PT1230392E

PT1230392E - Sistema de segurança

Info

Publication number: PT1230392E
Application number: PT00977665T
Authority: PT
Inventors: Tom Brown; Nichola Thelwell; Paula Maxwell; Paul Maxwell; Paul Whiting
Original assignee: Crime Solutions Ltd
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-20
Publication date: 2010-10-12
Also published as: CY1111278T1; ATE473292T1; AU1530401A; GB9927292D0; EP1230392B1; DK1230392T3; EP1230392A2; WO2001036676A3; WO2001036676A2; ES2348589T3; DE60044647D1

Description

PE 1230392 - 1 -

DESCRIÇÃO "SISTEMA DE SEGURANÇA" A presente invenção diz respeito a marcadores de segurança para marcação de objectos e pessoas, a procedimentos para utilização de tais marcadores, a procedimentos para detecção de marcadores, e a dispositivos de segurança que contenham tais marcadores. Em particular, os marcadores de segurança usados consistem numa molécula de ácido nucleico que possa ser exclusivamente identificada com uma origem especifica do marcador de segurança.

Os marcadores de segurança para identificação dos direitos de propriedade sobre um artigo são já bem conhecidos nesta tecnologia. Alguns marcadores utilizam uma formulação específica de diferentes compostos químicos para identificar o facto de um objecto ser propriedade de alguém, ou se encontrar num local específico. Esses marcadores químicos são, por exemplo, divulgados pelo documento GB 2245583. Tais sistemas apenas apresentam um número limitado de compostos de identificação, tornando assim difícil identificar de forma exclusiva um grande número de localizações.

Os marcadores de segurança que envolvem a utilização de moléculas de ácido nucleico são também já -2- ΡΕ1230392 conhecidos nesta tecnologia, como é, por exemplo, divulgado nos documentos WO 94/04918, WO 87/06383 e WO 95/02702. Esses marcadores de segurança podem ser simplesmente identificados pelo uso de uma sonda adequada, a qual pode hibridar para o ácido nucleico dentro do marcador. A utilização da reacção em cadeia da polimerase ("Polymerase Chain Reaction - PCR") para isolar e multiplicar uma amostra de ácido nucleico dentro de um marcador de segurança é já conhecida, como se divulga no documento WO 90/14441. O documento WO 95/02702 promove a divulgação de um procedimento para marcação de artigos com grânulos ("beads") tendo ácidos nucleicos fixados nos mesmos. O documento US 5 451 505 promove a divulgação de um procedimento para marcação e rastreio de materiais que utilizam ácidos nucleicos como meios de marcação. O documento US 5 643 728 promove a divulgação de um procedimento para marcação de um liquido com uma multiplicidade de particulas contendo ácido nucleico.

Uma vantagem de se usar uma molécula de ácido nucleico como marcador de segurança consiste em que apenas uma sequência exclusiva de nucleótidos pode ser utilizada para cada utilizador do marcador de segurança, ou para cada localização onde é utilizado um marcador de segurança. A utilização de oligonucleótidos apresentando sequências -3- PE 1230392 aleatórias de ácidos nucleicos é divulgada pelo documento US 5 139 812.

Os inventores aperceberam-se de que existe um mercado para marcadores de segurança melhorados. Tais marcadores de segurança podem ser usados para marcar produtos ou, alternativamente, ser utilizados num sistema de segurança, no qual eles são pulverizados sobre um intruso após a activação de um adequado accionador. Neste último caso, esses marcadores de segurança são úteis para demonstrar que um intruso terá estado presente na cena de um crime.

Sempre que um destes marcadores é usado com o objectivo de detecção de crimes, torna-se importante que a detecção do marcador se encontre tão desprovida de erros quanto possível, para reduzir a possibilidade de condenar terceiros falsamente.

Os inventores aperceberam-se que a reacção em cadeia da polimerase para uma cadeia de ácido nucleico usando um precursor adequado, a que se segue a sequenciação a partir do precursor, nem sempre produz uma sequência consistente para todos os DNA de marcador. Torna-se por isso útil dispor de uma cópia de segurança para confirmar a sequência de qualquer sequência exclusiva de uma região de marcador do marcador de segurança. Os inventores terão para isso disponibilizado uma região de segundo precursor sobre o marcador de segurança, a qual permite que a sequência da -4- PE 1230392 região de marcador seja confirmada, ao possibilitar que a cadeia complementar seja produzida por PCR, e que seja seguidamente sequenciada utilizando um segundo precursor.

Nestas circunstâncias, uma primeira vertente da invenção proporciona um procedimento para produção de um marcador de segurança destinado à marcação de objectos e/ou pessoas, em conformidade com o que as reivindicações estabelecem.

