PT1362123E - Sistema de segurança - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

SISTEMA DE SEGURANÇA A presente invenção está relacionada com marcadores de segurança tendo em vista a marcação de objectos e indivíduos, métodos de utilização de marcadores, métodos de detecção de marcadores e dispositivos de segurança que contenham esses marcadores. Está relacionada, em particular, com um sistema isento de falhas que será aceite em Tribunal e permitirá auxiliar a polícia e os Tribunais a condenar criminosos, pelo que se trata da criação de um produto de excelente valor dissuasor. Em particular, os marcadores de segurança utilizados incluem uma molécula de ácido nucleico, especificamente concebida de forma consciente e segura, de modo a permitir a respectiva utilização nesta indústria, sendo possível identificá-la de forma exclusiva como pertencendo a uma única origem do marcador de segurança, bem como local, data e hora.

Os marcadores de segurança de identificação da posse de um artigo são conhecidos na técnica. Alguns marcadores utilizam uma fórmula específica de diferentes compostos químicos para identificar se um determinado objecto pertence a um determinado indivíduo ou se se encontrava numa determinada localização. Este tipo de marcadores químicos é tratado, por exemplo, na patente GB 2245583. Este tipo de sistemas apresenta apenas um número limitado de compostos de identificação, tornando difícil a identificação de um grande número de localizações. Além 1 disso, é necessário dispersar uma grande quantidade da substância, tornando-os complexos, pouco práticos e susceptiveis a possíveis problemas de contaminação cruzada.

Os marcadores de segurança que abrangem a utilização de moléculas de ácido nucleico também são conhecidos na técnica, conforme mostrado, por exemplo, em WO 94/04918, WO 87/06383 e WO 95/02702. A patente US 5.763.176 descreve a utilização de várias sequências de ADN, ligadas a uma base para marcação de um item ou artigo sólido. A utilização de várias sequências de ADN permite a introdução de uma diversidade de marcadores. Este tipo de marcadores de segurança poderá ser simplesmente identificado através da utilização de uma sonda adequada que poderá hibridar com o ácido nucleico no marcador. A utilização de uma reacção de polimerização em cadeia [PCR, Polymerase Chain Reaction] para isolar e multiplicar uma amostra de ácido nucleico num marcador de segurança é conhecida, conforme estabelecido em WO 90/14441. Em virtude da tecnologia PCR, é necessário recuperar uma parte muito inferior do marcador, pelo que a pulverização pode ser efectuada de forma suave.

Uma das vantagens da utilização da molécula de ácido nucleico como marcador de segurança é o facto de ser possível utilizar uma sequência nucleótida exclusiva para cada utilizador do marcador de segurança ou para cada localização na qual seja utilizado um marcador de segurança. A utilização de oligonucleótidos apresentando 2 sequências de ácido nucleico aleatórias é divulgada na patente US 5.139.812.

Os inventores constataram que existe um mercado para marcadores de segurança melhorados, especificamente concebidos para utilização num contexto de segurança. É possível utilizar este tipo de marcadores de segurança para pulverização sobre o intruso após activação de um activador adequado. Neste caso, este tipo de marcadores de segurança com os activadores adequadamente concebidos e dispositivos de segurança correctamente posicionados podem ser utilizados pela polícia e pelos Tribunais para comprovar que um determinado intruso se encontrava no local do crime a uma determinada hora.

Caso este tipo de marcador seja utilizado especificamente com a finalidade de detecção criminal é importante que o sistema que rodeia o marcador seja o mais possível isento de falhas, de modo a reduzir a possibilidade de condenação injusta. Mais concretamente, a detecção do marcador tem de ser o mais isenta de erros possível, tanto do ponto de vista da possibilidade de contaminação cruzada entre o próprio marcador e terceiros e, em conformidade com o pedido conjunto de patente PCT/GBO0/04419, como do ponto de vista da contaminação de ADN não pertencente ao marcador. Da mesma forma, para ser útil à polícia e aos Tribunais na área da segurança, o marcador tem de ser concebido para ser suficientemente flexível, de modo a adequar-se aos procedimentos policiais normais, como, por exemplo, às leis aplicáveis 3 ao suspeito no que respeita a prazos e períodos de detenção.

Os inventores constataram que a reacção de polimerização em cadeia de uma cadeia de ácido nucleico utilizando um iniciador adequado, seguindo-se a sequenciação desse iniciador, nem sempre produz uma sequência consistente relativamente a qualquer ADN de marcador. É importante, por isso, em termos de segurança, ter uma alternativa de segurança, de modo a confirmar a sequência de qualquer sequência exclusiva de uma região de marcador do marcador de segurança. Deste modo, os inventores incluíram uma segunda região de iniciador no marcador de segurança que permite à sequência da região do marcador ser confirmada, permitindo que a cadeia complementar seja produzida por uma PCR e, em seguida, sequenciada utilizando um segundo iniciador.

Outra vantagem a nível de segurança da presente invenção trata-se do facto de ser possível à ocupada polícia e às autoridades forenses utilizar esta funcionalidade para verificar em primeira instância e confirmar se foi recuperado um oligomarcador, fazendo corresponder estes

iniciadores complementares e efectuando a leitura do comprimento da região do marcador desconhecida, proporcionado à polícia mais elementos de prova. A redução de falsos positivos em virtude de ADN contaminado implica que se for produzida uma cadeia de ADN para o marcador com o tamanho correcto, deve-se quase invariavelmente ao facto de o marcador de segurança estar presente e não devido a ADN contaminado. Deste modo, a 4 polícia poderá deter um suspeito enquanto o processo de sequenciação for levado a cabo, o que na vida real de um laboratório forense poderá não ter uma resolução imediata. É este o tema do pedido de patente pendente PCT/GB00/04419.

