PT1183328E - Polímeros microcelulares como meio de crescimento celular e novos polímeros - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"POLÍMEROS MICROCELULARES COMO MEIO DE CRESCIMENTO CELULAR E NOVOS POLÍMEROS" A presente invenção descreve polímeros microcelulares como meio de crescimento celular, sistemas biologicamente activos e módulos de suporte de órgãos compreendendo os polímeros e as células biológicas, um método para crescimento celular nos materiais, a sua utilização como implantes no corpo humano ou animal ou para estudos in vitro, novos processos para a preparação e modificação de polímeros microcelulares e dos polímeros obtidos desse modo e um método para fabrico de um módulo de suporte de órgãos.

De um modo mais específico, a presente invenção descreve polímeros microcelulares possuindo porosidade superior a 75%, na forma de uma estrutura de poro e de interligação de poro possuindo dimensões de poro e de interligação relativas d/D, como meio de crescimento celular para crescimento celular tridimensional por todo o polímero, o sistema compreendendo isto, método para crescimento e sua utilização, e novos processos para a sua preparação e polímeros obtidos desse modo.

Os materiais naturais/inorgânicos/orgânicos sintéticos microcelulares nos quais os poros estão interligados são, frequentemente, utilizados como um suporte para cultivar células vegetais ou animais ou enzimas. 1 A configuração de um suporte microcelular para uma aplicação de crescimento celular específico é, frequentemente, difícil com materiais microcelulares que se formam naturalmente. Recentemente, têm sido feitos esforços para cultivar células em materiais microcelulares recentemente desenvolvidos, que são preparados através de uma via de polimerização de emulsão de fase interna elevada (HIPE) , em que o volume de fase, da fase dispersa, é superior a cerca de 75% e, subsequentemente, polimerizando e/ou reticulando para obter uma estrutura rígida, proporcionando muitas vantagens. Estes materiais foram descritos na literatura pública e em divulgações de patentes e são referidos como polímeros polyhipe (PHP).

Refere-se que as características importantes destes materiais são: 1. 0 volume de poro poder ser tão elevado quanto 97% (para fins práticos); 2. Os poros estarem interligados; 3. Os tamanhos de poro e de interligação poderem ser controlados com precisão e independentemente; 4. Poderem ser conseguidas reacções de policondensação adicionais; 5. A reticulação poder ser conseguida com proteínas, polímeros, silicatos ou polímeros orgânicos mais uma vasta gama de materiais porosos pode ser obtida; 6. A modificação pós-polimerização/reticulação de PHP ser possível o que é ainda facilitado utilizando monómeros funcionais no estado de emulsificação; 7. 0 PHP poder ser obtido em bloco e/ou em forma particulada; 8. Uma vez que podem ser bombeadas HIPE, é possível formar estruturas moldadas. 2 A patente US 5071747 descreve a preparação de materiais de suporte polimérico microcelulares com diâmetro médio de cavidade (poro) dentro de uma gama de 1 a 150 pm, interligadas por furos (interligações) . O tamanho de furo (d) está relacionado com o tamanho de cavidade (D) e a sua razão pode ser controlada na gama de 0 < d/D <0,3. O controlo da razão d/D é através do controlo da concentração de tensioactivo e pela adição de electrólito, principalmente CaCl2 na gama de 10-4 molar a 5 molar. Os electrólitos são seleccionados de halogenetos e sulfatos solúveis. A função do electrólito é reivindicada como sendo o controlo do tamanho dos furos e para melhorar a estabilidade da emulsão.

No estado 1, as fases oleosa e aquosa são introduzidas sob deformação (agitação) e no estado 2, a HIPE resultante é homogeneizada sob deformação (agitação). Embora a velocidade de introdução das fases (i. e., tempo de dosagem (tD) ) da fase dispersa no misturador e o tempo de homogeneização (tn) subsequente da HIPE sejam referidos na patente US 5071747, as condições de mistura não estão especificadas. A polimerização é seguida por introdução de células. O documento US 5071747 divulga crescimento celular vegetal e animal isotrópico (não direccional) em três dimensões (3D) em Polímero Polyhipe polivínilico (PHP), o nome genérico para o material microporoso. Os reagentes ou nutrientes são proporcionados por meio de furos de interligação (interligações) dentro do PHP para aceder a cavidades (poros) nas quais são cultivadas células ou feitas reagir para produzir produtos. O PHP é meramente utilizado como um meio de crescimento celular permitindo o normal funcionamento dentro das cavidades, 3 utilizando furos (interligações) como canais de acesso. Proporcionaram-se cavidades e furos possuindo diâmetro de cavidade de 6-12 vezes o diâmetro das células a introduzir e a cultivar e diâmetro de furo de 3-6 vezes, i. e. diâmetro de cavidade de 45 micrones e diâmetro de furo de 15 micrones no caso de crescimento de células de levedura da ordem de 5 micrones. Contudo, nestes casos, o crescimento celular foi, predominantemente, crescimento superficial. Num exemplo adicional, o PHP possuindo porosidade de 90%, diâmetro de cavidade e de furo de 30 micrones e 10 micrones, respectivamente, foi utilizado para crescimento fúngico o qual se verificou penetrar a rede polimérica porosa.

Contudo, a literatura proporciona apenas ensinamento limitado relativamente ao controlo od tamanho de poro e de interligação. No documento US 5071747 acima não se refere como foram conseguidas as dimensões reivindicadas e, de facto, não seria possível obter dimensões de poro superiores a 50 micrones utilizando a informação limitada proporcionada, nem seria possível controlar ou pré-determinar um tamanho de poro particular dentro da gama de 1-50 micrones sem experimentação exaustiva. A utilidade de materiais PHP para crescimento celular permanece, por esse motivo, extremamente limitada e existe uma necessidade de materiais e métodos para preparar polímeros mais sofisticados permitindo crescimento celular mais sofisticado.

De um modo surpreendente, verificou-se agora que pode ser conseguido o crescimento celular coerente dentro de polímeros PHP para proporcionar um sistema multicelular cooperador que está adaptado para uma série de utilizações e que esses novos 4 PHP podem ser obtidos possuindo novas propriedades adaptadas para utilizações biológicas e não biológicas. É particularmente vantajoso que as células cooperem no PHP da invenção, uma vez que isto é importante para o crescimento celular. É proporcionado um método de fabrico de polímero natural ou sintético polyhipe microcelular na forma de um material celular aberto reticulado homogéneo possuindo porosidade superior a 75%, compreendendo poros de diâmetro 1 a 10000 mícrones e interligações de poro de diâmetro até 100 mícrones, em que o polyhipe é um suporte para crescimento multicelular em três dimensões, em que os poros e interligações de polímero estão compreendidos numa pluralidade de zonas distintas ou interpenetrantes que estão adaptadas para regular o posicionamento e morfologia celular pelo qual o crescimento celular é constrangido dentro e/ou se estende completamente por várias zonas, de modo direccional e/ou não direccional, para proporcionar uma estrutura celular múltipla para aplicações biomédicas.

Em particular, a invenção proporciona um método de fabrico de um suporte de polímero polyhipe microcelular, compreendendo o método os passos de preparar uma emulsão de fase interna elevada, compreendendo a emulsão uma fase dispersa compreendendo estireno, divinilbenzeno e um tensioactivo, e caracterizado por a fase contínua compreender um iniciador e um polímero hidrossolúvel. 0 polímero solúvel é, de um modo preferido, seleccionado de carboximetilcelulose ou óxido de polietileno. De um modo mais preferido, quando acarboximetilcelulose é o polímero solúvel, a carboximetilcelulose possui uma massa molecular de 90000 ou 5 250000. De um modo ainda mais preferido, quando o óxido de polietileno é polímero, o óxido de polietileno possui uma massa molecular de 200000 ou 400000 . De um modo ainda mais preferido, o polímero solúvel, está presente a um nível de 1% p/p.

De um modo opcional, o método inclui o passo de incluir dietil-hexilacrilato na fase dispersa.

De um modo conveniente, o tensioactivo é Span 80™. O polímero de acordo com a invenção pode ser proporcionado com características adicionais na forma de redes microcapilares, nanoporos, superfície, modificação química, propriedades eléctricas ou semelhantes para fins específicos.

Deste modo, a invenção proporciona materiais de PHP úteis, gujas muitas aplicações são altamente significativas, especialmente, a invenção pode ser utilizada como um módulo de órgão in-vitro multicanal em que as células devem estar sob um determinado potencial químico e/ou eléctrico, para expressar e, deste modo, funcionar. O potencial químico e/ou eléctrico será proporcionado pelos conteúdos dos microcanais. Este tipo de módulo é necessário em órgãos, como fígado, rim e pâncreas. Podem também ser utilizados módulos com microcanais como biorreactores selectivos, em que a expressão celular é regulada através da presença de um potencial químico e/ou eléctrico imposto através de cada tipo de conteúdo de canal. A expressão celular sob diferentes tipos de potencial e resistência ao potencial pode ser utilizada para produzir compostos bioquímicos que podem conduzir ao entendimento de processos de doença e/ou preparação de novas proteínas em aplicações de fármacos. 6 A utilização de materiais de PHP na produção de compostos bioquímicos não está confinada ao cultivo de células animais num sistema de suporte com uma arquitectura e condições fisiológicas preferidas. As células vegetais assim como os microrganismos, tais como bactérias e vírus, podem também ser cultivados utilizando o material de PHP. Neste caso, pode ser utilizada a forma particulada do material de PHP com poros abertos para proporcionar suporte para crescimento de células, bactérias ou vírus. 0 material de PHP particulado pode ser suspenso num biomeio adequado para a reacção bioquímica prosseguir.

