PT1426054E

PT1426054E - Utilização medicinal de inibidor da histona desacetilase e método de avaliação do seu efeito antitumoral

Info

Publication number: PT1426054E
Application number: PT02760663T
Authority: PT
Inventors: Yuka Sasakawa; Yoshinori Naoe
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2001-08-21
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2011-12-06
Also published as: JP4238728B2; PL368708A1; RU2004108137A; HUP0400668A2; RU2298414C2; US20050191713A1; EP1426054B1; MXPA04001612A; HUP0400668A3; EP1426054A1; CA2457043A1; PL210794B1; DK1426054T3; WO2003015810A1; HU229521B1; US8470783B2; JPWO2003015810A1; ES2371630T3; NO331682B1; ATE526029T1

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO MEDICINAL DE INIBIDOR DA HISTONA DESACETILASE E MÉTODO DE AVALIAÇÃO DO SEU EFEITO ANTITUMORAL"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um agente terapêutico para o cancro da próstata. Técnica Antecedente

Nos últimos anos, a "medicina personalizada" tem ganho reconhecimento, a qual toma em consideração as diferenças individuais entre doentes e é considerada ser necessária uma pesquisa para um marcador que distinga um cancro contra o qual um agente farmacêutico é eficaz de um cancro contra o qual o agente farmacêutico é ineficaz. É uma tentativa para melhorar ética e medicamente o desempenho financeiro do tratamento medicamentoso por administração de um agente farmacêutico a doentes após verificação, antecipada, da probabilidade do seu efeito, para melhorar assim a eficácia, bem como evitar a toxicidade do agente farmacêutico e reduzir a utilização insignificante do agente farmacêutico. No tratamento de cancro, tem-se pretendido o desenvolvimento de um método para prever a eficácia de agentes anticancerosos uma vez que pode ser um meio importante para unir a lacuna entre o estudo básico e a aplicação clinica. 1

Além disso, tem-se indicado em relação a uma substância ou um composto geralmente referido por possuir uma actividade antitumoral que, quando o relatório é baseado apenas em resultados in vitro, esses resultados não levam directamente à previsão de resultados in vivo. Por outras palavras, é um problema que uma substância que mostra uma actividade antitumoral in vitro não mostre necessariamente uma actividade antitumoral in vivo e é dificil a aplicação de uma substância que mostra uma actividade antitumoral in vitro directamente como um agente anticanceroso.

Por exemplo, foi descrito que um composto representado pela fórmula (II)

O

(Π) 2 introduz uma potente actividade antitumoral inibindo selectivamente a histona desacetilase (foi também descrito que esta substância provoca uma elevada acetilação da histona numa célula tratada com esta substância e, como resultado, induz actividade de controlo transcricional de vários genes, actividade inibidora do ciclo celular e actividade inibidora de apoptose (documento JP-B-7-64872, H. Nakajima et al. , Exp. Cell Res. 241, 126-133 (1998))). No entanto, nenhum relatório estabeleceu um factor capaz de prever um efeito antitumoral deste composto e, como a situação permanece, existem ainda muitos problemas a ser resolvidos, tais como se os resultados in vitro se aplicam ou não directamente in vivo, se o composto mostra ou não um efeito prático in vivo em qualquer tumor e semelhantes. A histona desacetilase é uma enzima metalo-desacetilada, em que o Zn está coordenado no centro activo (M.S. Finnin et al., Nature, 401, 188-193 (1999)). É considerado que esta enzima altera a afinidade para o ADN de várias histonas acetiladas. Um fenómeno biológico directo que isto provoca são alterações na estrutura da cromatina. A unidade mínima da estrutura de cromatina é um nucleossoma, em que 146 pb de ADN estão enrolados 1,8 vezes, no sentido anti-horário, em volta de um octâmero de histona (H2A, H2B, H3 e H4, 2 moléculas de cada, histona nuclear). A histona nuclear estabiliza a estrutura do nucleossoma uma vez que a carga positiva no terminal-N de cada proteína histona interage com ADN. A acetilação da histona é controlada pelo balanço entre a reacção de acetilação em que está envolvida a histona acetiltransferase e a reacção de desacetilação em que está envolvida a histona desacetilase. A acetilação da histona ocorre num resíduo de lisina evolutivamente bem conservado no terminal-N da proteína histona, 3 pelo que é considerado que a proteína histona nuclear perde a carga no terminal-N, a interacção com ADN é atenuada e a estrutura de nucleossoma torna-se instável. Como consequência, é considerada a desacetilação da histona procede inversamente, nomeadamente, no sentido da estabilização da estrutura do nucleossoma. No entanto, permanecem ainda muitos aspectos pouco claros, tal como o grau de acetilação alterar a estrutura de cromatina e como isto se relaciona com o controlo transcricional secundariamente induzido e semelhantes.

Divulgação da Invenção

Um objectivo da presente invenção é proporcionar um novo agente terapêutico para o cancro da próstata. Outro objectivo da presente descrição é descrever um método para avaliar e prever um efeito antitumoral de um inibidor da histona desacetilase. A presente requerente conduziu estudos intensivos numa tentativa de resolver os problemas acima mencionados e encontrou um agente terapêutico para o cancro da próstata que permite a confirmação do efeito antitumoral in vivo. Além disso, a presente requerente verificou que um efeito antitumoral de um inibidor da histona desacetilase varia dependendo do tipo de tumor e que a variação é observada em conjunto com alterações no estado de expressão de um gene ou proteína específico e, com base nessa observação, determinou um método para avaliar um efeito antitumoral de um inibidor da histona desacetilase que resultou na totalidade da presente invenção. Como consequência, a presente invenção proporciona o seguinte. 4 (1) Um agente para tratamento do cancro da próstata que compreende, como ingrediente activo, um composto representado pela fórmula (I) (daqui em diante será também referido como FK228; SEQ ID N° 5), O II c-

c· H CH, HN CH \ CH2 // 0 \ S Vo gh3 / | \ CH-CH s 1 ' NH ' 1 \ / ch3 \ CH, / * / HN \ H,C 2 \ CH '/ ™-CH / 1 'CH, ó' N, HC _ l _ 0) H,

H L vy/ c particularmente um composto representado pela fórmula (II) (daqui em diante será também referido como FR901228)

O

ou um seu sal. 5 (2) 0 agente para tratamento do cancro da próstata do acima mencionado (1) que possui uma acção antitumoral in vivo. (3) Uma composição farmacêutica para tratamento do cancro da próstata que compreende FK228, particularmente a fórmula FR901228 e um veiculo farmaceuticamente aceitável. (4) A composição farmacêutica para tratamento do cancro da próstata do acima mencionado (3) que possui uma acção antitumoral in vivo. (5) Um método para tratamento do cancro da próstata, que compreende administrar uma quantidade eficaz de FK228, particularmente a fórmula FR901228. (6) Utilização de FK228, particularmente a fórmula FR901228, para a produção de um agente para tratamento do cancro da próstata. (7) A utilização do acima mencionado (6), em que o agente para tratamento do cancro da próstata possui uma acção antitumoral in vivo.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é um gráfico mostrando um efeito antitumoral de FR901228 em cancro da próstata humano, em que o eixo vertical mostra uma taxa de crescimento tumoral, o eixo horizontal mostra o número de dias passados desde a administração inicial e a taxa de crescimento tumoral é expressa numa proporção relativa de 6 volume tumoral após o dia 0, relativamente ao volume tumoral no dia 0 considerado como 1. A Fig. 2 inclui gráficos mostrando um efeito antitumoral de FR901228 em linfoma humano, em que o eixo vertical mostra a proporção de murganhos sobreviventes e o eixo horizontal mostra o número de dias passados após implantação de células tumorais. A Fig. 3 inclui gráficos mostrando um efeito antitumoral de FR901228 em cancro da próstata ((a); PC-3) e cancro do rim ((b); ACHN) humanos, em que o eixo vertical mostra uma taxa de crescimento tumoral, o eixo horizontal mostra o número de dias passados após a administração inicial e a taxa de crescimento tumoral é expressa numa proporção relativa de volume tumoral após o dia 0 relativamente ao volume tumoral no dia 0, considerado como 1. A Fig. 4 inclui gráficos mostrando uma acção de FR901228 na expressão do gene p21 in vitro (célula PC-3, célula ACHN). (a), (b) ; O eixo vertical mostra uma quantidade relativa da expressão do gene p21 e o eixo horizontal mostra o tempo de contacto (h) com FR901228. (c); 0 eixo vertical mostra uma quantidade relativa de expressão do gene p21. A Fig. 5 inclui gráficos mostrando uma acção de FR901228 na expressão do gene p21 e expressão do gene c-myc in vivo (célula PC-3, célula ACHN), em que o eixo vertical mostra uma quantidade relativa da expressão do gene p21 ou de c-myc e o eixo 7 horizontal mostra o número de dias passados após administraçao de FR901228.

