PT1372682E - Catequinas para o tratamento de fibrilogénese em doença de alzheimer, doença de parkinson, amiloidose αa sistémica e outras perturbações amiloides - Google Patents

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DESCRIÇÃO "CATEQUINAS PARA O TRATAMENTO DE FIBRILOGÉNESE EM DOENÇA DE ALZHEIMER, DOENÇA DE PARKINSON, AMILOIDOSE AA SISTÉMICA E OUTRAS PERTURBAÇÕES AMILOIDES"

DOMÍNIO TÉCNICO A invenção refere-se a composições para o tratamento de doença de corpos de Lewy ou doença de Parkinson, utilizando catequinas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de Alzheimer é caracterizada pela acumulação de um péptido de 39-43 aminoácidos denominado proteina beta-amiloide ou Αβ, numa forma fibrilar, que existe na forma de placas amiloides extracelulares e na forma de amiloide nas paredes de vasos sanguíneos cerebrais. Crê-se que a deposição de amiloide Αβ fibrilar em doença de Alzheimer é prejudicial para o paciente e acaba por conduzir a toxicidade e morte celular neuronal, caracteristicas distintivas de doença de Alzheimer. Evidências acumuladas implicam a amiloide como um importante fator causador da patogénese da doença de Alzheimer. A doença de Parkinson é outra perturbação humana caracterizada pela formação, deposição, acumulação e/ou persistência de depósitos anormais de proteínas fibrilares que demonstram muitas das caracteristicas da amiloide. Em doença de Parkinson, crê-se que uma acumulação de corpos de Lewy citoplasmáticos que consistem em filamentos de alfa-sinucleína/NAC é importante na patogénese e como alvos terapêuticos. Novos agentes ou compostos capazes de inibir a formação, deposição, acumulação e/ou persistência de 2 alfa-sinucleina/NAC, ou de destruir fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleina/NAC (ou porções destas) são considerados agentes terapêuticos potenciais para o tratamento de doença de Parkinson.

Uma variedade de outras doenças humanas também demonstra deposição de amiloide e habitualmente envolve órgãos sistémicos (isto é, órgãos ou tecidos situados fora do sistema nervoso central), em gue a acumulação de amiloide conduz a disfunção ou falha de órgãos. Estas doenças amiloides (discutidas em baixo) conducentes a acentuada acumulação de amiloide nalguns órgãos e tecidos diferentes são conhecidas como amiloidoses sistémicas. Noutras doenças amiloides podem ser afetados órgãos isolados, como o pâncreas em 90% dos pacientes com diabetes do tipo 2. Neste tipo de amiloidose, crê-se que as células beta nos ilhéus de Langerhans do pâncreas são destruídas pela acumulação de depósitos amiloides fibrilares que consistem principalmente numa proteina conhecida como polipéptido amiloide dos ilhéus (IAPP) . Crê-se que a inibição ou redução dessa acumulação de amiloide conduz a novos tratamentos eficazes para diabetes do tipo 2. Em doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doenças amiloides "sistémicas" não há, presentemente, nenhuma cura ou tratamento eficaz, e o paciente habitualmente morre num periodo de 3 até 10 anos desde o surgimento da doença.

As doenças amiloides incluem mas não estão limitadas à amiloide associada a doença de Alzheimer, sindroma de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Holandês, e miositose de corpos de inclusão (Askanas et al., Ann. Neurol. 43_: 521-560, 1993) (em que a amiloide especifica é referida como proteina beta-amiloide ou Αβ), a 3 amiloide associada a inflamação crónica, várias formas de malignidade e Febre Mediterrânica Familiar (em que a amiloide especifica é referida como amiloide AA ou amiloidose associada a inflamação), a amiloide associada a mieloma múltiplo e outras discrasias de células B (em que a amiloide especifica é referida como amiloide AL) , a amiloide associada a diabetes do tipo II (em que a proteína amiloide específica é referida como amilina ou polipéptido amiloide dos ilhéus), a amiloide associada às doenças por prião, incluindo doença de Creuzfeldt-Jakob, síndroma de Gerstmann-Straussler, Kuru e tremor epizoótico de animais (em que a amiloide específica é referida como amiloide PrP), a amiloide associada a hemodiálise de longa duração e síndroma do túnel cárpico (em que a amiloide específica é referida como amiloide de beta2-microglobulina), a amiloide associada a amiloide cardíaca senil e Polineuropatia Amiloidótica Familiar (em que a amiloide específica é referida como transtiretina ou pré-albumina), e a amiloide associada a tumores endócrinos, como carcinoma medular da tiroide (em que a amiloide específica é referida como variantes da procalcitonina).

Adicionalmente, a proteína alfa-sinucleína que forma fibrilas, e é positiva para vermelho do Congo e Tioflavina S, encontra-se como parte de corpos de Lewy nos cérebros de pacientes com doença de Parkinson, doença de corpos de Lewy (Lewy em "Handbuch der Neurologie", M. Lewandowski, editor, Springer, Berlim páginas 920-933, 1912; Pollanen et al.r J. Neuropath. Exp. Neurol. _52: 183-191, 1993; Spillantini et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _95: 6469-6473, 1998; Arai et al., Neurose. Lett. 259: 83-86, 1999), e atrofia de múltiplos sistemas (Wakabayashi et al., Acta Neuropath. 96: 445-452, 1998) . 4 A descoberta e identificação de novos compostos ou agentes como terapêuticos potenciais para travar a formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide que ocorrem em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses são desesperadamente procuradas.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona a utilização de uma catequina na preparação de um medicamento para o tratamento de doença de Parkinson ou doença de corpos de Lewy, em que a catequina é selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores.

Num segundo aspeto, a presente invenção proporciona uma catequina selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores, para o tratamento de doença de Parkinson ou doença de corpos de Lewy. 0 medicamento pode destinar-se a administração oral, injeção parentérica, injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, administração tópica, ou administração por pulverização de aerossol.

Num terceiro aspeto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de fibrilogénese de alfa-sinucleina ou 5 NAC num ambiente in vitro, em que o método compreende o passo de administrar no ambiente in vitro uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma catequina selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores.

Num quarto aspeto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para uso no tratamento de doença de Parkinson ou doença de corpos de Lewy, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma catequina selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores, e um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da catequina compreende uma dosagem situada no intervalo de cerca de 0,1 até 500 mg/kg de peso do corpo do sujeito. A quantidade terapeuticamente eficaz da catequina pode compreender uma dosagem situada no intervalo de cerca de 1,0 até 100 mg/kg de peso do corpo do sujeito.

Em certas formas de realização, a composição compreende uma mistura de duas ou mais das catequinas selecionadas grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, sais epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores. 6 A catequina selecionada está preferivelmente em forma isolada substancialmente pura. A identificação e utilização de extrato de chá verde padronizado e respetivos derivados e constituintes, como os compostos de catequina apresentados, por exemplo, na Figura 1, são divulgadas para a intervenção terapêutica de doença de Alzheimer, amiloidose AA sistémica e outras amiloidoses, e doenças de Parkinson e de corpos de Lewy.

Adicionalmente, são divulgados métodos de isolamento para a identificação e purificação dos ingredientes potentes inibidores de amiloide do extrato de chá verde. É antecipado que a utilização de extrato de folhas de chá verde padronizado e seus ingredientes (isto é, 50% de polifenóis) contidos em diferentes preparações comerciais beneficie pacientes humanos com doença de Alzheimer e outras amiloidoses, e doenças de Parkinson e de corpos de Lewy, devido à capacidade do extrato de folhas de chá verde para inibir a formação de fibrilas amiloides, e a formação de fibrilas de alfa-sinucleina de Parkinson e de corpos de Lewy, e para causar dissolução/destruição e desagregação de fibrilas amiloides e de alfa-sinucleina pré-formadas.

Divulgamos a identificação e fazemos a descoberta surpreendente de que catequinas disponíveis no mercado, como as presentes em extratos de chá verde padronizados, e o próprio extrato de folhas de chá verde padronizado (como presente em extrato padronizado para 50% de polifenóis), atuam como um inibidor impressionante da formação de fibrilas amiloides em doença de Alzheimer, formação de fibrilas amiloides AA sistémicas, e formação de fibrilas de alfa-sinucleína/NAC em doença de Parkinson. Além disso, 7 catequinas disponíveis no mercado (incluindo mas não se limitando a epicatequina, catequina, qalhato de galhocatequina, qalhato de epiqalhocatequina, epiqalhocatequina e/ou qalhato de epicatequina) e extrato de folhas de chá verde padronizado têm capacidade para causar um desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides pré-formadas do tipo de Alzheimer, suqerindo que este aqente pode ser útil para pacientes em fases mais tardias de doença de Alzheimer, e os afetados com outras doenças amiloides. Verificou-se que extrato de folhas de chá verde padronizado e catequinas obtidas de diferentes fontes comerciais (extratos isolados de cápsulas revestidas com gelatina) servem de inibidores potentes da fibrilogénese amiloide em doença de Alzheimer e fibrilogénese de proteínas em doença de Parkinson.

Para finalidades desta divulgação, a doença de Parkinson, devido ao facto de fibrilas se desenvolverem nos cérebros de pacientes com esta doença (que são positivas para vermelho do Congo e Tioflavina S, e que contêm predominantemente uma estrutura secundária de folhas beta pregueadas), é identificada e discutida como uma doença que também exibe as características de uma doença do tipo amiloide, sendo consequentemente esperado que divulgações aqui apresentadas relacionadas com amiloidoses se refiram terapeuticamente, de igual modo, às doenças de Parkinson e de corpos de Lewy. Assim, é antecipado que agentes ou compostos que se verifique inibirem a formação de fibrilas amiloides Αβ em doença de Alzheimer também sejam eficazes na inibição da formação de fibrilas de alfa-sinucleína/NAC. Em consequência, estes agentes ou compostos também servirão de terapêuticos para as doenças de Parkinson e de corpos de Lewy, para além de terem eficácia como terapêuticos para 8 doença de Alzheimer, amiloidose sistémica, diabetes do tipo 2, e outras perturbações amiloides.

Compostos aromáticos poli-hidroxilados selecionados, como epicatequina, aparentam ser eficazes como inibidores de amiloidose AA sistémica in vivo. De modo significativo, descobrimos que a própria catequina (o epimero da epicatequina) não é eficaz como inibidor de amiloidose AA sistémica. Identificamos vários compostos aromáticos poli-hidroxilados que inibem a formação e/ou deposição de amiloide AA fibrilar e que são úteis para o tratamento de amiloidose AA sistémica que ocorre em pacientes com perturbações inflamatórias crónicas.

Extrato de folhas de chá verde padronizado e várias catequinas disponíveis no mercado causaram uma acentuada inibição significativa dependente da dose de formação de fibrilas amiloides Αβ 1-40, determinado utilizando um ensaio de fluorometria com Tioflavina T, de um modo dependente da dose. Extrato de folhas de chá verde padronizado e catequinas obtidos de fontes comerciais também foram destruidores potentes de fibrilas amiloides pré-formadas contendo Αβ 1-42, determinado utilizando um ensaio de fluorometria com Tioflavina T, e exerceram os seus efeitos de um modo dependente da dose. Compostos aromáticos poli-hidroxilados selecionados, como epicatequina, aparentam ser inibidores eficazes de amiloidose AA sistémica num modelo experimental de ratinho. Por fim, extrato de folhas de chá verde padronizado obtido de diferentes fontes comerciais causou uma desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas Αβ 1-42 em doença de Alzheimer, e catequinas obtidas de diferentes fontes 9 comerciais causaram uma inibição de fibrilas contendo NAC em doença de Parkinson.

Em consequência, é divulgada a utilização de extrato de folhas de chá verde padronizado e/ou catequinas especificas (em várias formas, isto é, uma pilula, comprimido, forma liquida, forma em pó, etc.) e respetivos derivados, de diferentes fontes comerciais, para o tratamento de fibrilogénese em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica e outras amiloidoses. Também são divulgados métodos de isolamento para identificar e purificar os ingredientes chave inibidores de amiloide no material do extrato de chá verde. É antecipado que a identificação dos ingredientes "ativos" inibidores de amiloide nos materiais vegetais extraídos do chá verde conduza à conceção de novos fármacos para terapêuticas antiamiloides do futuro. É antecipado que a utilização corrente de extrato de folhas de chá verde padronizado e seus ingredientes, como catequinas contidas em diferentes preparações comerciais, beneficie pacientes humanos em todas as fases das doenças de Alzheimer, Parkinson e outras doenças amiloides ou do tipo amiloide, devido à capacidade demonstrada de novo de catequinas e extrato de chá verde padronizado para inibir a formação de fibrilas amiloides Αβ, e a formação de fibrilas de alfa-sinucleína (importante para o tratamento de fases precoces até intermédias de doença de Alzheimer e doença de Parkinson, respetivamente), e causar dissolução/destruição e desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas (importante para o tratamento de fases intermédias até tardias de doença de Alzheimer e doença de Parkinson, respetivamente). De modo semelhante, é antecipado que catequinas e extrato de folhas de chá verde padronizado beneficiem pacientes com diferentes doenças 10 amiloides sistémicas, como amiloidose AA sistémica, e diabetes do tipo 2, independentemente da fase da acumulação de amiloide e do órgão (ou tecido) envolvido. Não obstante os resultados do extrato de chá serem exemplificados com a Espécie Camellia sinensis, crê-se que extratos de outras espécies da família Theaceae tenham efeitos semelhantes. A utilização de chá verde, folhas e extratos de chá verde, e catequinas ou seus derivados, é divulgada para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide e/ou fibrilas em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Também se pretende que "tratamento", em todos os casos possíveis, inclua e abranja "tratamento in vitro", seja para fins experimentais ou de rastreio, e quer o tratamento in vitro conduza ou não, ou seja pretendido que conduza ou não, a tratamento de uma fibrilogénese semelhante, ou qualquer doença de amiloide ou alfa-sinucleína correspondente a essa fibrilogénese, num sujeito mamifero.

Também é divulgada a utilização de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, da espécie Camellia sinensis para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, da família Theaceae são divulgados para o 11 tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses. Pílulas, comprimidos, "caplets", cápsulas de gelatina mole e endurecida, rebuçados, saquetas, cápsulas de hóstias ("cachets"), cápsulas vegetais, gotas líquidas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, saquetas de chá, folhas de chá, aerossóis (na forma de um sólido ou num meio líquido), supositórios, soluções injetáveis esterilizadas, pós embalados esterilizados e/ou folhas em pó disponíveis no mercado que contêm chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, são divulgados para o tratamento de pacientes com doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, e/ou os polifenóis contidos em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses. A invenção é descrita com referência a formas de realização, espécies e partes de plantas, métodos e procedimentos específicos e afins. No entanto, será reconhecido pelos profissionais que várias substituições químicas podem ser feitas nos compostos divulgados sem sair do espírito e âmbito da invenção. Em particular, é conhecido que catequinas podem ser isoladas e/ou 12 purificadas de materiais vegetais por alguns métodos diferentes. Será adicionalmente reconhecido que estes métodos alternativos, e consequentes alterações noutros passos do método, como a utilização de diferentes solventes ou diferentes colunas para purificação, e de catequinas de uma composição de polifenóis parcialmente purificados, pertencem ao âmbito dos presentemente divulgados extratos derivados de plantas e respetivos compostos derivados.

Também é divulgada a utilização de catequinas contidas em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Catequinas, incluindo mas não se limitando a catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e/ou galhato de epicatequina, quer estejam contidas em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, ou provenientes de outras fontes naturais ou sintéticas, são divulgadas para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Também é divulgada a utilização de bioflavanoides contidos em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses, e a utilização de 13 flavanóis contidos em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Também é divulgada a utilização de flavanodióis contidos em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses, e a utilização de flavanoides contidos em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Também é divulgada a utilização de taninos contidos em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Também são divulgados métodos de isolamento dos ingredientes ativos presentes em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para utilização como agentes potentes que inibem a formação de amiloide, deposição de amiloide, acumulação de amiloide, persistência de amiloide, causam um desmantelamento/destruição e/ou causam um desmantelamento de fibrilas amiloides pré-formadas ou pré-depositadas em doença de Alzheimer, doença 14 de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses. Métodos de isolamento dos ingredientes ativos do chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, incluem a aplicação de algumas técnicas comuns conhecidas dos profissionais, incluindo mas não se limitando a cromatografia de camada fina utilizando placas revestidas com silica, e separação e isolamento utilizando cromatografia liquida de alta ou baixa pressão (HPLC). Outros ingredientes ativos do chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, que se verifique serem inibidores potentes da formação de amiloide, deposição de amiloide, acumulação de amiloide, persistência de amiloide, e/ou causem um desmantelamento/destruição e desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas ou pré-depositadas em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses, são identificados testando de novo bandas ou frações individuais (separadas por cromatografia de camada fina, cromatografia em coluna e/ou HPLC) utilizando testes de ensaios especificos descritos nos Exemplos. 0 isolamento suficiente destes ingredientes ativos contidos em bandas e/ou frações individuais é então enviado para análises especificas, que podem incluir mas não estão limitadas a microscópio eletrónico de varrimento equipado com um analisador de raios x por energia dispersiva para detetar e mapear espacialmente alguns elementos presentes em cada amostra, análise elementar por combustão para determinar a % relativa de carbono, hidrogénio e azoto, espetroscopia de massa de alta resolução para determinar o peso molecular e composição elementar, espetroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier para determinar grupos funcionais e efetuar comparações com os espetros de 15 compostos conhecidos, calorimetria diferencial de varrimento para determinar o ponto de fusão, absorção atómica, cromatografia em gel, cromatografia liquida de alto desempenho, espetroscopia de ressonância magnética nuclear de protões e C para a caracterização do material e para proporcionar informações respeitantes à posição de átomos uns relativamente aos outros, e espetroscopia de UV/VIS. É esperado que técnicas adicionais sejam desenvolvidas como parte do isolamento adicional de ingredientes ativos potentes de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados. A utilização de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, e/ou dos seus ingredientes [(independentemente da fonte comercial e independentemente da forma final para consumo por humanos, isto é, pílulas, comprimidos, "caplets", cápsulas de gelatina mole e endurecida, rebuçados, saquetas, cápsulas de hóstias ("cachets"), cápsulas vegetais, gotas liquidas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, saquetas de chá, aerossóis (na forma de um sólido ou num meio liquido) , supositórios, soluções injetáveis esterilizadas, pós embalados esterilizados e/ou folhas de chá em pó] é divulgada para inibição da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide, independentemente do seu cenário clínico.

Também são divulgadas composições e métodos envolvendo a administração a um sujeito de uma dose terapêutica de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, que inibe a deposição de amiloide. Em conformidade, as composições e métodos divulgados são úteis para inibir amiloidose em perturbações nas quais ocorre deposição de 16 amiloide. Os compostos divulgados aqui podem ser utilizados terapeuticamente para tratar amiloidose, ou podem ser utilizados de modo profilático num sujeito suscetível a amiloidose. Os métodos divulgados baseiam-se, pelo menos em parte, na inibição direta da formação de fibrilas amiloides, causando desmantelamento/destruição e/ou desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas.