Um potencial problema associado a marcadores de segurança trata-se da contaminação cruzada de terceiros, ou seja, quando o marcador é transmitido de um objecto ou indivíduo associado ao local do crime a terceiros sem qualquer ligação. Para que o marcador de segurança seja eficaz a nível de segurança, tem de estar correctamente ligado ao objecto, quer se trate de um indivíduo ou de um objecto.

Os inventores conceberam um sistema que está ligado à extremidade do marcador de segurança, ligando de forma segura o marcador ao objecto.

Uma das dificuldades encontradas neste tipo de sistemas é a remoção do marcador de segurança, de modo a ser possível testá-lo e identificá-lo. Os inventores produziram um marcador de segurança no qual é possível separar a região do marcador da região de ligação.

Por consequência, um primeiro aspecto da invenção proporciona a utilização de um marcador de segurança, conforme definido na Reivindicação 1 do presente pedido.

Num modo de realização, o marcador de segurança traduz-se numa única cadeia da molécula de ácido nucleico que 5 poderá ser produzida como um oligonucleótido. A molécula de ácido nucleico poderá trata-se de ADN, ARN ou de uma molécula nucleótida sintética.

As expressões substancialmente “idêntico a um segundo iniciador" ou "substancialmente o complemento oposto de um primeiro iniciador" têm como finalidade exprimir que existe uma homologia suficiente para permitir que o primeiro ou segundo iniciador, bem como a região à qual estão ligados no marcador de segurança ou numa molécula de ácido nucleico complementar ao marcador de segurança, hibridem em condições de elevado rigor. Tais condições traduzem-se preferencialmente em condições típicas de PCR.

Na prática, o primeiro iniciador é preferencialmente utilizado para permitir que a molécula de ácido nucleico replique através de PCR, produzindo, deste modo, uma segunda cadeia complementar de ácido nucleico. Em seguida, a cadeia abrange inclui a região do iniciador com a sequência correcta, de modo a permitir que o segundo iniciador seja ligado à mesma. Posteriormente, o segundo iniciador pode ser utilizado para multiplicar a cadeia de ácido nucleico complementar. A região do iniciador complementar situa-se preferencialmente acima da região do marcador.

Os inventores também constataram que, caso existisse um marcador ligado a um objecto ou a um intruso, existiria frequentemente, por exemplo, uma grande quantidade de 6 fragmentos de ADN contaminado proveniente, por exemplo, de seres humanos e/ou quaisquer animais de estimação, tais como cães e gatos, junto ao objecto ou intruso.

Nesta conformidade, a sequência de ácido nucleico do primeiro iniciador e a sequência de ácido nucleico do segundo iniciador são seleccionadas de modo a que as respectivas regiões de ligação de iniciador não ocorram em 150 bases, 120 bases nem 100 bases das respectivas bases no ADN nativo. Ou seja, as sequências que ocorrem naturalmente às quais os iniciadores utilizados com o marcador de segurança se podem ligar, em condições de elevado nivel de rigor, geralmente não ocorrem em 150 bases das respectivas bases no ADN nativo.

Por elevado nivel de rigor entende-se, por exemplo, 1,5 mM MgC12, 53°C de temperatura de recozimento.

Tal obteve-se através de uma selecção cuidadosa dos iniciadores utilizados face a bases de dados de sequências nucleótidas disponíveis publicamente. O ADN nativo é preferencialmente procariótico ou eucariótico, especialmente o ADN dos seres humanos, cães, gatos, ratos, ratazanas e/ou insectos.

Tal tem como vantagem, a nível de segurança, o facto de permitir uma rápida identificação de fragmentos de ADN amplificados contendo a região do marcador por tamanho. É possível que um ou outro iniciador se ligue a ADN que não seja do marcador de segurança, mas para produzir um produto PCR é necessário que ambos os iniciadores se 7 liguem, embora seja provável que apenas produzam ADN de um tamanho diferente do ADN do marcador de segurança, permitindo assim que tais fragmentos sejam facilmente descartados. Permite ainda que uma agência forense consiga confirmar rápida e facilmente se detém um comprimento de oligomarcador que permita a sequência. Desta forma, a polícia pode obter informações rapidamente possibilitando uma provável detenção do suspeito mais prolongada, durante a qual decorre a sequenciação, que pode levar alguns dias a ser realizada. Além disso, poderá encorajar o suspeito a confessar-se culpado até antes de ocorrer a sequenciação.

Uma vez identificada uma amostra que contenha um marcador de segurança, o marcador de segurança poderá então ser sequenciado tendo em vista a determinação da sequência exacta da região do marcador. Em seguida, é efectuada a correspondência destes resultados na base de dados e posteriormente são analisadas as instalações para determinar a data e hora da pulverização.

Preferencialmente, os iniciadores e as regiões às quais estes se ligam no marcador de segurança, ou numa molécula complementar, são 100% complementares à respectiva região de ligação. Deste modo, torna-se possível utilizar elevados níveis de rigor para analisar a presença do marcador. preferido, os da preguiça-ai especialmente

Num modo inventores (Bradypus de realização especialmente empregaram o ácido nucleico variegatus) . A sequência 8 preferida da preguiça-ai é uma sequência de ácido nucleico correspondente ao gene ND1 mitocondrial da preguiça.

Por ácido nucleico entende-se uma cadeia simples ou dupla de ADN ou ARN de origem natural ou sintética ou derivados sintéticos que poderão ser total ou parcialmente constituídos por bases raras ou por bases modificadas.