Podem ser utilizados sistemas de suporte monolíticos, tais como os descritos nesta invenção, também para este fim. Quando é para cultivar virus no suporte de PHP, pode ser preferido material de tamanho de poro pequeno, inferior a 1 mícron.

De um modo preferido, as zonas estão adaptadas para crescimento de vários tipos de células independentemente constrangidos dentro e/ou que se estendem completamente por várias zonas, respectivamente.

Os parâmetros importantes que promovem crescimento celular são os tamanhos de poro e de interligação e caracterí st icas químicas e físicas da superfície de suporte. Em alguns casos, o crescimento celular pode ser anisotrópico (direccional) e, por esse motivo, pode ser necessário que os poros do suporte celular estejam na forma de microcanais com interligações para proporcionar comunicação celular e penetração celular. As paredes dos microcanais podem ser (bio)degradáveis de modo a que possa ser obtida subsequente fusão celular após (bio)degradação. 7

As aplicações biomédicas incluem qualquer aplicação em que os materiais interagem com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo. Os materiais podem, por esse motivo, ser considerados para uma gama de aplicações, por exemplo, o fabrico de lentes de contacto, obturação dentária, implantes cocleares, suportes vasculares incluindo válvulas cardíacas e pacemakers cardíacos e adesivos de pele para distribuição de fármacos e semelhantes.

Aqui, a referência a um suporte é para um material poroso que proporciona suporte e permite um posicionamento ou função de suporte de carga no suporte, num estado precoce, à medida que o suporte direcciona o crescimento ou toma a carga até as células crescerem dentro de um suporte e possuírem matriz extracelular desenvolvida para ganharem capacidade de suporte de carga e suportarem elas próprias as cargas. 0 crescimento celular pode ser de células que são introduzidas no suporte ou que migram para o suporte, por exemplo, no caso em que é utilizado um suporte para crescimento sintético ou é utilizado para crescimento celular natural por migração de células do tecido envolvente.

Aqui, a referência a polyhipe é para qualquer polímero natural ou sintético compreendendo poros e interligações, como anteriormente definido, obtido polimerizando uma emulsão de fase interna elevada.

Aqui, a referência a poros e interligações no polímero é para poros ou células vazias com interligações de poro entre si, que podem estar vazias ou podem conter materiais dissolvidos ou dispersos. Os poros e interligações são distinguidos pela sua magnitude e dimensões relativas como definido abaixo. A porosidade total do material é o espaço vazio combinado proporcionado pela soma de todos os poros e interligações.

Aqui, a referência a zonas dentro do polímero é para regiões distintas ou interpenetrantes caracterizadas pela forma, localização, dimensão ou outra propriedade de poros e interligações compreendida na zona. Por exemplo, são proporcionadas uma ou mais zonas na superfície de polímero, dentro da sua matriz de carga, na interface entre polímero e fase interna, entre poros e/ou interligações adjacentes de diferente forma ou dimensão ou adaptadas para crescimento de diferentes tipos de célula. As zonas são distinguidas por fronteiras que podem estar entre, ou contidas dentro de, poros e/ou interligações adjacentes nas respectivas zonas. 0 material de suporte celular com duas ou mais zonas distintas, em que os locais de poro e de interligação são diferentes, será necessário quando se co-cultivarem dois ou mais tipos de célula.

De um modo preferido, o polímero de acordo com a invenção é adequado para crescimento de vários tipos de célula para proporcionar uma estrutura celular multi-zona em que tipos de célula seleccionados estão confinados à fronteira específic, enquanto outros tipos de célula crescem por toda a estrutura através das fronteiras apresentadas pelo suporte. Por este meio, o suporte de polyhipe proporciona para vários sistemas celulares que se estendem por todo o suporte, de um modo opcional incluindo crescimento de intra-interligação ou de intra-microcapilar e apresentando delimitação de zonas e, de um modo opcional, interdelimitação de zonas de células biológicas. 9 0 polímero aqui descrito está, além disso, apto para encorajar a delimitação natural de zonas de células por migração dentro, ao longo e entre zonas que foram adaptadas para migração preferencial de tipos de célula desejados. 0 polímero aqui descrito pode ser obtido de quaisquer monómeros, oligómeros, macromonómeros, polímeros reactivos, naturais ou sintéticos, e suas misturas que apresentam biocompatibilidade. Os polyhipes estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparados utilizando métodos como divulgados no documento US 5071747 e em publicações de patente adicionais aí referidas ou como descrito abaixo. O polímero polyhipe genérico que está comercialmente disponível compreende polyhipe polivinílico e é constituído por monómeros de fase oleosa, estireno, divinilbenzeno (DVB) e tensioactivo (monooleato de sorbitano Span 80) e pode ser em forma rígida ou flexível, dependendo das proporções relativas dos monómeros, além da forma flexível, incluindo o monómero 2-etil-hexilacrilato e na fase aquosa uma quantidade de perssulfato de potássio como iniciador de fase aquosa. O polímero aqui descrito pode ser natural ou sintético, solúvel ou insolúvel, de um modo opcional, polímero reticulado (bio)degradável, de um modo preferido, seleccionado de proteínas e celulose, poliacrilamida, polivinilo em forma rígida ou flexível, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, policaprolactona, poli(láctido/glicólido) e poliacrilimida. O polyhipe comercialmente disponível possui, tipicamente, diâmetro de poro na gama de 5-50 mícrones. 10 0 suporte de PHP pode possuir diâmetro de poro na gama de 0,5 ou 1-10000 mícrones. Um limite de gama inferior preferido é 10 mícrones, de um modo mais preferido 30, por exemplo, 50 mícrones. Um limite de gama superior preferido é 300 mícrones, de um modo mais preferido 200 mícrones. O polyhipe de diâmetro de poro particular pode ser obtido por métodos anteriormente descritos e pode possuir qualquer razão desejada de interligação para o diâmetro de poro, por exemplo na gama de 0 < d/D < 0,5, de um modo preferido, na gama de 0,1 < d/D < 0,5 quando o diâmetro de poro é, aproximadamente, inferior a 200 mícrones. As interligações podem possuir diâmetro numa gama até 100 mícrones, de um modo preferido, 0,001 a 100 mícrones, de um modo mais preferido, 10-50 mícrones. Podem ser proporcionadas redes extensas de microcapilares elongados de diâmetro tão baixo como 10 mícrones, estando estes capilares separados pelo polímero microcelular. Uma zona compreendendo a interface entre uma parede capilar e o polímero de carga pode proporcionar uma camada superficial de qualquer espessura desejada para crescimento de células de qualquer tamanho desejado. Uma interface possuindo uma camada superficial fina da ordem de 0,5-5 mícrones é, particularmente, adequada para crescimento de neurónios (células nervosas) ou células musculares em que a direccionalidade é importante. A interface possuindo tamanho de poro mais pequeno do que a carga proporciona uma zona ideal para crescimento de células que formam um revestimento, por exemplo, células que revestem os vasos sanguíneos ou para crescimento de células endoteliais na superfície de interface. A estrutura de poro na presente invenção forma-se através de 4 mecanismos diferentes. Estes mecanismos utilizam-se frequentemente em combinação, para obter várias formas de arquitectura de suporte de modo a criar um modelo realista para 11 suporte de órgãos. Sao descritas abaixo quatro estruturas de poro diferentes:

Poros Tipo-1 (Poros básicos): Esta é a estrutura básica de poro, do qual o tamanho é determinado no estado de emulsificação da formação de PHP. Por esse motivo, o tamanho de poro é principalmente determinado pelo historial de deformação (fluxo) da emulsão. A integridade destes poros mantém-se durante a polimerização e as interligações são formadas neste estado. Dependendo da química das fases aquosa e oleosa, volume de fase e das condições de polimerização, tais como temperatura e pressão, o tamanho de interligação pode ser controlado na gama de 0 < d/D < 0,5.

Poros Tipo-2 (poros coalescente): Este tipo de arquitectura de poro é obtida através de coalescência controlada dos poros Tipo-1 durante a polimerização. As gotículas de fase dispersa na emulsão do PHP são coalescidas pela adição de polímeros hidrossolúveis na fase aquosa ou adicionando óleos ligeiramente hidrofílicos (tal como óxido de estireno) à fase oleosa. Neste caso, o tamanho de interligação é o mesmo que o dos poros Tipo-1 que formam uma matriz que incorpora os poros coalescidos. Contudo, devido ao facto de os poros coalescidos serem muito grandes comparados aos poros básicos, a razão d/D é muito pequena.