Também são divulgadas composições farmacêuticas para o tratamento de amiloidose. As composições farmacêuticas divulgadas incluem um composto terapêutico numa quantidade eficaz para inibir a deposição de amiloide e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Também é divulgada a utilização de quaisquer e todos os compostos sintéticos que são semelhantes a chá verde, folhas de chá verde, respetivos extratos ou derivados e/ou seus ingredientes ativos, para utilização como agentes potentes que inibem a formação de amiloide, deposição de amiloide, acumulação de amiloide, persistência de amiloide, causam um desmantelamento/destruição e/ou desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas ou pré-depositadas em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses. É divulgado um método de isolamento para purificar e identificar os ingredientes inibidores de amiloide de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados. Num desses métodos, um extrato preparado a partir de pílulas, comprimidos, "caplets", cápsulas de gelatina mole e endurecida, rebuçados, saquetas, cápsulas de hóstias ("cachets"), cápsulas vegetais, gotas líquidas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, saquetas de chá, 17 aerossóis (na forma de um sólido ou num meio liquido) , supositórios, soluções injetáveis esterilizadas, pós embalados esterilizados, chá em pó comercialmente obtidos, utilizando o método empregando alguns ou todos os passos seguintes: a) extração a partir de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, independentemente da forma como descrito acima, utilizando água ou álcool (isto é, metanol, etanol ou propanol, b) centrifugação a 2 500X g durante 20 minutos e recolha do sobrenadante, c) evaporação rotativa até à secura para compostos extraídos com álcool e liofilização para compostos extraídos com água, d) lavagem do pó seco obtido com 4 volumes de éter de petróleo (repetido 4 vezes), seguido de centrifugação (cada vez) a 2 500X g durante 20 minutos, e recolha de sobrenadantes e grânulos, e) secagem ao ar de grânulos recolhidos, f) nova extração de grânulos secos ao ar com água e centrifugação a 2 500X g durante 20 minutos, g) liofilização de sobrenadantes recolhidos (referidos como extratos aquosos), h) redissolução dos grânulos ou pó de extrato aquoso liofilizado em acetonitrilo/água/ácido trifluoroacético (TFA), i) injeção e separação por HPLC ou cromatografia de baixa pressão, j) identificação de ingredientes inibidores de amiloide por realização de testes em ensaios in vitro e in vivo relevantes, e k) envio para se obter a análise estrutural e composição elementar, como descrito aqui.

Também é divulgada uma composição, na forma de um suplemento dietético, para proporcionar, suportar ou melhorar num sujeito uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas selecionadas do grupo de qualidades mentais ou cognitivas que consistem em suporte nutricional do declinio cognitivo ou da memória relacionado com a idade, função 18 cerebral normal, capacidade cognitiva, e concentração, em que a composição compreende chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados. É divulgada uma composição, na forma de um suplemento dietético, para promover, manter ou intensificar num sujeito uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas selecionadas do grupo de qualidades mentais ou cognitivas que consistem em acuidade mental, estado de alerta mental, bem-estar cognitivo, função cerebral normal, capacidade cognitiva, desempenho mental, memória concentração, perspicácia mental, vitalidade mental, clareza mental, memória de curto prazo, função cerebral normal, aprendizagem, e boa saúde cerebral, em que a composição compreende chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados.

Também é divulgada uma composição, na forma de um suplemento dietético, para promover ou suportar uma função pancreática saudável num sujeito, ao ajudar a promover a função normal da insulina, ou para reduzir, destruir, dissolver, inibir, eliminar ou prevenir num sujeito um ou mais estados envolvendo o pâncreas selecionados do grupo de estados envolvendo o pâncreas que consistem em depósitos de fibrilas amiloides, depósitos da proteína amiloide, pâncreas associado a depósitos de fibrilas amiloides, depósitos da proteína amiloide associados ao pâncreas, formação e crescimento de fibrilas amiloides, e formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, em que a composição compreende chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados. 19 É divulgada a utilização de (a) epicatequina ou seus derivados, (b) catequinas, catequina hidratada ou seus derivados, (c) galhato de galhocatequina ou seus derivados, (d) galhato de epicatequina ou seus derivados, (e) epigalhocatequina ou seus derivados, (f) galhato de epigalhocatequina ou seus derivados, (g) chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, (h) chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, da espécie Camellia sinensis, (i) chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, da familia Theaceae, (j) pilulas, comprimidos, "caplets", cápsulas de gelatina mole e endurecida, rebuçados, saquetas, cápsulas de hóstias ("cachets"), cápsulas vegetais, gotas liquidas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, saquetas de chá, folhas de chá, aerossóis (na forma de um sólido ou num meio liquido), supositórios, soluções injetáveis esterilizadas, pós embalados esterilizados, e/ou folhas em pó disponíveis no mercado que contêm chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, ou catequinas, e (k) catequinas, incluindo mas não se limitando a catequina, epicatequina, epigalhocatequina, galhato de epicatequina, galhato de epigalhocatequina e galhato de galhocatequina contidas em chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, para o tratamento da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de fibrilas em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses.

Também são divulgadas composições e métodos envolvendo a administração a um sujeito de uma dose terapêutica de 20 catequinas ou seus derivados, que inibe a deposição de amiloide. Em conformidade, as composições e métodos divulgados são úteis para inibir amiloidose em perturbações nas quais ocorre deposição de amiloide. Os compostos podem ser utilizados de modo terapêutico para tratar amiloidose ou podem ser utilizados de modo profilático num sujeito suscetível a amiloidose. Os métodos baseiam-se, pelo menos em parte, na inibição direta da formação de fibrilas amiloides, causando desmantelamento/destruição e/ou desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas. É divulgada a utilização de quaisquer e todas as catequinas sintéticas ou seus derivados e/ou seus ingredientes ativos, para utilização como agentes potentes que inibem a formação de amiloide, deposição de amiloide, acumulação de amiloide, persistência de amiloide, causam um desmantelamento/ destruição e/ou desagregação de fibrilas pré-formadas ou pré-depositadas em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses. É divulgado um agente farmacêutico para o tratamento de uma doença amiloide num paciente, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta da família Theraceae, e em particular do género Camellia. O agente farmacológico provém preferivelmente de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. O agente farmacológico é preferivelmente um extrato obtido de Camellia sinensis, em que o extrato provém das folhas secas. 0 agente farmacológico tem preferivelmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de extrato de folhas de chá verde 21 padronizado, ou catequinas específicas, numa dosagem situada no intervalo desde cerca de 0,1 até cerca de 500 mg/kg de peso do corpo do paciente, e mais preferivelmente situada no intervalo desde cerca de 1,0 até cerca de 100 mg/kg de peso do corpo do paciente.

Agentes farmacêuticos preferidos têm uma percentagem por peso de extrato vegetal no agente situada no intervalo desde cerca de 70% até cerca de 95%, e também podem ter um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, o agente farmacêutico tem uma atividade ou eficácia inibidora de amiloide maior do que 50%.

As composições divulgadas também têm a capacidade para reduzir, eliminar, prevenir, inibir, destruir, desmantelar ou desagregar depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas amiloides associadas ao cérebro ou depósitos de proteína amiloide associados ao cérebro, bem como formação de fibrilas amiloides, ou formação de fibrilas amiloides associadas à idade, formação de fibrilas amiloides associadas ao cérebro; em consequência, irão promover a acuidade mental, promover o estado de alerta mental, proporcionar suporte nutricional para declínio cognitivo ou da memória devido ou relacionado com a idade, promover o bem-estar cognitivo, suportar a função cerebral, melhorar a capacidade cognitiva, desempenho mental ou memória, promover a concentração e perspicácia mental, melhorar a vitalidade mental, promover maior clareza e estado de alerta mentais, melhorar a memória de curto prazo, reduzir ou inverter o declínio cognitivo ou da memória associado à idade, suportar uma função cerebral normal, intensificar a aprendizagem ou memória; melhorar a 22 concentração, intensificar o desempenho mental, reduzir o declínio mental, reduzir a probabilidade de ocorrência de perturbações cerebrais relacionadas com a idade, e manter boa saúde cerebral. É antecipado que as composições divulgadas também têm a capacidade para reduzir, eliminar, prevenir, inibir, destruir, desmantelar ou desagregar depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides associados ao pâncreas, bem como a formação e crescimento de fibrilas amiloides, e formação e crescimento de fibrilas amiloides associadas ao pâncreas; em consequência, irão suportar uma função pancreática saudável e promover a função pancreática ao ajudar a promover uma função normal da insulina.

As composições divulgadas também podem incluir transportadores, diluentes e/ou excipientes habitualmente utilizados nas indústrias farmacêutica e de suplementos dietéticos, e quaisquer dessas adições, conhecidas dos profissionais, são aceitáveis e podem ser empregues sem sair do âmbito da invenção.

Também é divulgado um método de isolamento de constituintes inibidores de amiloide em chá verde, folhas, extratos de chá verde ou seus derivados, cujo método compreende os passos seguintes: a) extração do chá verde, folhas, extratos de chá verde ou seus derivados com água, ou com um solvente orgânico, b) remoção de materiais insolúveis, c) evaporação até à secura ou liofilização para se obter um pó, d) recuperação e redissolução dos constituintes inibidores de amiloide obtidos na água ou solvente orgânico, e e) injeção e 23 separação por cromatografia líquida de alta pressão ou baixa pressão.

Constituintes representativos de chá verde incluem catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos ou respetivos derivados, apesar de, para finalidades desta divulgação, estas substâncias também poderem ser opcionalmente derivadas de modo sintético ou ser independentemente encontradas noutras fontes vegetais. 0 passo de extração da matéria vegetal com um solvente orgânico também compreende a adição de metanol inicialmente a materiais vegetais que estão em forma de pó, e a mistura resultante é agitada durante a noite. 0 solvente utilizado no passo de extração de ingredientes inibidores de amiloide tem, preferivelmente, uma polaridade que varia entre a da água e a do pentanol. 0 passo de remoção de materiais insolúveis é preferivelmente efetuado por centrifugação do extrato e recolha do sobrenadante. 0 passo de concentração do extrato é preferivelmente efetuado por evaporação rotativa ou liofilização (para extratos aquosos). Após os passos de extração e centrifugação, o procedimento de extração e centrifugação é preferivelmente repetido mais 1 até 5 vezes, e os sobrenadantes são recolhidos.

Após os passos repetidos de extração e concentração, os sobrenadantes são preferivelmente reunidos e secos utilizando um evaporador rotativo ou liofilização (para extratos aquosos). 0 pó seco é lavado com 4 volumes de éter de petróleo (repetido 4 vezes), seguido de centrifugação (cada vez) a 2 500X g durante 20 minutos, e recolha dos sobrenadantes e grânulos. Os grânulos recolhidos são secos ao ar e extraídos de novo com água e são centrifugados a 2 500Χ g durante 20 minutos. Os sobrenadantes recolhidos (referidos como extratos aquosos) são liofilizados, e os grânulos ou extrato aquoso em pó liofilizado são redissolvidos em acetonitrilo/água/ácido trifluoroacético (TFA) para injeção de HPLC ou cromatografia de baixa pressão. O grânulo dissolvido é dividido em porções iguais e é injetado numa HPLC. A HPLC contém preferivelmente uma coluna Cis 1 X 25 cm, apesar de outros tamanhos poderem servir, e é mantida a 30 °C com uma taxa de fluxo de 2 mL/minuto. As porções de amostra injetadas na HPLC são eluidas com gradientes de A e B, como 0% de B durante 5 minutos, 0-15% de B durante 5-10 minutos, 15-45% de B durante 10-70 minutos, e 45-100% de B durante 70-85 minutos; em que B = 95% acetonitrilo com 0,5% ácido acético em água destilada, e A = 5% acetonitrilo com 0,5% ácido acético em água destilada. Os eluentes da HPLC são monitorizados a todos os comprimentos de onda, frações de 4 mL são recolhidas num coletor de frações e picos reunidos são obtidos a vários tempos de retenção (desde 0 até 85 minutos). As frações obtidas podem ser concentradas por liofilização depois de a maior parte do acetonitrilo ser removida por evaporação rotativa.

Em seguida, as frações concentradas obtidas são testadas em ensaios relevantes in vitro para identificar inibidores potentes da formação de fibrilas amiloides, ou desmantelamento/destruição ou desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas. Os ingredientes inibidores de amiloide são preferivelmente recolhidos dos tempos de retenção aproximados de HPLC de 10-70 minutos.

Também é divulgado um método para o tratamento de uma doença amiloide num paciente, que compreende o passo de 25 administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados. 0 chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, são preferivelmente administrados pela via oral ou por pulverização de aerossol ou numa forma parentericamente injetável ou apta a ser infundida.

Em métodos divulgados, a formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide num sujeito são inibidas por administração ao sujeito de uma dose terapêutica da invenção. Pretende-se que o termo "sujeito" inclua organismos vivos nos quais pode ocorrer amiloidose. Exemplos de sujeitos incluem humanos, macacos, vacas, ovelhas, cabras, cães, gatos, ratinhos, ratos e respetivas espécies transgénicas. A administração de chá verde, folhas e extratos de chá verde ou seus derivados, a um sujeito a ser tratado pode ser efetuada utilizando procedimentos conhecidos, em dosagens e durante períodos de tempo eficazes para inibir a formação, deposição, acumulação e persistência de amiloide no sujeito. Uma quantidade eficaz do composto terapêutico, necessária para se obter um efeito terapêutico, pode variar de acordo com fatores tais como a quantidade de amiloide já depositada no sítio clínico no sujeito, a idade, sexo e peso do sujeito, e a capacidade do composto terapêutico para inibir amiloidose no sujeito. Método Representativo ou Formas de Realização do Processo É apresentado um método de tratamento, prevenção ou gestão de uma amiloidose num sujeito mamífero suscetível ou afetado pela amiloidose, cujo método compreende o passo de administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica de matéria vegetal de uma fonte de chá verde, folhas de chá 26 verde, extrato de chá verde padronizado, ou derivado de chá verde. É apresentado um método para o tratamento, inibição, prevenção ou gestão da formação, deposição, acumulação, agregação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses num sujeito mamífero, cujo método compreende o passo de administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica de uma substância selecionada do grupo de substâncias que consistem em chá verde, folhas de chá verde, extrato de chá verde padronizado, derivado de chá verde, catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos ou respetivos derivados. A substância é preferivelmente uma catequina selecionada do grupo de catequinas que consistem em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, ou um derivado de um do grupo acima.

Em qualquer uma destas formas de realização, no passo de administração de matéria vegetal, também pode ser opcionalmente administrada uma quantidade terapêutica de um ou mais materiais vegetais selecionados do grupo de plantas que consistem e que são habitualmente conhecidas como Unha de Gato, gingko biloba, rosmaninho, gotu kola, bacopin e ginseng. É apresentado um método para o tratamento, inibição, prevenção ou gestão da formação, deposição, acumulação, agregação e/ou persistência de fibrilas de alfa-sinucleína 27 em doença de Parkinson, doença de corpos de Lewy, ou atrofia de múltiplos sistemas, num sujeito mamifero, cujo método compreende o passo de administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica de uma substância selecionada do grupo de substâncias que consistem em chá verde, folhas de chá verde, extrato de chá verde padronizado, derivado de chá verde, catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos ou respetivos derivados. A substância é preferivelmente uma catequina selecionada do grupo de catequinas que consistem em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina, e galhato de epicatequina, ou um derivado de um do grupo acima. É apresentado um método para promover o estado de alerta mental num paciente, cujo método compreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta da familia Theaceae, e preferivelmente de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. Este método também pode ser utilizado para inibir a formação de depósitos de amiloide no cérebro. É apresentado um método para promover, manter ou intensificar num paciente uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas selecionadas do grupo de qualidades mentais ou cognitivas que consistem em acuidade mental, estado de alerta mental, bem-estar cognitivo, função cerebral normal, capacidade cognitiva, desempenho mental, memória, concentração, perspicácia mental, clareza mental, memória de curto prazo, função cerebral normal e aprendizagem, cujo método compreende o passo de administrar 28 ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um método para proporcionar, suportar ou melhorar num paciente uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas selecionadas do grupo de qualidades mentais ou cognitivas que consistem em função cerebral normal, capacidade cognitiva, e concentração, cujo método compreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um método de redução num paciente de um ou mais dos efeitos mentais ou cognitivos selecionados do grupo de efeitos mentais ou cognitivos que consistem em declínio cognitivo ou da memória associado à idade, declínio mental, e probabilidade de ocorrência de perturbações cerebrais ou cognitivas relacionadas com a idade, cujo método compreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um método para reduzir, destruir, dissolver, inibir, eliminar ou prevenir num paciente um ou mais estados envolvendo o cérebro selecionados do grupo de estados envolvendo o cérebro que consistem em depósitos de fibrilas amiloides, depósitos de proteínas amiloides, depósitos de fibrilas amiloides associados ao cérebro, depósitos de proteínas amiloides associados ao cérebro, formação e crescimento de fibrilas amiloides, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados à idade, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao 29 cérebro, cujo método compreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um método para promover ou suportar uma função pancreática saudável num paciente, ao ajudar a promover uma função normal da insulina, cujo método compreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um método para reduzir, destruir, dissolver, inibir, eliminar ou prevenir num paciente um ou mais estados envolvendo o pâncreas selecionados do grupo de estados envolvendo o pâncreas que consistem em depósitos de fibrilas amiloides, depósitos de proteínas amiloides, depósitos de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, depósitos de proteínas amiloides associados ao pâncreas, formação e crescimento de fibrilas amiloides, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, cujo método compreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis.