Descrição Detalhada da Invenção 0 agente terapêutico para o cancro da próstata da presente invenção compreende, como ingrediente activo, um composto (FK228) representado pela fórmula (I) ou um seu sal. Dos compostos da fórmula (I), é preferido um composto (FR901228) representado pela fórmula (II) que é um estereoisómero. Estes compostos possuem uma forte actividade inibidora da histona desacetilase (Nakajima, H. et al. ; ibid. (1998)) e FR901228 está, particularmente, de um modo preferido, contido no agente terapêutico para cancro da próstata da presente invenção porque possui uma actividade inibidora da histona desacetilase mais forte.

Na presente descrição, uma referência simples a FK228 significa um grupo de compostos, independentemente do estereoisomerismo, incluindo os compostos representados pela fórmula (II), salvo indicação em contrário. 0 FK228 e um seu sal são substâncias conhecidas e disponíveis. Por exemplo, FR901228, que é um dos estereoisómeros de FK228, pode ser obtido cultivando uma estirpe capaz de produzir FR901228 e pertencente ao género Chromobacterium sob condições aeróbias e recuperando a substância do caldo de cultura. Como estirpe capaz de produzir FR901228 e pertencente ao género Chromobacterium pode ser mencionada, por exemplo, a Chromobacterium violaceum WB968 (FERM BP-1968) . Mais especificamente, pode ser obtido FR901228 a partir de uma 8 estirpe que produz FR901228 de acordo com o método descrito no documento JP-B-7-64872 (correspondente à Patente US N° 4977138). 0 FR901228 é, de um modo preferido, recuperado a partir de uma estirpe capaz de produzir FR901228 e pertencente ao género Chromobacterium, por ser mais facilmente obtido. No entanto, o FR901228 sintético ou semi-sintético é também vantajoso uma vez que não é necessário, ou são necessários apenas poucos, passo(s) de purificação. Do mesmo modo, o FK228 que não FR901228 pode ser também semi-sintetizado ou totalmente sintetizado de acordo com um método convencionalmente conhecido. Mais especificamente, pode ser produzido de acordo com o método referido por Khan W.Li, et al. (J. Am. Chem. Soc., vol. 118, 7237-7238 (1996)). 0 sal de FK228 é um sal biologicamente aceitável, geralmente não tóxico, e os seus exemplos incluem sais com base inorgânica (e. g, sais de metais alcalinos, tais como sal de sódio, sal de potássio, etc., sais de metais alcalino-terrosos, tais como sal de cálcio, sal de magnésio, etc. e sal de amónio), sais com base orgânica (e. gr sais de aminas orgânicas, tais como sal de trietilamina, sal de di-isopropiletilamina, sal de piridina, sal de picolina, sal de etanolamina, sal de N,N'-dibenziletilenodiamina etc.), sais de adição de ácidos inorgânicos (e. g, cloridrato, bromidrato, sulfidrato, fosfato, etc.), sais orgânicos de adição de ácido carboxilixo - ácido sulfónico (e. g, formato, acetato, trifluoroacetato, maleato, tartarato, fumarato, metanossulfonato, benzenossulfonato, toluenossulfonato, etc.), sais com um aminoácido básico ou ácido (e. g, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, etc.), sais com uma base e sais de adição de ácido. 0 FK228 pode possuir um estereoisómero (e. g, FR901228), tal como um isómero óptico ou isómero geométrico com base num átomo 9 de carbono assimétrico ou numa ligação dupla, e todos os isómeros e uma sua mistura estão dentro do âmbito da presente invenção.

Os compostos solvatos de FK228, FR901228 e seus sais (e. g, compostos de inclusão (e. g, hidrato, etc.)) estão também abrangidos no âmbito da presente invenção.

Na presente invenção, in vivo e in vitro entendem-se, geralmente, como utilizados na área em questão. Isto é, " in vivo" refere-se a um estado em que uma função ou reacção biológica objectiva é expressa no organismo vivo e " in vitro" refere-se a uma expressão dessa função ou reacção num tubo de ensaio (sistema de cultura de tecido, sistema de cultura de célula, sistema livre de célula, etc.). 0 tumor que será o alvo na presente invenção é um tumor no qual FK228, que é um inibidor da histona desacetilase, exerce um efeito antitumoral e os seus exemplos incluem cancro da próstata, onde o efeito in vivo é particularmente notável. A presente invenção mostra um efeito antitumoral óptimo in vivo particularmente contra este tumor. 0 agente terapêutico para o cancro da próstata da presente invenção pode ser utilizado como uma preparação farmacêutica na forma de um sólido, semi-sólido ou liquido contendo FK228 ou um seu sal, como ingrediente activo, em mistura com um veiculo ou excipiente, orgânico ou inorgânico, adequado para aplicação oral ou parentérica. 0 ingrediente activo pode ser misturado com um veiculo farmaceuticamente aceitável não tóxico, convencional, para, por exemplo, pó, comprimido, pastilha, cápsula, supositório, líquido, emulsão, suspensão, aerossol, pulverizador 10 e outras formas adequadas para utilização. Quando necessário podem também ser utilizados agentes auxiliares, estabilizadores, espessantes, e semelhantes. Estes veículos e excipientes podem ser utilizados após um tratamento de esterilização, quando necessário, ou podem ser esterilizados após formulação numa preparação. 0 FK228 ou um seu sal pode estar contido numa quantidade suficiente para proporcionar um efeito antitumoral, no agente terapêutico para o cancro da próstata.

Quando o agente farmacêutico é aplicado a um humano, de um modo preferido, é aplicado por administração intravenosa, intramuscular ou oral. Embora a dosagem terapeuticamente eficaz de FK228 ou um seu sal, que são ingredientes activos, varie dependendo da idade e do estado de doentes individuais a serem tratados e do tipo de cancro, é, geralmente, 0,1-100 mg, de um modo preferido, 1-50 mg, de um modo mais preferido 5-30 mg, por dia na quantidade de FK228 por área superficial do corpo humano (m2) no caso de administração intravenosa para o tratamento de tumor. A presente descrição também divulga um método de avaliação de um efeito antitumoral do inibidor da histona desacetilase. Utilizando este método, pode ser encontrado um inibidor da histona desacetilase que pode exercer um efeito antitumoral na célula tumoral alvo sem administrar, efectivamente, o inibidor a um corpo humano.