As regiões do iniciador são dispostas no ácido nucleico de modo a permitir que um iniciador adequado do ácido nucleico hibride selectivamente com a região do iniciador, permitindo, assim, ao marcador de segurança que contém a região do marcador de segurança ser ampliado a partir de uma amostra.

Preferencialmente, a região do iniciador é constituída por 15 a 50 nucleótidos, de preferência, 17 a 30, em especial 18, de modo a permitir um nível de rigor suficientemente elevado em termos de hibridação com um iniciador adequado, utilizado para identificar a presença do marcador de segurança. 0 iniciador em si poderá ser utilizado para amplificar directamente o marcador de segurança através, por exemplo, da reacção de polimerizaçao em cadeia. O primeiro iniciador e o segundo iniciador poderão ser idênticos ou diferentes. A região do marcador em si contém uma sequência de ácido nucleico predeterminada que, preferencialmente, é 9 exclusiva do proprietário de um determinado marcador de segurança numa determinada localização, como, por exemplo, umas instalações comerciais ou um carro. A principal utilização deste marcador consiste em pulverizar um intruso com o marcador de segurança exclusivo. 0 termo "complementar" define a relação entre duas cadeias de ADN ou ADN e ARN, em que são complementares entre si, caso as respectivas sequências estejam relacionadas por regras de pares de bases. Portanto, ATCG é complementar da sequência TAGC e par da mesma através de uma ligação de hidrogénio. Por consequência, a exactidão da sequenciação da região do marcador poderá ser determinada comparando a sequência com a sequência obtida relativamente ao marcador a partir do segundo iniciador e observando se as duas sequências são complementares entre si. Este mecanismo de dupla verificação é importante para fins de segurança.

Preferencialmente, a região do marcador é constituída por 10 a 30 nucleótidos, especialmente entre 15 e 25, mais preferencialmente 20 nucleótidos de comprimento. Deste modo, é possível um grande número de sequências exclusivas, cada qual exclusiva de uma determinada aplicação do marcador de segurança a criar. É possível que um ou cada iniciador seja separado da região do marcador num intervalo de até 50, especialmente entre 20 e 40, mais preferencialmente num intervalo de 20 a 30 nucleótidos de comprimento. O intervalo de 10 nucleótidos entre o iniciador e a região do marcador foi determinado pelos inventores para melhorar a exactidão da sequenciação do marcador de segurança, como é óbvio, importante neste contexto. É importante que o custo da produção de oligoelementos não seja impeditivo, reduzindo assim o mercado do marcador e diminuindo o seu valor dissuasor. É preferível utilizar oligoelementos de baixo volume, uma vez que são mais fáceis e económicos de produzir. Uma vez que, ao realizar reacções de sequências, as leituras têm tendência a tornarem-se mais claras após cerca de 200 mer, é necessário que os resultados da sequenciação sejam ainda mais amplificados para que este processo seja eficaz. Tal pode ser obtido através da utilização de vários métodos.

Quando o oligoelemento está ligado de modo tão forte ao objecto, é necessário utilizar um determinado método para removê-lo. Para tal poderá ser utilizada uma estrutura em gancho e um local de clivagem predeterminado. Preferencialmente, o marcador de segurança irá abranger, pelo menos, uma região de ácido nucleico de cadeia dupla. A região do ácido nucleico de cadeia dupla poderá ter a forma de uma estrutura em gancho. As estruturas em gancho são geralmente pequenas regiões de cadeia dupla, possíveis numa molécula de ácido nucleico de cadeia simples devido à complementaridade de sequências vizinhas. A estrutura em gancho é formada, preferencialmente, como resultado de uma extremidade de uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples com duas 11 regiões de ácidos nucleicos complementares, de modo a que seja formada uma estrutura em gancho numa das extremidades do marcador de segurança.

Preferencialmente, o local de clivagem predeterminado é uma ligação quimicamente instável, como, por exemplo, uma ligação de ácido instável ou uma ligação reduzível quimicamente, como, por exemplo, uma ligação de dissulfeto. A clivagem deste tipo de ligação permite a separação da parte do marcador de segurança que contém a região do primeiro iniciador, a região do marcador e opcionalmente a região do segundo iniciador, da região de ligação. Deste modo, é possível libertar a parte da molécula de ácido nucleico de um objecto ao qual esteja ligada. A parte libertada do marcador de segurança poderá, então, ser sujeita à reacção de polimerização em cadeia e poderá ser determinada a sequência da região do marcador.

Em alternativa, o local de clivagem predeterminado poderá tratar-se de um local de clivagem de nuclease, especialmente para uma endonuclease de restrição. As bactérias produzem enzimas designadas por nucleases de restrição que as protegem decompondo quaisquer moléculas de ADN estranhas. Cada enzima reconhece uma sequência específica de 4-6 nucleótidos no ADN. Grande parte das nucleases de restrição foram purificadas a partir de diferentes espécies de bactérias e mais de 100, a maior parte das quais reconhece diferentes sequências nucleótidas, estão actualmente disponíveis a nível comercial. Entre alguns exemplos de endonucleases de 12 restrição comuns encontram-se Hpal, Eco RI e Hind III. Conforme indicado, este tipo de enzimas e os locais nos quais elas efectuam o corte de ADN são bem conhecidos. São fáceis de obter a nivel comercial a partir, por exemplo, de Promega, Southampton, Reino Unido. Os protocolos de utilização de endonucleases de restrição para corte de moléculas de ácido nucleico são igualmente bem conhecidos e estão bem documentados. Consultar, por exemplo, os Protocolos e o Manual de Aplicações de Promega, Promega Protocols and Applications Guide, Terceira Edição, 1996, páginas 2-24. Esta fonte bibliográfica também fornece uma lista alargada de muitas das endonucleases conhecidas disponíveis a nível comercial. A maior parte das endonucleases de restrição requer ADN de cadeia dupla. Por consequência, o marcador de segurança abrangerá, preferencialmente, pelo menos, uma região de ADN de cadeia dupla que abranja um local de endonuclease de restrição.