Formas de Realização Representativas de Utilizações e/ou Composições/Agentes É apresentada a utilização de uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados, na preparação de uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para o tratamento, prevenção e ou gestão de uma amiloidose num sujeito mamífero suscetível ou afetado pela amiloidose. 30 É apresentada a utilização de uma fonte de chá verde, folhas de chá verde, extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados, na preparação de uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para inibir a formação, deposição, acumulação ou persistência de fibrilas amiloides ou causar dissolução/destruição ou desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas. É apresentada uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para o tratamento, prevenção, ou gestão de amiloidose num sujeito mamifero suscetível ou afetado pela amiloidose, cuja composição compreende uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados, e, se desejado, um transportador, diluente ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico ou dietético. É apresentada uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para inibir a formação, deposição, acumulação ou persistência de fibrilas amiloides ou causar dissolução/ destruição e ou desagregação de fibrilas amiloides pré-formadas, cuja composição compreende uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados, e, se desejado, um transportador, diluente ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico ou dietético. É apresentada a utilização de catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos ou respetivos derivados para o tratamento, prevenção ou gestão da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, 31 amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses, num sujeito mamífero suscetível à amiloidose. É apresentada uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para o tratamento, prevenção ou gestão da formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses num sujeito mamífero suscetível a esse estado amiloide, em que a composição compreende catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos, ou respetivos derivados, e, se desejado, um transportador, diluente ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico ou dietético. É apresentada uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para o tratamento, inibição, prevenção ou gestão da formação, deposição, acumulação, agregação e/ou persistência de fibrilas de alfa-sinucleína em doença de Parkinson, doença de corpos de Lewy, ou atrofia de múltiplos sistemas num sujeito mamífero, cuja composição compreende uma substância selecionada do grupo de substâncias que consistem em chá verde, folhas de chá verde, extrato de chá verde padronizado, derivado de chá verde, catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos, ou respetivos derivados. É apresentada a utilização de uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados, na preparação de uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para proporcionar, suportar ou melhorar num sujeito uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas. 32 É apresentada a utilização de uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados, na preparação de uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para promover ou suportar uma função pancreática saudável num sujeito. É apresentada uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para proporcionar, suportar ou melhorar num sujeito uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas, que compreende uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados. É apresentada uma composição farmacêutica ou suplemento dietético para promover ou suportar uma função pancreática saudável num sujeito, que compreende uma fonte de chá verde, folhas de chá verde ou extrato de folhas de chá verde padronizado, ou respetivos derivados. É apresentado um agente farmacológico para promover, manter ou intensificar num paciente uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas selecionadas do grupo de qualidades mentais ou cognitivas que consistem em acuidade mental, estado de alerta mental, bem-estar cognitivo, função cerebral normal, capacidade cognitiva, desempenho mental, memória, concentração, perspicácia mental, vitalidade mental, clareza mental, memória de curto prazo, função cerebral normal, e aprendizagem, e boa saúde cerebral, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. 33 É apresentado um agente farmacológico para proporcionar, suportar ou melhorar num paciente uma ou mais das qualidades mentais ou cognitivas selecionadas do grupo de qualidades mentais ou cognitivas que consistem em suporte nutricional de declinio cognitivo ou da memória relacionado com a idade, função cerebral normal, capacidade cognitiva, e concentração, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um agente farmacológico para reduzir num paciente um ou mais dos efeitos mentais ou cognitivos selecionados do grupo de efeitos mentais ou cognitivos que consistem em declinio cognitivo ou da memória relacionado com a idade, declínio mental, e probabilidade de ocorrência de perturbações cerebrais ou cognitivas relacionadas com a idade, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um agente farmacológico para reduzir, destruir, dissolver, inibir ou prevenir num paciente um ou mais estados envolvendo o cérebro selecionados do grupo de estados envolvendo o cérebro que consistem em depósitos de fibrilas amiloides, depósitos de proteínas amiloides, depósitos de fibrilas amiloides associados ao cérebro, depósitos cerebrais de Αβ, depósitos de Αβ associados ao cérebro, depósitos de proteínas amiloides associados ao cérebro, depósitos amiloides cerebrais, formação e crescimento de fibrilas amiloides, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados à idade, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente 34 eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um agente farmacológico para promover ou suportar uma função pancreática saudável num paciente, ao ajudar a promover uma função normal da insulina, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis. É apresentado um agente farmacológico para reduzir, destruir, dissolver, inibir ou eliminar ou prevenir num paciente um ou mais estados envolvendo o pâncreas selecionados do grupo de estados envolvendo o pâncreas que consistem em depósitos de fibrilas amiloides, depósitos de proteínas amiloides, depósitos de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, depósitos de amilina, depósitos de polipéptido amiloide dos ilhéus, depósitos de proteínas amiloides associados ao pâncreas, formação e crescimento de fibrilas amiloides, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, em que o agente farmacológico compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de matéria vegetal de uma planta do género Camellia, espécie sinensis.

Quanto a uma discussão mais pormenorizada e informação do contexto respeitante a amiloide e amiloidose, doença de Alzheimer e a população em envelhecimento, amiloide como alvo terapêutico para doença de Alzheimer e doença de Parkinson e formação de fibrilas de alfa-sinucleína ver o nosso requerimento de patente US copendente 20030017998 e patentes registadas 6,037,327, 6,264,994 e 6,346,280. 35

Estas e outras características e vantagens tornar-se-ão mais claras quando a seguinte descrição pormenorizada for lida em conjunção com as figuras adjuntas.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS FIGURA 1 é um conjunto de estruturas para derivados de catequina. FIGURA 2 é um gráfico a preto e branco de um ensaio de fluorometria com Tioflavina T utilizado para determinar os efeitos dependentes da dose de extrato de folhas de chá verde padronizado na inibição da formação de fibrilas amiloides Αβ 1-40 em doença de Alzheimer. FIGURA 3 é um gráfico a preto e branco de um ensaio de fluorometria com Tioflavina T utilizado para determinar os efeitos dependentes da dose de extrato de folhas de chá verde padronizado no desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides Αβ 1-42 pré-formadas em doença de Alzheimer. FIGURA 4 é um gráfico a preto e branco de um ensaio espetrofotométrico de Αβ com vermelho do Congo para determinar os efeitos de extrato de folhas de chá verde padronizado (de 2 fontes comerciais ) na desagregação de fibrilas Αβ 1-42 pré-formadas em doença de Alzheimer. FIGURA 5 é um gráfico a preto e branco de um ensaio de fluorometria com Tioflavina T utilizado para determinar os efeitos dependentes da dose de diferentes catequinas disponíveis no mercado na inibição da formação de fibrilas amiloides Αβ 1-40 em doença de Alzheimer. 36 FIGURA 6 é uma fotomicrografia a cores que demonstra a inibição da formação de fibrilas Αβ 1-40 em doença de Alzheimer por epicatequina. FIGURA 7 é um gráfico a preto e branco de um ensaio de fluorometria com Tioflavina T utilizado para determinar os efeitos dependentes da dose de catequinas disponíveis no mercado no desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides Αβ 1-42 pré-formadas em doença de Alzheimer. FIGURA 8 é um gráfico a preto e branco de um ensaio de fluorometria com Tioflavina T utilizado para determinar os efeitos dependentes da dose de diferentes catequinas disponíveis no mercado na inibição da formação de fibrilas de NAC em doença de Parkinson (também referidas como "NAC-P") . FIGURA 9 mostra fotomicrografias a preto e branco da deposição de amiloide no baço num modelo de ratinho de amiloidose AA experimental. FIGURA 10 mostra fotomicrografias a preto e branco da deposição de amiloide no fígado num modelo de ratinho de amiloidose AA experimental. FIGURA 11 é um gráfico que demonstra o efeito de compostos fenólicos específicos na destruição/desmantelamento de fibrilas amiloides pré-formadas consistindo em polipéptido amiloide dos ilhéus (IAPP). FIGURA 12 é um gráfico de espetroscopia de dicroísmo circular que demonstra a destruição da estrutura de folhas β em fibrilas amiloides Αβ 1-42 por epicatequina. 37 FIGURA 13 é um gráfico que demonstra a inibição de amiloide esplénico por epicatequina, mas não catequina hidratada, num modelo experimental de ratinho de amiloidose AA sistémica. FIGURA 14 mostra fotomicrografias a preto e branco da inibição da deposição de amiloide AA esplénico por epicatequina num modelo de ratinho de amiloidose AA sistémica. FIGURA 15 ilustra as estruturas de alguns dos compostos contendo aromáticos poli-hidroxilados concebidos para terem atividade antiamiloide.

MELHOR MODO DE IMPLEMENTAR A INVENÇÃO

Passando agora às Figuras e Exemplos, a invenção será descrita em formas de realização preferidas por referência pormenorizada àqueles.

Algumas Definições "Análogos e derivados farmaceuticamente aceitáveis". Análogos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de um composto reivindicado incluem várias substituições do tipo grupo R, e quaisquer outras modificações estruturais derivadas que não afetem a eficácia divulgada destes compostos. "Percentagem de Pureza". As composições divulgadas contêm uma ou mais catequinas ou derivados do chá verde, em que cada catequina ou derivado do chá verde está presente na composição numa proporção percentual ou percentagem de pureza que "excede significativamente" uma proporção 38 percentual da presença natural da mesma substância numa planta, ou num extrato da planta. Por exemplo, suponhamos que uma catequina particular está presente numa planta numa percentagem por peso de 0,01 por cento, e está presente num extrato da planta numa percentagem por peso de 1,0 por cento. Então, numa composição divulgada, a mesma catequina está presente na composição numa percentagem por peso que é significativamente maior do que 0,01 por cento ou 1,0 por cento, digamos 10 por cento. Seguindo esta linha, também podem ser aplicadas outras proporcionalidades, como percentagem da composição ou percentagem da presença por volume, ou percentagem de pureza. A titulo de outro exemplo, sem limitar o âmbito da invenção a este ou outros exemplos, uma catequina está presente num comprimido a ser distribuido oralmente de acordo com a divulgação aqui apresentada. A catequina é uma catequina isolada presente numa percentagem de pureza de 98,5% (isto é, a catequina é 98,5% pura, medido por indícios convencionais de pureza, tais como, por exemplo, a banda de pico abrupto isolada característica numa HPLC). No entanto, a catequina particular é um ingrediente do comprimido presente apenas a 15%. É conhecido que a catequina está presente numa planta numa percentagem de peso seco de 0,06, ao passo que é conhecido que certos extratos da mesma planta contêm até 0,75 por cento de peso seco da mesma catequina. Neste exemplo, a catequina está proporcionalmente mais presente no comprimido do que no extrato por uma razão de 20:1, e esta é uma medida que excede significativamente a presença em proporção percentual natural numa planta ou extrato da planta. 39

Em geral, uma catequina presente numa forma de dose administrada terapeuticamente que tem uma percentagem da catequina (por peso, peso seco, volume, ou pureza) que é 10 vezes (ou mais) maior do que a presença percentual natural da mesma catequina numa planta é uma percentagem que "excede significativamente" a presença percentual natural da catequina na planta. Neste contexto, ao falar de extratos de uma planta, deve notar-se que devem ser considerados apenas extratos convencionais ou naturais (sucos, concentrados e afins, ou extratos conhecidos e utilizados para outras finalidades), e não extratos novos, preparados após a data de prioridade desta divulgação, dos quais se pretende concentrar a catequina particular de modo a obter uma descoberta negativa de "excede significativamente", como acaba de ser definido. Também deve ser notado que, nalguns casos, pode ser justificada uma descoberta de "excede significativamente" com uma razão tão pequena quanto 2:1, mas mais preferivelmente tão grande quanto 50:1 até 100:1.

No exemplo de um composto de uma única catequina com um excipiente para perfazer a composição, pode ser conveniente meramente notar e comparar a percentagem de pureza do composto na composição, em vez da sua percentagem por peso global, para fins do padrão de "excede significativamente", como reivindicado. No caso de misturas de catequinas, pode ser apropriado considerar uma composição percentual combinada das catequinas misturadas na dosagem terapêutica, e comparar esse número com uma presença percentual combinada das mesmas catequinas na planta ou extrato natural. 40

Em qualquer caso, a finalidade do padrão de medição divulgado é fixar uma margem razoável pela qual uma composição reivindicada excede a leitura da ocorrência natural dos ingredientes ativos em plantas e extratos convencionais de plantas.

Composições preferidas conterão uma catequina que é pelo menos substancialmente pura. Também pode ser vantajosamente empregue uma catequina que está em forma isolada ou sintética substancialmente pura. Em geral, "puro" significa melhor do que 95% puro, e catequina "substancialmente pura" significa uma catequina purificada por extração, ou outros meios conhecidos ou meios divulgados aqui, de modo que a catequina está presente na dosagem terapêutica apenas com aquelas impurezas que não podem ser removidas de modo fácil ou razoável pelos processos de extração ou purificação. "Isolado" significa que a catequina em questão não está acompanhada, na forma terapêutica, de quantidades significativas de outras catequinas. Um composto "puro isolado" é um composto em forma purificada isolada tal como é convencional para ingredientes ativos na indústria farmacêutica.

Um Método de Cultura de Células para Gerar Amiloide AA

Alguns estudos anteriores indicam que a formação de amiloide AA pode ser obtida em sistemas de modelos de cultura de células (Shirahama et al., Lab. Invest. _62: 61-68, 1990; Palm et al., APMIS 105: 603-608, 1997; Kluve-Beckerman et al., Am. J. Path. 155: 123-133, 1999). Provavelmente, o melhor sistema de cultura de células onde produzir proteína amiloide AA fibrilar foi descrito por Kluve-Beckerman et al. (Am. J. Path. 155: 123-133, 1999). Neste sistema in vitro foram mantidos macrófagos 41 peritoneais murinos (isolados da cavidade peritoneal de ratinhos C57BL/6 normais), aos quais se adicionaram SAA2 recombinante (rSAA2) em meio de pH neutro, e/ou fator de reforço amiloide (AEF) (discutido em baixo) . 0 meio contendo SAA2 recombinante foi utilizado a uma concentração tipica da observada em soro na fase aguda (isto é, 140 pg/mL) . Num período de 24-48 horas após o tratamento, as culturas desenvolveram foci de depósitos de amiloide AA, que aumentaram e se tornaram cada vez mais congófilos e birrefringentes (após coloração com vermelho do Congo, visualizado à luz polarizada). Este estudo demonstrou que SAA2 foi clivado pelos macrófagos para formar proteína amiloide AA (fragmento de ~8,5 kDa) em cultura, que era fibrilar (demonstrado por birrefringência com vermelho do Congo e fluorescência com Tioflavina S positivas).

Verificou-se que as células peritoneais eram viáveis (determinado por exclusão de coloração com azul de tripano) e mantiveram atividade de fagocitose (mostrado pela fagocitose de esférulas de latex). Adicionalmente, culturas de células peritoneais obtidas de ratinhos nus demonstraram formação e deposição de amiloide semelhantes em cultura, indicando que linfócitos T não foram essenciais para a formação de fibrilas amiloides.

Apesar de o AEF não ser requerido, a sua adição ao meio de cultura resultou em depósitos amiloides maiores e mais numerosos. Também foi observada uma quantidade maior de deposição de amiloide AA fibrilar em cultura quando as culturas foram tratadas com pepstatina, um inibidor de proteases aspárticas (Kluve-Beckerman et al., Am. J. Path. 155: 123-133, 1999). Estas culturas também mantiveram uma viabilidade semelhante à de culturas não tratadas, mesmo durante um período tão longo quanto 24 dias. As culturas 42 tratadas com pepstatina desenvolveram grandes áreas de massas densas e localizadas de amiloide associadas a agregados celulares.

Este sistema de cultura de células é fácil de empregar e propenso a manipulação para o desenvolvimento de deposição e persistência de amiloide AA in vitro.

Um Modelo Relevante de Ratinho de Amiloidose AA Experimental

Existem alguns modelos animais experimentais bons para a produção de amiloidose AA sistémica in vivo. Estudos anteriores envolvendo injeções repetidas de azocaseina (derivado da caseína) demonstraram que a acumulação de depósitos amiloides AA em baço, fígado e rim ocorreu num período de 14-21 dias após o tratamento (Janigan e Druet, Am. J. Path _48_: 1013-1024, 1966) . Neste modelo, a injeção da azocaseina resultou num abcesso estéril que causou uma reação inflamatória, induzindo níveis elevados no soro de SAA no ratinho (Kindy e DeBeer, Methods Enzym. 30 9: 701-716, 1999). Os depósitos amiloides AA eram fibrilares, indicado pela sua coloração positiva com vermelho do Congo (isto é, birrefringência vermelha/verde, visualizada à luz polarizada).

Em modelos animais mais recentes, a deposição sistémica de amiloide AA pode ser induzida rapidamente em ratinhos CBA/J após uma única injeção subcutânea de 2% nitrato de prata (o estímulo inflamatório) mais uma única injeção intravenosa de fator de reforço amiloide (AEF) (discutido em baixo). Neste modelo, a deposição de amiloide AA ocorre primeiramente no baço (num período de 24-48 horas), depois no fígado (num período de 3-4 dias) , seguido do rim (5-7 43 dias) (Axelrad et al., Am. J. Path. 7_8: 277-284, 1975;

Kisilevsky et al., Lab. Invest. 3_7: 544-553, 1977).

Utilizámos previamente este modelo de modo extenso para estudar o desenvolvimento de amiloidose AA e o papel que proteoglicanos/glicosaminoglicanos específicos desempenham na formação de amiloide (Kisilevsky et al., Appl. Path. 2: 308-315, 1984; Snow et al., Lab. Invest. 5_3: 37-44, 1985; Lab. Invest. 56: 665-675, 1987; Lab. Invest. 57: 687-698, 1987; J. Histochem. Cytochem. 39: 1321-1330, 1991) . Este modelo experimental relevante já está a ser usado e é especificamente utilizado para identificar e testar a eficácia de terapêuticos potenciais para amiloide AA, como descrito em baixo. O modelo experimental de ratinho CBA/J (descrito em baixo) é um sistema ideal para testar a eficácia de terapêuticos potenciais para amiloide AA uma vez que, após um estimulo inflamatório (isto é, nitrato de prata) e AEF, 100% dos animais testados depositarão amiloide em tecidos num periodo de alguns dias. Não obstante apenas uma pequena percentagem de pacientes com proteínas precursoras desenvolverem realmente amiloide, todos os animais neste modelo experimental o fazem. A reação inflamatória em ratinhos CBA/J, ao contrário de artrite reumatoide ou osteomielite, por exemplo, conduz ao aparecimento de todos os pré-requisitos para a ocorrência de deposição de amiloide. O AEF encurta dramaticamente o tempo necessário para a indução experimental da deposição de amiloide AA em ratinhos CBA/J e pode ser demonstrada em tecidos 24-48 antes do aparecimento de amiloide (Axelrad et al., Lab. Invest. 47: 139-146, 1982). Apesar de a identidade real do 44 AEF não ter sido completamente resolvida, crê-se ter natureza genericamente proteica (Axelrad et al., Lab. Invest. 41_: 139-146, 1982) , ou consistir num pequeno ninho de material do tipo fibrilas amiloides que contém folhas β abundantes (Kisilevsky et al., Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 6_: 98-106, 1999) . O AEF é habitualmente preparado a partir de baços e/ou figados cheios de amiloide de animais previamente induzidos para acumulação de amiloide AA após injeções diárias de azocaseina ou injeções únicas de AEF e nitrato de prata. Estes tecidos amiloidóticos são homogeneizados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo inibidores de proteases, e o grânulo é homogeneizado de novo algumas vezes. O segundo até quarto sobrenadantes (obtidos após extrações com água) contêm geralmente atividade de AEF potente, que é utilizada para induzir rapidamente deposição de AA em animais. A descoberta e identificação de novos compostos ou agentes como agentes terapêuticos potenciais para travar a formação, deposição, acumulação e/ou persistência de amiloide fibrilar amiloide que ocorrem em doença de Alzheimer, amiloidose AA sistémica, diabetes do tipo 2 e outras amiloidoses, e fibrilogénese em doença de corpos de Lewy, doença de Parkinson, e atrofia de múltiplos sistemas, são desesperadamente procuradas.