Pelo "inibidor da histona desacetilase" entende-se um composto que se liga ao sítio activo da histona desacetilase competitivamente com o substrato ou um composto que se liga a um sítio que não o sítio activo da histona desacetilase e possui uma acção para alterar a actividade enzimática da histona 11 desacetilase e inclui um composto já conhecido como um inibidor da histona desacetilase cuja utilização é conhecida, todos os compostos (sintéticos ou naturais) referidos como possuindo uma actividade inibidora da histona desacetilase e todos os compostos que serão referidos no futuro. Para ser especifico, podem ser mencionados o acima mencionado FK228, um seu sal e um seu derivado (e. g, FK228 acetilado, uma forma tiol em que a ligação S-S foi reduzida, etc.). Além disso, tricostatina A, butirato de sódio, ácido suberoilanilido hidroxâmico (SAHA), MS-275, péptido contendo ácido hidroxâmico ciclico, Apicidina, Trapoxina e semelhantes são também compostos cuja actividade inibidora da histona desacetilase foi referida. 0 método de avaliação de um efeito antitumoral do inibidor da histona desacetilase da presente divulgação inclui, pelo menos, (i) um passo de tratamento de uma célula teste com um inibidor da histona desacetilase e (ii) um passo de medição de alteração na expressão de um gene e/ou uma proteína específico(a) na célula teste, antes e depois do tratamento com o referido inibidor e comparando ambas as quantidades de expressão. Cada passo é explicado em pormenor a seguir. (i) Passo de tratamento de uma célula teste com um inibidor da histona desacetilase.

Neste passo, uma célula teste é cultivada numa solução contendo um inibidor da histona desacetilase.

Embora a célula teste a ser utilizada na presente divulgação não seja particularmente limitada desde que possua histona desacetilase, uma vez que a avaliação de um efeito antitumoral do inibidor da histona desacetilase, particularmente a 12 especificidade do sitio de tumor do inibidor, é um dos problemas da presente divulgação, a célula teste a ser utilizada, de um modo preferido, é derivada de um tumor no qual se pretende que o efeito seja examinado. Por exemplo, quando é para avaliar o efeito no cancro da próstata, são utilizadas a célula PC-3, que é uma célula de cancro da próstata humano cultivada e semelhantes, e quando é para avaliar o efeito no cancro do rim, são utilizadas a célula ACHN, que é uma célula de cancro do rim humano cultivada e semelhantes. As várias células cancerosas humanas cultivadas a serem utilizadas como células teste, incluindo estas células cancerosas, estão comercialmente disponíveis ou disponíveis a partir de vários bancos de células e semelhantes. Para exame de um efeito de tratamento a longo prazo, ou eficácia para doentes individuais, nomeadamente, medicina personalizada, é possível cultivar uma célula cancerosa que pode ser obtida a partir de um tumor de doente e utilizar a célula cancerosa como uma célula teste. 0 inibidor da histona desacetilase a ser utilizado para este passo é como acima mencionado.

As condições de tratamento da célula teste e do inibidor da histona desacetilase estão livres de qualquer limitação particular desde que o efeito do inibidor da histona desacetilase possa ser totalmente exercido e apropriadamente estabelecido de acordo com os factores, tais como o tipo da célula teste a ser utilizada e o tipo de inibidor da histona desacetilase a ser testado e semelhantes. 0 solvente para obter uma solução de um inibidor da histona desacetilase não é particularmente limitado desde que possa dissolver o inibidor da histona desacetilase e não mostre 13 toxicidade para a célula teste. Geralmente, é preparada uma solução concentrada com etanol, PEG400, solução de HCO-60 a 10%, sulfóxido dimetilico e semelhantes, uma sua mistura de solvente e semelhantes, e diluída até uma concentração pretendida com um meio de cultura, tampão fisiológico e semelhantes, e utilizada. A concentração do inibidor da histona desacetilase na solução é, geralmente, 0,001-1000 nM, de um modo preferido, 0,01-100 nM, de um modo mais preferido, 0,1-10 nM e, em alguns casos, a solução é sucessivamente diluída e é feita e utilizada uma série de diluições sucessivas.

No método de avaliação da presente divulgação, o número de células teste a ser inoculado pode ser apropriadamente aumentado ou diminuído dependendo do tempo de tratamento, e semelhantes, com um inibidor da histona desacetilase. Geralmente, é cerca de 1χ103-1χ10δ células, de um modo preferido, cerca de 1χ104-1χ105 células, por 1 mL de meio de cultura. 0 tempo de tratamento (tempo de cultivo) da célula teste com um inibidor da histona desacetilase é apropriadamente estabelecido de acordo com o tipo e concentração da célula teste e do inibidor e de outras condições de cultura e varia dependendo do objecto de avaliação mas é, geralmente, 1-100 h, de um modo preferido, 1-72 h. Quando se pretende a confirmação de um efeito antitumoral sustido a longo prazo, estabelece-se um tempo de tratamento comparativamente maior. A célula teste é geralmente tratada (cultivada) a 37 °C na presença de 5% de C02+95% de 02. (ii) Passo de medição de alteração na expressão de um gene específico e/ou uma proteína específica na célula teste antes e 14 depois do tratamento com o referido inibidor e comparando ambas as quantidades de expressão.

Este passo pode ser realizado por qualquer método pelo qual possa ser observada a quantidade de expressão de um gene especifico e/ou uma proteína específica numa célula teste. Por exemplo, podem ser mencionados os processos descritos a seguir. (1) Um gene, particularmente ARNm ou proteína, é extraído a partir de uma célula teste antes do tratamento com um inibidor da histona desacetilase. (2) Como descrito em pormenor no acima mencionado (i) Passo de tratamento da célula teste com um inibidor da histona desacetilase, após a célula teste ser tratada com o inibidor da histona desacetilase e cultivada para um determinado período de tempo, um gene, particularmente ARNm ou proteína, é extraído da célula tratada do mesmo modo como no acima mencionado (1). (3) Utilizando uma substância possuindo afinidade específica para um gene específico (ou proteína específica), o gene específico (ou proteína específica) é detectado. Aqui, o gene específico (ou proteína específica) significa um que mostra alteração na sua quantidade de expressão antes e depois do tratamento com o inibidor da histona desacetilase e mostra uma correlação entre a alteração na quantidade de expressão e o efeito antitumoral do inibidor da histona desacetilase. Especificamente, podem ser mencionados o gene (proteína) p21 e o gene (proteína) c-myc. 0 gene p21 é um gene que regula o ciclo celular envolvido na supressão do progresso do ciclo celular e o seu produto é conhecido por inibir a actividade de ciclina/complexo de cinase dependente de ciclina, bloqueando 15 assim o progresso do ciclo celular. 0 gene c-myc codifica uma proteína intranuclear e a sua expressão génica altera extraordinariamente de acordo com o crescimento celular, desenvolvimento celular e cancerização. Como consequência, o envolvimento do produto génico no crescimento celular atrai a atenção.

Para um gene específico (ou proteína específica) a ser medido na presente divulgação, é suficientemente útil um tipo de medição, mas quando necessita de ser conhecido um efeito tumoral mais pormenorizado, de um modo preferido, são medidos dois ou mais tipos de genes específicos com proteínas específicas, simultaneamente.