As moléculas de ácido nucleico, quando expostas à superfície de qualquer objecto, podem ser decompostas por nucleases que ocorrem naturalmente, como, por exemplo, as exonucleases 3' ou 5'. Este tipo de nucleases poderá estar presente na pele de um indivíduo ou ser proveniente de bactérias existentes na superfície do objecto. É, por isso, recomendado, melhorar a resistência dos marcadores de segurança face ao ataque deste tipo de enzimas. Por consequência, é preferível que a molécula de ácido nucleico inclua numa ou duas extremidades, um agente 13 bloqueador. Este tipo de agentes bloqueadores inclui os agentes que é sabido conseguirem resistir a ataques de nuclease, como, por exemplo, ligações de fosforotioato, nucleósidos não naturais, dendrimeros e grupos alquilo amino.

Os fosforotioatos são úteis para os agentes de ligação, uma vez que o fosforotioato formará ligações de dissulfeto com resíduos de cisteína que ocorram naturalmente nas proteínas, como, por exemplo, a lã, o cabelo, as unhas dos dedos, etc.

Os inventores também constataram que seria possível construir um marcador de segurança que inclua informações codificadas na sequência de ácido nucleico do marcador para identificar o país de origem de um artigo.

Deste modo, num modo de realização, a região do marcador abrange duas ou mais regiões de codificação distintas às quais é possível atribuir diferentes identificadores. 0 marcador de segurança abrange, preferencialmente, 3, 4, 5 ou mais regiões de codificação distintas.

Diferentes regiões de codificação permitem que vários tipos diferentes de informações sejam codificados no marcador de segurança. Tal torna-se particularmente útil, por exemplo, em situações em que bens furtados tenham sido recuperados pela polícia e se pretenda identificar o país de origem dos bens furtados e o local de onde foram furtados. Em alternativa, caso tenha sido pulverizada uma 14 solução sobre um ladrão durante um roubo ou assalto de automóvel, as regiões de codificações podem ser utilizadas para identificar a origem do marcador de segurança no ladrão.

Por conseguinte, a primeira região de codificação poderá ser atribuída para identificar o país de origem do marcador de segurança. A segunda região de codificação poderá ser atribuída para identificar o tipo de utilização associado ao marcador de segurança, por exemplo, um marcador de segurança de joalharia, num carro, por exemplo, uma marca específica ou um modelo específico de carro, uma determinada instalação fabril, banco, estabelecimento comercial ou doméstico, etc. Poderá ser utilizada uma terceira região de codificação para codificar uma sequência nucleótida específica exclusiva de uma firma, indivíduo ou utilização em particular.

Quando é detectado um marcador de segurança, a utilização de regiões de codificação separadas permite à origem do marcador de segurança ser rapidamente identificada após a PCR e a sequenciação do marcador através da procura numa base de dados de registos apropriada. A molécula de ácido nucleico no marcador de segurança da invenção poderá ser identificada. Poderá, por exemplo, ser identificada com um corante visível que permita ao marcador de segurança ser facilmente visível a olho nu. Em alternativa, o identificador poderá ter um corante 15 fluorescente que permita à molécula de ácido nucleico ser identificada recorrendo a luz ultravioleta.

Como alternativa, o marcador de segurança poderá abranger um ou mais identificadores em separado, como, por exemplo, identificadores colorimétricos e/ou fluorescentes.

As moléculas de ácido nucleico, quando expostas à superfície de qualquer objecto, podem ser decompostas por nucleases que ocorrem naturalmente, como, por exemplo, as exonucleases 3' ou 5'. Este tipo de nucleases poderá estar presente na pele de um indivíduo ou ser proveniente de bactérias existentes na superfície do objecto. É, por isso, recomendado, melhorar a resistência dos marcadores de segurança ao ataque deste tipo de enzimas. Por consequência, é preferível que a molécula de ácido nucleico inclua numa ou duas extremidades, um agente bloqueador. Este tipo de agentes bloqueadores inclui os agentes que é sabido conseguirem resistir a ataques de nuclease, como, por exemplo, ligações de fosforotioato, nucleósidos não naturais, dendrímeros e grupos alquilo amino.

Também é recomendado fazer com que o marcador de segurança se fixe a um objecto ao qual tenha estado ligado. A molécula de ácido nucleico abrange, preferencialmente, um ou mais agentes de ligação que auxiliam na ligação da molécula de ácido nucleico a um objecto. Entre os agentes de ligação podem contar-se a biotina, a vitamina E colesterol e os fosforotioatos. A 16 biotina, a vitamina E e o colesterol poderão ser utilizados, uma vez que se tratam de moléculas lipo-solúveis, permitindo que a molécula de ácido nucleico se ligue à pele de um intruso. Além disso, a biotina é especialmente útil, uma vez que as moléculas de ácido nucleico que contêm biotina, obtidas a partir de uma amostra, poderão ser isoladas de imediato através de uma solução criada a partir da amostra através de uma coluna de avidina. A molécula de ácido nucleico com biotina poderá ligar-se à avidina na coluna, permitindo o respectivo isolamento e purificação.