Utilização de Catequinas, Bioflavanoides, Flavanóis, Flavanodióis, Flavanoides, Taninos (ou derivados de quaisquer destes) de Chá Verde, Folhas de Chá Verde, Extratos de Chá Verde ou Derivados de Chá Verde, ou de Outras Fontes Naturais ou Sintéticas É conhecido que chá verde e outras fontes naturais, como chá preto e vinho, contêm catequinas, bioflavanoides, 45 flavanóis, flavanodióis, flavanoides, taninos ou derivados destes. Ver Sugita-Konishi et al., "Epigallocatechin gallate and gallocatechin gallate in green tea catechins inhibit extracellular release of Vero toxin from enterohemorrhagic E. coli", Biochemica et Biophysica Acta, 1472, 42-50 (1999), e Fernandez et al., "HPLC determination of catechins and caffeine in tea", Analyst 125: 421-425 (2000). Cremos agora que estes constituintes desempenham um papel significativo nos efeitos surpreendentemente benéficos do chá verde em amiloidoses, como discutido em baixo.

Em particular, cremos agora que as catequinas do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e/ou galhato de epicatequina, ou um derivado de um do grupo acima, são eficazes, isoladamente ou em combinação com outros ingredientes inibidores de amiloide, como qualquer matéria vegetal do grupo de plantas que consistem e são habitualmente conhecidas como Unha de Gato, gingko biloba, rosmaninho, gotu kola, bacopin, e ginseng, para se obterem quaisquer ou a totalidade dos efeitos benéficos descritos em baixo.

Estruturas gerais de catequinas representativas estão apresentadas na Figura 1. É esperado que análogos e derivados farmaceuticamente aceitáveis destas estruturas de catequinas, tais como, por exemplo, várias substituições do tipo grupo R, e outras modificações estruturais derivadas que não afetem a eficácia divulgada destes compostos, possam ser preparados sem afetar o âmbito das reivindicações adjuntas. 46

Utilização de Extrato de Folhas de Chá Verde Padronizado para Inibir Amiloidose

Todos os Exemplos ilustrados em baixo servem bem para estabelecer que, pelo menos in vitro, chá verde, folhas e extratos de chá verde, ou seus derivados, têm a capacidade para inibir a formação de depósitos amiloides no cérebro que ocorrem durante o envelhecimento normal e numa variedade de perturbações do cérebro, incluindo doença de Alzheimer. Adicionalmente, é conhecido que pacientes que acumulam depósitos amiloides no cérebro acabam por perder capacidade cognitiva e função da memória e mantêm uma redução acentuada da clareza mental em geral. Em consequência, segue-se que a inibição desses depósitos amiloides no cérebro irá pelo menos promover um estado de alerta mental nesses pacientes.

Os Exemplos também estabelecem que, novamente, pelo menos in vitro, chá verde, folhas e extratos de chá verde, ou seus derivados, têm a capacidade para reduzir, eliminar, prevenir, inibir, destruir/dissolver, ou desagregar depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, bem como a formação de fibrilas amiloides, ou formação de fibrilas amiloides associadas à idade, e formação de fibrilas amiloides associadas ao cérebro. Adicionalmente, é conhecido que pacientes que acumulam depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas associadas ao cérebro ou depósitos de proteínas amiloides associados ao cérebro, ou que exibem sintomas de formação e crescimento de fibrilas amiloides ou formação e crescimento de fibrilas amiloides associados à idade, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao cérebro, em geral acabarão por perder acuidade mental, estado de alerta mental, concentração, bem-estar cognitivo, ou alguma medida da 47 função cerebral ou capacidade cognitiva, desempenho mental ou memória, ou concentração e perspicácia mental, ou vitalidade mental, ou clareza e estado de alerta mentais, memória de curto prazo, ou alguma das capacidades de aprender e recordar. Também é conhecido que esses pacientes estão sujeitos a declínio cognitivo ou da memória associado ou relacionado com a idade, ou manterão uma redução acentuada da clareza mental.

Segue-se então que a inibição, redução, eliminação, prevenção, destruição, desmantelamento ou desagregação desses depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas amiloides associados ao cérebro ou depósitos de proteínas amiloides associados ao cérebro, ou formação e crescimento de fibrilas amiloides, ou formação e crescimento de fibrilas amiloides associados à idade, irão melhorar a acuidade mental, promover o estado de alerta mental, proporcionar suporte nutricional para declínio cognitivo ou da memória relacionado com a idade, promover o bem-estar cognitivo, suportar a função cerebral, melhorar a capacidade cognitiva, desempenho mental ou memória, promover a concentração e perspicácia mental, melhorar a vitalidade mental, promover maior clareza e estado de alerta mentais, melhorar a memória de curto prazo, reduzir ou inverter o declínio cognitivo ou da memória associado à idade, suportar uma função cerebral normal, intensificar a aprendizagem ou memória; melhorar a concentração, intensificar o desempenho mental, reduzir o declínio mental, reduzir a probabilidade de ocorrência de perturbações cerebrais relacionadas com a idade, e manter uma boa saúde mental, nesses pacientes. 48

Os Exemplos também sugerem que chá verde, folhas e extratos de chá verde, ou respetivos derivados, devem ter a capacidade para reduzir, eliminar, prevenir, inibir, destruir, dissolver, desmantelar, desagregar depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides associados ao pâncreas, bem como a formação e crescimento de fibrilas amiloides, e formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao pâncreas. Adicionalmente, é conhecido que pacientes que acumulam depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides associados ao pâncreas, ou que exibem sintomas de formação e crescimento de fibrilas amiloides, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, em geral perdem uma função pancreática saudável ou mantêm uma redução da função normal da insulina, conduzindo a perda ou redução da função pancreática. Em consequência, segue-se que a inibição, redução, eliminação, prevenção, destruição, desmantelamento, dissolução ou desagregação desses depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides, depósitos de fibrilas ou proteínas amiloides associados ao pâncreas, ou formação e crescimento de fibrilas amiloides, formação e crescimento de fibrilas amiloides associados ao pâncreas, irão suportar uma função pancreática saudável e promover a função pancreática ao ajudar a promover uma função normal da insulina nesses pacientes.

Estudos recentes, publicados após a data de prioridade deste requerimento, suportam agora estes resultados experimentais. Ver Hasegawa, "Preventive effect of Japanese green tea against cognitive impairment in the elderly", posters 42 e 755, Proceedings of World Alzheimer Congress 2000, em Neurobiology of Aging, 21: 18 (2000), relatando 49 uma relação estatisticamente significativa entre bebida aumentada de chá verde e niveis cognitivos mais elevados.

EXEMPLOS

Apresentam-se os exemplos seguintes de modo a fornecer aos profissionais a divulgação e descrição e utilização de extrato de chá verde e catequinas disponíveis no mercado que, surpreendentemente, se verifica causarem uma inibição, desmantelamento/destruição e/ou desagregação de fibrilas contendo Αβ em doença de Alzheimer, e fibrilas de NAC em doença de Parkinson. No entanto, não deve ser considerado que a invenção está limitada a estes exemplos específicos.

Exemplo 1

Extrato de Folhas de Chá Verde Padronizado é um Inibidor Potente da Formação de Fibrilas Amiloides Αβ (1-40) em

Doença de Alzheimer

Um método previamente descrito de medição da formação de fibrilas amiloides utilizando fluorometria com Tioflavina T (H Naiki et al., Lab. Invest. 65_: 104-110, 1991; H Levine III, Protein Sei. 2: 404-410, 1993; H Levine III, Amyloid:

Int. J. Exp. Clin. Invest. 2_: 1-6, 1995; H Naiki e K.

Nakakuki, Lab. Invest. IA'· 374-383, 1996) foi inicialmente empregue para identificar se extrato de folhas de chá verde padronizado era capaz de inibir a formação de fibrilas amiloides Αβ em doença de Alzheimer. Utilizando este ensaio sensivel foi previamente mostrado que quaisquer decréscimos ou aumentos da fluorescência estão correlacionados com um decréscimo ou aumento da quantidade de fibrilas amiloides (H Naiki et al., Lab. Invest. _65_: 104-110, 1991; H Levine III, Protein Sei. 2: 404-410, 1993; H Levine III, Amyloid:

Int. J. Exp. Clin. Invest. 2: 1-6, 1995; H Naiki e K.

Nakakuki, Lab. Invest. 74: 374-383, 1996), permitindo 50 determinar os efeitos de inibidores e/ou intensificadores potenciais da formação de fibrilas amiloides.

Num primeiro estudo, os efeitos de extrato de chá verde padronizado como agente inibidor potente de amiloide em doença de Alzheimer na formação de fibrilas Αβ (1-40) em doença de Alzheimer foram avaliados por fluorometria com Tioflavina T. É conhecido que a Tioflavina T se liga a proteínas amiloides fibrilares, e um aumento da fluorescência está correlacionado com um aumento da formação de fibrilas amiloides, ao passo que um decréscimo da fluorescência está correlacionado com um decréscimo da formação de fibrilas amiloides. A proteína Αβ (1-40) em doença de Alzheimer, quando incubada a 37°C, tende a formar espontaneamente fibrilas amiloides cuja quantidade aumenta ao longo do tempo. Neste estudo, testámos o extrato de chá verde padronizado para inibir a formação de fibrilas pela proteína Αβ amiloide em doença de Alzheimer durante um

período de 1 semana. Para este estudo, 25 μΜ de Αβ (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EUA; Lote # WM365) foi incubado em tubos de microcentrífuga a 37°C durante 1 semana (em triplicado), isoladamente ou na presença de 10 yg/mL, 50 yg/mL ou 100 yg/mL de extrato de chá verde padronizado em 150 mM Tris HC1, 10 mM NaCl, pH 7,0 (TBS) . Para este estudo, o pó de uma cápsula de gelatina de extrato de chá verde padronizado obtido de uma fonte comercial (Nature's Resource, Mission Hills, CA) foi extraído em 1 mL de água destilada e transformado em grânulo utilizando uma microcentrí fuga (durante 10 minutos a 2 500X g) . O sobrenadante foi então recolhido e liofilizado. Depois preparou-se uma solução de trabalho a 1 mg/mL, para utilização nos ensaios in vitro descritos em baixo, utilizando água destilada. Os extratos de folhas de chá 51 verde comerciais são habitualmente padronizados para 50% de polifenóis.

Para avaliar os efeitos do extrato de chá verde padronizado na formação de fibrilas de Αβ (1-40), aliquotas de 50 yL foram recolhidas de cada tubo para análise à 1 hora, 1 dia, 3 dias e 1 semana. Para cada determinação descrita acima, após cada período de incubação, 50 yL de Αβ +/- extrato de chá verde padronizado foram adicionados a 1,2 mL de 100 yM Tioflavina T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 50 mM NaP04 (pH 6,0). Os estudos indicaram que concentrações crescentes de Αβ fibrilar originaram um aumento proporcional da fluorescência na presença de 100 yM Tioflavina T, desse modo excluindo a presença de quaisquer efeitos de filtros internos desproporcionados nestes estudos. A emissão da fluorescência a 482 nm foi medida num fluorómetro da Turner Instrument modelo 450 a um comprimento de onda de excitação de 450 nm. Para cada determinação, o fluorómetro foi calibrado fixando o zero na presença do reagente de Tioflavina T isoladamente, e fixando os 50 ng/mL de riboflavina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) no reagente de Tioflavina T em 1800 unidades de fluorescência. Todas as determinações da fluorescência basearam-se nestas referências, e qualquer fluorescência exibida por qualquer dos compostos na presença do reagente de Tioflavina T foi sempre subtraída de todas as leituras pertinentes.

Para todos os estudos de fibrilogénese utilizando fluorometria com Tioflavina T, como divulgado aqui, as comparações de proteína amiloide na presença ou ausência de extrato de chá verde padronizado basearam-se em testes t de Student emparelhados, com dados apresentados na forma de 52 média +/- desvio padrão. A significância foi relatada aos niveis de confiança de 95% (p < 0,05), 99% (p < 0,01) e 99, 5% (p < 0,005) .

Como mostrado na Figura 2, os efeitos do extrato de chá verde padronizado na formação de fibrilas amiloides Αβ (1-40) em doença de Alzheimer foram avaliados durante um periodo de incubação de 1 semana. Αβ (1-40) isoladamente suspenso de fresco, após uma incubação de 1 hora a 37°C, demonstrou uma fluorescência inicial de 183 +/- 10 unidades de fluorescência. Durante o periodo de incubação de 1 semana ocorreu um aumento gradual da fluorescência de Αβ (1-40) isoladamente, aumentando aproximadamente 4 vezes desde 1 hora até 1 dia, com uma fluorescência de pico de 852 +/- 3 unidades de fluorescência observada no dia 1 (Figura 2), consistente com estudos prévios (Castillo et ai., J. Neurochem. 6_9: 2452-2465, 1997). O extrato de chá verde padronizado inibiu significativamente a formação de fibrilas amiloides Αβ (1-40), de um modo dependente da dose, logo à 1 hora de incubação (Figura 2) . Observou-se inibição significativa (p < 0,005), por extrato de folhas de chá verde padronizado, da formação de fibrilas amiloides Αβ 1-40 em todos os instantes, incluindo 1 hora, 1 dia, 3 dias e 1 semana (Figura 2). À 1 hora, 10 yg/mL, 50 yg/mL e 100 yg/mL de extrato de folhas de chá verde padronizado inibiram significativamente (p < 0,005) a formação de fibrilas de Αβ 1-40 em 50,3 +/- 3,3%, 66,1 +/- 3,3% e 95,1 + /- 1,6%, respetivamente. No dia 1, 10 yg/mL, 50 yg/mL e 100 yg/mL de extrato de folhas de chá verde padronizado inibiram significativamente (p < 0,005) a formação de fibrilas de Αβ 1-40 em 36,7 +/- 2,0%, 90,7 +/- 1,0% e 95,9 + /- 2,0%, respetivamente. À 1 semana, 10 yg/mL, 50 yg/mL e 100 yg/mL de extrato de folhas de chá verde padronizado 53 inibiram significativamente (p < 0,005) a formação de fibrilas de Αβ 1-40 em 58,9 +/- 10,7%, 83,0 +/- 1,8% e 89,3 + /- 2,1%, respetivamente. Estes dados iniciais indicaram que o extrato de chá verde padronizado e pelo menos um dos seus constituintes ativos de catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides ou taninos foram inibidores potentes da formação de fibrilas amiloides em doença de Alzheimer.

Exemplo 2

Desmantelamento/Destruição de Fibrilas Amiloides de Αβ 1-42 em Doença de Alzheimer por Extrato de Folhas de Chá Verde

Padronizado

No estudo seguinte, extrato de folhas de chá verde padronizado foi testado quanto à sua capacidade para causar um desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides pré-formadas em doença de Alzheimer contendo Αβ 1-42. Este tipo de atividade é importante para qualquer composto antiamiloide potencial que possa ser utilizado em pacientes que já exibam deposição substancial de amiloide em órgãos e/ou tecidos. Por exemplo, pacientes com doença de Alzheimer com doença em fase intermédia-tardia têm abundantes depósitos de amiloide contendo Αβ nos seus cérebros, como parte de placas neuriticas e depósitos amiloides cerebrovasculares. Um composto capaz de causar desmantelamento/destruição de depósitos amiloides pré-existentes será vantajoso para utilização nestes pacientes que estão em fases mais tardias do processo de doença.

Para este estudo, 1 mg de Αβ 1-42 (Bachem Inc., Torrance, CA, EUA; Lote # 516817) foi dissolvido em 1,0 mL de água duplamente destilada (solução 1 mg/mL). Em seguida, 25 μΜ de Αβ 1-42 foi incubado durante a noite (—18 horas) a 37°C, 54 na ausência ou presença de 10 yg/mL, 100 yg/mL ou 200 yg/mL de extrato de folhas de chá verde padronizado na presença de 150 mM Tris HC1, 10 mM NaCl (pH 7,0) com 0,02% azida de sódio. Nestes estudos, (ver resultados descritos em baixo e na Figura 3), a razão de pesos Αβ l-42:extrato de chá verde foi 1:0, 1:1 e 1:2, respetivamente.

Para este estudo, o pó de uma cápsula de gelatina de extrato de chá verde padronizado obtido de uma fonte comercial (Nature's Resource, Mission Hills, CA) foi extraído em 1 mL de água destilada e transformado em grânulo utilizando uma microcentrífuga (durante 10 minutos a 2 500X g). O sobrenadante foi então recolhido e liofilizado. Depois preparou-se uma solução de trabalho a 1 mg/mL, para utilização nos ensaios in vitro descritos em baixo, utilizando água destilada. Os extratos de folhas de chá verde comerciais são habitualmente padronizados para 50% de polifenóis.

Um método previamente descrito de medição da formação de fibrilas amiloides utilizando fluorometria com Tioflavina T (H Naiki et al., Lab. Invest. j%5: 104-110, 1991; H Levine III, Protein Sei. 2_: 404-410, 1993; H Levine III, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2_: 1-6, 1995; H Naiki e K. Nakakuki, Lab. Invest. 14_: 374-383, 1996) foi empregue para avaliar se extrato de folhas de chá verde padronizado é capaz de causar um desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides Αβ 1-42 em doença de Alzheimer. É conhecido que a Tioflavina T se liga a proteínas amiloides fibrilares, e um aumento da fluorescência está correlacionado com um aumento da formação de fibrilas amiloides, ao passo que um decréscimo da fluorescência está correlacionado com um decréscimo de fibrilas amiloides devido a desmantelamento 55 e/ou destruição. A proteína Αβ (1-42) em doença de Alzheimer, quando colocada em solução, como água destilada, tende a formar espontaneamente fibrilas amiloides. Utilizando este ensaio sensivel foi previamente mostrado que quaisquer decréscimos ou aumentos da fluorescência estão correlacionados com um decréscimo ou aumento da quantidade de fibrilas amiloides (H Naiki et ai., Lab. Invest. _65: 104-110, 1991; H Levine III, Protein Sei. 2: 404-410, 1993; H Levine III, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2: 1-6, 1995; H Naiki e K. Nakakuki, Lab. Invest. 74: 374-383, 1996), permitindo identificar e quantificar a extensão de inibidores e/ou intensificadores potenciais de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 em doença de Alzheimer.

Para avaliar os efeitos do extrato de chá verde padronizado no desmantelamento/destruição potenciais de fibrilas de Αβ 1-42 pré-formadas, 50 pL de Αβ 1-42 +/-extrato de folhas de chá verde padronizado, a várias concentrações (descritas acima), foram adicionados a 1,2 mL de 100 μΜ Tioflavina T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 50 mM NaP04 (pH 6,0) para leituras de fluorometria (como descrito no Exemplo 1).

Como mostrado na Figura 3, quantidades crescentes de extrato de chá verde padronizado causaram um desmantelamento/destruição dependente da dose de fibrilas pré-formadas de Αβ 1-42 em doença de Alzheimer. Αβ 1-42 isoladamente demonstrou uma fluorescência média de 780 +/-50 unidades de fluorescência (Figura 3) . O extrato de chá verde padronizado a 10 pg/mL causou significativamente (p < 0,05) um desmantelamento/destruição de fibrilas de Αβ 1-42 em 17 + 7%. Por outro lado, 100 pg/mL e 200 pg/mL causaram significativamente (p < 0,005) um desmantelamento/ destruição de fibrilas de Αβ 1-42 em 76 +/- 1,0% e 85 +/- 56 4,0%, respetivamente. Este estudo demonstrou que extrato de chá verde padronizado e pelo menos um dos seus constituintes ativos de catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides ou taninos causaram desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 pré-formadas e foram eficazes de um modo dependente da dose.