Uma substância possuindo afinidade específica para o gene específico ou proteína específica está livre de qualquer limitação particular desde que possua essa sensibilidade que permite a detecção de expressão nas células teste. Como aqui utilizado, pela "afinidade específica" entende-se uma propriedade para hibridar ou ligar a um objecto apenas gene ou proteína. Como a substância para detectar o gene específico, pode ser mencionada uma substância completamente complementar a todo ou a uma parte do referido gene, ou uma substância contendo uma ou várias incompatibilidades dentro da extensão satisfazendo a propriedade acima mencionada. Os exemplos específicos incluem oligo- ou polinucleótidos contendo uma parte ou a totalidade da sequência base do gene e as suas sequências complementares e semelhantes, e é seleccionada uma substância apropriada dependendo da forma do gene a ser detectado. A derivação da substância não é particularmente limitada uma vez que possui afinidade específica para o gene e pode ser sintetizada ou formada clivando uma parte necessária do gene e purificando a 16 parte por um método convencional. A substância pode ser rotulada com uma substância fluorescente, uma enzima, um radioisótopo e semelhantes. Como a substância a ser utilizada para detectar uma proteina especifica, por exemplo, pode ser mencionado um anticorpo possuindo afinidade específica para a proteína ou um seu fragmento. A sua afinidade específica significa uma capacidade para reconhecer especificamente a proteína por uma reacção antigénio-anticorpo e ligar-se a esta. 0 anticorpo e o seu fragmento não são particularmente limitados desde que se possam ligar especificamente à proteína e possam ser qualquer de um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal e seus fragmentos funcionais. Estes anticorpos e seus fragmentos funcionais podem ser produzidos de acordo com um método geralmente empregue na área em questão. Estes anticorpos e os seus fragmentos podem ser rotulados com uma substância fluorescente, uma enzima, um radioisótopo e semelhantes. A extracção de um gene, particularmente ARNm, bem como a extracção de uma proteína da célula teste pode ser realizada de acordo com um método geralmente empregue na área em questão ou por uma combinação apropriada desses métodos. Quando o ARNm foi extraído, a sua expressão é examinada de acordo com um método geralmente empregue na área em questão, tal como transferência de Northern, RT-PCR e semelhantes, utilizando uma substância possuindo afinidade específica para o gene específico acima mencionado. Por outro lado, quando uma proteina foi extraída, a sua expressão é examinada de acordo com um método geralmente empregue na área em questão, tal como imunomarcação, Western blot e semelhantes, utilizando uma substância (anticorpo, um seu fragmento, etc.) possuindo afinidade específica para a proteína específica acima mencionada. 17

Deste modo, alterações na expressão de um gene específico (ou proteína específica) numa célula teste, antes e depois de tratamento com um inibidor da histona desacetilase, são medidas e comparadas para determinar se o inibidor da histona desacetilase testado mostrou efectivamente, ou não, uma actividade antitumoral na célula testada. Quando o gene (ou proteína) p21 é utilizado como indicador e o tratamento com um inibidor da histona desacetilase aumenta a quantidade de expressão, o inibidor é determinado por possuir um efeito antitumoral contra um tumor da célula teste dele derivado. Quando o gene (ou proteína) c-myc é utilizado como indicador e o tratamento com um inibidor da histona desacetilase diminui a quantidade de expressão, o inibidor é determinado por possuir um efeito antitumoral contra um tumor da célula teste dele derivado. Quando uma célula tumoral clinicamente obtida de um doente é utilizada como célula teste, é possível a previsão de efeito antitumoral reflectindo a especificidade individual do doente.

Na presente divulgação, pode ser proporcionado um método de rastreio de um inibidor da histona desacetilase possuindo uma actividade antitumoral específica de sitio (tipo) de tumor utilizando o método de avaliação acima mencionado de um efeito antitumoral do inibidor da histona desacetilase. A especificidade do sítio de tumor de cada inibidor pode ser determinada utilizando uma célula teste derivada de um tumor alvo, tratando com um inibidor da histona desacetilase cujo efeito é para ser examinado e determinando a presença ou não do efeito antitumoral de acordo com o método acima mencionado.

Além disso, a presente descrição divulga um método para obter um gene a ser um indicador para prever a eficácia de 18 FK228. Analisando a expressão do gene (grupo) obtido por esse método, pode ser obtida a informação de se FK228 é ou não útil para o tratamento, se o cancro alvo é ou não afectado por FK228 e semelhantes, que pode contribuir para a "medicina personalizada". 0 método é especificamente realizado como se segue. (1) Passo de tratamento de célula tumoral sensível a FK228 e célula tumoral resistente a FK228 com FK228

Aqui, a célula tumoral sensível a FK228 significa uma célula tumoral do tipo FK228 que suprime o seu crescimento. Por exemplo, pode ser mencionada a célula do cancro da próstata PC-3 como mostrada nos Exemplos descritos abaixo. Além disso, SC-6, que é uma célula cancerosa gástrica, é um tipo das células tumorais sensíveis a FK228. Por outro lado, a célula tumoral resistente a FK228 é uma célula tumoral do tipo FK228 que falha ao exibir supressão do seu crescimento e o FK228 não pode proporcionar nela um efeito de supressão de tumor. Por exemplo, pode ser mencionada a célula cancerosa de rim ACHN como mostrada nos Exemplos descritos abaixo. Além disso, A498, que é uma célula cancerosa de rim, é um tipo das células tumorais resistentes a FK228. 0 tratamento destas células tumorais com FK228 é conduzido do mesmo modo como no acima mencionado "Passo de tratamento de uma célula teste com um inibidor da histona desacetilase". (2) Passo de selecção de genes que mostram expressão aumentada ou diminuída pelo tratamento do passo (1) acima 19

Este passo de selecção de genes pode ser realizado utilizando as técnicas descritas na presente descrição e métodos geralmente empregues na área em questão. Uma técnica utilizando um chip de gene é, de um modo preferido, empregue com vista à vantagem de possível análise de uma grande quantidade de expressão do gene num dado momento. (3) Passo de selecção, a partir de genes seleccionados no passo (2) acima, (i) um gene que mostra expressão aumentada devido ao tratamento com FK228, maior expressão na célula tumoral sensível a FK228 e menor expressão na célula tumoral resistente a FK228, (ii) um gene que mostra expressão aumentada devido ao tratamento com FK228, menor expressão na célula tumoral sensível a FK228 e maior expressão na célula tumoral resistente a FK228, (iii) um gene que mostra expressão diminuída devido ao tratamento com FK228, maior expressão na célula tumoral sensível a FK228 e menor expressão na célula tumoral resistente a FK228, ou (iv) um gene que mostra expressão diminuída devido ao tratamento com FK228, menor expressão na célula tumoral sensível a FK228 e maior expressão na célula tumoral resistente a FK228.

Por outras palavras, este passo pretende a selecção de genes que mostram algumas alterações na expressão (aumento ou 20 diminuição) devido ao tratamento com FK228 e mostram um estado de expressão diferente dependendo se são ou não sensíveis ou insensíveis a FK228. Analisando o estado de expressão do gene (grupo) pode ser um meio útil para prever a eficácia de FK228 sem administração de FK228. 0 método de verificação do aumento ou diminuição de expressão génica pode ser realizado de acordo com métodos geralmente empregues na área em questão e é realizado utilizando as técnicas também descritas na presente descrição. De um modo preferido, é empregue uma técnica utilizando um chip génico com vista à vantagem de possível análise de uma grande quantidade de expressão do gene num momento.

Exemplos A presente invenção é explicada especificamente e em pormenor a seguir por referência a Exemplos que não devem ser considerados limitativos.

Alguns destes exemplos foram incluídos apenas por questão de referência.