As expressões "substancialmente idêntico ao primeiro precursor" ou "essencialmente o complemento inverso de um segundo precursor" têm como significado que existe uma homologia suficiente, para permitir que o primeiro precursor ou o segundo precursor e a região à qual se ligam sobre o marcador de segurança, ou sobre uma molécula de ácido nucleico em complementaridade com o marcador de segurança, consigam hibridar sob condições de elevado rigor. Tais condições estarão de preferência submetidas a condições típicas de PCR.

De preferência, o marcador de segurança irá consistir numa molécula de ácido nucleico de cadeia simples, a qual é mais fácil de produzir sob a forma de oligonucleótido. Em alternativa, podem ser usados marcadores de cadeia dupla.

Durante a utilização, de preferência, o segundo precursor será usado para permitir que a molécula de ácido -5- PE 1230392 nucleico possa replicar por PCR, assim produzindo uma segunda cadeia de ácido nucleico em complementaridade. A cadeia em complementaridade irá portanto integrar uma região de precursor que dispõe da sequência correcta para permitir que o primeiro precursor se ligue a ela. 0 primeiro precursor poderá então ser usado para multiplicar a cadeia de ácido nucleico em complementaridade.

De preferência, a região de precursor em complementaridade situar-se-á a jusante da região de marcador.

Os inventores também se aperceberam que, quando um marcador tiver sido fixado num objecto ou num intruso, a titulo de exemplo, existirá frequentemente uma grande quantidade de fragmentos de DNA contaminantes provenientes de, por exemplo, seres humanos e/ou quaisquer animais domésticos como cães e gatos, que estão em redor do objecto ou do intruso.

Nestas circunstâncias, a sequência de ácido nucleico do primeiro precursor e a sequência de ácido nucleico do segundo precursor serão seleccionadas, pelo que haverá uma baixa probabilidade para que as respectivas regiões de ligação de precursor ocorram com 150 bases ou 120 ou 100 bases umas das outras, no DNA nativo. Ou seja, as sequências que naturalmente ocorrem, às quais os precursores utilizados com o marcador de segurança se poderiam ligar sob condições de elevado rigor, não irão -6- PE 1230392 normalmente ocorrer no intervalo de 150 bases uma da outra, no DNA nativo.

Preferivelmente, a probabilidade será inferior a 95%, em particular inferior a 97%, e com maior grau de preferência inferior a 99%.

Por elevado rigor quer-se significar, a titulo de exemplo, 1,5 mM de MgCl2, temperatura de recozimento de 53 °C.

Isto foi conseguido por intermédio de uma cuidadosa selecção dos precursores utilizados para comparação com as bases de dados publicamente disponíveis de sequências de nucleótidos. De preferência, o DNA nativo será procariótico ou eucariótico, particularmente DNA humano, de cão, gato, rato, ratazana, e/ou de insecto.

Isto tem a vantagem de ser possível identificar rapidamente os fragmentos de DNA ampliados contendo a região de marcador, pelo seu tamanho. Um ou outro precursor poderá ligar-se a DNA de marcadores de que não sejam de segurança, mas para produzir um produto de PCR é requerido que ambos os precursores se liguem e estes são susceptíveis de apenas produzir DNA com um tamanho diferente do DNA do marcador de segurança, permitindo assim que tais fragmentos sejam facilmente descontados.

Uma vez que uma amostra contendo um marcador de segurança tiver sido identificada, o marcador de segurança -7- PE1230392 poderá então ser sequenciado para determinar a sequência exacta da região de marcador.

De preferência, os precursores e as regiões às quais eles se ligam sobre o marcador de segurança, ou sobre uma molécula em complementaridade, estarão 100% em complementaridade relativamente à sua região de ligação. Isso permite que sejam usados elevados niveis de rigor para examinar a presença de marcador.

Num modelo de realização particularmente preferido, os inventores conseguiram identificar o ácido nucleico proveniente da preguiça de garganta castanha (Bradypus variegatus). A sequência particularmente preferida da preguiça de garganta castanha usada é uma sequência de ácido nucleico correspondente ao gene mitocondrial ND1 da preguiça. A expressão ácido nucleico diz respeito a DNA ou RNA de cadeia única ou dupla com origem natural ou sintética, ou aos seus derivados sintéticos que podem ser total ou parcialmente constituídos por bases raras ou bases modificadas.

As regiões de precursor são dispostas sobre o ácido nucleico, para permitir que um adequado precursor de ácido nucleico consiga hibridar selectivamente para a região de precursor, possibilitando assim que o marcador de -8- PE 1230392 segurança que contém a região de marcador seja ampliado a partir de uma amostra.