Exemplo 3

Desagregação de Fibrilas de Αβ 1-42 em Doença de Alzheimer por Extrato de Folhas de Chá Verde Padronizado

No estudo seguinte, um ensaio espetrofotométrico de Αβ com vermelho do Congo (Klunk et al., Anal. Biochem. 266: 66-76, 1999) foi modificado para determinar a eficácia de extrato de folhas de chá verde padronizado na desagregação de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 em doença de Alzheimer. Para este ensaio, 25 μΜ de Αβ 1-42 (Bachem Inc., Torrance CA, Lote # 516817) foi incubado em triplicado durante 4 dias em água destilada a 37°C, na ausência ou presença de 400 pg/mL de extrato de chá verde padronizado (obtido de duas fontes comerciais) em solução salina tamponada com Tris (TBS) (100 mM Tris; 50 mM NaCl; pH 7,0, com 0,02% azida de sódio) . A razão de pesos Αβ:extrato de chá verde foi 1:4. A fonte 1 do extrato de chá verde padronizado utilizado neste estudo proveio da Sundown Herbals (fabricado e distribuído para a Sundown Vitamins, Boca Raton, Fl), ao passo que a fonte 2 do extrato de chá verde padronizado utilizado neste estudo proveio da Nature's Resource (Mission Hills, CA). O chá verde utilizado neste estudo foi extraído em água destilada como descrito nos Exemplos 1 e 2.

Após incubação de Αβ 1-42 na presença ou ausência de extratos de chá verde padronizados (como descrito acima) 57 (os extratos de chá verde padronizados das 2 fontes são referidos como compostos de teste) , 50 pL de 360 μΜ de vermelho do Congo (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) em água destilada foram então adicionados a 250 pL de cada mistura de incubação, originando uma razão molar final de Αβ:vermelho do Congo de 1:3. Passados 10 minutos determinou-se a absorvância a 405 nm (comprimento de onda de referência, para dar conta da absorvância do vermelho do Congo isoladamente a 540 nm) e 540 nm (absorvância da amostra, em que "amostra" se refere a Αβ isoladamente, composto de teste isoladamente, ou Αβ + composto de teste, todos na presença de vermelho do Congo) utilizando um Leitor de Placas de ELISA Biorad Modelo 550 (Biorad, Hercules, CA, EUA). A absorvância ao comprimento de onda de 405 nm foi automaticamente subtraída, pelo leitor de placas de ELISA, da absorvância ao comprimento de onda de 540 nm (a diferença é referida como Δ absorvância) (Klunk et ai., Anal. Biochem. 266: 66-76, 1999). Em consequência, a leitura da Δ absorvância a 540 nm foi proporcional à quantidade de Αβ agregada restante em solução (Klunk et ai., Anal. Biochem. 266: 66-76, 1999).

Para todas as experiências envolvendo compostos de teste, a leitura da Δ absorvância a 540 nm do composto de teste isoladamente (na ausência de Αβ) foi sempre subtraída da leitura da Δ absorvância correspondente a 540 nm do composto de teste na presença de Αβ.

Utilizando esta modificação do método de Klunk et ai. (Anal. Biochem. 266: 66-76, 1999), a utilização de uma maior concentração final de vermelho do Congo (isto é, 60 μΜ em vez de 14 μΜ) (Anal. Biochem. 2 66: 66-76, 1999) na 58 presença de Αβ fibrilar originou uma absorvância global a 540 nm que foi sempre inferior a 1,0 Unidades de Absorvância (AU), e bem dentro do intervalo de absorvância linear.

Testaram-se extratos de folhas de chá verde padronizados de duas fontes comerciais utilizando o ensaio espetrofotométrico de Αβ com vermelho do Congo descrito acima para determinar a sua eficácia na desagregação de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 em doença de Alzheimer.

Como mostrado na Figura 4, ambos os extratos de chá verde padronizados disponíveis no mercado causaram uma desagregação de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 pré-agregadas, determinado utilizando o ensaio espetrofotométrico com vermelho do Congo descrito acima. Αβ 1-40 isoladamente demonstrou uma Δ absorvância média de 0,141 +/- 0,013 AU (Figura 4) . O extrato de chá verde padronizado da fonte 1 (Sundown Herbals) causou uma desagregação significativa (p < 0,005) de 52,5 +/- 8,5% de 25 μΜ fibrilas de Αβ 1-42 quando incubado a uma razão de pesos de Αβ l-42:extrato de chá verde de 1:4 (Figura 4) . Por outro lado, o extrato de chá verde padronizado da fonte 2 (Nature's Resource) causou uma desagregação significativa (p < 0,005) de 63,8 +/- 4,2% de 25 μΜ fibrilas de Αβ 1-42 quando incubado a uma razão de pesos de Αβ 1-42:extrato de chá verde de 1:4 (Figura 4) . Assim, independentemente da fonte, extrato de folhas de chá verde padronizado e pelo menos um dos seus constituintes ativos de catequinas, bioflavanoides, flavanóis, flavanodióis, flavanoides ou taninos foram desagregadores potentes de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 em doença de Alzheimer. 59

Exemplo 4

Catequlnas são Inibidores Potentes da Formação de Fibrilas Amiloides de Αβ (1-40) em Doença de Alzheimer

Um método previamente descrito de medição da formação de fibrilas amiloides utilizando fluorometria com Tioflavina T (H Naiki et al.r Lab. Invest. U5: 104-110, 1991; H Levine III, Protein Sei. 2: 404-410, 1993; H Levine III, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2: 1-6, 1995; H Naiki e K. Nakakuki, Lab. Invest. 7_4: 374-383, 1996) foi empregue inicialmente para identificar se extrato de folhas de chá verde padronizado era capaz de inibir a formação de fibrilas amiloides de Αβ em doença de Alzheimer.

Num primeiro estudo avaliaram-se os efeitos de catequinas disponíveis no mercado como agente inibidor potente de amiloide em doença de Alzheimer na formação de fibrilas de Αβ (1-40) em doença de Alzheimer por fluorometria com Tioflavina T. A proteína Αβ (1-40) em doença de Alzheimer, quando incubada a 37°C, tende a formar espontaneamente fibrilas amiloides cuja quantidade aumenta ao longo do tempo. Neste estudo testámos a capacidade de catequinas para inibirem a formação de fibrilas pela proteína Αβ amiloide em doença de Alzheimer durante um período de 1 semana. Para este estudo, 125 μΜ de Αβ (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EUA) foi incubado em tubos de microcentrífuga a 37°C durante 1 semana (em triplicado), isoladamente ou na presença de catequinas de diferentes fontes comerciais, incluindo Epicatequina (ICN Pharmaceuticals Inc., Costa Mesa, CA), Epicatequina (Aldrich, St. Louis, MO), Catequina hidratada (Fluka Chemica-Biochemika, Ronkonkoma, Nova Iorque) e Catequina (Aldrich, St. Louis, MO) em 50 mM Tris HC1, 50 mM NaCl, pH 7,0 (TBS). Testaram-se quantidades crescentes de catequinas (como descrito acima) incluindo 60 Aβ:catequina a uma razão peso/peso de 1:1, 1:0,1, 1:0,01 e 1:0,001, para determinar se as catequinas exerceram uma inibição dependente da dose da formação de fibrilas de Αβ 1-40.

Para avaliar os efeitos de catequinas na formação de fibrilas de Αβ (1-40), aliquotas foram recolhidas de cada tubo para análise aos 0, 3 dias e 7 dias. Para cada determinação descrita acima, após cada periodo de incubação, 10 yL de Αβ +/- catequinas foram adicionados a 1,2 mL de 100 μΜ Tioflavina T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 50 mM NaP04 (pH 6,0). Os estudos indicaram que concentrações crescentes de Αβ fibrilar originaram um aumento proporcional da fluorescência na presença de 100 μΜ Tioflavina T, desse modo excluindo a presença de quaisquer efeitos de filtros internos desproporcionados nestes estudos. A emissão da fluorescência a 482 nm foi medida num fluorómetro da Turner Instrument modelo 450 a um comprimento de onda de excitação de 450 nm. Para cada determinação, o fluorómetro foi calibrado fixando o zero na presença do reagente de Tioflavina T isoladamente, e fixando os 50 ng/mL de riboflavina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) no reagente de Tioflavina T em 1800 unidades de fluorescência. Todas as determinações da fluorescência basearam-se nestas referências, e qualquer fluorescência exibida por qualquer dos compostos na presença do reagente de Tioflavina T foi sempre subtraida de todas as leituras.

Para todos os estudos de fibrilogénese utilizando fluorometria com Tioflavina T, como divulgado aqui, as comparações de proteina amiloide na presença ou ausência de catequinas basearam-se em testes t de Student emparelhados, com dados apresentados na forma de média +/- desvio padrão. 61 A significância foi relatada aos níveis de confiança de 95% (p < 0,05), 99% (p < 0,01) e 99,5% (p < 0,005).

Os efeitos de catequinas disponíveis no mercado na formação de fibrilas amiloides Αβ (1-40) em doença de Alzheimer foram avaliados durante um período de incubação de 1 semana. Durante o período de incubação de 1 semana ocorreu um aumento gradual da fluorescência de Αβ (1-40) isoladamente, com uma fluorescência de pico de 450 + /- 46 unidades de fluorescência observada aos 7 dias (Figura 5), consistente com estudos anteriores (Castillo et al., J. Neurochem. 6_9: 2452-2465, 1997). Todos de entre epicatequina (da ICN e Aldrich), catequina hidratada e catequina inibiram a formação de fibrilas amiloides de Αβ (1-40) de um modo dependente da dose, e significativamente (p < 0,01) a razões de peso de Aβ:catequina de 1:1 e 1:0,1 (Figura 5). Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina (ICN) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 85%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,1 de Αβ:epicatequina (ICN) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 67%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 86%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,1 de Αβ:epicatequina (ICN) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 62%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:catequina hidratada (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 88%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,1 de Αβ:catequina (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 62%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:catequina (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 85%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,1 de Αβ:catequina (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de Αβ em 66%. Estes dados iniciais indicaram que catequinas, incluindo epicatequina, catequina hidratada e catequina, 62 foram inibidores potentes da formação de fibrilas amiloides em doença de Alzheimer.

Exemplo 5

Inibição da Formação de Fibrilas Amiloides de Αβ por Catequinas Demonstrada por uma Redução da Birrefringência com vermelho do Congo A inibição da formação de fibrilas de Αβ 1-40 por catequinas foi confirmada por uma perda da birrefringência com vermelho do Congo, demonstrada em ensaios de coloração com vermelho do Congo (Figura 6). Nestes estudos, aliquotas de 125 μΜ Αβ isoladamente, ou Αβ + catequinas foram incubadas durante 1 semana a 37°C, e depois foram colocadas em lâminas revestidas com gelatina, foram secas ao ar durante a noite e coradas com vermelho do Congo. Foi exibida uma redução acentuada da birrefringência com vermelho do Congo (visualizada à luz polarizada) na presença de epicatequina (ICN) (como exemplo) (Figura 6) a uma razão de pesos de Αβ:epicatequina de 1:0,5 (Fig. 6B) e, em menor extensão, a uma razão de pesos de Αβ:epicatequina de 1:0,05 (Fig. 6C). A Figura 6A demonstra a coloração com vermelho do Congo de depósitos amiloides de Αβ após incubação de 125 μΜ de Αβ 1-40 a 37°C durante 1 semana isoladamente. Este estudo demonstrou que catequinas, como epicatequina, foram inibidores potentes da formação de fibrilas amiloides de Αβ.

Exemplo 6

Desmantelamento/Destruição de Fibrilas Amiloides de Αβ 1-42 em Doença de Alzheimer por Catequinas

No estudo seguinte testaram-se catequinas disponíveis no mercado quanto à sua capacidade para causar um desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides pré- 63 formadas em doença de Alzheimer contendo Αβ 1-42. Este tipo de atividade é importante para qualquer composto antiamiloide potencial que possa ser utilizado em pacientes que já exibam uma deposição substancial de amiloide em órgãos e/ou tecidos. Por exemplo, pacientes com doença de Alzheimer com doença em fase intermédia-tardia têm abundantes depósitos de amiloide contendo Αβ nos seus cérebros, como parte de placas neuriticas e depósitos amiloides cerebrovasculares. Um composto capaz de causar desmantelamento/destruição de depósitos amiloides pré-existentes será vantajoso para utilização nestes pacientes que estão em fases mais tardias do processo de doença.

Para este estudo, 1 mg de Αβ 1-42 (Bachem Inc., Torrance, CA, EUA) foi dissolvido em 1,0 mL de água duplamente destilada (solução 1 mg/mL) . Em seguida, 25 μΜ de Αβ 1-42 foi incubado a 37°C, na ausência ou presença de epicatequina (da Fluka), epicatequina (da ICN), catequina hidratada (da Aldrich), Galhato de galhocatequina (da Sigma), Galhato de epicatequina (da Sigma), Epicatequina (da Sigma), Epicatequina de chá verde (da Sigma) na presença de 150 mM Tris HC1, 10 mM NaCl (pH 7,0) com 0,02% azida de sódio. Nestes estudos (ver resultados descritos em baixo e na Figura 7) testaram-se as razões de peso de Αβ 1-42:catequina de 1:1, 1:0,1 e 1:0,01. Utilizou-se o ensaio de fluorometria com Tioflavina T como descrito no Exemplo 1.

Como mostrado na Figura 7, quantidades crescentes de catequinas disponíveis no mercado causaram um desmantelamento/destruição dependente da dose de fibrilas de Αβ 1-42 pré-formadas em doença de Alzheimer. Αβ 1-42 isoladamente demonstrou uma fluorescência média de 1037 +/- 64 101 unidades de fluorescência (Figura 7) . Todos de entre epicatequina (da Fluka, ICN, Aldrich e Sigma), catequina hidratada, galhato de galhocatequina e galhato de epicatequina causaram uma destruição/desmantelamento de fibrilas amiloides de Αβ (1-42) pré-formadas de um modo dependente da dose, e significativamente (p < 0,01) a razões de peso de Aβ:catequina de 1:1 e 1:0,1 (Figura 6). Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina (Fluka) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 86%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:epicatequina (Fluka) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 63%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina (ICN) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 91%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:epicatequina (ICN) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 78%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina (Aldrich) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 85%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:epicatequina (Aldrich) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 74%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:catequina hidratada (Aldrich) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 86%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:catequina hidratada (Aldrich) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 60%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:galhato de galhocatequina (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 86%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:ρ3ΐ1ΐ3Ρο de galhocatequina (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 44%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:galhato de epicatequina (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 92%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:galhato de epicatequina (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 65%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 85%, 65 ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ:epicatequina (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 81%. Uma razão peso/peso de 1:1 de Αβ:epicatequina de chá verde (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 86%, ao passo que uma peso/peso de 1:0,1 de Αβ: epicatequina de chá verde (Sigma) destruiu a formação de fibrilas de Αβ 1-42 em 63%. Este estudo demonstrou que todas as catequinas, incluindo epicatequina (da Fluka, ICN, Aldrich e Sigma), catequina hidratada (Aldrich), galhato de galhocatequina (Sigma) e galhato de epicatequina, causaram um desmantelamento/destruição de fibrilas amiloides de Αβ 1-42 pré-formadas e foram eficazes de um modo dependente da dose.

Exemplo 7

Catequinas são Inibidores Potentes da Formação de Fibrilas em Doença de Parkinson

No estudo seguinte testaram-se catequinas disponíveis no mercado quanto à sua capacidade para inibir a formação de fibrilas de alfa-sinucleína em doença de Parkinson. Utilizou-se NAC (também conhecida e por vezes referida aqui como NAC-P), um fragmento de 35 aminoácidos da alfa-sinucleína, uma vez que é conhecido que forma espontaneamente fibrilas do tipo amiloide após incubação a 37°C. Para este estudo, 62,5 μΜ de NAC (Bachem Inc., Torrance, CA, EUA) foi incubado em tubos de microcentrífuga a 37°C durante 1 semana (em triplicado), isoladamente ou na presença de catequinas de diferentes fontes comerciais, incluindo Epicatequina (EC) (Fluka), Epicatequina (EC) (ICN), Epicatequina (EC) (Aldrich), Epicatequina (EC) (Sigma), Galhato de epicatequina (Sigma), Catequina hidratada (Aldrich) e Galhato de galhocatequina (Sigma) em 150 mM Tris HC1, 10 mM NaCl, pH 7,0 (TBS) . Testaram-se 66 quantidades crescentes de catequinas (como descrito acima) incluindo NAC:catequina a uma razão peso/peso de 1:1, 1:0,5, 1:0,1, e 1:0,01 para determinar se as catequinas exerceram uma inibição dependente da dose da formação de fibrilas de NAC. Para avaliar os efeitos de catequinas na formação de fibrilas de NAC recolheram-se aliquotas de cada tubo para análise aos 0, 3 dias e 7 dias, utilizando o procedimento de fluorometria com Tioflavina T como descrito no Exemplo 4.

Os efeitos de catequinas disponíveis no mercado na formação de fibrilas de NAC foram avaliados durante um período de incubação de 1 semana. Durante o período de incubação de 1 semana ocorreu um aumento gradual da fluorescência de NAC, com uma fluorescência de pico de 381 + /- 50 unidades de fluorescência observada aos 7 dias (Figura 8) . Todos de entre epicatequina (da Fluka, ICN, Aldrich e Sigma), galhato de epicatequina (Sigma), catequina hidratada (Aldrich) e galhato de galhocatequina (Sigma) inibiram a formação de fibrilas de NAC de um modo dependente da dose, e significativamente (p < 0,01) a razões de peso de NAC:catequina de 1:1, 1:0,5, 1:0,1 e 1:0,01 (Figura 8). Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC:epicatequina (Fluka) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 70%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:epicatequina (Fluka) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 46%. Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC:epicatequina (ICN) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 89%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:epicatequina (ICN) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 49%. Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC:epicatequina (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 76%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:epicatequina (Aldrich) inibiu a formação de 67 fibrilas de NAC em 33%. Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC:epicatequina (Sigma) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 75%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:epicatequina (Sigma) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 40%. Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC:galhato de epicatequina (Sigma) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 77%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:galhato de epicatequina (Sigma) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 34%. Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC: catequina hidratada (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 77%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:catequina hidratada (Aldrich) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 34%. Uma razão peso/peso de 1:0,1 de NAC:galhato de galhocatequina (Sigma) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 73%, ao passo que uma razão peso/peso de 1:0,01 de NAC:galhato de galhocatequina (Sigma) inibiu a formação de fibrilas de NAC em 34%. Este estudo demonstrou que todas as catequinas, incluindo epicatequina (da Fluka, ICN, Aldrich e Sigma), catequina hidratada (Aldrich), galhato de galhocatequina (Sigma) e galhato de epicatequina (Sigma), causaram uma inibição da formação de fibrilas de NAC e foram eficazes de um modo dependente da dose.