Poros Tipo 3 (Microcapilares): É possível obter uma rede de microcapilares dentro dos poros Tipo-1 ou Tipo-2 (i. e. suportado por estes poros) ou, na realidade, obter microcapilares suportados por poros Tipo-1 com poros Tipo-2 que formam as paredes dos capilares ou vice-versa. Estes microcapilares são formados utilizando um molde especialmente 12 construído, em que são inseridas hastes ou fibras finas. A emulsão de PHP é bombeada para o molde e realiza-se a polimerização. Após polimerização, estas inserções são removidas puxando-as para fora (quando a polimerização resulta em contracção ou quando as inserções poliméricas são primeiro inchadas durante a polimerização e, subsequentemente, contraídas após polimerização ou a remoção do solvente utilizado como enchimento para o monómero) ou dissolvendo as inserções em ácido ou num solvente adequado. 0 diâmetro mínimo destes microcapilares pode ser tão baixo como 10 mícrones (utilizando fibras de vidro, de carbono ou poliméricas). Podem ser utilizadas fibras metálicas para obter microcapilares na gama de 50-1000 mícrones ou superior.

Poros Tipo-4 (Nano-poros): As paredes de poro do PHP microporoso podem ser feitas nanoporosas utilizando um "enchimento" adequado na fase oleosa de modo que, após a polimerização, o enchimento ou a sua forma reagida possa ser removido por extracção de solvente. O enchimento pode ser óleo ou outro monómero ou macromonómero que não seja submetido a polimerização ou se o monómero/macromonómero polimerizar, o polímero resultante pode ser extraído. O enchimento pode também ser outro polímero ou polímero reactivo que se dissolve no monómero ou um óleo de hidrocarboneto adequado, assim como sólidos de tamanho nano, tal como pó de sílica ou zeólito. Se o óleo de "enchimento" for altamente solúvel no monómero, assim como o polímero reticulado resultante, criará poros muito finos após extracção. Se o polímero resultante não for solúvel no óleo de enchimento ou se não inchar, formarão partículas sub-mícrones ligadas umas às outras por várias cadeias de reticulação. Esta rede de partículas e o óleo de enchimento formarão um sistema co-contínuo. Este método pode ser utilizado para controlar a 13 quantidade de nano-porosidade no polímero microporoso. Os nanoporos são também obtidos utilizando polímeros que são solúveis no monómero. Estes polímeros podem também ser extraídos após a formação do polímero polyhipe para criar nanoporos. Tais polímeros de enchimento, se não extraídos, podem proporcionar resistência extra. Tais nanoporos permitirão a difusão de solutos de baixo peso molecular através do suporte de órgão, uma vez que as paredes criarão uma barreira para o transporte destes solutos vitais. Tais solutos incluem oxigénio, dióxido de carbono, nutrientes, hormonas de crescimento, electrólito e semelhantes. A presença dos nanoporos pode também ser útil na biodegradação controlada do suporte de órgão e através de degradação hidrolítica de polímero uma vez que a área de superfície efectiva será muito elevada.

Os tipos de poro podem estar presentes em qualquer forma modular, por exemplo, tipo invólucro e tubo ou cúbico/poliédrico.

De um modo preferido, o tamanho de poro e tamanho de interligação são seleccionados de acordo com o tipo de célula a cultivar e o tipo de crescimento, i. e., com ou sem penetração, confinado a uma fronteira ou fronteiras de passagem entre zonas. 0 tamanho de poro em zonas pretendidas para crescimento de células por toda a zona é, de um modo preferido, de diâmetro 2-3 vezes o diâmetro de células a crescer, por exemplo 2,5 vezes de diâmetro de célula. Sem estar limitado a esta teoria, crê-se que esta razão de dimensões é óptima para tipos de célula, incluindo tipos de célula de cartilagem, pelos quais as células estão aptas para crescer e prosperar, como indicado pela produção de colagénio. Por exemplo, as células de cartilagem de 14 diâmetro 10 mícrones foram cultivadas em poros de diâmetro na gama de 17-30 mícrones, de um modo particular, de 25 micrones. O suporte de polyhipe pode ser adaptado para proporcionar uma superfície desejada caracterizada por meio do revestimento de superfície, utilizando materiais de revestimento introduzidos in situ durante a polimerização ou pós-polimerização. Podem ser empregues quaisquer materiais conhecidos tipicamente utilizados para polímeros de revestimento para utilização em crescimento celular, por exemplo, promotores de crescimento celular, tais como hidroxiapatite ou fosfato tricálcico, que também promove biocompatibilidade, outros minerais, sílica, colagénio, hialurano, óxido de polietileno, carboximetilcelulose (CMC), proteínas, polímeros orgânicos, partículas e semelhantes. O revestimento in situ proporciona revestimento homogéneo por todo o suporte. O revestimento pós-polimerização utilizando, por exemplo, ablação laser resulta em revestimento confinado à superfície da matriz de carga e pode ser revestimento de partícula. O suporte de polyhipe pode ser construído de quaisquer materiais desejados como anteriormente aqui definidos. Verificou-se que a deformação mecânica cíclica do suporte ou a aplicação de um campo eléctrico também pode melhorar a velocidade de crescimento celular. Em muitos casos, a biodegradabilidade do suporte parece não ser importante e, por esse motivo, o material de suporte com células de crescimento pode ser implantado no organismo animal sem medo de rejeição. Contudo, quando é necessária fusão célula-célula, a (bio)degradabilidade torna-se importante. 15

Por esse motivo, o polímero é, de um modo preferido, feito de materiais elásticos ou resilientemente deformáveis ou torna-se elástico ou resilientemente deformável por meios adequados. Os materiais preferidos são, por esse motivo, termoplásticos que podem ser deformados de modo adequado para influenciar o crescimento celular. De um modo preferido, um suporte de polyhipe, como anteriormente definido, é adequado para tensão e relaxamento repetido por meio de deformação oscilatória do suporte durante o crescimento celular. Verificou-se por possuia efeitos benéficos na promoção de velocidade de crescimento celular. 0 suporte de polyhipe, como anteriormente definido, pode ser electricamente condutor ou pode tornar-se electricamente condutor por meios conhecidos pelos quais é adaptado para conduzir uma corrente eléctrica durante o crescimento celular. Esta técnica é particularmente vantajosa para distinguir determinados tipos de células e promover crescimento e fusão de tipos de célula particulares, tais como neurónios e células musculares. 0 suporte de polyhipe pode ser biodegradável ou pode tornar-se biodegradável por meios conhecidos pelos quais é adaptado para degradar por contacto com qualquer agente desejado ou por introdução em qualquer ambiente desejado, por exemplo, um agente ou ambiente biológico específico. De um modo preferido, o suporte de polyhipe é adaptado para degradação pela hidrólise ou hidrólise catalisada por enzima das cadeias de polímero e reticulação ou pela erosão do polímero. Por este meio, os suportes de polyhipe podem ser utilizados como um suporte para suportar um sistema biologicamente activo para a duração de tempo necessário para o sistema se estabelecer ele próprio e ser 16 auto-suportável e, posteriormente, se degradar sem efeitos prejudiciais. De um modo preferido, é utilizado um suporte degradável para crescimento de tipos de célula incluindo, por exemplo, células musculares. Por este meio, um suporte é adaptado para posicionar vários tipos de células em zonas pré-determinadas e, posteriormente, degradar permitindo auto fusão para tomar lugar na ausência do suporte de intervenção pelo qual são criados micro-sistemas biologicamente activos funcionais.

Num aspecto adicional da invenção é proporcionado um suporte de polyhipe, como anteriormente definido, compreendendo várias células caracterizado por crescimento em três dimensões, como anteriormente definido, em zonas de polímero como anteriormente definido. 0 suporte, incluindo células, pode compreender qualquer das propriedades como anteriormente aqui definidas.