Os fosforotioatos são úteis no papel de agentes de ligação, uma vez que o fosforotioato formará ligações de dissulfeto com resíduos de cisteína que ocorrem naturalmente nas proteínas, como, por exemplo, a lã, o cabelo, as unhas dos dedos, etc.

Durante a utilização, o marcador de segurança é libertado, preferencialmente, através da clivagem de um local de clivagem predeterminado. Em alternativa, o marcador de segurança poderá ser removido da superfície de um objecto através dos meios adequados. Por exemplo, observou-se que a lavagem utilizando etanol pode ser utilizada. Também é possível utilizar uma amostra de raspado da pele. Verificou-se que o ditiotreitol (DTT) é útil no isolamento de marcadores de segurança que abranjam fosforotioato incorporado na molécula de ácido nucleico. 0 DTT desnatura quaisquer ligações de dissulfeto entre o fosforotioato e as proteínas no 17 objecto marcado, libertando, deste modo, o marcador de segurança.

Verificou-se que o tratamento de uma amostra com protease, como, por exemplo a Protease K, é particularmente útil na libertação de marcadores de segurança. A Protease K, produzida pelo fungo Tritirachium album apresenta uma especificidade de clivagem muito alargada e assimila a proteína na amostra. Deste modo, o marcador de segurança é libertado disponibilizando-o para a PCR. Também assimila DNases que poderão encontrar-se na amostra, impedindo assim a decomposição do marcador.

Poderão ser utilizados marcadores de segurança com diferentes identificadores fluorescentes e coloridos. Por exemplo, poderá ser utilizada uma cor específica num país e não noutro, permitindo, deste modo, a identificação de suspeitos de crimes quando passam, por exemplo, as fronteiras. Em alternativa, poderão ser utilizadas diferentes cores para diferentes situações, por exemplo, para demonstrar se um indivíduo realizou um assalto de automóvel ou esteve envolvido no arrombamento e invasão de propriedade de instalações fabris. 0 corante poderá estar ligado de forma covalente à molécula de ácido nucleico ou poderá estar separado.

Num modo de realização preferencial, o corante é constituído por duas cores, uma com uma menor duração ou estabilidade de alavanca do que a outra, por exemplo, os 18 corantes vermelho e azul em conjunto proporcionam um aspecto púrpura. 0 corante vermelho poderá permanecer na pele durante vários dias e o azul durante várias semanas. Se o suspeito apresentar o corante púrpura, a polícia terá, portanto, conhecimento de que a pulverização foi emitida nos últimos dias. Um corante azul indicará que a pulverização foi activada há mais tempo. Cores diferentes também poderão indicar um tipo de sistema de alarme diferente. Por exemplo, as propriedades comerciais poderão apresentar um corante púrpura, os veículos um corante cor-de-laranja (vermelho e amarelo). Deste modo, a polícia poderá verificar os respectivos reqistos (uma vez que se encontra a aguardar os resultados dos testes forenses) correspondentes ao tipo e período de tempo aplicável ao crime cometido. De preferência, os corantes apenas são visíveis à luz UV.

Em alternativa, é possível utilizar corantes de infravermelhos. São invisíveis sob a luz natural, mas brilham a verde sob infravermelhos. São particularmente úteis ao utilizar com LEDs de infravermelhos, por exemplo, em sistemas de circuito fechado de televisão (CCTV), para seguir um suspeito que apresente o corante.

Também é incluído um método de marcação de um objecto aplicando um marcador de segurança a um objecto. Poderá ser aplicado um marcador de segurança através de qualquer meio adequado, como, por exemplo, utilizando uma escova, pulverizador, aerossol ou fluxo. De preferência o objecto será humano, como, por exemplo, um intruso. 19

No que diz respeito a outro aspecto da invenção, é fornecido um método de detecção de um marcador de segurança, conforme definido na Reivindicação 18. 0 marcador de segurança poderá ser amplificado, por exemplo, através de PCR antes da sequenciação da primeira região do marcador. 0 marcador de segurança poderá ser adicionalmente analisado com uma segunda sonda com capacidade de hibridação com a região do segundo iniciador, uma vez replicado o marcador para formar uma cadeia complementar através, por exemplo, de PCR, sendo então a segunda região do marcador sequenciada.

As regiões do marcador poderão ser sequenciadas através de quaisquer métodos conhecidos na área, como, o método de sequenciação de Sanger (didesoxi), a sequenciação de espectometria de massa ou através de outras técnicas conhecidas na área.

Estes tipos de sequenciação poderão ocorrer após a amplificação inicial através de PCR ou directamente, por exemplo, utilizando a mini-sequenciação. A sequência da região do marcador poderá ser comparada com uma base de dados para determinar a origem do marcador de segurança. Ou seja, para permitir que, por exemplo, o proprietário do objecto seja identificado ou para identificar em que situações o principal suspeito tenha estado exposto ao marcador de segurança. 20

Poderá ser incluído um marcador de segurança, como parte de um kit de segurança, em conformidade com o primeiro aspecto da invenção. 0 kit de segurança poderá ser constituído por um marcador de segurança numa solução adequada ou, por exemplo, numa massa lubrificante. Esta massa lubrificante poderá ser utilizada para garantir que uma amostra de tecido seja marcada com êxito. 0 kit poderá incluir meios de utilização de aerossol para aplicar o marcador de segurança como um pulverizador ou aerossol a um objecto. 0 sistema de segurança poderá incluir adicionalmente um gerador de fumo. Este tipo de geradores de fumo utiliza, por exemplo, um glicol para preencher rapidamente um espaço, como, por exemplo, o interior de uma sala ou automóvel, com um fumo químico. Deste modo, o intruso fica desorientado e não consegue levar a cabo o furto de objectos nem do carro. 0 sistema de segurança também poderá incluir sensores e actuadores adequados para colocar em prática a aplicação do marcador de segurança ao intruso. 0 actuador também poderá ser activado remotamente, por exemplo, a partir de uma sala de controlo.