De preferência, a região de precursor irá consistir num número de nucleótidos situado entre 15 e 50 de preferência de 17 a 30, e particularmente por 18 nucleótidos - para permitir um rigor de hibridação suficientemente elevado, com um precursor apropriado usado para identificar a presença do marcador de segurança. O próprio precursor pode ser usado para ampliar directamente o marcador de segurança através de, por exemplo, uma reacção em cadeia da polimerase. 0 primeiro precursor e o segundo precursor podem ser iguais ou diferentes. A própria região de marcador contém uma pré-determinada sequência de ácido nucleico, que será preferencialmente exclusiva para o proprietário de um marcador de segurança em particular, ou para uma localização em particular, como por exemplo um específico edifício fabril, ou um carro específico. A título de exemplo, quando o marcador de segurança tiver sido usado num artigo, esse artigo tiver sido roubado e posteriormente recuperado pela polícia, o dono do artigo roubado poderá ser rastreado após o marcador de segurança ter sido identificado pela sequenciação da sequência do marcador. Como alternativa, e a título de exemplo, para o caso de o marcador de segurança ter sido pulverizado sobre um -9- PE 1230392 intruso, a sequência exclusiva do marcador de segurança poderá posteriormente identificar o facto de o intruso ter estado dentro de uma particular instalação fabril, ou dentro de um carro, quando, por exemplo, foi activado um dispositivo de segurança que continha o marcador de segurança. A expressão "em complementaridade" define a relação entre duas cadeias de DNA - ou de DNA e RNA - que estarão em complementaridade uma com a outra se as suas sequências estiverem relacionadas por regras baseadas em emparelhamento. Concretamente, a sequência ATCG está em complementaridade com a sequência TAGC e em emparelhamento com ela pela ligação de hidrogénio. Nestas circunstâncias, a exactidão da sequenciação da região de marcador pode ser determinada ao comparar a sequência com a sequência obtida para o marcador a partir do segundo precursor, e observando se as duas sequências estão em complementaridade uma com a outra.

De preferência, a região de marcador consiste num número de nucleótidos situado entre 10 e 30, em particular entre 15 e 25, e com maior grau de preferência com 20 nucleótidos de comprimento. Isso permite um grande número de sequências exclusivas, cada uma das quais será exclusiva para uma aplicação particular do marcador de segurança a ser gerado. - 10- PE 1230392 0 precursor, ou cada um deles, pode estar separado da região de marcador por um troço de nucleótidos que poderá chegar a 50, em particular situado entre 20 e 40, mais preferivelmente por um troço com 20 a 30 nucleótidos de comprimento. Os inventores descobriram que a existência do troço de nucleótidos entre o precursor e a região de marcador contribui para melhorar o rigor da sequenciação do marcador de segurança. A molécula de ácido nucleico dentro do marcador de segurança pode ser marcada. Ela poderá, a titulo de exemplo, ser marcada com um corante visivel que permita que o marcador de segurança possa ser facilmente visto a olho nu. Alternativamente, a marca pode consistir num corante fluorescente que permite que a molécula de ácido nucleico seja identificada sob luz ultravioleta.

Diversos exemplos de apropriados marcadores de segurança são apresentados na Tabela 1. PE 1230392 - 11 -

Tabela 1

Características espectrais de corantes fluorescentes adequados para marcar oligonucleótidos Corante Comprimento de onda de absorção Comprimento de onda de emissão Coeficiente de extinção M^1cm_1 Quantum produzido FAM-5 ou FAM-6 (fluoresceina) 500 525 TET 525 550 JOE 530 555 HEX 540 565 TAMRA 555 580 ROX 585 610 BIODIPY FL C3 502 510 82 400 BIODIPY FL-X 503 510 85 306 BIODIPY TMR-X C3 544 570 55 586 BIODIPY 493/503 493 503 79 169 BIODIPY 530/550 530 550 77 000 BIODIPY 558/568 558 568 95 700 BIODIPY 564/570 564 570 141 650 BIODIPY 576/589 576 589 83 400 BIODIPY 581/591 581 591 135 900 BIODIPY TR-X C3 587 616 67 700 Cy2 489 506 150 000 >0,12 Cy3 550 570 150 000 >0,15 Cy3.5 581 596 150 000 >0,15 Cy5 649 670 250 000 >0,28 Cy5.5 675 694 250 000 >0,28 Cy7 743 767 250 000 0,3 Fluor X 494 520 68 000 R6G (6-carboxi-rodamina 6G 535 555 Texas red 584 603 116 300

Como alternativa, o marcador de segurança pode incluir uma ou mais marcas separadas, por exemplo marcas colorimétricas e/ou fluorescentes.

As moléculas de ácido nucleico, quando expostas à superfície de qualquer objecto, podem ser degradadas por nucleases que ocorrem naturalmente, tais como as exonucleases 3' ou exonucleases 5' . Tais nucleases podem-se - 12- PE 1230392 encontrar presentes sobre a pele de uma pessoa, ou serem provenientes de bactérias sobre a superfície de um objecto. Torna-se portanto desejável conseguir melhorar a resistência dos marcadores de segurança relativamente ao ataque de tais enzimas. Nestas circunstâncias, a molécula de ácido nucleico irá de preferência apresentar, numa ou em ambas as extremidades, um agente de bloqueio. Destes agentes de bloqueio fazem parte os agentes que são já conhecidos por resistirem ao ataque de nucleases, tais como o acoplamento de tiofosfato ("phosphothioate linkage"), nucleósidos não naturais, dendrímeros ou grupos de amino alquil.