As células múltiplas podem ser qualquer tipo de célula desejado, seleccionado de células humanas, animais e vegetais. De um modo preferido, as células são células humanas ou animais e são representativas de vários tipos de células presentes em qualquer órgão, sistema ou parte do corpo humano ou animal. As células são, de um modo preferido, seleccionadas de células teciduais e ósseas isotrópicas presentes em cartilagem, córnea, medula e semelhantes, células anisotrópicas, tais como células nervosas, musculares, de vasos sanguíneos e semelhantes. 0 tipo de célula inclui, por exemplo, fibroblastos, condrócitos, osteoblastos, células de medula óssea, hepatócitos, cardiomicitos, neurónios, mioblastos, macrófagos e células de endotélio microvasculares. 17 É também aqui descrito um sistema biologicamente activo compreendendo um suporte de polyhipe e várias células, como anteriormente definido, adaptado para proporcionar funcionamento celular normal associado com um sistema biologicamente activo natural presente no corpo humano ou animal. Um sistema biologicamente activo pode compreender o suporte de polyhipe intacto ou em estado parcialmente degradado, como anteriormente definido, adaptado para fusão ou assimilação num ambiente. É também descrito um método para crescimento de várias células num suporte de polyhipe, como anteriormente definido, compreendendo proporcionar células sobre ou no suporte num ambiente controlado e proporcionar um nutriente adequado adaptado para crescimento de modo conhecido. 0 método pode incluir qualquer técnica para promoção de crescimento, controlo posicionai e semelhantes, adaptados para proporcionar um sistema estrutural como anteriormente definido. É também descrito um suporte de polyhipe adaptado para crescimento celular múltiplo, como anteriormente definido, compreendendo várias células como anteriormente definido ou um sistema biologicamente activo como anteriormente definido para utilização como um implante in vivo no corpo humano ou animal ou como módulos para estudos in vitro que imitam uma parte do corpo humano ou animal ou para utilização num ambiente de crescimento para sistemas adicionais como anteriormente definido, por exemplo, para o crescimento de células de órgãos no lado celular do módulo de modo a estimular órgãos. É também descrito um módulo de suporte de órgãos compreendendo um módulo cúbico ou poliédrico rigorosamente 18 entrecruzado mas que não interliga canais imersos em PHP. 0 módulo é adequado para crescimento de células de órgão especificas no PHP e/ou nos canais. Algumas células podem estar em contacto com um microcanal especifico e todas as células serão susceptiveis de comunicação intercelular.

Podem ser produzidos órgãos in vitro utilizando as interligações de microcapilares do suporte, como anteriormente definido, para circulação de nutrientes e remoção de produtos de desperdício enquanto crescem células nos poros de carga e, adicional ou subsequentemente, quando é necessário crescimento celular anisotrópico, por exemplo, para imitar sistemas cardiovasculares e semelhantes, empregando circulação de nutrientes e produtos de desperdício removíveis através dos poros de carga do suporte microporoso enquanto crescem células nas interligações de microcapilares. É uma vantagem particular que isto permite crescimento e mantém o funcionamento celular durante períodos prolongados. A utilização dos suportes e sistemas, como anteriormente definida, como órgãos in vitro, pode ser aproveitada para ensaios de fármacos e de quaisquer substâncias a introduzir no corpo humano ou animal, para engenharia genética, para estudar mecanismos associados com doenças e semelhantes sob condições controladas e semelhantes. Isto é particularmente vantajoso na eliminação da necessidade para ensaios animais. Os módulos in vitro, como anteriormente aqui definidos, para tipos específicos de várias células e aplicações, podem ser proporcionados e podem ser associados com instrumentação para proporcionar as condições fisiológicas necessárias. 0 módulo é adequado para crescimento de células de órgão específicas no PHP e/ou nos canais. Algumas células podem estar 19 em contacto com um microcanal específico e todas as células serão susceptíveis de comunicação intercelular

De modo a mimetizar o ambiente natural das células dentro de um órgão, tem de ser proporcionada uma série de recursos para a função celular fisiologicamente correcta. Estes recursos podem ser resumidos como: 1. microcapilares de fornecimento de sangue ou nutrientes; 2. canais de recolha de expressão celular; 3. estimulação neural; 4. suporte microcelular para a co-cultura de células de suporte; 5. biocompatibilidade e biodegrabilidade controlada; e 6. características de suporte mecânicas, químicas e eléctricas controladas. É possível alojar um conjunto de canais microcapilares que são separados por material de suporte celular (maioria do suporte de órgão) para facilitar (1)-(3). Nesse sistema de suporte de órgão, as células estão dentro de mícrones de poucas centenas destes microcapilares. Em cada conjunto de rede capilar assim como na carga, a pressão média pode ser regulada de modo que os produtos de expressão celular sejam recolhidos no conjunto de capilares designado e, subsequentemente, recuperados. Os neurónios podem ser cultivados no conjunto de microcapilares designado e electricamente estimulados através de um micro-chip externo. Uma vez que a expressão celular é afectada por tensões externas (tensões físicas, tais como tensão e temperatura cíclica, tensões químicas, tais como fármaco/toxina em sangue/nutriente, estimulação eléctrica através dos nervos) é possível obter diferentes expressões 20 celulares dependendo da tensão externa que pode ser controlada com muita precisão num órgão in vitro. In vivo, a gama e duração de tensões externas são limitadas e existe sempre interferência das outras células. Por esse motivo, são úteis órgãos in vitro com recursos fisiológicos para aumentar o âmbito de resposta celular a tensões externas. Neste sentido, os órgãos in vitro podem ser vistos como Reactores Biomédicos que permitem a sintese de novas proteínas e entendimento dos processos de doenças.

Pode ser utilizado um conjunto de capilares para alimentação de modo que as células não necessitem de percorrer uma longa distância de modo a ocupar o espaço disponível. Após alimentação, estes microcapilares podem ser utilizados para outros fins. É possível conceber um sistema de suporte de órgão que permite a co-cultura de células de suporte na proximidade imediata às células de órgão principais. As emulsões de PHP com tamanhos de poro e de interligação diferentes podem ser co-extrudidas numa configuração desejada (i. e., concentricamente ou lado a lado). Como verificado nesta invenção, as células não penetram se os tamanhos de poro e de interligação forem muito grandes ou muito pequenos em relação ao tamanho de célula. Por esse motivo, cada tipo de célula estará apto a escolher a estrutura de poro óptima para suporte e crescimento. A estimulação eléctrica de crescimento de células nervosas num microcapilar pode ser conseguida revestindo os microcapilares com polímeros condutores. Na ausência de qualquer rede neural para estimulação eléctrica, podem ser criados campos 21 eléctricos controlados dentro do sistema de suporte utilizando uma rede de fibras de carbono como condutores.

Deve ser entendido que a invenção deriva da verificação de que os suportes de polyhipe, como anteriormente aqui definidos, podem ser proporcionados com dimensões e diâmetros de poro controlados em zonas, como anteriormente definidas, de tal modo que, por exemplo, um tipo de célula penetra o suporte e um segundo tipo de célula pode crescer na superfície. Isto permite crescimento e posicionamento celular controlado de modo a criar uma estrutura celular múltipla que é adaptada para co-operar para proporcionar actividade biológica. É proporcionado um processo para a preparação de polímeros naturais ou sintéticos polyhipe microcelulares, como anteriormente aqui definidos, compreendendo, num primeiro estado, a formação de uma emulsão de fase interna elevada (HIPE) de fase dispersa em fase contínua, em que a fase dispersa pode ser esvaziada ou pode conter materiais dissolvidos ou dispersos e estão presentes monómeros, oligómeros e/ou pré-polímeros na sua fase contínua, homogeneização e polimerização, por meio de no primeiro estado se introduzir a fase dispersa por dosagem controlado na fase contínua com mistura controlada a temperatura controlada para conseguir uma emulsão e, subsequentemente, homogeneizar durante um período controlado sob deformação controlada e polimerizar sob temperatura e pressão controlada. 0 processo permite uma vasta gama de tamanhos de poro a serem obtidos controlando a técnica de processamento e condições composicionais e, em particular, como anteriormente definido, para obter micro-poros Tipo 1-4. Os tamanhos de poro são obtidos em, aproximadamente, 3 grupos: são estes; tamanho de poro 22 pequeno: 1-10 μιη; tamanho de poro grande: 11-2 00 pm e tamanho de poro muito grande: 201-10000 pm.

As emulsões de tamanho de poro muito pequeno (atingindo 0,5 pm) são obtidas utilizando caudais de deformação muito elevados em que o fluxo é predominantemente extenso e a temperatura de emulsificação é tão baixa quanto possível. As emulsões de tamanho de poro grande (atingindo 200 pm) são obtidas a temperaturas elevadas e apenas acima da velocidade de deformação crítica abaixo da qual a emulsão irá inverter, total ou parcialmente, por exemplo, para um sistema tipo óleo em água. A velocidade de deformação crítica pode ser determinada variando, por exemplo, a velocidade de adição ou velocidade de deformação durante mistura para um dado sistema. Estas emulsões devem também ser processadas num curto tempo utilizando predominantemente fluxos de corte.

As emulsões de poro muito grande (atingindo 10000 pm) são obtidas através do método de coalescência de poro controlada durante a polimerização. Existem dois métodos de atingir coalescência controlada: 1) adicionando na fase aquosa (dispersa) uma quantidade conhecida de polímero hidrossolúvel ou 2) adicionando solutos de "enchimento" na fase oleosa contínua. Em ambos os métodos, a concentração e o tipo destes aditivos são importantes. Se as concentrações forem baixas, estes aditivos resultam em polímeros polyhipe na gama de 1-200 pm com algumas propriedades desejadas. Se a concentração for acima de um determinado valor, os poros de coalescência começam a formar-se. Neste caso, o tamanho de poro é definido pelo tamanho dos poros antes do início de coalescência, temperatura de polimerização e concentração, peso molecular e tipo de aditivo. 23 A emulsão pode ser obtida de quaisquer fases imisciveis desejadas que formem uma fase continua e uma dispersa, de um modo preferido, de fases aquosas e não aquosas, de um modo mais preferido, fases aquosas e oleosas. A emulsão obtida pode ser uma aquosa em emulsão oleosa ou oleosa em emulsão aquosa. 0 processo de acordo com a invenção pode ser utilizado para a preparação de quaisquer polímeros desejados, como anteriormente aqui definidos.