Os inventores também constataram que é possível melhorar o revestimento de um objecto ou indivíduo expostos a um pulverizador ou aerossol de um marcador de segurança, em conformidade com a invenção. Verificaram que tal é possível aplicando uma carga electrostática ao aerossol ou fumo. Por consequência, um outro aspecto da invenção 21 proporciona um aplicador para um marcador de segurança, conforme definido na Reivindicação 15. 0 marcador poderá encontrar-se na solução, dispersão ou em pó.

Os meios que permitem gerar uma carga electrostática poderão ser uma placa metálica de carga sobre a qual o marcador de segurança é forçado antes de sair do bico do aplicador. A placa metálica de carga poderá ter uma carga positiva ou negativa para adicionar ou remover electrões do pulverizador ou aerossol.

Ao carregar o pulverizador ou aerossol, este fixa-se aos objectos, melhorando assim a cobertura do marcador de segurança.

Poderão ser incluídas, como parte de uma base de dados, informações detalhadas sobre onde está a ser utilizado um marcador de segurança, em conformidade com a invenção, bem como uma lista da sequência de ácido nucleico que codifica a região do marcador de segurança. Deste modo, torna-se possível identificar a origem de um marcador de segurança, em conformidade com a invenção.

Poderá ser utilizado um actuador, como parte de um dispositivo de segurança, para libertar um fornecimento de ácido nucleico, em conformidade com a invenção, e adicionalmente para abranger uma memória de escrita única, só de leitura (ROM, Read Only Memory) para gravar a data e hora de uma activação do actuador. Este tipo de 22 dispositivo permite determinar a data e hora exactas da entrada de um intruso. É útil a nivel de segurança, uma vez que não é possível alterar a gravação após o evento. Deste modo, é melhorada a probabilidade de ser movida com êxito uma acção judicial contra o intruso proporcionando um registo exacto das circunstâncias inerentes à cobertura do intruso com o marcador de segurança.

Também poderá ser utilizada uma câmara, bem como um dispositivo de gravação de imagens, denominado "instantâneo", para captar uma ou mais imagens da libertação do marcador de segurança, em conformidade com a invenção, num indivíduo ou objecto.

Este processo ocorre juntamente com a activação de ADN, não só marcando o indivíduo como também captando uma fotografia do indivíduo ao ser efectuada a marcação. A placa do instantâneo não inclui peças amovíveis e, por isso, é extremamente fidedigna. Funciona gravando imagens fotográficas num ciclo contínuo. Não podem ser acedidas até que ocorra um evento, por exemplo, o facto de ser pulverizado ADN. Em seguida, é armazenado um determinado número de imagens antes da pulverização, da pulverização em si e um determinado número de imagens após a pulverização, com a marcação da data, hora e número de identidade da solução de ADN ligada, conforme mostrado na base de dados. Apenas as autoridades competentes, ou seja, a polícia, poderão, em seguida, obter as imagens. As autoridades podem utilizar esta ferramenta de duas formas. 0 instantâneo poderá auxiliar a polícia divulgando o aspecto do suspeito. Esta informação poderá 23 ser armazenada numa base de dados. Quando um suspeito é detido, por exemplo, apresentando um corante UV, até mesmo antes de ser analisado o ADN, será possível efectuar uma consulta na base de dados e obter uma fotografia do suspeito nas instalações, garantindo, deste modo, uma condenação. Além disso, se a imagem estiver de alguma forma obscurecida, haverá também elementos de prova de ADN retirados do local, uma vez efectuada a respectiva sequenciação. A invenção será, em seguida, descrito recorrendo a exemplos apenas com referência às figuras que se seguem.

Figura 1 mostra um diagrama esquemático que representa um marcador de segurança de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

Figura 2 mostra exemplos de locais de endonucleases de restrição para Hpa I;

Eco RI; e Hind III.

Figura 3 mostra um diagrama esquemático que representa um marcador de segurança após ser separado da região de ligação.

No que diz respeito à Figura 1, esta mostra um marcador de segurança, de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Inclui uma parte da cadeia simples de ácido nucleico e abrange uma região de estrutura em gancho. A estrutura em gancho é formada uma vez que a molécula de 24 ácido nucleico de cadeia simples abrange duas sequências de ácidos nucleicos complementares entre si. Deste modo, torna-se possível que a molécula de ácido nucleico de cadeia simples se enrole sobre si própria para formar uma estrutura em gancho. A estrutura em gancho é mantida através da ligação de hidrogénio entre os ácidos nucleicos complementares (G-C e A-T). A estrutura em gancho contém adicionalmente várias ligações de fosforotioatos (mostradas como tttt). Constatou-se que o fosforotioato se liga à pele dos indivíduos, bem como às fibras, como a lã. Deste modo, o marcador de segurança pode ser aplicado a objectos e, por exemplo, a ladrões ou a outros indivíduos que tenham accionado um dispositivo de segurança que contenha o marcador de segurança. A sequência "palindrómica" de ácido nucleico (gaattc-cttaag) codifica um local de endonuclease de restrição Eco RI. Tal significa que, caso tenha sido recuperada uma amostra de tecido ou, por exemplo, raspado de pele, do local do crime, poderá utilizar-se Eco RI para separar a região do ácido nucleico que codifica a região do primeiro iniciador e a região de segundo iniciador, juntamente com o marcador, para utilização na reacção de polimerização em cadeia, de modo a multiplicar a amostra para um tamanho que permita a respectiva sequenciação. Deverá ser realçado que o exemplo mostrado na Figura 1 não é restritivo e poderão ser utilizados outros locais de endonuclease de restrição.