Também é desejável que o marcador de segurança seja colado a um objecto sobre o qual ele deverá ser fixado. A molécula de ácido nucleico irá preferivelmente conter um ou mais agentes de ligação que ajudam à fixação da molécula de ácido nucleico num objecto. Os agentes de ligação podem incluir biotina, vitamina E, colesterol e tiofosfatos. A biotina, a vitamina E e o colesterol podem ser utilizados, uma vez que são moléculas solúveis em gordura que permitem que a molécula de ácido nucleico se vá fixar na pele de um intruso. Além disso, a biotina é particularmente útil porque as moléculas de ácido nucleico contendo biotina, que tenham sido obtidas a partir de uma amostra, podem ser facilmente isoladas fazendo passar uma solução feita a partir da amostra através de uma coluna contendo avidina. A molécula de ácido nucleico contendo - 13- PE1230392 biotina pode-se ligar à avidina sobre a coluna, permitindo-lhe que seja isolada e purificada.

Os tiofosfatos são utilizáveis como agentes de ligação, porque o tiofosfato irá formar ligações de dissulfeto com os residuos de cisterna que ocorrem naturalmente em proteínas tais como a lã, o cabelo, as unhas, etc. 0 marcador de segurança pode ser removido da superfície de um objecto, por qualquer meio adequado. Por exemplo, a limpeza com utilização de etanol tem provado funcionar bem. Também podem ser utilizados raspadores de pele. 0 ditiotreitol ("Dithiothreitol DTT") tem mostrado ser útil no isolamento de marcadores de segurança que integrem tiofosfato incorporado dentro da molécula de ácido nucleico. 0 DTT desnatura quaisquer ligações de dissulfeto entre o tiofosfato e as proteínas sobre o objecto que fora marcado, libertando assim o marcador de segurança.

Podem ser utilizados marcadores de segurança marcados com diferente coloração ou diferente fluorescência para diferentes situações. Por exemplo, uma determinada cor pode ser usada num país e não noutro, assim permitindo a identificação de pessoas suspeitas de serem criminosas quando elas por exemplo passarem na fronteira. Alternativamente, diferentes cores podem ser usadas para diferentes situações, por exemplo para demonstrar que uma pessoa terá levado a cabo o roubo de um carro, ou terá - 14- PE 1230392 estado envolvida numa intrusão ilegal numa instalação fabril. A invenção também diz respeito à utilização de um marcador de segurança, em conformidade com a invenção, para marcar um objecto. É igualmente disponibilizado um procedimento para marcação de um objecto, incluindo a aplicação de um marcador de segurança em conformidade com a invenção. Um marcador de segurança poderá ser aplicado por qualquer meio adequado, como por exemplo usando um pincel, um spray, um aerossol, ou um fluxo. Em termos preferenciais, o objecto será um ser humano, por exemplo um intruso. São ainda disponibilizados procedimentos para detecção de marcadores de segurança em conformidade com a invenção, em que um procedimento é constituído pelas seguintes etapas: (i) obtenção de uma amostra de um objecto que potencialmente tenha sido marcado com uma marcador de segurança em conformidade com a invenção; (ii) ampliação do marcador com dois precursores capazes de selectivamente ligar ácido nucleico ao marcador; e (iii) promover a sequenciação de qualquer marcador de segurança identificado a partir de um precursor, pelo menos, para determinar a sequência de ácido - 15- PE 1230392 nucleico da região de marcador dentro do marcador de segurança. 0 marcador de segurança pode ser ampliado, a titulo de exemplo, por intermédio de PCR antes da sequenciação da região de primeiro marcador. 0 marcador de segurança poderá adicionalmente ser examinado com uma segunda sonda capaz de hibridar para a região de segundo precursor, uma vez que o marcador tenha sido replicado para formar uma cadeia em complementaridade, por exemplo através de PCR, e a região de segundo marcador será então sequenciada.

As regiões de marcador poderão ser sequenciadas por quaisquer dos métodos já conhecidos nesta tecnologia, como a sequenciação de "dideoxy" (método de Sangler), a sequenciação de espectrometria de massa, ou outras técnicas já conhecidas nesta tecnologia

Tal sequenciação pode ocorrer após a ampliação inicial por PCR, ou directamente usando por exemplo mini sequenciação. A sequência da região de marcador pode ser comparada com uma base de dados para determinar a origem do marcador de segurança. Ou seja, para permitir por exemplo que o proprietário do objecto seja identificado, ou para - 16- PE 1230392 identificar o local onde um principal suspeito poderá ter sido exposto ao marcador de segurança.