Exemplo 8

Rastreio e Identificação de Compostos Aromáticos Poli-hidroxilados Específicos como Inibidores de Amiloidose AA Utilizando um Sistema de Modelo de Cultura de Células

Crê-se que compostos aromáticos poli-hidroxilados específicos são inibidores/destruidores potentes da formação e deposição de amiloide AA fibrilar em cultura de células. Crê-se que um grupo de cerca de 30 compostos aromáticos poli-hidroxilados disponíveis no mercado, que 68 diferem na posição de vários grupos hidroxilo funcionais, inibe a formação e deposição de amiloide AA fibrilar utilizando um sistema modelo de cultura de células. Um sistema de cultura de macrófagos murinos recebendo amiloide do soro A 2 (SAA2) recombinante e fator de reforço amiloide (AEF) é utilizado para gerar amiloide AA fibrilar in vitro. A deposição de amiloide AA fibrilar, detetada por coloração com vermelho do Congo e fluorescência com Tioflavina S, é quantificada utilizando um sistema de análise de imagens. Adicionalmente, a quantificação da formação e deposição de amiloide AA é efetuada pela análise da camada de células e meios derivados de culturas utilizando SDS-PAGE, imunocoloração e densitometria de varrimento. Compostos eficazes selecionados que se verifica inibirem a formação e/ou deposição de amiloide AA em cultura são então testados num modelo experimental de ratinho de amiloidose AA.

Exemplo 9

Determinação da Eficácia de Compostos Aromáticos Poli-hidroxilados Selecionados num Modelo de Ratinho de Amiloidose AA Sistémica

Crê-se que compostos aromáticos poli-hidroxilados específicos são inibidores potentes da formação e deposição de amiloide AA fibrilar num modelo de ratinho de amiloidose AA experimental. Os compostos eficazes selecionados identificados como acima são usados para tratar oralmente (por gavagem) grupos de ratinhos CBA/J (n = 8 por grupo) ao longo de um período de tratamento de 21 dias. Amiloide AA fibrilar é induzida nestes animais no dia 8 do período de tratamento por uma única injeção subcutânea de nitrato de prata (estímulo inflamatório), seguida de uma única injeção na veia da cauda de 100 pg de AEF. Um grupo de 12 animais tratados oralmente com solução salina tamponada com fosfato 69 (PBS) e induzidos para amiloidose AA (no dia 8) serve de grupo de controlo. Baço, figado e rins são obtidos de cada animal e quantifica-se a carga de % amiloide em cada órgão utilizando análise de imagens após coloração com vermelho do Congo ou fluorescência com Tioflavina S. Adicionalmente, implementa-se imuno-histoquimica para a deteção da proteina amiloide AA e o seu precursor (isto é, SAA) , bem como outros componentes conhecidos associados a amiloide AA (isto é, proteoglicanos/glicosaminoglicanos de sulfato de heparano, componente P amiloide, e ApoE), para determinar se a redução da deposição de amiloide AA em tecidos também está correlacionada com uma redução de componentes associados a amiloide.

Estabelecemos internamente a utilização do modelo experimental de ratinho de AA. Em primeiro lugar, o AEF foi amavelmente fornecido pelo Dr. Robert Kisilevsky (Queen's University, Kingston, Ontário, Canadá). Ratinhos CBA/J fêmeas foram então injetados subcutaneamente com uma única injeção de 0,5 mL de 3% nitrato de prata (para induzir uma reação inflamatória) e uma única injeção na veia da cauda de 100 yg de AEF. Utilizando este modelo, num período de 2-3 dias após a injeção, ocorreu deposição abundante de amiloide AA no baço, seguido do fígado e rim. Como mostrado na Figura 9, depósitos de amiloide AA fibrilar foram primeiramente observados nas áreas perifoliculares do baço. A coloração com vermelho do Congo de secções de tecido revelou uma birrefringência vermelha/verde característica (visualizada à luz polarizada) indicadora de depósitos amiloides fibrilares (Fig. 9A) . A presença de depósitos amiloides fibrilares também foi confirmada por fluorescência positiva com Tioflavina S (Fig. 9C). 70 A confirmação de depósitos amiloides AA em baço, figado e rim foi demonstrada por imunocoloração positiva utilizando um anticorpo policlonal contra a proteina amiloide AA (Serotek) (não mostrado). Adicionalmente, como previamente descrito nalguns estudos (Snow et al., Lab. Invest. 5_3; 37-44, 1985; Snow et al., Lab. Invest. 5_6: 665-675, 1987; Snow et al., Lab. Invest. _57: 687-698, 1987; Snow et al., J. Histochem. Cytochem. 3_9: 1321-1330, 1991). Os depósitos amiloides AA demonstraram uma colocalização de glicosaminoglicanos de sulfato de heparano (provavelmente como parte de proteoglicanos), mostrado utilizando um anticorpo de fração periplasmática gerado por expressão em fagos (conhecido como HS4C3, que reconhece um epitopo GAG de sulfato de heparano especifico) (van Kuppevelt et al., J. Biol. Chem. 273: 12960-12966, 1998) (Fig. 9C). A Figura 9 mostra a deposição de amiloide no baço num modelo de ratinho de amiloidose AA experimental. Os painéis representam tecido esplénico recolhido 5 dias depois de ratinhos CBA/J terem sido injetados com 100 yg de AEF +0,5 mL de 3% nitrato de prata. (Fig. 9A) Amiloide esplénico na área perifolicular (áreas a claro; setas), mostrado por coloração com vermelho do Congo (isto é, birrefringência vermelha/verde), visualizado à luz polarizada. (Fig. 9B) Amiloide esplénico (áreas a claro; setas) na área perifolicular noutro animal, demonstrado por fluorescência positiva com Tioflavina S. (Fig. 9C) Colocalização de glicosaminoglicanos de sulfato de heparano nas áreas perifoliculares esplénicas (áreas a escuro; setas), demonstrado por imunocoloração com um anticorpo gerado por expressão em fagos (conhecido como HS4C3), que reconhece um epitopo GAG de sulfato de heparano especifico. Todas as figuras X100. 71

No fígado, depósitos amiloides AA fibrilares foram primeiramente observados, num período de 3-4 dias, nas paredes das veias centrais (Fig. 10A), seguido de deposição de amiloide em todo o parênquima pelos dias 5-7 (Fig. 10C). A natureza dos depósitos amiloides fibrilares foi confirmada por coloração positiva com vermelho do Congo (isto é, birrefringência vermelha/verde visualizada à luz polarizada) (Figs. 10A, 10C) e Tioflavina S (isto é, fluorescência positiva) (Fig. 10B). A Figura 10 mostra a deposição de amiloide no fígado num modelo de ratinho de amiloidose AA experimental. Os painéis A e B representam tecido do fígado recolhido 7-10 dias depois de ratinhos CBA/J terem sido injetados com 100 yg de AEF + 0,5 mL de 3% nitrato de prata. (Fig. 10A) Amiloide no fígado (aos 7 dias) maioritariamente confinado às paredes de uma veia central (áreas a claro; setas) , mostrado por coloração com vermelho do Congo (isto é, birrefringência vermelha/verde), visualizado à luz polarizada (setas). X100 (Fig. 10B) Amiloide no fígado (aos 7 dias) nas paredes de veias centrais (áreas a claro; setas) e penetrando no parênquima (pontas de setas), detetado por fluorescência com Tioflavina S. X100 (Fig. 10C) Uma fotomicrografia a menor ampliação demonstrando acumulação acentuada de amiloide (aos 10 dias) nas paredes de veias centrais (áreas a claro; pontas de setas) e em todo o parênquima no fígado passados 10 dias após a injeção de AEF + AgN03. X25.

Estes estudos indicam que o modelo experimental de ratinho de amiloidose AA sistémica é viável. Utilizamos este modelo para testar a eficácia de inibidores de amiloide AA após 72 rastreio inicial utilizando o sistema de modelo de cultura de células.

Exemplo 10

Identificação de uma Nova Classe de Compostos como Agentes

Antiamiloide Potenciais A maior parte dos nossos estudos anteriores envolveu a análise destes compostos quanto à destruição/ desmantelamento de fibrilas amiloides pré-formadas consistindo em proteina beta-amiloide (observada em depósitos amiloides em doença de Alzheimer), polipéptido amiloide dos ilhéus (observado nos ilhéus de 90% dos pacientes com diabetes do tipo 2), alfa-sinucleina (observada em depósitos em doença de Parkinson), ou proteina prião (observada em doenças por prião). Os nossos estudos iniciais demonstram que compostos polifenólicos específicos podem causar destruição/desmantelamento de diferentes tipos de proteínas amiloides e, assim, tendem a ser menos específicos, ao passo que outros compostos polifenólicos tendem a destruir apenas um tipo de proteina amiloide (e, assim, são mais específicos) . Apresentam-se em baixo exemplos de alguns dos compostos aromáticos poli- hidroxilados que rastreámos quanto a inibição da formação e deposição de amiloide AA.

Como exemplo, a Figura 11 demonstra o efeito de compostos aromáticos poli-hidroxilados específicos na destruição/ desmantelamento de fibrilas amiloides consistindo em polipéptido amiloide dos ilhéus (IAPP) (a proteina amiloide que se acumula nos ilhéus pancreáticos de -90% dos pacientes com diabetes do tipo 2) (Westermark, 1972; Clark et al., 1988), avaliado por fluorometria com Tioflavina T (Naiki et al., 1991; Levine III, 1993; 1995). Neste ensaio, 73 aumentos ou decréscimos da fluorometria com Tioflavina T são proporcionais a aumentos ou decréscimos da quantidade de fibrilas de IAPP (Naiki et ai., 1991; Levine III, 1993; 1995). Como mostrado na Figura 11, após uma incubação de 1 semana a 37°C, 25 μΜ de IAPP isoladamente demonstrou 5 806 +/- 301 unidades de fluorescência, indicando a presença de fibrilas amiloides de IAPP abundantes. Todas as fibrilas de IAPP incubadas durante 1 semana a 37°C a uma razão de pesos de IAPP:composto de 1:0,1 (razão molar aproximada de 1:1) com compostos aromáticos poli-hidroxilados específicos, incluindo epicatequina (EC; Fluka), galhato de epicatequina (ECG; Sigma) ou pirocatecol (Sigma), demonstraram uma destruição/desmantelamento acentuado de 90-96% de fibrilas de IAPP pré-formadas. Por outro lado, EDTA (como controlo negativo) e o polifenólico conhecido como ácido quínico não causaram nenhuma destruição/desmantelamento significativo de fibrilas de IAPP pré-formadas (Fig. 11) . A destruição direta de fibrilas de IAPP pré-formadas por compostos polifenólicos específicos também foi confirmada por ensaios de coloração com vermelho do Congo (não mostrado). A Figura 11 mostra que compostos aromáticos poli-hidroxilados específicos atuam como destruidores potentes de fibrilas amiloides pré-formadas. Este gráfico é um ensaio de fluorometria com Tioflavina T durante 1 semana para identificar inibidores de fibrilas de IAPP. Como mostrado, apenas epicatequina (EC), galhato de epicatequina (ECG) e pirocatecol destroem/desmantelam fibrilas de IAPP pré-formadas em 90-96%.

Nos nossos outros estudos emprega-se espetroscopia de dicroísmo circular para testar a eficácia de certos polifenólicos na destruição de fibrilas pré-formadas 74 consistindo em proteína beta-amiloide (Αβ) 1-42, uma proteína que forma fibrilas amiloides como parte de placas amiloides extracelulares nos cérebros de todos os pacientes com doença de Alzheimer. Como exemplo, testaram-se os efeitos do polifenólico epicatequina na destruição de fibrilas de Αβ 1-42. Neste estudo, 50 μΜ de Αβ 1-42 (Bachem Inc) foi incubado na ausência ou presença de epicatequina (Sigma) durante 1 semana a 37°C, a uma razão peso/peso de Αβ:ΕΟ de 1:1 (razão molar aproximada de 1:10) . Como mostrado na Figura 12, Αβ 1-42 isoladamente demonstra os espetros típicos de uma proteína amiloide fibrilar, contendo uma estrutura em folhas β pregueadas, pelos mínimos marcados observados a 222 nm. Por outro lado, a incubação com epicatequina durante 3 dias causou uma destruição/desmantelamento significativo da estrutura em folhas β pregueadas (Fig. 12), sugerindo que o mecanismo de ação de compostos aromáticos poli-hidroxilados específicos pode envolver destruição de folhas β pregueadas. A Figura 12 mostra a destruição/desmantelamento por epicatequina da estrutura de folhas β pregueadas de fibrilas amiloides pré-formadas em doença de Alzheimer. Utilizou-se espetroscopia de dicroísmo circular para avaliar a capacidade da epicatequina (EC) para causar uma destruição/desmantelamento da estrutura em folhas β pregueadas de fibrilas de Αβ 1-42 pré-formadas. Como mostrado, aos 3 dias de coincubação, a epicatequina foi eficaz na destruição de estrutura de folhas β (revelado pela alteração dos espetros, especialmente a 222 nm).

Exemplo 11

Inibição de Amiloidose Experimental de Amiloide AA pela

Epicatequina 75

Estudos também demonstram que o composto aromático poli-hidroxilado específico conhecido como epicatequina (C15H14O6; PM 290,3) tem a capacidade para prevenir acentuadamente a deposição de amiloide AA no baço e fíqado no modelo de ratinho (isto é, após administração de AEF + nitrato de prata). Isto não foi observado após tratamento com catequina (o epímero da epicatequina), suqerindo que existem relações estrutura-atividade para a inibição da formação e deposição de fibrilas amiloides AA por compostos aromáticos poli-hidroxilados.

Neste estudo, 4 grupos (n = 6 por grupo) de ratinhos CBA/J fêmeas com 8 semanas de idade foram primeiramente pré-tratados durante 7 dias com a) solução salina tamponada com fosfato (PBS) , b) epicatequina (C15H14O6; PM 290,3) (Fluka, St. Louis, MO) ou c) catequina hidratada (Ci5Hi406; PM 290,3) (Fluka, St. Louis, MO). A epicatequina foi administrada diariamente por gavagem oral (0,5 mL do artigo de teste em PBS, pH 7,4) a uma dosagem de 78 mg/kg/dia (limite de solubilidade da epicatequina), ao passo que a catequina hidratada foi administrada a uma dose elevada (500 mg/kg/dia).

Após um período de pré-tratamento durante 7 dias com PBS, epicatequina ou catequina, todos os animais foram induzidos para deposição de amiloide AA por uma única injeção subcutânea de 0,5 mL de nitrato de prata (estímulo inflamatório), seguida de uma única injeção na veia da cauda de 100 yg de AEF em água destilada. Em seguida, os ratinhos foram tratados durante mais 14 dias com PBS, epicatequina ou catequina por gavagem oral como descrito acima (tempo total de tratamento com o composto de teste de 76 21 dias). No final do protocolo experimental, os animais foram sacrificados e o baço, figado e rins foram recolhidos para análise histológica.

Secções de tecido (isto é, baço, figado e rim) foram depois coradas quanto a amiloide fibrilar utilizando vermelho do Congo e Tioflavina S. Cinco secções por órgão foram então utilizadas para avaliar a carga amiloide. Nestes estudos empregou-se um sistema de pontuação arbitrário (desde 0 até 5), e a carga amiloide por órgão foi determinada pela pontuação cega de dois investigadores. Como exemplo, para a pontuação de secções de tecido com vermelho do Congo no baço, 0 = nenhuma birrefringência com vermelho do Congo em tecido; 1 = ligeira birrefringência com vermelho do Congo confinada a uma porção da área perifolicular; 2 = birrefringência com vermelho do Congo confinada a duas ou mais porções da área perifolicular; 3 = birrefringência com vermelho do Congo ocupando a totalidade da área perifolicular; 4 = birrefringência com vermelho do Congo ocupando a totalidade da área perifolicular e penetrando na polpa branca; 5 = birrefringência com vermelho do Congo ocupando a totalidade da área perifolicular e penetrando profundamente na polpa branca. Também utilizamos uma abordagem mais quantitativa para determinar a carga de % amiloide em vários tecidos utilizando um sistema de análise de imagens mais sofisticado.

Como mostrado na Figura 13, os animais que receberam solução salina isoladamente demonstraram deposição acentuada de amiloide no baço no final do periodo de indução de amiloide de 2 semanas, com uma pontuação de vermelho do Congo de 3,83 +/- 0,1. A catequina hidratada (isto é, pontuação de vermelho do Congo de 3,20 +/- 0,46) 77 reduziu a deposição de amiloide AA no baço em 16,5%, mas este valor não foi significativo. No entanto, a epicatequina (isto é, pontuação de vermelho do Congo de 2,16 + /- 0,50) inibiu significativamente (p < 0,01) a deposição de amiloide AA fibrilar no baço em 43,7% (Fig. 13) . Também foi observada uma inibição semelhante de amiloide AA fibrilar no figado e rim após tratamento com epicatequina, mas não com catequina (não mostrado). 0 efeito inibidor da epicatequina é tão potente que alguns dos animais chegaram mesmo a demonstrar pouca ou nenhuma amiloide AA fibrilar em tecidos após o tratamento (Figura 14) . Este estudo demonstra que compostos aromáticos poli-hidroxilados selecionados têm a capacidade para servir de terapêuticos potenciais para o tratamento de amiloidose AA sistémica. Os estudos descritos empregam técnicas de cultura de células e um modelo experimental de ratinho de amiloidose AA para identificar compostos aromáticos poli-hidroxilados que servem de compostos protótipos para o tratamento de amiloidose AA. A Figura 14 mostra uma redução acentuada da deposição de amiloide AA esplénica por epicatequina, revelado por coloração com vermelho do Congo. (Fig. 14A) Coloração com vermelho do Congo de depósitos amiloides AA na área perifolicular do baço (setas) num ratinho induzido com AEF + AgN03 (no dia 8), e tratado com PBS (durante 21 dias). As fotomicrografias a cores demonstram uma birrefringência vermelha/verde indicadora de amiloide fibrilar (visualizada à luz polarizada). (Fig. 14B) Eliminação quase completa de depósitos amiloides AA na área perifolicular do baço (setas), mostrado por ausência de coloração com vermelho do Congo (visualizada à luz polarizada) de um animal induzido 78 com AEF + AgNC>3 (dia 8), e tratado com epicatequina (durante 21 dias).

Exemplo 12

Identificação de Novos Inibidores de Amiloide AA - Rastreio

In Vi tro

Os nossos estudos sugerem que certos compostos aromáticos poli-hidroxilados, como epicatequina, podem servir de inibidores potentes da formação e deposição de amiloide AA fibrilar em tecidos. Utilizamos técnicas inovadoras de cultura de células para rastrear alguns compostos aromáticos poli-hidroxilados conhecidos e disponíveis no mercado que diferem no número de anéis aromáticos e/ou na posição de vários grupos hidroxilo e outros grupos funcionais nos anéis aromáticos. Este tipo de relação estrutura-atividade (SAR) de estudos de rastreio ilumina as características estruturais importantes necessárias para uma inibição eficaz da formação e deposição de amiloide AA. Emprega-se um sistema de cultura de macrófagos murinos utilizando SAA2 recombinante e AEF para gerar amiloide AA fibrilar in vitro. A deposição de amiloide AA fibrilar detetada por coloração com vermelho do Congo e fluorescência com Tioflavina S é quantificada em cultura utilizando um sistema de análise de imagens equipado para fluorescência e polarização. Adicionalmente, a quantificação da formação de amiloide AA é obtida pela análise da camada de células e meios utilizando SDS-PAGE, imunocoloração e densitometria de varrimento. Quando a amiloide AA é estabelecida em cultura, as culturas são rastreadas com compostos poli-hidroxilados selecionados a concentrações crescentes. Os compostos mais eficazes que se verifica inibirem a formação e deposição de amiloide AA em 79 cultura são então testados num modelo experimental relevante de ratinho de amiloidose AA.