Segue-se abaixo um exemplo de construção de acordo com a Figura 1: 25 5'_GAATTCGAGCATAATACCCACGATTCCGCTACGATCAACTA/ATACACTTGGTA TGAAAÇAATTT/CCTCCCACTCACCCTGGCCCTATGCACGTGACACATAACCGAATT CTTttttTTGAATrC_3 ' / \ área de estrutura de cadeia dupla em que: tttt corresponde a uma ligação de fosforotioato.

Foi removida com êxito pelos inventores utilizando protocolos de endonuclease de restrição padrão a partir de pele e tecido. Entre os protocolos de endonuclease de restrição mostrados encontra-se, por exemplo, o Manual de protocolos e aplicações de Promega (supramencionado). Os locais de endonuclease de restrição também são mostrados, por exemplo, na Figura 2. A Figura 3 mostra um diagrama esquemático com a utilização de uma região separada da molécula de ácido nucleico com a finalidade de sequenciação e identificação de uma sequência de marcador especifica. É apresentado em seguida um protocolo tipico para a identificação da sequência do marcador: A Figura 3a mostra uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples. A molécula de ácido nucleico poderá ser de ADN ou ARN. A cadeia inclui a região do primeiro iniciador e, abaixo da região do iniciador, uma região de marcador e uma região de iniciador complementar. Após realizar a PCR com um iniciador com capacidade para ligar a região do segundo iniciador, é produzida uma cadeia 26 complementar (lb). A cadeia complementar apresenta uma região de primeiro iniciador funcional com capacidade de ligação através do primeiro iniciador. Apresenta também uma região de marcador complementar à região de marcador no marcador original.

Os inventores verificaram que é possível obter uma sequência de iniciador particularmente útil a partir da preguiça-ai. É então apresentada a seguinte sequência: 5'-ta cccacgattccgctacgatc aactaataca cttgctatga aaaaatttcc tcccactcac cctggccctatgca cgtgacacataacc-3'

Esta sequência é obtida a partir do gene mitocondrial ND1 do organismo.

Foi utilizada para criar os seguintes iniciadores: 1. 5'-ta cccacgattccgctac-3'. 2. 5 '-ggttatgtgtcacgtgca-3'.

As sequências de iniciador foram ligadas a sequências de marcador exclusivas, por exemplo à sequência: gaaaaaatttcctcccactcac de um 10 que foram separadas das sequências do iniciador através de um intervalo de 22 bases a partir da região de um primeiro iniciador, 10 bases a partir da região segundo iniciador. 27

As moléculas de ácido nucleico podem ser preparadas através de métodos de fase sólida convencionais, geralmente num sintetizador de ADN automatizado. 0 método mais comum implica a utilização da composição química β-cianoetil fosforamidito, conforme descrito nas seguintes publicações:

The synthesis of chemically labelled PCR primers. D.J.S. Brown e T. Brown (1995 "PCR: essencial data" Wiley, ed. C.R. Newton. Capítulo 7, pp 57-70.

Preparation of synthetic oligodeoxynucleotide probes. T. Brown e J. Grzybowski (1995) "Gene probes: a Practical Approach". IRL press. Capítulo 5, 145-167.

Os oligonucleótidos também podem ser sintetizados através de métodos de fase sólida manuais ou através de métodos de fase de solução, embora o método de fase sólida automatizado tenha como vantagem um desempenho superior.

Também é possível utilizar ADN isolado a partir de origens biológicas.

Protocolo de Reacção de Polimerização em Cadeia

Foram utilizadas técnicas de PCR convencionais para identificar e multiplicar as sequências. Uma mistura de reacção de 50 pL típica inclui 28 ΙΟχ PCR buffer desenvolvido para reacções SYBR Green no sistema de detecção ABI Prism Sequence 7700, obtido a partir de Genesys. 200 μΜ dNTP (utilizando uma mistura de dUTP e dTTP) 0,5 μΜ de concentração de ambos os iniciadores. 1,5 mM MgC12. 1 unidade da enzima Hot Goldstar (uma polimerase TAQ) 0,5 unidades de UNG.

As condições de ciclo típicas foram de 53°C durante 2 min., 95°C durante 10 min., 40 ciclos de 95° durante 30 seg., 50°C durante 30 seg. e, posteriormente, 72° durante 30 seg. Foi realizada um prolongamento final a 72°C durante 7 min.

Em seguida, é possível sequenciar o ADN do marcador utilizando técnicas de sequenciação convencionais.

Protocolo de Libertação da Protease K

Os marcadores de segurança da invenção foram libertados com êxito a partir de amostras de pele, fibra e cabelo utilizando a Protease K. A enzima encontra-se disponível a nível comercial a partir de, por exemplo, Promega RU, Southampton, RU. Geralmente, a Protease K é adicionada a 0,2 mg./ml., incubada a 56°C de um dia para o outro e, posteriormente, o etanol é precipitado para isolar o marcador de segurança. 29