Uma outra vertente da invenção disponibiliza um kit de segurança que inclui um marcador de segurança em conformidade com a invenção. 0 kit de segurança pode integrar um marcador de segurança no seio de uma solução adequada ou, por exemplo, no seio de uma matéria gordurosa. A matéria gordurosa pode ser útil para assegurar que uma amostra de tecido é marcada com sucesso. A invenção passa agora a ser descrita, a titulo de exemplo, apenas fazendo referência aos desenhos seguintes. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático que representa um marcador de segurança em conformidade com a invenção. A Figura 2 mostra: A) a sequência de nucleótidos obtida a partir de um marcador de segurança em conformidade com a invenção; e B) a marca de sequenciação obtida. A Figura 3 mostra um diagrama de fluxo indicando a utilização de um marcador de segurança da invenção. A Figura 4 mostra um resumo da utilização de um marcador de segurança em conformidade com a invenção. - 17 - PE 1230392 A Figura la mostra uma molécula de ácido nucleico de cadeia única. A molécula de ácido nucleico pode ser de DNA ou RNA. A cadeia compreende uma região de primeiro precursor e, a jusante da região de precursor, uma região de marcador e uma região de precursor em complementaridade. Mediante a realização da PCR com um precursor capaz de fazer a ligação da região de segundo precursor, é produzida uma cadeia em complementaridade (lb) . A cadeia em complementaridade apresenta uma região funcional de primeiro precursor com capacidade para estar ligada por um primeiro precursor. Ela também apresenta uma região de marcador em complementaridade com a região de marcador sobre o marcador original.

Os inventores descobriram que uma sequência de precursor particularmente útil pode ser obtida a partir da preguiça de garganta castanha. Esta apresenta a seguinte sequência: 5'-ta cccacgattccgctacgatc aactaataca cttgctatga aaaaatttcc tcccactcac cctggccctatgca cgtgacacataacc-3'

Esta é obtida a partir do gene mitocondrial ND1 do organismo.

Ela foi usada para criar os seguintes precursores: 1.5'-ta cccacgattccgctac-3'. 2.5'-ggttatgtgtcacgtgca-3'. - 18- PE 1230392

As sequências de precursor foram fixadas a sequências exclusivas de marcadores, por exemplo com sequência: gaaaaaatttcctcccactcac que foram separadas das sequências de precursor por um troço de 22 bases a partir de uma região de precursor, 10 bases a partir de uma região de segundo precursor.

As moléculas de ácido nucleico podem ser preparadas por métodos convencionais em fase sólida, normalmente num sintetizador de DNA automatizado. O método mais comum envolve o recurso à química de fosforamidite de β-cianoetil, conforme descrito nas seguintes publicações:

The synthesis of chemically labelled PCR primers. D.J.S. Brown e T. Brown (1995). "PCR: essential data" Wiley, ed C.R. Newton, Capítulo 7, pp 57-70.

Preparation of synthetic oligodeoxynucleotide probes. T. Brown e J. Grzybowski (1995) "Gene probes: a Practical Approach". IRL press. Capítulo 5, 146-167.

Os oligonucleótidos também podem ser sintetizados por métodos manuais em fase sólida, ou por métodos em fase - 19- PE1230392 de solução, mas o método automatizado em fase sólida tem como vantagem um alto rendimento.

Também pode ser usado DNA isolado a partir de origens biológicas.

Opcionalmente, as moléculas de ácido nucleico continham vitamina E, colesterol, tiofosfato e/ou FAM (um corante de fluoresceina).

As amostras do marcador de segurança foram colocadas em cima de amostras como, por exemplo, de tecido ou pele.

Protocolo da Reacção em Cadeia da Polimerase

Foram usadas técnicas convencionais de PCR para identificar e multiplicar as sequências. Uma típica mistura de reacção com 50 μί contém: - 10 x tampão ("buffer") de PCR desenvolvido para reacções SYBR Green sobre o sistema de detecção 7700 da sequência ABI Prism, que foi obtida da Genesys. - 200 μΜ dNTP's (usando uma mistura de dUTP e dTTP) . - 0,5 μΜ de concentração de ambos os precursores. - 1,5 mM de MgCl2. - 1 unidade de enzima Hot GoldStar (uma polimerase TAQ). - 0,5 unidades de UNG. -20- PE 1230392

As condições típicas de realização de ciclo foram: 53 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos, e depois 72 °C durante 30 segundos. Foi realizado um prolongamento final a 72 °C durante 7 minutos.

Os resultados foram analisados relativamente ao tamanho do produto, usando 5 μ£ de produto num gel de agarose a 2%. A recuperação de um DNA a partir de tecidos de algodão (5μί de uma solução de 0,04ng/mí de DNA adicionada a uma pequena mancha, permitindo a sua secagem e deixando-a na bancada do laboratório) - através da imersão do tecido em 1 m£ de água esterilizada ou etanol durante 1 hora, a que opcionalmente se segue a remoção de tecido - é possível durante pelo menos 1 semana. Quando foi utilizado o etanol, a este processo seguiu-se a precipitação do etanol. A água foi congelada até ao final da semana, quando as reacções de PCR foram conjuntamente realizadas utilizando 5 μ£ da água.