De um modo surpreendente, verificou-se que por meio de dosagem controlado da fase dispersa na fase contínua, é possível conseguir a emulsão desejada. Num misturador, a dosagem da fase dispersa é, de um modo preferido, conduzido a partir do fundo do misturador, utilizando pontos de entrada únicos ou múltiplos. A alimentação de várias entradas resultou em emulsões de poros mais largos. Se a velocidade de dosagem foi muito rápida, a mistura criada pelo jacto emergente de fase aquosa era muito severa e, por esse motivo, o tamanho de poro de emulsão diminui. Por esse motivo, esta combinação de pontos de alimentação múltiplos com uma dosagem relativamente prolongado criou emulsão de poro grande. Após a conclusão da dosagem, a emulsão deve ser homogeneizada mas se o período de homogeneização foi grande, o tamanho de poro diminuiu. A mistura controlada como anteriormente aqui definida, pode ser crítica ou extensa. Mistura crítica é misturar o suficiente para provocar a dispersão de fase aquosa na fase oleosa sem inversão de fase. A mistura crítica é obtida pela utilização de um campo de mistura homogénea pelo qual o tamanho de poro é substancialmente uniforme impedindo quebra da emulsão e inversão de fase. 24 A mistura pode ser por qualquer dos meios adequados para proporcionar um campo de mistura homoqénea substancialmente por todo o volume total das duas fases e é, de um modo preferido, por várias lâminas, jacto múltiplo e misturas semelhantes.

De um modo surpreendente, verificou-se por esse motivo que, ao contrário do ensinamento do documento US 5071747, o atingir de uma emulsão estável com diâmetro de poro grande é obtido minimizando a intensidade de mistura. De acordo com a invenção, verificou-se que por meio de dosagem, mistura homogénea e semelhantes, pode ser obtida uma emulsão estável dispensando a necessidade de mistura intensa. 0 dosagem, emulsificação e homogeneização podem ser conduzidos a qualquer temperatura adequada dependendo do tamanho de poro no polímero polyhipe final. Se o tamanho de poro desejado for grande, a temperatura preferida é elevada mas, contudo, abaixo do ponto de ebulição da fase de ebulição mais baixa. Uma fase aquosa como a fase de ebulição mais baixa, entra em ebulição a cerca de 100 °C. Verificou-se que o processo da invenção que emprega temperatura de emulsificação de 60 °C, ou superior, resulta em polímeros a serem obtidos possuindo tamanho de poro superiores a 60 mícrones. O aumento da temperatura de emulsificação acima de 60 °C resulta em aumento dramático no tamanho de poro por uma quantidade superior à atingida para um aumento semelhante na temperatura abaixo de 60°C. A temperatura máxima de emulsificação pode ser superior à temperatura de ebulição normal da fase de ebulição mais baixa, por exemplo, a fase de ebulição mais baixa pode incluir qualquer componente adequado adaptado para aumentar o ponto de ebulição. 25

De um modo preferido, a fase aquosa inclui um electrólito que é estável a 100 °C e é potencialmente inerte. Por este meio, o processo é, de um modo preferido, realizado com utilização de temperatura de homogeneização na gama de 60-150 °C, de um modo mais preferido, 80-140 °C, de um modo muito preferido, 80-120 °C. A emulsificação e subsequente polimerização podem ser realizadas a temperaturas acima do ponto de ebulição normal dos materiais de fase aquosa ou continua, aumentando a pressão acima da atmosférica utilizando equipamento de processamento continuo fechado. O processo pode ser realizado com utilização de iniciadores de fase aquosa ou oleosa adicionais, agentes de reticulação, enchimentos e semelhantes e é preferido que estes sejam estáveis à temperatura máxima de funcionamento, como anteriormente definido. A selecção de iniciadores, agentes de reticulação e semelhantes é feita com referência à viscosidade aceitável das fases para emulsionar e homogeneizar. Pode ser aceitável reduzir a quantidade de agente de reticulação necessário por utilização de uma proporção de pré-polímeros e de pré-polímeros parcialmente reticulados, de um modo opcional, com a utilização de um enchimento de fase oleosa adequado para aumentar o volume de fase oleosa e reduzir a viscosidade efectiva.

De um modo preferido, o processo da invenção é caracterizado pela utilização de um iniciador na fase oleosa, em conjunto com, ou em vez de, um iniciador de fase aquosa como conhecido na técnica. 26

De um modo preferido, o processo realiza-se com utilização de enchimentos de fase oleosa e permitindo funcionamento a temperatura de emulsificação elevada e com utilização de agente de reticulação minimo. Isto possui a vantagem adicional de o enchimento de fase oleosa, tal como hidrocarboneto de elevado ponto de ebulição, poder ser filtrado após a polimerização criando nano-poros e aumentando o tamanho das interligações. Os electrólitos podem ser, por exemplo, cloreto de cálcio ou minerais, tal como hidroxiapatite.

Os iniciadores de fase aquosa podem ser empregues para funcionamento a temperaturas inferiores e incluem perssulfato de sódio ou potássio.

Para funcionamento a temperatura elevada acima de 80 °C, são, de um modo preferido, utilizados iniciadores de fase oleosa, por exemplo, 1,1-azobis (ciclo-hexanocarbonitrilo). O agente de reticulação pode ser, por exemplo, divinilbenzeno (DVB) . Se o polyhipe for necessário para ser biodegradável, podem ser obtidas reticulações hidrolisáveis. Estes agentes de reticulação são etilenodiacrilato, Ν-Ν'-dialil tartardiamida, N-N (1,2, di-hidroxietano)-bis-acrilamida e Ν-Ν'-Ν''-trialil citrictriamida. Contudo, neste caso de agentes de reticulação biodegradáveis, o próprio polímero deve ser biodegradável. Estes polímeros são ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli ε-caprolactam e poliacrilimida.

Quando são necessários polímeros hidrossolúveis para formar a estrutura microcelular, estes necessitam de ser reticulados. Neste caso desses polímeros, o monómero (tal como acrilamida) é dissolvido em água e forma-se uma emulsão HIPE que doseia esta 27 solução de monómero num hidrocarboneto líquido, tal como hexano ou tolueno, na presença de tensioactivo, iniciador e agente de reticulação adequados.

As proteínas e celulose podem também formar estruturas microcelulares. Neste caso, estes materiais em conjunto com um emulsionante adequado são dissolvidos numa fase aquosa adequada (água para proteínas e reagente de Schweitzer, Cu(NH3) 4 (OH) 2 para celulose) e doseados num líquido de hidrocarboneto para formar uma HIPE contínua em água. A reticulação é conseguida imergindo a HIPE numa solução de glutaraldeído (para proteínas) ou solução ácida (celulose). 0 enchimento de fase oleosa pode ser qualquer hidrocarboneto de ponto de ebulição elevado, outro monómero ou macromonómero, polímero reactivo ou inerte, partículas sólidas ou suas combinações. 0 processo pode incluir a introdução de qualquer modificador adequado, como anteriormente definido, anterior ou subsequente à polimerização. Por exemplo, podem ser introduzidos minerais, tais como hidroxiapatite, na fase aquosa dispersa e doseados na fase contínua, como anteriormente definido. De um modo alternativo, é empregue um estado de modificação pós-polimerização, que pode simplesmente tomar a forma de remover tensioactivo, electrólito e monómero não reagido, revestimento, polimerização ou reacção adicional na superfície de polímero existente. Os agentes modificantes e as técnicas de modificação são mostrados na técnica. 28 A polimerização realiza-se sob condições conhecidas de tempo e temperatura para o respectivo monómero, oligómero e ou pré-polímero a polimerizar, como conhecido na técnica. É proporcionado um polímero natural ou sintético polyhipe microcelular na forma de um material celular aberto reticulado homogéneo possuindo porosidade superior a 75% compreendendo poros e interligações de poro formados polimerizando uma emulsão de fase interna elevada (HIPE), como aqui definida anteriormente, em que o diâmetro de poro médio é superior a 50 mícrones. De um modo preferido, o diâmetro de poro médio é superior a 100 mícrones, de um modo mais preferido, superior a 150 mícrones e é seleccionado para ser adequado para a aplicação de polímero desejada. São considerados diâmetros de poro até 10000 mícrones. Os diâmetros de interligação são como anteriormente aqui definidos. É proporcionado polímero polyhipe, como anteriormente definido, possuindo tamanho de poro médio, como anteriormente definido, na gama de 1-10000 mícrones, em que o polímero é modificado durante a sua polimerização ou pós-polimerização para ser electricamente condutor, degradável, ou compreende mineral distribuído por toda a matriz ou como um revestimento de superfície. É proporcionado um aparelho para a preparação de um polímero compreendendo um vaso de mistura adaptado para conter a fase contínua possuindo várias entradas para a introdução por dosagem da fase dispersa como anteriormente definido e compreendendo meios para mistura homogénea, como anteriormente definido e compreendendo elevação de temperatura e meios de regulação. 29 É proporcionado um método para fabrico de um módulo de suporte de órgãos, como anteriormente definido. 0 método emprega um ou mais estados, como anteriormente aqui definidos, para criar poros Tipo 1-4. A invenção é agora ilustrada, de um modo não limitante, com referência aos seguintes exemplos e figuras em que:

As Figuras la-2b são esquemáticas e uma secção transversal de sistema de suporte de órgãos utilizando a invenção.