Exemplo 1 (1) Preparação de agente farmacêutico

Pesou-se uma quantidade necessária de FR901228 e adicionou-se um solvente (10% de HCO-60/soro fisiológico). A mistura foi sonicada para permitir a dissolução. Dissolveu-se uma substância 21 de controlo positivo, Paclitaxel, em solução de Cromóforo EL/etanol (1:1) a 24 mg/mL antes do teste e conservou-se num frigorífico. Quando em utilização, diluiu-se com uma quantidade de 9 vezes de soro fisiológico a 2,4 mg/mL (componente de solvente: Cromóforo EL a 5% - etanol a 5% - soro fisiológico a 90%) . (2) Animal de teste

Para o teste antitumoral do agente farmacêutico, compraram-se murganhos BALB/cANnNCrj-nu/nu (machos, 6 semanas de idade) de Charles River Japan e, após adaptação durante não mais do que uma semana, utilizaram-se para o teste. Os murganhos foram criados sob um ambiente LPE e permitiu-se um livre acesso a água e alimento. (3) Tumor de teste A linha celular de cancro da próstata humano cultivada (PC-3: disponível de Japanese Foundation for Câncer Research, Câncer Chemotherapy Center, Fundamental Research) foi implantada subcutaneamente em 2-3xl07 células num murganho nude. Subcultivou-se um tumor sólido crescido não mais do que 3 gerações e utilizou-se para o teste. (4) Implantação Experimental e agrupamento

Um tumor sólido subcultivado num murganho nude foi subcutaneamente implantado na parte posterior direita de um 22 num quadrado de quando o volume tumoral atingiu 6 murganhos por murganho como um fragmento de tecido tumoral cerca de 3 mm. Após a implantação do tumor, (1/2 x diâmetro maior x diâmetro menor ) 100-300 mm3, os murganhos foram agrupados em grupo para nivelar o tamanho tumoral. (5) Administração A administração iniciou-se no dia de agrupamento (Dia 0). O FR901228 foi administrado intravenosamente a um grupo de administração de FR901228 3 vezes a cada 4 dias (q4dx3) (3,2 e 1,8 mg/kg). O Paclitaxel (24 mg/kg) foi administrado intravenosamente durante 5 dias consecutivos (qdx5) a um grupo de administração de Paclitaxel, substância de controlo positivo. Administrou-se (q4dx3) apenas um solvente (soro 10% de HCO-60/soro fisiológico) a um grupo controlo. A quantidade de liquido para cada administração foi calculada (0,1 mL/10 g de peso corporal) com base no peso corporal medido no dia de administração. Note-se que 3,2 mg/kg/dia (q4dx3) de FR901228 e 24 mg/kg/dia (qdx5) de Paclitaxel foram as suas doses máximas toleradas (DMT). (6) Medição do tamanho tumoral e peso corporal O tamanho tumoral (diâmetro maior, diâmetro menor) e peso corporal foram medidos duas vezes por semana a partir do Dia 0. 23 (7) Avaliaçao de efeito antitumoral 0 nível de crescimento tumoral foi avaliado com base na taxa de crescimento tumoral (Volume Tumoral Relativo). A taxa de supressão de crescimento foi expressa numa proporção relativa de volume tumoral após o dia 0 para o volume tumoral no dia 0 como 1. 0 efeito antitumoral foi determinado no 14° dia (Dia 14) a partir do inicio da administração do agente farmacêutico. Quando a proporção da taxa de crescimento tumoral do grupo de administração de agente farmacêutico à do grupo controlo (administração de solvente), (T/C%), não foi mais do que 50% e se verificou uma diferença significativa (P<0,01) no teste U de Mann Whitney, o agente farmacêutico foi determinado como sendo eficaz.

Os resultados são mostrados na Fig. 1. O FR901228 mostrou um efeito antitumoral in vivo contra cancro da próstata humano.

Exemplo 2 (1) Preparação de agente farmacêutico

Pesou-se uma quantidade necessária de FR901228 e adicionou-se um solvente (10% de HCO-60/soro fisiológico). A mistura foi sonicada para permitir a dissolução. (2) Animal de teste

Para o teste antitumoral do agente farmacêutico, compraram-se murganhos Chase C.B-l7/Icr-SCID.Jcl (machos, 6 semanas de idade) de CLEA JAPAN INC. e, após adaptação durante não mais do que uma semana, utilizaram-se para o teste. Os murganhos foram criados sob um ambiente LPE e permitiu-se um livre acesso a água e alimento. (3) Tumor de teste A linha celular de linfoma humano cultivada (U937: obtida de Dr. Minowada, Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.) foi cultivada em RPMI (contendo FCS a 10%) e subcultivada in vitro. (4) Implantação Experimental e agrupamento A ciclofosfamida (Shionogi & Co., Ltd., 150 mg/kg) foi intraperitonealmente administrada a murganhos. O linfoma (lxlO1 2 3 células) subcultivado in vitro foi intraperitonealmente implantado no dia seguinte. Após a implantação do tumor, os murganhos foram agrupados em 6 (12 em grupo controlo) ratos por grupo para nivelar o peso corporal. 25 1

Administração 2 A administração iniciou-se no dia de agrupamento (Dia 0). O FR901228 foi administrado intraperitonealmente a um grupo de administração de FR901228 uma ou duas vezes por semana 3 (0,1-1,0 mg/kg). Administrou-se apenas um solvente (10% de HCO-60/soro fisiológico) a um grupo controlo. (6) Avaliaçao

Como efeito antitumoral, contaram-se os dias de sobrevivência dos murganhos.

Os resultados são mostrados na Fig. 2. A Fig. 2(a) mostra os resultados de administração de FR901228 uma vez por semana e a Fig. 2(b) mostra os resultados de administração de FR901228 duas vezes por semana. 0 FR901228 mostrou um efeito antitumoral in vivo contra linfoma humano.

Exemplo 3 (1) Preparação de agente farmacêutico

Pesou-se uma quantidade necessária de FR901228 adicionou-se um solvente (10% de HCO-60/soro fisiológico). A mistura foi sonicada para permitir a dissolução. Dissolveu-se uma substância de controlo positivo, Paclitaxel em solução de Cromóforo EL/etanol (1:1) a 24 mg/mL antes do teste e conservou-se num frigorifico. Quando em utilização, diluiu-se com uma quantidade de 9 vezes de soro fisiológico a 2,4 mg/mL (componente de solvente: Cromóforo EL a 5% - etanol a 5% - soro fisiológico a 90%) . 26 (2) Animal de teste

Para o teste antitumoral do agente farmacêutico, compraram-se murganhos BALB/cANnNCrj-nu/nu (machos, 6 semanas de idade) de Charles River Japan e, após adaptação durante não mais do que uma semana, utilizaram-se para o teste. Os murganhos foram criados sob um ambiente LPE e permitiu-se um livre acesso a água e alimento. (3) Tumor de teste A linha celular 1 de cancro do rim humano cultivada (ACHN: disponível de ATCC) e linha celular 1 de cancro da próstata humano cultivada (PC-3: disponível de ATCC) foram implantadas subcutaneamente em 2-3*101 2 3 4 células num murganho nude. Subcultivou-se um tumor sólido crescido não mais do que 3 gerações e utilizou-se para o teste. 27 1

Implantaçao experimental e agrupamento 2

Um tumor sólido subcultivado num murganho nude foi 3 subcutaneamente implantado na parte posterior direita de um murganho como um fragmento de tecido tumoral num quadrado de 4 cerca de 3 mm. Após a implantação do tumor, quando o volume (1/2 x diâmetro maior x diâmetro menor ) tumoral atingiu 100-300 mm , os murganhos foram agrupados em 6 murganhos por grupo para nivelar o tamanho tumoral. (5) Administração A administração iniciou-se no dia de agrupamento (Dia 0). O FR901228 foi administrado intravenosamente a um grupo de administração de FR901228 3 vezes a cada 4 dias (q4dx3) (3,2 e 1,8 mg/kg). O Paclitaxel foi administrado (24 mg/kg) intravenosamente durante 5 dias consecutivos (qdx5) a um grupo de administração de Paclitaxel, substância de controlo positivo. Administrou-se (q4dx3) apenas um solvente (10% de HCO-60/soro fisiológico) a um grupo controlo. A quantidade de liquido para cada administração foi calculada (0,1 mL/10 g de peso corporal) com base no peso corporal medido no dia de administração. Note-se que 3,2 mg/kg/dia (q4dx3) de FR901228 e 24 mg/kg/dia (qd*5) de Paclitaxel foram as suas DMT. (6) Medição do tamanho tumoral e peso corporal O tamanho tumoral (diâmetro maior, diâmetro menor) e peso corporal foram medidos duas vezes por semana desde o Dia 0. (7) Avaliação do efeito antitumoral 0 nível de crescimento tumoral foi avaliado com base na taxa de crescimento tumoral (Volume Tumoral Relativo). A taxa de supressão de crescimento foi expressa numa proporção relativa de volume tumoral após o dia 0 para volume tumoral no Dia 0 como 1. 0 efeito antitumoral foi determinado no 14° dia (Dia 14) a partir do início da administração de um agente farmacêutico. Quando a razão do grupo de administração de agente farmacêutico à taxa de crescimento tumoral do grupo controlo (administração 28 de solvente) (T/C%) não foi mais do que 50% e se verificou uma diferença significativa (P<0,01) no teste U de Mann Whitney, o agente farmacêutico foi determinado como sendo eficaz.

