram quão adequado é o presente processo para a separação de misturas isoméricas de ftalocianinas metálicas diferentemente substituídas (I); de facto, através da utilização dos mesmos solventes ou misturas de solventes que aquelas utilizadas acima para separação por cromatografia em camada fina, uma separação efectiva dos produtos acima pode ser também conseguida por HPLC e MPLC preparativa.

Os isómeros separados das ftalocianinas metálicas de fórmula (I), além de terem as propriedades vantajosas das correspondentes misturas isoméricas já referidas nas patentes acima citadas em nome do Requerente, nalguns casos também possuem um coeficiente de absorção molar e/ou comprimento de onda mais elevado do que os fotossensibilizadores previamente descritos, tal como indicado na Tabela 2 do Exemplo 1; e isto representa um requisito importante para uma resposta terapêutica eficaz. A descoberta relativamente à toxicidade diferencial entre células hospedeiras e microrganismos reforça a importância dos produtos reivindicados de fórmula (I).

Os regioisómeros das presentes ftalocianinas de fórmula (I) podem então ser utilizados para as mesmas utilizações já descritas para as correspondentes misturas isoméricas nas patentes acima mencionadas em nome do Requerente, tal como para preparar composições farmacêuticas, possivelmente com excipientes e diluentes farmacologicamente aceitáveis, para serem usados em terapia fotodinâmica ou como marcadores 26 em para dignóstico in vivo/in vitro, possivelmente combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável. 27

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a separação de misturas regioisoméricas de ftalocianinas de fórmula geral (I)

(D na qual Me é seleccionado do grupo que consiste em Zn, Si (0¾) 2, Ge(OR4)2 e AIOR4, em que R4 é escolhido entre o grupo que consiste em H e alquilo C1-C15; n = 0, 1; R e Ri são seleccionados de substituintes de fórmula geral (II) 1

em que X é seleccionado do grupo que consiste em 0, S, NHCO, -CH2-, C=C e C=C; Z é seleccionado de fenilo, arilo, arilalquilo e grupos cicloalifáticos; e Y e Y', iguais ou diferentes uns dos outros, são seleccionados entre grupos alquilo Ci-Ci5; q = 0, 1; R2 e R3 são seleccionados entre H e substituintes de fórmula geral (II) tal como definida acima, com a ressalva que: pelo menos um de R2 e R3 é sempre diferente de H; e quando n = 0: a) R2 e R3, idênticos ou diferentes um do outro, são ambos diferentes de H, ou b) R2 = H e R3 é igual ou diferente de Ri; e quaisquer seus sais farmaceuticamente aceitáveis; consistindo o referido processo numa separação cromatográfica seleccionada entre cromatografia liquida de elevada pressão (HPLC) e cromatografia líquida de média pressão (MPLC), compreendendo os seguintes passos: 2 i) aplicação da mistura a uma coluna de separação contendo a fase estacionária compreendendo um suporte sólido seleccionado do grupo consistindo em óxido de alumínio, sílica e sílica à qual foram ligados grupos alifáticos e/ou aromáticos; ii) separação da referida mistura através da eluição da referida coluna com um solvente seleccionado do grupo que consiste em diclorometano, tetra-hidrofurano, metanol, n-hexano, acetonitrilo e suas misturas, opcionalmente em combinação com uma solução aquosa tamponada de um reagente com um par iónico.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida cromatografia líquida de elevada pressão é seleccionado do grupo que consiste em HPLC de Fase Normal, HPLC de Fase Reversa e RP-HPLC DE PAR IÓNICO de Fase Reversa.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos grupos alifático e/ou aromático são seleccionados do grupo que consiste em octilo, octadecilo e quantidades equi-molares de grupos fenilo e hexilo.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que nas referidas ftalocianinas metálicas de fórmula (I) Me é Zn.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas ftalocianinas metálicas de fórmula (I) n = 0, R = H e Ri = R3, X é seleccionado entre 0 e S, Zé fenilo, e Y e Y' são seleccionados entre metilo e etilo.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ftalocianina metálica de fórmula (I) é 3 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3-(dimetilamino) fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 1).
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ftalocianina metálica de fórmula (I) é 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(4-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 2).
8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ftalocianina metálica de fórmula (I) é 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(2- (dimetil)amino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 3) .
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ftalocianina metálica de fórmula (I) é 1 (4),8 (11),15(18),22(25)-tetraquis[(4-(dimetilamino)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 4).
10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ftalocianina metálica de fórmula (I) é 1(4), 8(11), 15(18), 22 (25)-tetraquis [ ( (3- (dimetilamino)fenil)sulfanil) ftalocianinato] zinco(II) (composto 5).
11. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ftalocianina metálica de fórmula (I) é 1(4),8(11),15(18),22(25)-tetraquis[(3- (trimetilamónio)fenoxi) ftalocianinato] zinco(II) (composto 6) .
12. Regioisómeros de ftalocianinas metálicas de fórmula (I) tais como definidos na reivindicação 1 em forma substancialmente pura, representados por: 4 - regioisómeros C4h; - regioisómeros D2h; - regioisómeros C2v; - regioisómeros Cs; - mistura de regioisómeros C2v e Cs.
13. Utilização dos regioisómeros das ftalocianinas metálicas de fórmula (I) tais como definidos na reivindicação 12 para a preparação de composições farmacêuticas para terapia fotodinâmica.
14. Utilização de regioisómeros de ftalocianinas metálicas de fórmula (I) de acordo com a reivindicação 12 para a preparação de composições a serem usadas como diagnóstico in vivo/in vitro.
15. Ftalocianinas metálicas de fórmula (I)

>2 O) na qual 5 Me é seleccionado do grupo que consiste em Zn, Si(ORj)2, Ge(OR4)2 e AIOR4, em que R4 é escolhido entre o grupo que consiste em H e alquilo C1-C15; n = 0, 1; R e Ri são seleccionados de substituintes de fórmula geral (II)

X em que X é seleccionado do grupo que consiste em O, S, NHCO, -CH2-, C=C e C=C; Z é seleccionado de fenilo, arilo, arilalquilo e grupos cicloalifáticos; e Y e Y' , iguais ou diferentes uns dos outros, são seleccionados entre grupos alquilo C1-C15; q = 0, 1; R2 e R3 são seleccionados entre H e substituintes de fórmula geral (II) tal como definida acima, com a ressalva que n = 0 e R2 e R3 são ambos diferentes de H. 6