Exemplo A - preparação de polyhipe, utilizando aparelhos de acordo com a invenção. A preparação da emulsão foi realizada num misturador a partir de uma fase oleosa e de uma fase aquosa, doseadas a uma velocidade pré-determinada, enquanto a emulsão foi agitada a velocidade reaccional constante. A velocidade de dosagem, velocidade de deformação, velocidade de mistura foram pré-determinadas como uma função de volume das fases respectivas, diâmetro do misturador e dos rotores, velocidade rotacional dos rotores e tempo de homogeneização.

De modo a eliminar as diferenças no desempenho de diferentes condições de mistura, caracteriza-se a mistura através de:

Velocidade de dosagem RD = Va 30

Velocidade de deformação durante dosagem RE = VA / (tDV0)

Velocidade de mistura RM — Dj Ω /D0 Em que:

VA = Volume de fase aquosa adicionado ao longo de um período de tempo tD V0 = Volume da fase oleosa colocado no misturador Di = Diâmetro dos rotores Do = Diâmetro do misturador Ω = Velocidade rotacional

Define-se também tH como o tempo de homogeneização e tT como o tempo de mistura total.

t? - tD + tH

Após a preparação das emulsões sob um dado conjunto de condições, como descrito em cada dos seguintes exemplos, deixou-se a emulsão polimerizar a 60 °C durante 8 horas. As amostras foram ainda modificadas como descrito nos seguintes exemplos.

Os tamanhos de poro e de interligação foram determinados utilizando microscópio de varrimento electrónico, utilizando amostras completamente secas e lavadas. 31

Exemplo AI - o efeito da condição de funcionamento no tamanho de poro e de interligação. A fase oleosa continha 78% de estireno, 8% de monómero DVB e agente de reticulação e 14% de tensioactivo Span 80, monooleato de sorbitano, enquanto a fase aquosa continha 1% de perssulfato de potássio. Utilizaram-se dois rotores de pás planas (8 cm de diâmetro e 1,4 cm de largura) num tanque de mistura de 8,5 cm de diâmetro. A separação de rotor foi 1 cm. Colocaram-se 25 mL de fase oleosa no fundo do tanque e dosearam-se 225 mL de fase aquosa utilizando 16 pontos de alimentação. A temperatura da fase aquosa variou de -1,0 a 80 °C.

Tabela 1-0 efeito das condições de funcionamento no tamanho de poro e de interligação.

Temp Tamanho de Tamanho de Tempo de Tempo de d/D (°C) Poro (D) Interligação dosagem homogeneização (pm) (d) (pm) (s) (s) 5 34 9 40 60 0,26 25 37 14 40 60 0,38 60 65 22 40 60 0,33 80 141 37 40 60 0,26 25 102 25 40 20 0,25 25 72 21 30 20 0,29 25 67 22 25 20 0,33 25 148 43 60 20 0,29 32

Exemplo A2 - Efeito de polímeros hidrossolúveis no tamanho de poro e de interligação em coalescência de poro controlada.

Prepararam-se emulsões utilizando 78% de estireno, 8% de DVB e 14% de Span 80 como a fase oleosa. A fase aquosa continha 1% de perssulfato de potássio e quantidades variáveis de polímeros hidrossolúveis, carboximetilcelulose sódica (CMC) ou óxido de polietileno (PEO) . A emulsificação é a 25 °C, o volume de fase aquosa é 85% e a fase aquosa é distribuída através de uma entrada única. As condiçoes de processamento foram: tD = tH = 600 Rm = 4, 7 s sequndos, RD = 0,70 mL/s, Re = 0, 0067 s”1 e

Tabela 2-0 efeito de polímeros hidrossolúveis no tamanho de poro em coalescência de poro controlada

Massa Molecular relativa Concentração de Polímero Hidrossolúvel % em peso de fase aquosa Tamanho de Poro (pm) Controlo 0 18 Carboximetilcelulose sódica (CMC) 90000 0,5 22 90000 1,0 260 250000 1,0 1200 Óxido de polietileno (PEO) 200000 1,0 420 400000 1,0 4300 33

Exemplo A3 - Revestimento de superfície in-situ com hidroxiapatite

Prepararam-se emulsões utilizando: (Al) 78% de estireno, 8% de DVB e 14% de Span 80 ou (A2) : 15% de estireno, 60% de 2-etil-hexilacrilato, 10% de DVB e 15% de Span 8. A fase aquosa continha; (Bl): 1% de perssulfato de potássio ou (B2): 1% de perssulfato de potássio, 0,5% de hidroxiapatite (HA) e 15% de ácido fosfórico que é utilizado para dissolver a hidroxiapatite (HA) . A emulsificação é realizada a 25 °C, com volume de fase aquosa a 85% e a fase aquosa é distribuída através de uma entrada única. As condições de processamento foram tD = tH = 600 segundos, RD = 0,83 mL/s, RM = 4, 7s_1 e RE = 0, 0067 s_1. Após a emulsificação e polimerização, as amostras contendo hidroxiapatite foram ensopadas em NaOH 1M para precipitar a hidroxiapatite. Após precipitação, as amostras foram limpas em água para manter o pH = 7 e IPA e examinadas quanto à sua estrutura.

Tabela 3-0 efeito da hidroxiapatite no tamanho de poro e de interligação.

Descrição Composições de Fase Aquosa e Oleosa Ai Bi (PHP Rígido) Ai: B2 (PHP Rígido/HA) A2: Bi (PHP Elástico) A2; B2 (PHP Elástico/HA) Tamanho de poro D (pm) 22 38 9 17 Tamanho de interligação d (pm) 2 11 1,5 6 d/D Oh O o 0,29 \—1 o 0,35 34

As amostras com composições (A^B^ e (Ai,*B2) são examinadas sob SEM e a sua análise elementar de superfície indicou distribuição uniforme de hidroxiapatite (Caio (P04) 6 (OH) 2) como mostrado na Tabela 4. A fase oleosa contendo apenas estireno é referida como PHP rígido e quando a fase oleosa contém 2-etil-hexilacrilato, a composição resultante é referida como PHP elástico.

Tabela 4 - Análise elementar da superfície de fractura de dois polímeros polyhipe com composições (Ai;Bi) e (Ai;B2)

Componente PHP nao modificado (Ai:Bi) - % em peso PHP revestido com Hidroxiapatite (Ai; B2, ) % em peso Carbono 82 74 Oxigénio 12 21, 4 Cálcio - 3,2 Fósforo - 1—1

Este revestimento de hidroxiapatite in-situ de polyhipe é preferido, uma vez que o ensopamento pós-polimerização do material em solução de hidroxiapatite e subsequente precipitação parecem formar cristais de hidroxiapatite grandes, mas localizados, dentro dos poros de polyhipe. 35

Exemplo A 4 - Efeito da composição de fase oleosa no tamanho de poro e de interligação

Preparou-se uma emulsão como descrita acima, incluindo 0,5% de iniciador de fase oleosa, 1,1'-azobis(ciclo- hexanocarbonitrilo). O volume total e a viscosidade não foram, substancialmente, alterados. A emulsão foi processada e polimerizada como descrito acima mas utilizando tempos e velocidades de mistura convencionais como conhecidos na técnica (Velocidade de dosagem RD =0,71 mL/s, velocidade de mistura, RM = 4,7 s_1, tempo de mistura tD = tH = 600 s) e avaliaram-se as propriedades de material. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5

Amostra Tamanho de Poro, D (pm) Tamanho de Furo, d (pm) d/D Polyhipe de controlo 15, 8 2,3 0,15 Polyhipe com iniciador 22, 7 4 0,18

Exemplo A5 - Efeito do iniciador solúvel de fase oleosa em polyhipe modificado com hidroxiapatite.

Preparou-se uma emulsão utilizando solução de hidroxiapatite 0,5% em peso (pH = 2,5 ajustado com ácido fosfórico) sem qualquer iniciador de fase aquosa. A fase oleosa continha 77,5% de estireno, 8% de DVB, 14% de Span 80 e 0,5% de azobis-isobutironitrilo (AIBN) como iniciador de fase oleosa. 36

Todas as outras condições experimentais foram as mesmas do Exemplo 3. Na Tabela 6, o polyhipe modificado com hidroxiapatite é comparado com o material correspondente no Exemplo 3 (i. e., PHP rigido/HA).