Os resultados são mostrados na Fig. 3. O FR901228 mostrou um efeito antitumoral potente contra PC-3 na dosagem de 3,2 mg/kg (Fig. 3(a)) mas não mostrou um efeito antitumoral contra ACHN (Fig. 3(b)).

Exemplo 4 (1) Preparação de agente farmacêutico

Pesou-se uma quantidade necessária de FR901228 e dissolveu-se num solvente (etanol a 99,5%) à concentração de 1 mg/mL. Em seguida, diluiu-se a solução com meio de cultura. (2) Tumor de teste

Cultivaram-se células cancerosas humanas (PC-3 e ACHN) em DMEM (contendo FCS a 10%).

(3) Cultivo e extracção de ARN

As células foram inoculadas em 2χ10δ células por um disco de cultura e cultivadas na presença de FR901228 (5 ng/mL) durante um determinado tempo. Após cultivo, extraiu-se o ARN com um reagente TRIZOL (GIBCO BRL) de acordo com o manual de funcionamento. 29 (4) PCR em tempo real

0 ARN foi submetido a transcrição reversa utilizando um reagente (PE Biosystem) de transcrição reversa Taq-man de acordo com o manual de funcionamento. Posteriormente, o gene p21 foi amplificado utilizando uma mistura base SYBR green PCR (PE Biosystem) e o iniciador 5' -GGC AGA CCA GCA TGA CAC ATT-3 ' (a montante de p21) (SEQ ID N° 1), 5' -GGA TTA GGG CTT CCT CTT

GGA G-3' (SEQ ID N° 2) de acordo com o manual de funcionamento e detectou-se com detector de sequência ABI 7700 PRISM (PE Biosystem). A quantidade de expressão do gene p21 foi calculada a partir de uma curva padrão, dividida pela quantidade de expressão do gene β-actina, que foi utilizado como padrão interno e expressa numa quantidade de expressão relativamente padronizada.

Os resultados são mostrados na Fig. 4. Ao ser colocado em contacto com FR901228 in vitro, o PC-3 (Fig. 4(a)) mostrou uma expressão aumentada do gene p21 com o decorrer do tempo. Pelo contrário, o ACHN não mostrou expressão aumentada do gene p21 (Fig. 4(b)). Quando não tratado, o gene p21 mostrou pouca expressão em PC-3 mas mostrou expressão em ACHN (Fig. 4(c)).

Exemplo 5 0 cancro da próstata humano PC-3 ou o cancro do rim ACHN foi subcutaneamente implantado num murganho nude e quando o tamanho do tumor atingiu 100-300 mg, administrou-se intravenosamente FR901228 (3,2 mg/kg) . O tumor foi removido com o decorrer do 30 tempo e, depois, de extrair o ARN, examinou-se a quantidade de expressão do gene p21 e do gene c-myc por PCR em tempo real, do mesmo modo que no Exemplo 4. 0 gene c-myc foi amplificado utilizando um mistura base SYBR green PCR (PE Biosystem) e iniciador 5' -GAC AGA TCA GCA ACA ACC GAA A-3 ' (a montante de c-myc humano) (SEQ ID N° 3), 5'-TTG TGT GTT CGC CTC TTG ACA T-3' (a jusante de c-myc humano) (SEQ ID N° 4) de acordo com o manual de funcionamento e detectado com detector de sequência ABI 7700 PRISM (PE Biosystem).

Os resultados são mostrados na Fig. 5. 0 PC-3 mostrou

expressão aumentada do gene p21 in vivo com um pico a 3 h após administração de FR901228 (Fig. 5(a)). Pelo contrário, o ACHN não mostrou expressão aumentada de gene p21 (Fig. 5(a)).

Enquanto o gene c-myc mostrou expressão diminuída em PC-3, mostrou expressão aumentada em ACHN (Fig. (b)).

Exemplo 6: Análise (in vitro) da expressão do gene por FK228 em célula tumoral utilizando um chip génico O efeito de FK228 na expressão do gene in vitro em célula tumoral humana foi analisado utilizando um chip génico. <material*processo> (1) Materiais de teste agente farmacêutico FK228 (FR901228)

concentração em utilização: 50 ng/mL 31 método de preparação: Preparou-se, antecipadamente, uma solução a 10 mg/mL com etanol e diluiu-se sucessivamente com um meio de cultura para obter soluções a 50 ng/mL. forma de dosagem: solução (preparada quando em utilização) Células utilizadas: cancro da próstata humano (PC-3), linfoma humano (U937), cancro do rim humano (ACHN)

Meio de cultura: DMEM (para PC-3, ACHN), RPMI1640 (para U937) ambos obtidos de Nikken Biomedical Labomurganhory, contendo ainda FCS (Moregate) e

Penicilina-Estreptomicina (ICN Biomedicals Inc.).

Extracção de ARN: Kit RNeasy Mini (50) (Qiagen) RNase, água livre de DNase (Life Technologies) síntese de ADN: Sistema Superscript Choice (Life

Technologies) Ethachinmate (Nippon gene)

Iniciador T7-(dT)24 (Amersham Pharmacia) síntese de ARNc: Kit BioArray RNA Transcript Labeling (Amersham Pharmacia)

Fragmentação de ARNc: Trizma Base (SIGMA) ácido acético glacial (SIGMA) acetato de magnésio (SIGMA) acetato de potássio (SIGMA) 32

Hibridação: Kit Eukaryotic Hybridization Control (Amersham Pharmacia) solução de EDTA 0,5 M (SIGMA) MÊS, Sal de Sódio, (SIGMA) MÊS, Ácido Livre Mono-hidratado (SIGMA) ADN de Esperma de Arenque (Promega)

Sol. de Albumina de Soro Bovino Acetilada (Life Technologies)

Coloração: Ficoeritrina-Estreptavidina (Sondas Moleculares) IgG de cabra, Reagente Grade (SIGMA)

Anti-estreptavidina ab (cabra), biotinilada (Vector Lab)

Chip utilizado: matriz HuGeneFL (Amersham Pharmacia)

(2) Preparação celular e Extracçao de ARN

As células tumorais humanas (PC-3, U937, ACHN) que atingiram confluência em balões F75 foram submetidas a um tratamento de tripsina para obter suspensões celulares simples, que foram inoculadas em cinco balões F75 e cultivadas durante 24 h. O meio de cultura foi rejeitado e adicionaram-se um meio de cultura fresco (18 mL) e uma concentração de 10 vezes (50 ng/mL) de uma solução de FR901228 (2 mL). A mistura foi cultivada numa incubadora de CO2 a 37 °C durante um determinado tempo (0, 1, 3, 12 e 24 h) . Após o fim do cultivo, o meio de cultura foi rejeitado e extraiu-se o ARN total de acordo com o protocolo do Kit RNeasy Mini (50) (Qiagen). O ARN foi quantificado e confirmado por electroforése. 33 (3) Síntese de ARNc