Todas as amostras deram um bom produto de PCR com o tamanho esperado. A lavagem do tecido a 40 °C reduziu a quantidade de produto, o mesmo acontecendo com a passagem a ferro e a lavagem seguida de passagem a ferro.

Verificou-se que a Biotina e a VitaminaE não inibiram a PCR ou a sequenciação, quando ligadas à -21 - PE 1230392 extremidade 5' da marca. Os produtos de PCR foram sequenciados a seguir à purificação da PCR usando um kit de Quiagen. Ambos deram sequências, tendo o precursor inferior dado uma melhor sequência do que o precursor superior.

Verificou-se que a Biotina e a Vitamina E se mantiveram sobre o tecido (5μ£ de 0,04ng/m£) ao longo de 3 dias, e puderam ser recuperadas por imersão em 2 m£ de água durante 1 hora, seguindo-se o congelamento da amostra.

As marcas de Biotina e Vitamina E também podem ser recuperadas a partir da pele, limpando com lã de algodão (não absorvente) humedecida, após os 5 μ£ de 0,04ng/m£ terem sido deixados secar durante 10 minutos sobre a superfície da pele. A Biotina deu o melhor resultado. Não houve contaminação quando se limpou uma área de pele que não havia sido tratada com marcas.

Após 24 horas (tendo a pele sido normalmente tratada, ou seja, lavada), a Biotina pôde ser recuperada e deu um bom produto de PCR, embora inferior ao que foi obtido após 10 minutos. 0 colesterol pôde igualmente ser recuperado com êxito a partir de tecido e pele, tanto imediatamente a seguir à aplicação como após 24 horas, usando água ou etanol. Verificou-se também que se manteve no tecido após ter sido lavado a 60 °C. -22- PE 1230392

Foram produzidos dois diferentes marcadores, os quais foram marcados com FAM. Um deles foi marcado com FAM, e o outro apresentava FAM numa extremidade e 3 ligações de tiofosfatos na outra extremidade, entre adicionais bases de timina acrescentadas à molécula. Pensa-se que as ligações de tiofosfatos servem para ligar às proteínas na pele, fazendo com que o marcador de segurança se fixe nela. 0 FAM foi fixado usando química de fosforamidite Standard com extensão do tempo de acoplamento. 0 tiofosfato foi adicionado usando um ciclo de tiofosfato Standard, substituindo o iodo por dissulfureto de tiourama tetraetil ("tetraethyl thiuramdisulphide - TETD") como agente oxidante. A marca com as ligações de tiofosfato foi recuperada com sucesso, ao limpar a pele com 1% de DTT, seguido por imersão da colheita em 3 mi de etanol a 70% e 0,3 MNaOAc. A recuperação a partir do tecido foi realizada por imersão do tecido em 2 mí de DTT a 1% durante 10 minutos.

Foi então recuperado o DNA a partir da amostra por precipitação com etanol, utilizando técnicas já conhecidas nesta tecnologia.

Observou-se que nem o FAM nem as ligações de tiofosfatos inibiram a PCR. -23- PE 1230392

Além disso, os produtos de PCR foram recuperados com sucesso usando o sistema atrás descrito.

Um exemplo de uma sequência obtida a partir de um marcador de segurança é mostrado na Figura 2. A Figura 2A mostra a sequência de marcador e a Figura 2B mostra o rastreio da sequência ABI Prism. A Figura 3 mostra um espaço fechado - como por exemplo uma sala grande, mas que poderá igualmente ser um reboque, uma caravana, ou qualquer outro tipo de veiculo. De igual modo, a área não tem necessariamente de ser fechada. O espaço identificado pelo número de referência 10 está equipado com um convencional detector de movimento. Este poderá consistir num sensor duplo - tanto de infravermelho passivo e microondas, como de infravermelho passivo e ultra-sons - para dar redundância ao sistema, mas em algumas circunstâncias será suficiente usar uma única tecnologia convencional, se a área de cobertura não for hostil. O procedimento de detecção está identificado pelo número de referência 12, podendo ser ligados múltiplos sensores para dar uma cobertura correcta, juntamente com as advertências adequadas e os horários de entrada e de saída. Os sensores estão ligados a um painel de comando principal identificado pelo número de referência 14, em que tal painel de comando tem capacidade para armazenamento da hora, data e local, e para identificar o utilizador com -24- PE 1230392 registo de entrada e saída, etc. Ele tem igualmente capacidade para enviar, via GSM ou telefone fixo e conforme indica o número de referência 17, o código da sequência de DNA - com data, hora e local - para um centro de monitorização à distância identificado pelo número de referência 18, cuja activação irá automaticamente actualizar a base de dados identificada pelo número de referência 20. 0 processo de comunicação é realizado através de um comunicador digital, enviando um código digital para um receptor digital, tendo o receptor digital a capacidade para dar prioridade e ordenar chamadas, se necessário.