Tabela 6

Amostra Tamanho de poro D (pm) Tamanho de interligação d (pm) Razao d/D Rígido/HA 38 11 0,29 Rígido/HÁ iniciado com AIBN 30 12 0,40 A tabela acima indica que a presença de iniciador de fase oleosa não afecta, substancialmente, os tamanhos de poro e de interligação. Contudo, a análise elementar das superfícies de polyhipe utilizando EDAX (análise dispersiva de energia com raios X) mostra que a presença de HA é mais pronunciada se for utilizado iniciador fase oleosa. Estes resultados são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7

Componente Análise global no polyhipe com AIBN modificado com HA Análise global no polyhipe modificado com HA Carbono 63,09 74 Oxigénio 22, 49 21 Fósforo 2,98 2 Cálcio 9, 70 3 37 A concentração de iões cálcio é superior à do controlo que não contém AIBN.

Exemplo A6 - Efeito de partículas de sílica nas fases aquosa e oleosa

Incorporou-se silica hidrofílica (Aerosil 380, tamanho de partícula 7 nm) na fase aquosa enquanto se incorporou sílica hidrofóbica (Aerosil R812, tamanho de partícula 20 nm) na fase oleosa. Estas amostras de sílica foram obtidas de Degussa, Alemanha. Em cada caso, o rendimento de sílica foi 0,5, 1,0, 2,0 ou 5,0% em peso. 0 volume de fase da fase aquosa foi 90% e as condições de processamento foram: Velocidade de dosagem Rd = 0,375 mL/s; velocidade de mistura RM =4,7 s-1, tempo de mistura tD = 600 s, tH = 1200 s. Inicialmente, a fase oleosa continha 15% de estireno, 62% de 2-etil-hexilacrilato, 8% de DVB e 15% de Span 80. A sílica hidrofóbica foi adicionada nesta mistura a vários níveis. A fase aquosa continha 1% de perssulfato de potássio. Quando foi utilizada sílica hidrofílica na fase aquosa, não existia sílica na fase oleosa e foi utilizada a composição de fase oleosa original como acima. Os resultados são mostrados nas Tabelas 8 e 9. 38

Tabela 8. Efeito de sílica no tamanho de poro e de interligação de polímero polyhipe quando está presente sílica apenas na fase oleosa. Sílica em fase oleosa (% em peso) 0 0,5 1,0 2, 0 ΟΊ O Tamanho de poro, D (pm) 10, 7 14,3 21,9 37,2 60, 7 Tamanho de interligação, d (pm) 4,0 3,2 2,9 3,2 3,43 d/D 0,37 0,22 0,13 0, 09 0,06

Tabela 9. Efeito de sílica no tamanho de poro e de interligação de polímero polyhipe quando está presente sílica apenas na fase aquosa. Sílica em fase aquosa (% em 0 LO O 0 1 1 2,0 5, 0 peso) Tamanho de poro, D (pm) 10, 7 17, 6 28,9 36,2 Formação de Tamanho de interligação, 4,0 3,6 23,4 1,9 poro de d (pm) coalescência d/D 0,37 0,21 0,12 0, 05

Exemplo B7 - Crescimento celular múltiplo em polyhipe

Foram obtidos condrócitos (obtidos de articulação metacarfalangeal de bovino), células de osteoblastos humanos (HOB) e células de fibroblastos de ratazana 3T3. Duas amostras de polyhipe, sem e com HÁ, foram cortadas em discos, lavadas e completamente esterilizas. Utilizaram-se discos de Thermanox como controlo. Os discos foram ensopados no meio de cultura celular respectivo durante 24 horas e colocados em placas de 39 poços. As células 3T3, HOB e condrócitos foram, cada, alimentadas nos discos a densidades de 100000, 100000 e 500000 células por mL, respectivamente. As placas foram então incubadas a 37 °C em CO2 a 5% até três semanas. As amostras foram examinadas após 1,7,14 e 21 dias por SEM e para histologia.

Resultados

As 3T3 que cresceram no polyhipe rígido podem ser observadas por terem sido rapidamente multiplicadas, ao dia 1, estava presente uma camada confluente em ambos os tipos de polyhipe. Esta camada manteve-se por toda a duração da experiência. Da histologia, pode ser visto que não existiu penetração, em algumas mostras ao dia 7 e em todas as amostras ao dia 14 a camada celular começou a deixar a superfície do polyhipe.

As células HOB mostraram morfologia bem dispersa no dia 1 sob SEM, as células ligaram as interligações na superfície do polyhipe, oposto ao crescimento nas interligações. Ao dia 7 todas as amostras possuíam uma camada confluente na superfície. Da histologia, notou-se que existia ligeira penetração, apenas para a profundidade de um poro nas amostras contendo HA. A camada manteve-se, de um modo seguro, fixa à superfície por toda a duração da experiência.

Os condrócitos em determinados momentos de tempo de dias 1 e 7 aderiram aos discos de polyhipe e mostraram morfologia circular em ambos os tipos de polyhipe, comparados ao controlo ThermanoxR, em que as células foram pulverizadas e tornaram-se fibroblásticas em aparência. Ao dia 14 existiam sinais de 40 células mais planas e ao dia 21 existiam camadas confluentes em algumas amostras. As células no polyhipe HA podiam ser observadas aplanar em determinados momentos de tempo comparadas ao polyhipe não modificado. Da histologia, notou-se que a partir do dia 5 em diante, existiu penetração em polyhipes e células que estavam presentes dentro da estrutura 3D, contudo o polyhipe HA possuía penetração superior e parecia, visualmente, conter mais células. As células que penetraram o polyhipe não modificado foram poucas em número, contudo mantiveram a sua morfologia circular.

Dos resultados de coloração Safinin 0 pode ser mostrado que estiveram presentes condrócitos saudáveis no centro e na periferia da matriz de polímero. Existiam células viáveis que segregam GAG no polímero e na periferia. A velocidade de estudos de crescimento de condrócito (como obtido dos ensaios de ADN) indica que os polyhipes modificados com hidroxiapatite produziram crescimento significativamente mais rápido comparado com polyhipes não modificados como mostrado na Tabela 10.

Tabela 10

Tipo de Ensaio Lise Celular (mg ADN/mL) Tempo (dia) PHP Tempo (dia) 1 3,1 1 5 3,6 5 10 3,6 10 41

Exemplo B8 Celular

Efeito do Tamanho de Poro no Crescimento

Produziram-se seis tipos de Polimeros Polyhipe estireno/2-etil-hexilacrilato (contendo revestimento de hidroxiapatite) com tamanho de poro médio de 8, 17, 24, 31, 34 e 89 pm. 0 tamanho de interligação foi semelhante em todos os casos. Estas amostras foram então cultivadas com condrócitos e notou-se o efeito do tamanho de poro. Os resultados são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11. Efeito do tamanho de poro de PHP na penetração celular e produção de colagénio II após 21 dias de cultura celular.

Tamanho de poro, D (pm) 8 17 24 31 45 89 Tamanho de interligação, d (pm) 3 5 6 6 7 7 Profundidade de Penetração (pm) 17 508 570 367 67 45 Produção Relativa de Colagénio II 23 48 52 42 12 9 A produção de colagénio de Tipo II é uma indicação da função celular fisiológica correcta. Este exemplo indica que, para condrócitos que possuem tamanho celular de, aproximadamente, 10 pm, o tamanho de poro óptimo é, aproximadamente, 25 pm. Se o tamanho de poro for muito baixo, as células não podem, penetrar o polímero e se o tamanho de poro for muito grande, a morfologia celular altera-se de uma aparência circular para uma plana e fibroblástica. Estas células fibroblásticas proliferam rapidamente e formam uma camada na superfície em vez de penetrarem o polímero. 42

Outra medição da produção de matriz extra-celular é a produção de glicosaminoglicano (GAG) . A concentração de GAG foi determinada por um ensaio colorimétrico. 0 efeito de tamanho de poro na produção de GAG foi avaliado utilizando os estudos de cultura celular resumidos na Tabela 10. Os estudos de produção de GAG foram também comparados com Plásticos de Cultura de Tecido (TCP). Os resultados são mostrados na Tabela 12.

Tabela 12. Efeito do tamanho de poro na produção de GAG após 21 dias de cultura celular. Os resultados são também comparados com os estudos de cultura celular utilizando plásticos de cultura de tecido (TCP).