De acordo com o manual GeneChip, Capítulo 2 - Capítulo 4 e os manuais do Kit RNeasy Mini e do Kit RNA Transcript Labeling, purificou-se o ARN, sintetizou-se o ADNc, sintetizou-se o ARNc e fragmentou-se o ARNc. (4) Hibridaçao, Lavagem-Coloração, Varrimento A hibridação, lavagem-coloração e varrimento foram conduzidos de acordo com o manual GeneChip, Capítulo 5 Capítulo 7. (5) Análise

Analisados utilizando GeneSpring (análise de dados de micromatriz simples: fabricado por Silicon Genetics). <Resultados> 0 cancro da próstata humano PC-3 e o linfoma humano U937, que são células tumorais sensíveis a FK228 e o cancro do rim humano ACHN, que é uma célula tumoral resistente a FK228, foram colocadas em contacto in vitro com FK228 com o intervalo de tempo e, posteriormente, extraiu-se o ARN e foram examinados 7070 genes detectáveis utilizando GeneChip para genes mostrando 34 alteraçao na expressão devido a FK228. Esses genes foram analisados de acordo com os seguintes processos.

Análise 1: Selecçao de gene que mostra alteração na expressão devido à inibição da histona desacetilase.

Para limitar o gene que mostra alteração na expressão devido a FK228, seleccionou-se um gene mostrando alteração linear de expressão (condição de análise de GeneSpring: gene que mostra alteração na expressão por 0,5 vezes ou mais ou 0,5 vezes ou menos a qualquer momento).

Análise 2: Selecçao de gene envolvido em eficácia

Quando contactado com FK228 durante 72 h, o efeito de supressão de crescimento em PC-3, U937 e ACHN em valor IC50 foi 3,17, 3,20 e 4,25 ng/mL, respectivamente, mostrando praticamente o mesmo grau de efeito de supressão de crescimento nestas células tumorais. A partir destes resultados, os genes relativos à supressão de crescimento foram considerados como apresentando, habitualmente, alteração em expressão em qualquer célula.

Verificaram-se 105 genes que mostraram, habitualmente, expressão aumentada nestes três tipos de células tumorais humanas e 100 genes que mostraram, habitualmente, expressão diminuída nestes três tipos de células tumorais humanas. 35

Exemplo 7: Análise da expressão génica (in vivo) por FK228 em célula tumoral utilizando um chip gene 0 efeito de FK228 na expressão do gene in vivo em célula tumoral humana foi analisado utilizando um chip génica. <material*processo> (2) Materiais de teste agente farmacêutico FK228 (FR901228) dosagem: 10 mg/kg dosagem de administração: 10 mL/kg solvente: 10% de HCO-60/soro fisiológico forma de dosagem: solução (preparada quando em utilização) Célula Tumoral: cancro da próstata humano PC-3 (fragmento tumoral 3 mm x 3 mm x 3 mm/sitio de implantação no murganho s.c.) cancro gástrico humano SC-6; obtido de Central Institute for Experimental Animais (fragmento tumoral 3 mm x 3 mm x 3 mm/sitio de implantação no murganho s.c.) cancro do rim humano ACHN (fragmento tumoral 3 mm x 3 mm x 3 mm/sítio de implantação no murganho s.c.) 36 cancro do rim humano A498; obtido de ATCC (fragmento tumoral 3 mm x 3 mm x 3 mm/sitio de implantação no murganho s.c.)

Animal subcultivado: macho BALB c/nude/nude

Technologies) Ethachinmate (Nippon gene) Iniciador T7-(dT)24 (Amersham Pharmacia) síntese de ARNc: Kit BioArray RNA Transcript Labeling (Amersham Pharmacia)

Fragmentação de ARNc: Trizma Base (SIGMA) ácido acético glacial (SIGMA) acetato de magnésio (SIGMA) acetato de potássio (SIGMA)

Hibridação: Kit Eukaryotic Hybridization Control (Amersham Pharmacia) solução de EDTA 0,5 M (SIGMA) MES, Sal de Sódio (SIGMA) MES, Ácido Livre Mono-hidratado (SIGMA) ADN de Esperma de Arenque (Promega)

Sol. De Albumina de Soro Bovino Acetilada (Life Technologies)

Chip utilizado: matriz HuGeneFL (Amersham Pharmacia) 37

(2) Preparação celular e Extracção de ARN

Um fragmento tumoral quadrado de 3 mm (PC-3, SC-6, ACHN e A498) foi implantado subcutaneamente num murganho nude e, quando o tumor atingiu cerca de 100 mm (diâmetro maior 9 mm, diâmetro menor 8 mm), administrou-se intravenosamente FR901228 (10 mg/kg) Às 0, 0,5, 1, 2 e 4 h após administração de FR901228, removeu-se o tumor e extraiu-se o ARN total de acordo com o protocolo do Kit RNeasy Mini (50) (Qiagen) . O ARN foi quantificado e confirmado por electroforése. (3) Síntese de ARNc

De acordo com o manual GeneChip, Capítulo 2 - Capítulo 4 e os manuais do Kit RNeasy Mini e do Kit RNA Transcript Labeling, purificou-se o ARN, sintetizou-se o ADNc, sintetizou-se o ARNc e fragmentou-se o ARNc. (4) Hibridaçao, Lavagem-Coloração, Varrimento A hibridação, lavagem-coloração e varrimento foram conduzidos de acordo com o manual GeneChip, Capítulo 5 Capitulo 7. (5) Análise

Analisados utilizando GeneSpring (análise de dados de micromatriz simples: fabricado por Silicon Genetics). 38 <Resultados> 0 FR901228 (10 mg/kg) foi administrado intravenosamente em cancro da próstata humano PC-3, cancro gástrico humano SC-6, cancro do rim humano ACHN e cancro do rim humano A498- murganho transportando cancro e o tumor foi removido com o intervalo de tempo (0, 0,5, 1, 2 e 4 h). Em seguida, extraiu-se o ARN e foram examinados 7070 genes detectáveis utilizando GeneChip para genes mostrando alteração na expressão devido a FK228. A taxa de supressão de crescimento de cancro da próstata humano PC-3, cancro gástrico humano SC-6, cancro do rim humano ACHN e cancro do rim humano A498 pela administração de FR901228 (3,2 mg/kg) foi 98%, 84%, 20% e 29%, respectivamente. Portanto, PC-3 e SC-6 foram determinados serem tumores sensíveis a FK228 e ACHN e A498 foram determinados serem tumores resistentes a FK228.

Exemplo 8: Modo de expressão génica em tumor sensível a FK228 e tumor resistente a FK228 A correlação entre o modo de expressão génica e eficácia de FK228 foi examinada no tumor confirmado ser sensível ou resistente no Exemplo 7. Foi dada mais atenção aos genes (105 genes) que mostraram expressão aumentada por tratamento de FK228 e genes (100 genes) que mostraram expressão diminuída assim como demonstrado no teste in vitro no Exemplo 6 e estudou-se a correlação entre estes genes e a eficácia. Além disso, foram pesquisados um gene que mostrou expressão elevada num 39 tumor sensível e expressão baixa num tumor resistente e um gene que mostrou expressão baixa num tumor sensível e expressão elevada num tumor resistente. Como resultado, dos 105 genes que mostraram expressão aumentada in vitro por tratamento com FR901228, foram encontrados 6 genes que mostraram expressão elevada num tumor sensível e expressão baixa num tumor resistente e foram encontrados 4 genes a mostrar expressão baixa num tumor sensível e expressão elevada num tumor resistente (Tabela 1). Além disso, dos 100 genes que mostraram expressão diminuída in vitro por tratamento com FR901228, foram encontrados 4 genes que mostraram expressão elevada num tumor sensível e expressão baixa num tumor resistente e foram encontrados 9 genes que mostraram expressão baixa num tumor sensível e expressão elevada num tumor resistente (Tabela 2).