Mediante a activação do painel de comando, de acordo com critérios indicativos de alarme previamente estabelecidos, o equipamento de dispersão irá ser accionado em combinação com o dispositivo identificado pelo número de referência 16, indo este dispositivo gerar uma névoa combinada com a sequência de marcadores de DNA, conforme indica o número de referência 21. 0 dispositivo 16 gera uma névoa que preenche o espaço 10 com um caudal de 17 m3 por segundo, 340 m3 em 20 segundos, a trabalhar a +4 bar (58PSI) . A névoa é produzida a partir de um líquido aquecido (a 134 °C) . Tratando-se de um líquido à base de glicol (Etanol) (CAS NO 64-17-5) , este é mantido a uma temperatura exacta por intermédio de dois elementos de aquecimento identificados pelo número de referência 23, estando um deles ligado ao depósito de -25- PE 1230392 líquido identificado pelo número de referência 22 e o outro ao permutador de calor identificado pelo número de referência 24, para produzir uma névoa adequada. No presente modelo de realização, o marcador de segurança pode ser introduzido numa acção capilar, ou ser directamente adicionado através da válvula dupla identificada pelo número de referência 25, ou por meios próprios a partir do seu correspondente recipiente pressurizado identificado pelo número de referência 26. 0 dispositivo 16 dispõe de um microprocessador integrado, identificado pelo número de referência 28, para controlar os respectivos inputs e outputs e a temperatura de funcionamento. 0 marcador de segurança também pode ser adicionado a água esterilizada, CO2, etc., e pressurizado. A sua libertação controlada pode ser realizada através de válvula, solenoide, cápsula explosiva, ou bomba, para produzir um controlado jacto de liquido finamente pulverizado, de vapor, ou um spray.

No caso de ocorrer uma situação de alarme, o dispositivo 16 é activado, preenchendo rapidamente a área 10 com a solução. Ao mesmo tempo, é feito o registo da activação em conjunto com os detalhes do local, data, hora e código exclusivo na RAM 29, o qual é seguidamente enviado através do painel de comando 14 para a sala de comando 18, para ser registado na base de dados 20. -26- PE 1230392

Um exemplo típico consiste na utilização de um jacto de água, que poderá ser usado no controlo de manifestações e multidões, para identificar pessoas ou objectos que tenham estado presentes num determinado momento e lugar. A névoa, à medida que vai sendo gerada pelo dispositivo 16, irá assentar sobre o vestuário e as partes expostas do corpo de intrusos, e também sobre os objectos dentro do espaço 10. A névoa irá secar para interromper a contaminação cruzada.

Se um intruso for capturado num determinado local, ou se uma pessoa vier posteriormente a tornar-se suspeita ou for já conhecida pelas autoridades, ele poderá ser examinado sob condições controladas e, se o corante encoberto for detectado, poderá ser recolhida uma amostra a partir do suspeito ou do vestuário, da maneira habitual. 0 mesmo pode ser feito para os objectos de que haja suspeita de terem sido roubados num determinado local. Isto é importante ao usar as técnicas normais da ciência forense -para ampliar o marcador de segurança de DNA por PCR, a que se segue uma sequenciação em duas direcções para produzir dados que sejam rigorosos e fiáveis - pois este processo será utilizado nos tribunais para sustentar uma acusação bem-sucedida. A introdução destes dados numa base de dados segura destina-se à pesquisa e recuperação da original -27- PE1230392 sequência de correspondência obtida a partir do material originalmente fornecido.

Desta forma, torna-se possível comprovar que uma determinada pessoa ou um determinado objecto esteve presente num local especificado, e a uma hora e data específicas.

Um outro modelo de realização para a presente invenção consiste em usar a solução com codificação exclusiva para impregnar um material, com o fim de ser usado como um método de autenticidade e capacidade de rastreio para qualquer material ou objecto. A Figura 4 resume o procedimento para detecção do marcador de segurança.