Estabelecimento de um Sistema de Cultura de Células para o Estudo de Amiloidose AA

Para o estabelecimento de um sistema de cultura de células onde rastrear quanto a inibidores da formação e deposição de amiloide AA fibrilar, utilizamos o método descrito por Kluve-Beckerman et al. (1999).

Recolha e Cultura de Macrófagos/Células Peritoneais Murinos

As células são recolhidas por lavagem da cavidade peritoneal de ratinhos C57B1/6 fêmeas normais com 8-10 semanas de idade. Em resumo, 8 mL de meio de recolha (RPMI 1640; Life Technologies, Grand Island, NY), 25 mM HEPES, pH 7,0 e IX antibiótico-antimicótico (Life Technologies) são injetados de modo intraperitoneal, o abdómen é suavemente massajado, e o fluido e células são retirados. As células são recolhidas por centrifugação, são novamente suspensas a uma concentração de 5 X 106 células/mL e plaqueadas a uma densidade de 1,7 X 106 células/cavidade em lâminas de câmara de 8 cavidades. Os meios de cultura contêm RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, IX antibiótico-antimicótico, e 15% soro fetal de vitelo (Hyclone Labs, Logan, VT). É permitida a ligação das células durante 3 horas, após o que as células são extensamente enxaguadas para remover células não aderentes. As células aderentes exibem uma morfologia uniforme redonda tipica de macrófagos não ativados plaqueados de fresco. As células são mantidas em 350 yL de meio de cultura por cavidade a 37°C numa atmosfera de 5% CO2, sendo os meios substituídos a cada 2-3 dias. Após a adição de AEF e SAA2 recombinante (como descrito em baixo) 80 para a indução da deposição de amiloide AA em cultura (habitualmente observada num periodo de 2-4 dias de indução), as culturas de células são mantidas durante um periodo de 14-20 dias.

Preparação do Fator de Reforço Amiloide 0 AEF é preparado a partir dos baços de ratinhos amiloidóticos após um tratamento durante 2 semanas com uma única injeção subcutânea de 0,5 mL de AgNCb e uma única injeção na veia da cauda de 100 yg de AEF em água destilada. O material de AEF inicial foi amavelmente fornecido pelo Dr. Robert Kisilevsky (Queen's University, Canadá), tendo sido gerado mais AEF utilizando o método de Pras et al. (1968). Em resumo, aproximadamente 2 gramas (10 baços amiloidóticos) de tecido são processados para cada preparação. Os baços são homogeneizados, utilizando um triturador de tecido Kontes, em 40 mL de 0,15 M solução salina NaCl, até o tecido estar na forma de uma pasta fina. A pasta é então centrifugada, numa microcentrífuga de bancada, a 10 000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante é desperdiçado e o grânulo é novamente suspenso em 40 mL de solução salina e é centrifugado de novo como descrito acima. Este processo é repetido sete vezes. O sal é depois removido dos grânulos por nova homogeneização em água destilada esterilizada e centrifugação, numa microcentrifuga de bancada, a 15 000 rpm durante 2 horas. O sobrenadante é desperdiçado e o grânulo é novamente suspenso em 20 mL de água destilada e é novamente centrifugado a 15 000 rpm durante 2 horas. Desta vez, o sobrenadante não é desperdiçado e é designado Sobrenadante II (Sob II), que contém atividade de AEF significativa. O processo utilizado para a geração de Sob II é repetido, e o sobrenadante, designado Sob III, é guardado. O grânulo 81 obtido do último passo é novamente suspenso em 7 mL de água destilada e é centrifugado a 10 000 rpm durante 3 horas. O sobrenadante é guardado e é designado Sob IV. Sob II, Sob III e Sob IV contêm atividade de AEF, que é avaliada pelo método de Bradford (Bradford, 1976) para determinar a concentração proteica para cada sobrenadante. Os 3 sobrenadantes são então reunidos e liofilizados de modo a serem obtidas múltiplas aliquotas liofilizadas de 100 yg. O AEF é utilizado para estudos de cultura de células (objetivo 1) e indução de amiloide AA experimental num modelo de ratinho (objetivo 2), como descrito em baixo. Verificámos que 10 baços amiloidóticos originam aproximadamente 4 mg de AEF (suficiente para injeções para 40 animais; isto é, 100 yg por animal como descrito aqui.

Produção e Purificação de SAA2 Recombinante SAA2 recombinante de ratinho, correspondente à SAA em ratinhos da estirpe CE/J (SAA de CE/J) é produzido em células de Escherichia coli BL834, utilizando o vetor pET-21a como previamente descrito (Kluve-Beckerman et ai., 1997) . A purificação a partir de lisados de E. coli é acompanhada de cromatografia com Sefarose CL-6B em 4 M guanidina, 0,05 M Tris-HCl (pH 8,2), seguida de cromatofocagem numa gama de pH 8 até pH 5 em 6 M ureia (Kluve-Beckerman et ai., 1997). As preparações finais são precipitadas em sulfato de amónio (80% saturado), são extensamente dialisadas contra água e liofilizadas.

Indução da Formação de Amiloide AA em Cultura de Células

Para induzir a formação e deposição de amiloide AA em

macrófagos/células peritoneais em cultura utiliza-se SAA2 de ratinho recombinante (a uma concentração final de 140 yg/mL) e AEF (a uma concentração final de 12 yg/mL) . O SAA 82 (7 pL) é adicionado diretamente ao meio (350 pL) a partir de uma solução-mãe de 7-10 mg/mL, preparada por dissolução de SAA2 recombinante purificado e liofilizado em 6 M ureia, 25 mM HEPES, pH 7,2. As concentrações de soluções-mãe são ajustadas após análise por SDS-PAGE e quantificação densitométrica de bandas de SAA coradas com azul de Coomassie. Soluções-mãe de AEF (2 mg/mL) são extensamente misturadas, para suspender novamente material precipitado antes da recolha de uma aliquota (2 pL) para adição ao meio de cultura (350 pL).

Ensaio de Viabilidade Celular

Para confirmar a viabilidade celular de culturas de macrófagos após a indução de amiloide AA (como descrito acima) emprega-se exclusão de azul de tripano nalgumas culturas (nos dias 5, 10 e 20) . Antes da coloração, as células são enxaguadas 3 vezes com RPMI sem soro. Depois são cobertas durante 1 minuto com uma solução de 2% (p/v) de azul de tripano em PBS (Perry et al., 1997) .

Imediatamente após a remoção do azul de tripano, as células são fixadas com 4% (p/v) paraformaldeído, pH 7,5, durante 10 minutos à temperatura ambiente, são enxaguadas quatro vezes com PBS com agitação suave, e são examinadas ao microscópio antes da coloração com vermelho do Congo ou Tioflavina S.

Atividade Fagocitica de Macrófagos

Para avaliar e confirmar a atividade fagocitica de macrófagos em cultura (nos dias 5, 10 e 20 após a indução

de amiloide AA) , também é empregue um ensaio de captação com esférulas de latex. Esférulas de latex de poliestireno coradas de azul, com 0,8 pm de diâmetro (Sigma), são suspensas em RPMI sem soro a uma concentração de 7,2 X 83 108/mL. As células são enxaguadas 3 vezes com RPMI sem soro e depois são incubadas durante 30 minutos com 300 yL da suspensão de esférulas. Durante a incubação, as lâminas de câmara são fortemente embrulhadas em Parafilme e são agitadas suavemente num banho de água a 37°C. A suspensão de esférulas é removida e as células são enxaguadas no minimo 10 vezes com RPMI. As células são então fixadas com formalina e são coradas com hematoxilina.

Coloração com Vermelho do Congo

Para confirmar e quantificar a deposição de amiloide AA fibrilar em cultura, células aos 5, 10 e 20 dias (pós-indução de amiloide AA) são fixadas em 100% metanol gelado e depois são coradas durante 45 minutos com vermelho do Congo, preparado em 80% etanol alcalino (Putchler et al., 1962) . Após vários mergulhos rápidos em água, as lâminas são imersas em hematoxilina durante 2 minutos. As lâminas são então mergulhadas uma vez em 70% etanol acidificado, várias vezes em água e uma vez numa solução 1% de NaOH. Obtém-se desidratação por lavagem sequencialmente em 95% etanol e 100% etanol. As lâminas são limpas em xileno e aplicam-se lamelas de cobertura utilizando Permount. A extensão da coloração com vermelho do Congo (isto é, birrefringência vermelha/verde, visualizada à luz polarizada) é determinada quantitativamente utilizando um sistema de imagiologia como descrito aqui. Estudos prévios utilizando este sistema de cultura indicaram que o material positivo para vermelho do Congo permanece ligado às lâminas de câmara ao longo de todo o periodo da cultura (2-24 dias) (Kluve-Beckerman et al., 1999). Foi previamente demonstrado que a acumulação de amiloide AA na cultura ocorre num periodo de 2 dias após a adição de SAA2 e AEF (Kluve-Beckerman et al., 1999). 84

Fluorescência com Tioflavina S

Os depósitos amiloides AA fibrilares são detetados e analisados após coloração com Tioflavina S (Elghetany e Saleem, 1988). A fluorescência com Tioflavina S é quantificada utilizando o sistema de análise de imagens descrito aqui.

Quantificação da Carga de % Amiloide AA em Cultura de Células por Análise de Imagens

Para quantificar a carga de % amiloide presente em culturas de células após formação e deposição de amiloide AA (aos dias 5, 10 e 20) utilizamos um método quantitativo envolvendo análise de imagens. Em resumo, lâminas coradas com vermelho do Congo ou Tioflavina S são visualizadas à luz polarizada, ou luz fluorescente, respetivamente. Utilizam-se 5-7 lâminas por grupo de tratamento, como descrito aqui, para determinar a carga de % amiloide a uma dada ampliação (X100). A análise quantitativa de imagens é realizada utilizando um sistema de análise de imagens Image Pro Plus (Media Cybernetics) ligado a um microscópio Zeiss Axioskop 20 (com capacidades de polarização e fluorescência) através de uma câmara de video CCD. As imagens de secções de amiloide AA fibrilar (polarizada ou fluorescente) são armazenadas numa memória intermédia, e uma região especifica (isto é, a uma ampliação de X100) é manualmente delineada e determina-se a área total de pixéis ocupada pelas estruturas amiloides. Utiliza-se um limite de base monocromática para selecionar pixéis correspondentes a estruturas polarizadas ou imunofluorescentes. Calcula-se a % da região ocupada pelos pixéis etiquetados (isto é, vermelho/verde para vermelho do Congo; amarelo/verde para Tioflavina S) . Para todas as análises de imagens, o estado 85 de tratamento das culturas é desconhecido do observador. Efetua-se análise não paramétrica de Mann-Whitney utilizando o "software" Statview (SAS Institute, Cary, NC). As reduções de cargas amiloides causadas por tratamento com compostos aromáticos poli-hidroxilados (como descrito em baixo) podem ser determinadas quantitativamente utilizando a metodologia descrita acima. Utilizámos com êxito este sistema de imagiologia (utilizando coloração com vermelho do Congo; fluorescência com Tioflavina S, ou um anticorpo para Αβ biotinilado) para determinar a carga de % amiloide, número de placas amiloides e dimensão das placas, em várias regiões do cérebro em modelos de ratinhos transgénicos de doença de Alzheimer. Utilizando este método também quantificamos o número de macrófagos in vitro (a uma ampliação de X100) que contêm estruturas cheias de amiloide. Estudos prévios realizados por Kluve-Beckerman et al. (1999) demonstram que, utilizando o sistema de cultura de células como descrito acima, muitos dos macrófagos acumulam amiloide AA fibrilar no citoplasma dos macrófagos.

Teste de Compostos Aromáticos Poli-hidroxilados Quanto a Inibição da Formação e Deposição de Amiloide AA

Os nossos dados sugerem que certos compostos aromáticos poli-hidroxilados possuem atividade potente inibidora de amiloide. São divulgados em baixo compostos polifenólicos disponíveis no mercado que se crê serem adequados para inibição da formação e deposição de amiloide AA fibrilar.

Para estudos de relação estrutura-atividade, estes compostos polifenólicos facilmente disponíveis, com grupos hidroxi situados em várias posições em anéis aromáticos, podem ser adquiridos de fontes comerciais. Estudos iniciais para testar a toxicidade destes compostos indicam que 86 habitualmente demonstram toxicidade limitada, mesmo a dosagens elevadas. A quantificação da carga de % amiloide AA, como descrito aqui, é utilizada para avaliar a capacidade de vários compostos aromáticos poli-hidroxilados para inibir/destruir a formação e deposição de amiloide AA em cultura.

Compostos representativos divulgados e que se crê serem inibidores/destruidores eficazes antiamiloide e anti-alfa-sinucleína/NAC incluem EDTA (CioHi6N2C>8 PM 292,2, utilizado apenas como controlo negativo), e compostos polifenólicos disponíveis no mercado com uma variedade de padrões de substituição fenólica, incluindo: Epicatequina (C15H14O6; PM 290,3), Catequina hidratada (C15H14O6; PM 290,3), Epigalhocatequina (C15H14O7; PM 306, 3), Galhato de

Epigalhocatequina (C22H18O11; PM 458,4), Galhato de

Epicatequina (C22H18O10; PM 442,4), Galhato de Galhocatequina (C22H18O11; PM 458,4), Ácido clorogénico (Ci6Hi809; PM 354,3), Hematoxilina (C16H14O6; PM 302,3), Floroglucido (C12H10O5; PM 234.2) , Galhato de propilo (C10H12O5; PM 212,2), Éster de etilo do ácido gálhico (C9H10O5; PM 198,2), Ácido gálhico (C7H6O5; PM 170,1), 3,4, 5-tri-hidroxibenzamida hidratada (C7H7NO3; PM 169,1), 5-hidroxidopamina (C8HuN03; PM 205, 6), 1,2,4-benzenotriol (C6H603; PM 126,1), Ácido elágico (Ci4H608; PM 302,2), Quercetina (Ci0Hi2O5; PM 338,3),

Pirocatecol (C6H6<02; PM 110,1), Ácido tânico (C76H52O46; PM 1701.2) , Pirogalhol (C6H603; PM 126,1), e ácido p- aminossalicílico (C7H7N03; PM 153,1).

Todos estes compostos são comercialmente disponibilizados pela Sigma (St. Louis, MO), Fluka (St. Louis, MO) ou pela Acros Organic (filial da Fisher Scientific, Palatine, IL) . Como exemplo de estudos do tipo SAR, comparamos compostos 87 que contêm três grupos hidroxilo adjacentes num anel aromático (exemplos incluem pirogalhol, 5-hidroxidopamina, ácido gálhico e galhato de propilo) com compostos que contêm dois grupos hidroxilo adjacentes (exemplos incluem pirocatecol, quercetina e 1,2,4-benzenotriol) . Compostos que contêm grupos hidroxilo que estão espaçados em pelo menos 2 carbonos (como floroglucido) também são avaliados em cultura de células. Estes estudos ajudam a determinar caracteristicas estruturais fenólicas que contribuem para a inibição da formação e/ou deposição de fibrilogénese de AA. Também é contemplada a síntese de análogos químicos dos inibidores mais potentes identificados aqui. Estes estudos proporcionam bons discernimentos dos elementos estruturais requeridos para a bioatividade observada.

Para estudos em cultura de células utiliza-se uma dosagem inicial elevada de compostos de teste (a ser determinada empiricamente) para determinar se os compostos conseguem inibir a formação e/ou deposição de amiloide AA, determinado por métodos como descrito em baixo e aqui noutro local. Para estes estudos, cada composto aromático poli-hidroxilado é adicionado a culturas no início da indução de amiloide AA (isto é, administração de AEF + SAA2). Os meios de cultura de células contendo cada composto de teste individual são substituídos a cada 2-3 dias. A carga de % amiloide é quantificada nos dias 5 e 10 após a indução de amiloide AA e tratamento com composto de teste. As comparações são feitas diretamente com a carga de % amiloide em culturas só induzidas para deposição de amiloide AA (isto é, sem tratamento com composto de teste). Os compostos identificados que aparentam ser promissores como inibidores da formação e/ou deposição de amiloide AA fibrilar a uma única dose elevada são testados mais 88 extensamente e a concentrações crescentes (isto é, dose baixa, dose média e dose elevada; a serem determinadas empiricamente), para confirmar uma inibição dependente da dose da formação e/ou deposição de amiloide AA fibrilar. Os compostos selecionados identificados por rastreio utilizando os métodos de cultura de células descritos acima são então testados num modelo experimental de ratinho de amiloidose AA. A Figura 15 mostra estudos da relação estrutura-atividade (SAR) de diferentes compostos aromáticos poli-hidroxilados disponíveis no mercado. São mostrados 8 exemplos das estruturas de diferentes compostos polifenólicos disponíveis no mercado, que diferem na localização dos grupos hidroxilo no anel aromático, a serem utilizados para estudos de rastreio de SAR.

Quantificação de Amiloide AA Utilizando SDS-PAGE e Imunocoloração Para além da quantificação da carga de % amiloide em cultura após coloração com vermelho do Congo e fluorescência com Tioflavina £ ! utilizando análise de imagens, determina-se a acumulação de amiloide AA na camada de células e meios utilizando SDS-PAGE seguida de imunocoloração, como previamente descrito (Kluve-Beckerman et al., 1999) . Em resumo, as camadas de células são enxaguadas três vezes com RPMI sem soro, são raspadas para PBS, transformadas em grânulos por centrifugação e solubilizadas em tampão de amostras de SDS. Para análise de amiloide AA em meios de cultura derivados de células, alíquotas de 15 yL de meios são adicionadas diretamente a tampão de amostras de SDS. Amostras em triplicado são sujeitas a tricina-SDS-PAGE como previamente descrito 89 (Schagger e von Jago, 1987). Utilizando este método, camadas separadas, espaçadas e empilhadas contêm 16,5%, 10% e 4% de poliacrilamida, respetivamente. Emprega-se um anticorpo monoclonal contra a proteina amiloide AA (Serotek) e a técnica de coloração "Western" com quimioluminescência intensificada (ECL) de acordo com as recomendações do fabricante (Amersham Life Science). Utilizando os métodos descritos acima, a SAA2 aparece habitualmente na forma de múltiplas bandas a -12-14 kDa e mais elevadas, ao passo que a proteína AA aparece como uma banda principal a -8,5 kDa (Kluve-Beckerman et al., 1999). Inicialmente, depois de estabelecidas as culturas de células, implementa-se sequenciação N-terminal da banda principal a -8,5 kDa para confirmar a presença da proteína AA. Utilizámos previamente o método de eletroforese, eletroeluição e sequenciação de aminoácidos para identificar outras sequências peptidicas para outros projetos internos.