Corantes ou

Os corantes adequados poderão ser orgânicos inorgânicos. 30

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um marcador de segurança para marcar objectos e indivíduos, sendo que o referido marcador de segurança inclui: (i) uma região de primeiro iniciador, substancialmente o complemento oposto de um primeiro iniciador, sendo que a referida região do primeiro iniciador possui a capacidade de ser ligada pelo primeiro iniciador; (ii) ligada à região do primeiro iniciador, uma região de marcador que inclui uma sequência de ácido nucleico predeterminada com capacidade de identificar a origem do marcador de segurança; e (iii) uma região de segundo iniciador substancialmente idêntica a um segundo iniciador, sendo que a referida região do segundo iniciador está ligada à região do marcador; sendo que a sequência de ácido nucleico da região do primeiro iniciador e a sequência de ácido nucleico da região do segundo iniciador nao ocorrem em 100 das respectivas bases numa sequência de ADN nativo de seres humanos, cães, gatos, ratos, ratazanas, insectos ou organismos procarióticos. (iv) uma região de ligação para ligação do marcador a um objecto ou indivíduo; e (v) um local de clivagem predeterminado para permitir a separação da região do primeiro iniciador, a região do marcador e a região do segundo iniciador da região de ligação. 31
2. 2. Utilização em conformidade com a Reivindicação 1, abrangendo, pelo menos, uma região de ácido nucleico de cadeia dupla.
3. 3. Utilização em conformidade com a Reivindicação 2, sendo a região de ácido nucleico de cadeia dupla na forma de uma estrutura em gancho.
4. 4. Utilização em conformidade com a Reivindicação 3, sendo a região de ligação na extremidade da estrutura em gancho.
5. 5. Utilização em conformidade com qualquer das reivindicações anteriores, sendo o local de clivagem predeterminado uma ligação quimicamente instável ou um local de clivagem de endonuclease de restrição.
6. 6. Utilização em conformidade com a Reivindicação 5, sendo o local de clivagem predeterminado clivado através da endonuclease de restrição Ecor RI e inclui uma sequência de ácido nucleico de cadeia dupla: -G'AATTC--CTTA'G-em que " ' " indica o local de clivagem.
7. 7. Utilização em conformidade com qualquer das reivindicações anteriores, sendo que a região de ligação 32 inclui a biotina, a vitamina E, o colesterol ou o fosforotioato.
8. 8. Utilização em conformidade com qualquer das reivindicações anteriores, abrangendo adicionalmente um corante.
9. 9. Utilização em conformidade com a Reivindicação 8, incluindo um corante visível sob luz ultravioleta ou infravermelhos.
10. 10. Utilização em conformidade com a Reivindicação 8 ou com a Reivindicação 9, incluindo dois corantes que se decompõem em percentagens diferentes no ambiente.
11. 11. Utilização em conformidade com qualquer das reivindicações anteriores incluindo, ligada à região do primeiro iniciador, uma região de marcador abrangendo duas ou mais regiões de codificação distintas às quais é possível atribuir diferentes identificadores.
12. 12. Utilização em conformidade com a Reivindicação 11, incluindo adicionalmente, ligada à região do marcador, uma região de segundo iniciador substancialmente idêntica a um segundo iniciador.
13. 13. Utilização em conformidade com a Reivindicação 11 ou com a Reivindicação 12, incluindo 3 regiões de codificação distintas. 33
14. 14. Utilização em conformidade com a Reivindicação 13, sendo que é atribuída uma primeira região de codificação para identificação do país de origem de um artigo ao qual o marcador esteja associado; é atribuída uma segunda região de codificação para identificação do tipo de artigo ao qual o marcador está associado e a terceira região é atribuída a um código de ácido nucleico exclusivo associado ao marcador específico.
15. 15. Um aplicador para um marcador de segurança incluindo: (i) um reservatório que contenha um marcador de segurança, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores; (ii) pressurização significa forçar o marcador de segurança através de um bico para formar um pulverizador ou aerossol, caracterizado por esse facto; (iii) o aplicador inclui meios para criar uma carga electrostática no pulverizador ou aerossol do marcador de segurança.
16. 16. Utilização em conformidade com a Reivindicação 1, sendo que a região do primeiro iniciador, a região do marcador e a região do segundo iniciador incluem a sequência 5'-tacccacgattccgctacgatc aactaataca cttgctatga aaaaatttcc tcccactcac cctggccctatgca cgtgacacataacc-3' . 34
17. 17. Utilização em conformidade com a Reivindicação 1, sendo que o marcador de segurança inclui a sequência 5'- GAATTCGAGCATAATACCCACGATTCCGCTACGATCAACTAATACACTT GGTATGAAACAATTTCCTCCCACTCACCCTGGCCCTATGCACGTGACAC ATAACCGAATTCTTttttTTGAATTC-3', em que tttt corresponde a uma ligação de fosforotioato.
18. 18. Um método de detecção de um marcador de segurança, conforme definido em quaisquer das reivindicações 1-14, 16 ou 17, sendo que o referido marcador de segurança está ligado através da região de ligação a um objecto ou indivíduo, incluindo o referido método: (i) clivagem do local de clivagem predeterminado e libertação de uma parte do ácido nucleico do marcador de segurança incluindo a região do primeiro iniciador, a região do marcador e a região do segundo iniciador; (ii) amplificação da parte da sequência de ácido nucleico do marcador de segurança com o primeiro e segundo iniciadores, sendo que, durante a utilização, o primeiro iniciador liga-se à região do primeiro iniciador e o segundo iniciador liga-se a uma sequência complementar à região do segundo iniciador; e (iii) identificação de fragmentos de ácido nucleico amplificados contendo a parte do marcador de segurança. 35
19. 19. Um marcador de segurança que inclui a sequência de ácido nucleico 5'- GAATTCGAGCATAATACCCACGATTCCGCTACGATCAACTAATACACTT GGTATGAAACAATTTCCTCCCACTCACCCTGGCCCTATGCACGTGACAC ATAACCGAATTCTTttttTTGAATTC-3', em que tttt corresponde a uma ligação de fosforotioato. 36