Lisboa, 4 de Outubro de 2010

Claims

PE 1230392 - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um procedimento para produção de um marcador de segurança destinado à marcação de objectos e/ou pessoas, sendo o referido procedimento constituído pelas seguintes etapas: (A) disponibilização de uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de 40 a 230 nucleótidos, sendo tal sequência formada por: (i) uma região de primeiro precursor que consiste em 15 a 50 nucleótidos, em que tal região de primeiro precursor é substancialmente idêntica a um primeiro precursor, e ligada à região de primeiro precursor; (ii) uma região de marcador que compreende uma predeterminada sequência de ácido nucleico capaz de identificar a origem do marcador de segurança; e (iii) uma região de segundo precursor que consiste em 15 a 50 nucleótidos e que seja essencialmente o complemento inverso de um segundo precursor, e em que tal região de segundo precursor seja capaz de ser ligada pelo segundo precursor; e (B) exame da sequência de ácido nucleico da região de primeiro precursor (ou do primeiro precursor) e da sequência de ácido nucleico da região de segundo precursor (ou do segundo precursor) em comparação com uma base de dados publicamente disponível, para confirmar que as sequências de ácido nucleico das regiões de primeiro e -2- PE 1230392 segundo precursor não ocorrem no intervalo de 150 bases uma da outra, numa sequência de DNA nativa proveniente de seres humanos, cães, gatos, ratos, ratazanas, insectos ou organismos procarióticos.
2. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com a reivindicação 1, em que a região de precursor em complementaridade se encontra a jusante da região de marcador.
3. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, em que a região de primeiro precursor é diferente da região de segundo precursor.
4. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, em que a região de precursor, ou cada uma delas, é derivada a partir da Preguiça de Garganta Castanha (Bradypus variegatus).
5. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com a reivindicação 4, em que a região de precursor, ou cada uma delas, é derivada do gene mitocondrial ND1.
6. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes -3- PE 1230392 reivindicações, em que a região de marcador consiste num número de nucleótidos situado entre 10 e 30.
7. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, em que a região de precursor, ou cada uma delas, consiste num número de nucleótidos situado entre 17 e 30.
8. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, em que a região de precursor, ou cada uma delas, está separada da região de marcador por um troço de 20 a 50 nucleótidos.
9. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, no qual a molécula de ácido nucleico é marcada.
10. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com a reivindicação 9, onde a marca consiste num corante fluorescente.
11. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, integrando adicionalmente uma marca separada colorimétrica e/ou fluorescente. -4- PE 1230392
12. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, no qual a molécula de ácido nucleico apresenta um agente de bloqueio, numa ou em ambas as extremidades.
13. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com a reivindicação 12, onde o agente de bloqueio consiste num composto de tiofosfato, um nucleósido não natural, um dendrimero ou um grupo amino alquil.
14. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com qualquer uma das precedentes reivindicações, no qual a molécula de ácido nucleico integra adicionalmente um ou mais agentes de ligação fixados na molécula de ácido nucleico.
15. Um procedimento para produção de um marcador de segurança de acordo com a reivindicação 14, em que o agente de ligação consiste em biotina, vitamina E, colesterol ou num tiofosfato.
16. Um procedimento para produção de um marcador de segurança e fixação desse marcador num objecto e/ou pessoa, em que tal procedimento é constituído pelas seguintes etapas: -5- PE 1230392 (i) produção desse marcador de segurança através de um procedimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e (ii) aplicação deste marcador de segurança a um obj ecto.
17. Um procedimento de acordo com a reivindicação 16, onde o marcador de segurança é aplicado por meio de um pincel, um spray, um aerossol ou um fluxo.
18. Um procedimento de acordo com a reivindicação 16 ou 17, onde o objecto consiste num ser humano.
19. Um procedimento para produção de um marcador de segurança e fixação desse marcador num objecto e/ou pessoa, seguido pela detecção de tal marcador de segurança, em que tal procedimento é constituído pelas seguintes etapas: (i) produção e fixação desse marcador de segurança através de um procedimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18; e (ii) detecção desse marcador de segurança por intermédio de: (a) obtenção de uma amostra a partir de um objecto que tenha sido marcado com o dito marcador de segurança; (b) ampliação da sequência de ácido nucleico do marcador de segurança com dois precursores capazes de se -6- PE 1230392 ligarem selectivamente ao ácido nucleico do marcador, em que, no decurso da utilização, o primeiro precursor se liga a uma sequência em complementaridade com a região do primeiro precursor, e o segundo precursor se liga à região de segundo precursor; e (c) identificação de fragmentos ampliados contendo a região de marcador de segurança, pelo tamanho.
20. Um procedimento de acordo com a reivindicação 19, onde a etapa de detecção (ii) ainda inclui a sequenciação de qualquer marcador de segurança identificado a partir de um precursor, pelo menos, para determinar a sequência de ácido nucleico da região de marcador dentro do marcador de segurança, em que o marcador de segurança identificado pelo procedimento será de preferência ampliado antes da sequenciação da região de marcador.
21. Um procedimento de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que o marcador de segurança é adicionalmente examinado com uma sonda apresentando uma região em complementaridade com a região de marcador.
22. Um procedimento de acordo com a reivindicação 20, em que a mencionada sequenciação é realizada por sequenciação de "dideoxy" (método de Sangler), ou por sequenciação de espectrometria de massa. -7- PE 1230392
23. Um procedimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, onde a sequência da região de marcador é comparada com uma base de dados para determinar a origem do marcador de segurança. Lisboa, 4 de Outubro de 2010