Depois de estabelecido este sistema, empregamos densitometria de varrimento para determinar a extensão da proteina amiloide AA na camada de células e meios após indução por SAA2 + AEF (aos 5 e 10 dias pós-indução de amiloide AA) , na ausência ou presença de uma dose elevada de cada composto aromático poli-hidroxilado (como especificado acima). Utiliza-se a média de 3 varrimentos por amostra (com amostras manipuladas em SDS-PAGE em triplicado) para determinar os níveis de proteina amiloide AA na camada de células e meios nas várias condições. A análise estatística que compara a análise densitométrica de varrimento na ausência ou presença de compostos polifenólicos baseia-se em testes t de Student emparelhados, com dados apresentados na forma de média +/- 90 E.P. A significância é relatada aos níveis de confiança de 95% (p < 0,05), 99% (p < 0,01) e 99,9% (p < 0,001). Também é utilizado ANOVA, consoante o necessário.

Exemplo 13

Identificação de Novos Inibidores de Amiloide AA - Estudos em Animais

Estudos sugerem que certos compostos aromáticos poli-hidroxilados, como epicatequina, aparentam servir de inibidores potentes da formação e deposição de amiloide AA fibrilar in vivo. Realizamos estudos em modelos animais para determinar a eficácia de compostos aromáticos poli-hidroxilados selecionados num modelo experimental de ratinho de amiloidose AA. Grupos de ratinhos CBA/J (n = 8 por grupo) são primeiramente pré-tratados com diferentes compostos aromáticos poli-hidroxilados, durante um período de pré-tratamento de 7 dias, a uma dose elevada não tóxica (a ser determinada empiricamente). Os animais são induzidos para amiloidose AA fibrilar por uma única injeção subcutânea de AgN03 e uma única injeção na veia de cauda de 100 yg de AEF. O tratamento, durante a fase de indução de amiloide, com compostos aromáticos poli-hidroxilados continua durante mais 14 dias antes do sacrifício (tempo de tratamento = 21 dias no total). Obtêm-se baços, fígados e rins de cada animal e quantifica-se a carga de % amiloide em cada órgão utilizando análise de imagens. Adicionalmente, implementa-se imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra a proteína amiloide AA, SAA, proteoglicanos/glicosaminoglicanos de sulfato de heparano, componente P amiloide e ApoE para avaliar os efeitos de compostos de teste na acumulação de amiloide AA/SAA, e outros cofatores amiloides AA conhecidos. 91

Metodologia Grupos de Tratamento

Grupos (n = 8 por grupo) de ratinhos CBA/J fêmeas de 8 semanas de idade (Baxter Labs) são utilizados para os estudos de modelos animais. Inicialmente, cada animal é pré-tratado diariamente, por gavagem oral (num volume de 0,5 mL) , com um composto aromático poli-hidroxilado especifico (selecionado dos resultados dos testes acima) a uma dose inicial elevada e não tóxica (a ser determinada empiricamente) durante um período de pré-tratamento de 7 dias. Tipicamente, as nossas dosagens prévias baixas até elevadas com compostos aromáticos poli-hidroxilados administrados oralmente variam desde uma dose baixa de 25 mg/kg/dia até uma dose elevada de 500 mg/kg/dia. Utilizam-se dosagens equivalentes para comparar diferentes compostos aromáticos poli-hidroxilados tomando em consideração a toxicidade do composto e a solubilidade do composto (em PBS) . Efetua-se gavagem oral utilizando uma agulha de dosagem oral de calibre 22 (Popper) de compostos de teste dissolvidos em 0,50 mL de PBS (pH 7,4). No dia 8, todos os animais são induzidos para amiloidose AA por uma única injeção subcutânea de 0,5 mL de 3% AgNCq (Fisher) em água desionizada duplamente destilada. Segue-se uma única injeção na veia da cauda de 100 yg de AEF em água destilada desionizada duplamente destilada. Os animais são tratados, durante 14 dias adicionais, com cada um dos compostos poli-hidroxilados específicos. Um grupo de 12 ratinhos é induzido para amiloidose AA (por AgN03 + AEF como descrito acima) e é tratado oralmente apenas com PBS (pH 7,4), na ausência de quaisquer compostos de teste. No final do período de tratamento de 21 dias, os animais são sacrificados por dosagem excessiva com 0,1 mL de eutosol, e o baço, fígado e rins de cada animal são recolhidos para 92 coloração e imuno-histoquímica. 0 número de animais por grupo (n = 8 para compostos de teste; n = 12 para o grupo de controlo de solução salina) é determinado dos dados obtidos e cálculos de potência baseados num nivel alfa de 0,05 (dois lados) e desvios padrão de 0,5, que dão uma potência de 94%.

Produção de AEF O AEF é preparado como descrito acima.

Fixação e Preparação de Tecidos A fixação e preparação de tecidos são realizadas como previamente descrito (Snow et al., 1991). Em resumo, o baço, figado e rins são removidos de cada animal, são fixados em 90% etanol e 10% formaldeido durante 24 horas a -20°C, embutidos em parafina e seccionados a 25 μΜ (secções espessas necessárias para a quantificação da carga amiloide, como descrito em baixo). Cortam-se aproximadamente 50-75 secções por animal.

Coloração com Vermelho do Congo e Fluorescência com Tioflavina S A acumulação de amiloide AA fibrilar é detetada por coloração com vermelho do Congo (Puchtler et al., 1962) e fluorescência com Tioflavina S (Elghetany e Saleem, 1988) como descrito acima.

Quantificação da Carga Amiloide em Tecidos

Também se utiliza análise de imagens para quantificar a carga de % amiloide presente no baço, figado e rim de cada animal. A carga de % amiloide em cada órgão é quantificada como avaliado após coloração com vermelho do Congo (visualizada à luz polarizada) ou Tioflavina S (visualizada 93 à luz fluorescente) Empregam-se 5-7 lâminas igualmente espaçadas por animal por mancha (em cada grupo de tratamento) para determinar a carga de % amiloide a uma dada ampliação (X100). A análise quantitativa de imagens da carga amiloide num dado órgão (e a uma ampliação especifica) é realizada utilizando o sistema de análise de imagens descrito acima. Reduções potenciais da carga amiloide são determinadas quantitativamente para cada composto aromático poli-hidroxilado para cada órgão/animal. É esperado que certos compostos de teste reduzam a carga amiloide em 40-60%.

Imuno-histoquímica

Secções de tecido também são submetidas a imunocoloração para detetar marcadores importantes da proteina amiloide AA, e cofatores conhecidos associados a amiloide AA. Emprega-se um anticorpo monoclonal contra a proteina amiloide AA (Serotek) para conformar a localização de depósitos de amiloide AA, ao passo que se emprega um policlonal contra SAA (Serotek) para detetar a proteína precursora, SAA. Deteta-se a presença de perlecano (um proteoglicano de sulfato de heparano específico implicado em amiloidose AA) (Snow et al., 1991) utilizando um anticorpo monoclonal contra a proteína do "core" do perlecano (conhecida como HK-102; oferta generosa do Dr. Koji Kimata, Japão) (Snow et al., 1994), ao passo que se emprega um anticorpo de fração periplasmática gerado por expressão em fagos (conhecido como HS4C3; oferta generosa do Dr. Van Kuppevelt) (van Kuppevelt et al., 1998) contra um epítopo específico de cadeias GAG de sulfato de heparano para determinar a colocalização de GAGs de sulfato de heparano. 0 componente P amiloide é detetado utilizando um anticorpo policlonal (Research Diagnostics) , ao passo que 94

ApoE é detetado utilizando um anticorpo policlonal (Research Diagnostics).

Para a localização de anticorpos utilizamos técnicas comuns de fluorescência (Basgen et al., 1989; Mosedale et al., 1996) . 0 anticorpo primário para a coloração imuno- histoquímica é utilizado ao longo de uma série de diluições para se obter a melhor especificidade com a menor coloração de fundo. Os controlos da imunocoloração positiva consistem em secções tratadas com 1) pré-absorção do anticorpo primário com excesso de antigénio (se disponível), 2) um anticorpo primário diferente da mesma classe e espécie de Ig, e/ou 3) PBS + 1% albumina do soro bovino em vez do anticorpo primário (para assegurar que não há ligação inespecífica dos anticorpos secundários empregues).

Farmacologia e Utilidade

Os compostos divulgados atuam de modo a inibir ou prevenir a formação de fibrilas amiloides, inibir ou prevenir o crescimento de fibrilas amiloides, e/ou causar desmantelamento, destruição, e/ou desagregação de fibrilas amiloides e depósitos de proteínas amiloides pré-formados. A sua atividade pode ser medida in vitro por métodos como os discutidos nos Exemplos 1 até 4, ao passo que a sua atividade in vivo contra amiloidoses pode ser medida em modelos animais, como os de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose AA sistémica, diabetes de tipo 2 e outros.

Os compostos também atuam de modo a inibir ou prevenir a formação de fibrilas de alfa-sinucleína/NAC, inibir ou prevenir o crescimento de fibrilas de alfa-sinucleína/NAC, e/ou causar desmantelamento, destruição, e/ou desagregação 95 de fibrilas de alfa-sinucleina/NAC e depósitos de proteínas associadas a alfa-sinucleína/NAC pré-formados. A sua atividade pode ser medida in vitro por métodos como os discutidos no Exemplo 4 acima. A razão terapêutica de um composto pode ser determinada, por exemplo, comparando a dose que origina atividade eficaz antifibrilas (antiamiloide ou anti-alfa-sinucleína/NAC num modelo in vivo adequado numa espécie animal adequada, como o ratinho, com a dose que origina perda de peso significativa (ou outros efeitos secundários observáveis) na espécie animal de teste.

Composições farmacêuticas e administração

Em geral, os compostos são administrados em forma isolada pura em quantidades terapeuticamente eficazes por qualquer um dos modos habituais conhecidos na área, isoladamente ou em combinação com pelo menos um outro composto e/ou pelo menos um outro agente terapêutico convencional para a doença a ser tratada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar muito, dependendo da doença, da sua gravidade, a idade e estado de saúde relativa do animal a ser tratado, a potência do(s) composto (s), e outros fatores. Como agentes antifibrilas, quantidades terapeuticamente eficazes dos compostos podem variar entre 10-1000 mg/kg de peso do corpo; por exemplo, 10-100 mg/kg de peso do corpo. O profissional conseguirá, sem experimentação desnecessária e considerando a sua perícia e esta divulgação, determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto desta invenção para o tratamento de amiloidose. 96

Em geral, os compostos são administrados na forma de composições farmacêuticas por uma das vias seguintes: oral, tópica, sistémica (por exemplo, transdérmica, intranasal, ou por supositório) , ou parentérica (por exemplo, injeção intramuscular, subcutânea, ou intravenosa) . As composições podem tomar a forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, semissólidos, pós, formulações de libertação prolongada, soluções, suspensões, elixires, aerossóis, ou quaisquer outras composições apropriadas; e compreendem pelo menos um composto em combinação com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Excipientes adequados são bem conhecidos dos profissionais, e podem ser encontrados, tais como os métodos de formulação das composições, em referências comuns, tais como Alfonso AR: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17a edição, Mack Publishing Company, Easton PA, 1985. Transportadores liquidos adequados, especialmente para soluções injetáveis, incluem água, solução salina aquosa, solução de dextrose aquosa, e glicóis.

Em particular, o(s) composto(s) pode(m) ser administrado(s) oralmente, por exemplo, na forma de comprimidos, trociscos, rebuçados, suspensão aquosa ou oleosa, pós ou grânulos dispersáveis, emulsões, cápsulas duras ou moles, ou xaropes ou elixires. Composições destinadas a utilização oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na área para a preparação de composições farmacêuticas, e essas composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes conservantes, para se obterem preparações farmaceuticamente elegantes e agradáveis ao palato. 97

Comprimidos contêm o composto em mistura com excipientes não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para a preparação de comprimidos. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e desintegração, por exemplo, amido de milho ou ácido alginico; agentes aglutinantes, por exemplo, amido de milho, gelatina ou acácia, e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio ou ácido esteárico ou "tale". Os comprimidos podem não ser revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e, desse modo, proporcionar uma ação prolongada durante um período de tempo maior. Por exemplo, pode ser empregue um material de retardamento no tempo, como monoestearato de glicerol ou diestearato de glicerol. Formulações para utilização oral também podem ser apresentadas na forma de cápsulas de gelatina endurecida, em que o composto é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino, ou na forma de cápsulas de gelatina mole, em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite.

Suspensões aquosas contêm o composto em mistura com excipientes adequados para a preparação de suspensões aquosas. Esses excipientes consistem em agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulose, metil-celulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto e goma de acácia; agentes dispersantes ou humedecedores podem ser fosfatidos de ocorrência natural, por exemplo, lecitina, ou produtos 98 de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos, por exemplo, estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetileno-oxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos, como hexitol, como mono-oleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo, mono-oleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo, p-hidroxibenzoato de etilo ou n-propilo, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes, ou um ou mais agentes edulcorantes, como sucrose ou sacarina.

Suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo o composto num óleo vegetal, por exemplo, óleo de arachis, azeite, óleo de sésamo, ou óleo de coco, ou num óleo mineral, como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo, cera de abelhas, parafina ou álcool cetílico. Agentes edulcorantes, como os apresentados em baixo, e agentes aromatizantes podem ser adicionados para dar origem a uma preparação oral agradável ao palato. Estas composições podem ser conservadas por adição de um antioxidante, como ácido ascórbico. Pós e grânulos dispersáveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa por adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um agente dispersante ou humedecedor, um agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou humedecedores e agentes de suspensão adequados são exemplificados pelos já descritos acima. Também podem estar presentes excipientes 99 adicionais, por exemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes.

Os compostos também podem estar na forma de emulsões óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo, azeite ou óleos de arachis, ou um óleo mineral, por exemplo, parafina liquida, ou misturas destes. Agentes emulsionantes adequados podem consistir em gomas de ocorrência natural, por exemplo, goma de acácia ou goma de tragacanto, fosfatidos de ocorrência natural, por exemplo, soja, lecitina, e fosfatidos de ocorrência, por exemplo, soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo, mono-oleato de sorbitano, e produtos de condensação dos referidos ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitano. A emulsão também pode conter agentes edulcorantes e aromatizantes. Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes edulcorantes, por exemplo, glicerol, sorbitol ou sucrose. Essas formulações também podem conter um demulcente, um conservante e agentes aromatizantes e corantes.

Os compostos também podem ser administrados por injeção ou infusão, de modo subcutâneo ou intravenoso, ou intramuscular, ou intraesterno, ou intranasal, ou por técnicas de infusão na forma de uma suspensão injetável ou oleaginosa esterilizada. 0 composto pode estar na forma de suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis esterilizadas. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com a área conhecida utilizando agentes de dispersão de humedecimento e agentes de suspensão adequados que foram descritos acima. A preparação injetável esterilizada também pode ser uma solução ou suspensão injetável esterilizada num diluente ou 100 solvente não tóxico e aceitável do ponto de vista parentérico, por exemplo, na forma de uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veiculos e solventes aceitáveis que podem ser empregues contam-se água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Adicionalmente, óleos fixos esterilizados são convencionalmente empregues como solvente ou meio de suspensão. Para esta finalidade podem ser convencionalmente empregues quaisquer óleos fixos moles, incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos gordos, como ácido oleico, têm aplicação na preparação de injetáveis.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica ótima. Por exemplo, várias dosagens divididas podem ser administradas diariamente, ou a dosagem pode ser proporcionalmente reduzida como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular os compostos em formas galénicas unitárias, por facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Formas galénicas unitárias, como usado aqui, referem-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; em que cada uma contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e pelo menos um excipiente farmacêutico. Um produto farmacêutico compreenderá uma forma galénica unitária dentro de um recipiente que está etiquetado ou acompanhado de uma etiqueta que indica o método de tratamento pretendido, como o tratamento de uma doença amiloide, como doença de Alzheimer, ou de uma doença associada à formação de fibrilas de alfa-sinucleina, como doença de Parkinson. Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" preferivelmente inibe 101 amiloidose ou uma doença associada à formação de fibrilas de alf a-sinucleina num paciente em pelo menos 20, mais preferivelmente em pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente em pelo menos 60%, e ainda mais preferivelmente em pelo menos 80%, relativamente a sujeitos não tratados.

Preparação dos Compostos

Muitos dos compostos utilizados em métodos divulgados são bem conhecidos na área e estão disponíveis no mercado. Podem estar brevemente descritos em referências tais como o "Merck índex", 12a edição, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, Nova Jérsei, 1996 (que tipicamente apresenta uma referência para uma síntese ou isolamento), e podem ser encontrados em catálogos químicos, como os de fornecedores comerciais, como descrito aqui.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL A invenção tem utilidade em todo o mundo pelo fato de proporcionar alívio terapêutico e assistência ao diagnóstico no tratamento de doença de Parkinson e doença de corpos de Lewy, por utilização de uma catequina.

De acordo com os estatutos, a invenção foi descrita em linguagem mais ou menos específica no que se refere a características estruturais. No entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada às caracteristicas específicas apresentadas, uma vez que os meios e construção apresentados compreendem formas preferidas de implementar a invenção. Em consequência, a invenção é reivindicada em qualquer uma das suas formas ou modificações no âmbito legítimo e válido das reivindicações adjuntas, 102 apropriadamente interpretadas de acordo com a doutrina de equivalentes .

Lisboa, 27 de Julho de 2012

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma catequina na preparação de um medicamento para o tratamento de doença de Parkinson ou doença de corpos de Lewy, em que a catequina é selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores.

2. Catequina selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores, para o tratamento de doença de Parkinson ou doença de corpos de Lewy.

3. Utilização da reivindicação 1, em que o medicamento se destina a administração oral, injeção parentérica, injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, administração tópica, ou administração por pulverização de aerossol.

4. Catequina da reivindicação 2, que se destina a administração oral, injeção parentérica, injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, administração tópica, ou administração por pulverização de aerossol.

5. Método sinucleína compreende quantidade de uma de tratamento de fibrilogénese de alfa-ou NAC num ambiente in vitro, em que o método o passo de administrar no ambiente in vitro uma terapeuticamente eficaz de uma catequina 2 selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores.

6. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de doença de Parkinson ou doença de corpos de Lewy, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma catequina selecionada do grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e sais farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores, e um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da catequina compreende uma dosagem situada no intervalo de cerca de 0,1 até 500 mg/kg de peso do corpo do sujeito.

7. Composição da reivindicação 6, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da catequina compreende uma dosagem situada no intervalo de cerca de 1,0 até 100 mg/kg de peso do corpo do sujeito. sars

8. Composição da reivindicação 6 ou reivindicação 7, que compreende uma mistura de duas ou mais das catequinas selecionadas grupo que consiste em catequina, epicatequina, galhato de galhocatequina, galhato de epigalhocatequina, epigalhocatequina e galhato de epicatequina, e farmaceuticamente aceitáveis das catequinas anteriores. 3

9. Composição da reivindicação catequina selecionada está substancialmente pura. Lisboa, 27 de Julho de 2012 6, 7 ou 8, em forma em que isolada