Tabela 1: genes que mostraram expressão elevada num tumor sensível e expressão baixa num tumor resistente ou genes que mostraram expressão baixa num tumor sensível e expressão elevada num tumor resistente (genes que mostraram expressão aumentada in vitro por tratamento com FR901228)

Tumor Sensível (Elevado) e Tumor Resistente (Baixo) M13686_s_em (SFTP1) proteína associada a tensioactivo pulmonar U68111_em (PPP1R2)Fonte: gene do inibidor 2 de proteína fosfatase humana (PPP1R2), exão 6 e cds completo. U60521_em (CASP9) caspase 9 protease de cisteína relacionada com apoptose, L19783_em (PIGH)fosfatidilinositol glicano, classe H X60487_em (H4/h) 40

Tumor Sensível (Elevado) e Tumor Resistente (Baixo) J04056_em (CBR1) carbonil-redutase 1

Tumor Sensível (Baixo) e Tumor Resistente (Elevado) U56998_em (CNK) cinase induzível por citocina X68277_em (DUSP1) fosfatase 1 de especificidade dupla U65092_em (MSG1) gene 1 especifico de melanócito X01703_em Fonte: gene humano para alfa-tubulina (b alfa 1).

Tabela 2: genes que mostraram expressão elevada num tumor sensível e expressão baixa num tumor resistente ou genes que mostraram expressão baixa num tumor sensível e expressão elevada num tumor resistente (genes que mostraram expressão diminuída in vitro por tratamento com FR901228)

Tumor Sensível (Elevado) e Tumor Resistente (Baixo) X74987_s_em (RNASELI) inibidor de ribonuclease L (dependente de 2' , 5'-oligoisoadenilato sintetase) J03801_f_em (LYZ) lisozima (amiloidose renal) U09578_em (MAPKAPK3) proteína cinase 3 activada por proteína cinase activada por mitógeno D50678_em (LRP8) proteína 8 relacionada com receptor de lipoproteína de baixa densidade

Tumor Sensível (Baixo) e Tumor Resistente (Elevado) Y10375_s_em (SIRP-alpha 1) Z14982_rnal_em splicing alternativo (gene LAMP7-E1 da subunidade 41

Tumor Sensível (Elevado) e Tumor Resistente (Baixo) de proteassoma codificada por MHC) X62048_em (WEE1) weel + homólogo (S. pombe) X71874_cdsl_em (PSMB10) subunidade de proteassoma (prossoma, macropaína), tipo beta, 10 U32849_em (NMI) interactor N-myc (e STAT) D55716_em (Plcdc47) Fonte: ARNm humano para Plcdc47, cds completo. M98045_em (FPGS) folilpoliglutamato sintase U21551_em (ECA39)Fonte: ARNm ECA39 humano, cds completo. U06681_em U07620_em (PRKM10) proteína cinase activada por mitógeno 10 (MAP cinase)

Estes genes sugerem correlação com eficácia de FK228 e correlação com sensibilidade ou resistência a FK228, indicando deste modo a possibilidade destes genes serem utilizáveis como marcadores de previsão de eficácia.

Aplicabilidade Industrial 0 agente terapêutico para cancro da próstata da presente invenção, compreendendo, como ingrediente activo, FK228 (particularmente FR901228) ou um seu sal possuindo uma actividade inibidora da histona desacetilase, possui uma acção antitumoral superior não apenas in vitro mas também in vivo. Portanto, podem ser clinicamente utilizados, de um modo particularmente adequado, para tratamento de cancro. 42

Texto Livre de Listagem de Sequências SEQ ID N° 1: oligonucleótido iniciador para PCR de ARNm de SEQ ID N° 2: oligonucleótido iniciador para PCR de ARNm de SEQ ID N° 3: oligonucleótido iniciador para PCR de ARNm de SEQ ID N° 4: oligonucleótido iniciador para PCR de ARNm de SEQ ID N° 5: Xaa é um aminoá NH2C (CHCH3) COOH. concebido para actuar como um p21. concebido para actuar como um p21. concebido para actuar como um c-myc. concebido para actuar como um c-myc. ;ido representado pela fórmula 0 grupo carboxilo da fórmula COOHCfQCH (CHCHC2H4SH) OH está ligado com um grupo amino de Vai, que é o primeiro aminoácido, um grupo hidroxilo está ligado com um grupo carboxilo de Vai, que é o quarto aminoácido e um grupo SH está ligado por dissulfureto com um grupo SH de Cys, que é o segundo aminoácido.

Este pedido é baseado num pedido de patente N° 2001-250846 apresentado no Japão.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> FUJISAWA PHARMACEUTICAL CO., LTD. 43 inibidor da histona <12 Ο > Utilização farmacêutica de desacetilase e método de avaliaçao do seu efeito antitumoral <13 0> 09491 <150> JP 2001-250846 <151> 2001-8-21 <16 0> 5 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido concebido para actuar como iniciador para PCR de ARNm de p21. <40 0> 1 ggcagaccag catgacacat t 21 <210> 2 <211> 22 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> Oligonucleótido concebido para actuar como iniciador para PCR de ARNm de p21. 44 <400> 2 ggattagggc ttcctcttgg ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido concebido para actuar como iniciador para PCR de ARNm de c-myc. <400> 3 gacagatcag caacaaccga aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido concebido para actuar como iniciador para PCR de ARNm de c-myc. <400> 4 ttgtgtgttc gcctcttgac at 22 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Chromobacterium sp. 45 <22 0> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa é um aminoácido representado pela fórmula NH2C(CHCH3)COOH. <220> <221> LOCAL <222> (1), (2), (4) <223> Na fórmula COOHCH2CH (CHCHC2H4SH) OH, o grupo carboxilo está ligado com o grupo amino do primeiro aminoácido Vai, o grupo hidroxilo está ligado com o grupo carboxilo do quarto aminoácido Vai e o grupo SH está ligado com o grupo SH do segundo aminoácido Cys através de uma ligação dissulfureto. <400> 5

Vai Cys Xaa Vai 4

Lisboa, 15 de Novembro de 2011 46

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Agente para utilização no tratamento do cancro da próstata, que compreende um composto representado pela fórmula (I) CH, 'V CH, / CH-CH CH, .CH'"0' / V HN CH, CH // C \ (I) NH \ HN \ C- Hj CHt H,C 2 \ P HC i c-" H CH / CH CH, CH, ou um seu sal como um ingrediente activo.
2. Agente para utilização da reivindicação 1, em que o composto representado pela fórmula (I) é um composto representado pela fórmula (II)

1
3. Agente para utilização da reivindicação 1 ou 2, que possui uma acção antitumoral in vivo.
4. Composição farmacêutica para utilização no tratamento do cancro da próstata, que compreende um composto representado pela fórmula (I)

(1) ou um seu sal e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
5. Composição farmacêutica para utilização da reivindicação 4, em que o composto representado pela fórmula (I) é um composto representado pela fórmula (II) O

2 (II)
6. Utilização de um composto representado pela fórmula (I) CH, CH-CH / CH, .CH/ \ HN 'CH. / \ HN \ O c OII-c- 2\ CH, H,C // HC% -c- CH CHjkJ* v NH CH / CH CH, (0 'CH3 ou um seu sal, para a produção de um agente para tratamento do cancro da próstata.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o composto representado pela fórmula (I) é um composto representado pela fórmula (II)

3 em que o
8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7, agente para tratamento do cancro da próstata possui acção antitumoral in vivo. Lisboa, 15 de Novembro de 2011 uma 4