Tamanho de poro, D (ym) 8 17 24 31 45 89 TCP Tamanho de interligação, d (ym) 3 5 6 6 7 7 0 Produção Relativa de GAG 192 720 784 528 384 400 352

Exemplo B9 - Actividade de Macrófago no Polímero Polyhipe Sulfonatado A biocompatibilidade dos materiais pode ser ensaiada expondo-os a macrófagos. A resposta dos macrófagos a um material é avaliada por a) Alterações morfológicas aos macrófagos, b) Produção de peróxido de hidrogénio por macrófagos e c) Produção de beta glucuronidase por macrófagos. Os macrófagos são esféricos in vitro e qualquer desvio desta resposta é uma resposta negativa. A produção excessiva de peróxido de hidrogénio e beta glucuronidase são também respostas negativas. 43

Produz-se um Polímero Polyhipe estireno/2-etil-hexilacrilato. Algum deste material é sulfonatado (grau de sulfonação é 12%) e subsequentemente neutralizado utilizando hidróxido de sódio. Os macrófagos são cultivados nestes polímeros e são avaliadas a sua morfologia e capacidades de produção de peróxido de hidrogénio e de beta glucuronidase durante seis horas. Os resultados são mostrados na Tabela 13.

Tabela 13. Efeito de substrato na actividade macrófaga

Tipo de Substrato Morfologia Produção Relativa de Peróxido de Hidrogénio Produção Relativa de Beta Glucuronidase PHP Circular 370 47 PHP Plana 975 684 Sulfonatado TCP* Circular 295 93 * TCP = Plástico de Cultura de Tecido A Tabela 13 indica que PHP sulfonatado produz um nível muito elevado de acidez negativa e, por esse motivo, esses polímeros podem ser utilizados como padrão negativo em que a actividade é reduzida à medida que o nível de sulfonação diminui.

Exemplo C - Fabrico de um Sistema De Suporte De Órgão

As Figuras la-2b ilustram configurações de canal e de capilar de micro e macro escala em módulos de polyhipe obtidos pelo método do Exemplo C. 44

Num sistema de suporte celular, assume-se que estão apenas presentes poros de Tipo-1 (poros básicos) com, provavelmente, um conjunto de microcapilares que proporcionam uma cultura celular eficaz e, subsequentemente, actuam como canais de nutrientes. Neste caso, estes canais microcapilares não necessitam de ser proximamente compactados e podem possuir grandes diâmetros atingindo 500 micrones. Tais sistemas de suporte celular podem possuir o tipo de invólucro e tubo de disposição e podem ser construídos para possuir uma secção transversal cilíndrica ou quadrada ou rectangular. Esta disposição é semelhante aos peixes de fibra excepto que o lado de invólucro constitui o PHP de carga e a interface microcapilar/PHP de carga é muito fina (0,5-5 micrones).

Num sistema de suporte de órgão existe mais do que um tipo de microcapilar que está presente. Num suporte de órgão cúbico ou poliédrico, cartucho, as faces opostas podem estar ligadas umas às outras com microcapilares. Para o caso mais simples, ilustra-se um cartucho de suporte de órgão cúbico ou cubóide com três tipos de microcanais nas Figuras la, b. Na Figura la, são mostradas representações 3D dos microcapilares (são apenas ilustrados 3 tipos de capilares) enquanto na Figura lb, ilustra-se a secção transversal mostrando todos os capilares e PHP em grandes quantidades. Aqui, os canais são denotados como canais A, canais B e canais C. O seguinte processo é utilizado para obter uma rede 3D de fibras num molde que é, subsequentemente, cheio com a emulsão do PHP e, mais tarde, polimerizado. Contudo, este processo não é único mas pretende ilustrar a técnica de fabrico dos sistemas de suporte de órgãos in vitro. 45 1. Cadeias de hastes ou fibras metálicas de diâmetro desejado são ensanduichadas entre duas folhas de polímero utilizando uma prensa a quente ou um moinho de dois rolos (calandras) . As hastes ou fibras metálicas estão paralelas umas às outras e, eventualmente, criarão os canais A. Estes painéis ensanduichados são cortados para um tamanho desejado e, de um modo opcional, timbrados com um molde para formar furos que, eventualmente, alojarão as hastes metálicas conduzindo à formação dos canais B. Vários destes painéis ensanduichados são produzidos deste modo. 2. 0 processo acima é repetido utilizando hastes ou fibras metálicas de diâmetro desejado de modo a obter os canais C. Se os diâmetros dos canais A e C eram para ser iguais, não existe necessidade de ter de separar painéis ensanduichados de fibras/haste. 3. Estes painéis são colocados num molde em cima uns dos outros com dois tipos de espaçadores metálicos finos entre eles. 0 primeiro tipo de espaçador prende as fibras no lugar enquanto o segundo tipo pode ser removido quando o conjunto de fibras é comprimido na direcção dos canais B. A orientação das fibras que formarão os canais A e C é perpendicular umas às outras. 0 molde já contém hastes metálicas que formarão os canais B. A espessura dos espaçadores metálicos finos determina a separação dos canais A e C. 46 4. Estes painéis são apertados de um modo seguro, e colocados numa estufa o que permite o aperto das camadas de fibra/haste uma vez que a temperatura da estufa aumenta gradualmente acima do ponto de fusão do polímero utilizado nos painéis ensanduichados. A temperatura é ainda aumentada de modo á queimar o polímero, deixando completamente uma rede 3D de fibras/hastes. Estas fibras/hastes podem necessitar de revestimento de superfície com polímero de modo a criar uma interface capilar/carga desejada. Por exemplo, estas fibras/hastes padrão podem ser revestidas com polímeros hidrofóbicos para obter estrutura de poro fechada na interface quando são produzidos polímeros PHP à base de estireno. Se as f ibras/hastes padrão forem revestidas com polímeros hidrossolúveis, tais como óxido de polietileno, podem ser obtidos poros Tipo-2 na interface. Quando os metais não são revestidos, obtém-se estrutura de poro aberta na interface. 6. 0 molde é cheio com a emulsão, lentamente, sob vibração, de modo a obter enchimento completo. 0 molde é ainda comprimido na direcção dos canais B removendo os espaçadores metálicos de tipo 2, permitindo, deste modo, a saída da emulsão em excesso. A viscosidade da emulsão deve ser tão baixa quanto possível e a emulsão deve ser recirculada durante o enchimento. 47 7. Após enchimento e polimerização do molde, as hastes padrão são removidas e as fibras são dissolvidas em ácido revelando, deste modo, os canais microcapilares.

Após o fabrico do cartucho de suporte de órgão, lavou-se em água e neutralizou-se e, subsequentemente, lavou-se com etanol para remover qualquer monómero residual e lavou-se, novamente, com água e secou-se antes de ser esterilizado, pronto a utilizar como um suporte de órgão in vitro.

Nos módulos cuboides das Figuras la-2b, existem três tipos de canais A, B, C. Estes são mostrados nas Figuras 2a e 2b, ligando as faces de um cubo, indicado na Figura 2a como A-A', B-B' e C-C', respectivamente. Os canais A podem transportar sangue (ou plasma, ou nutrientes), os canais B podem ser utilizados para transportar os produtos celulares (produtos de expressão celular, metabólicos) enquanto os canais C podem ser utilizados para cultivar células anisotrópicas, tais como células nervosas ou musculares. Utilizando um módulo cubóide com oito faces e, assim, quatro tipos de microcanais, pode-se também cultivar células musculares em conjunto com células nervosas, proporcionando ainda recolha de produtos sanguíneos e celulares. 0 espaço entre os microcanais será ocupado com uma célula de órgão ou tecido conjuntivo ou tecido ou estimulante específico.

Cada canal pode ser de diferente diâmetro e diferente densidade de compactagem e pode ser independentemente modificado na superfície (por exemplo, torná-lo electricamente condutor ou possuir diferente porosidade de interface ou tamanho de poro ou diferente estrutura química). Em vez de cultivar células nervosas, pode ser suficiente possuir, por exemplo, fibras de 48 carbono presentes nestes canais para proporcionar condutividade eléctrica.

Lisboa, 5 de Novembro de 2012 49

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de fabrico de um suporte de polímero polyhipe microcelular, compreendendo o método os passos de preparar uma emulsão de fase interna elevada, compreendendo a emulsão uma fase dispersa compreendendo estireno, divinilbenzeno e um tensioactivo, e caracterizado por a fase contínua compreender um iniciador e um polímero hidrossolúvel.
2. 2 . Método de fabrico de um suporte de acordo com a Reivindicação 1, em que o polímero solúvel é seleccionado de carboximetilcelulose ou óxido de polietileno.
3. 3 . Método de fabrico de um suporte de acordo com a Reivindicação 2, em que a carboximetilcelulose possui uma massa molecular de 90000.
4. 4 . Método de fabrico de um suporte de acordo com a Reivindicação 2, em que a carboximetilcelulose possui uma massa molecular de 250000
5. • 5. Método de fabrico de um suporte de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que o óxido de polietileno possui uma massa molecular de 200000.
6. 6. Método de fabrico de um suporte de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que o óxido de polietileno possui uma massa molecular de 400000. 1
7. 7. Método de fabrico de um suporte de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a fase dispersa inclui dietil-hexilacrilato.
8. 8. Método de fabrico de acordo com qualquer das reivindicações 2-4, em que o polímero solúvel está presente a 1% p/p.
9. 9. Método de fabrico de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o tensioactivo é Span 80™.
10. 10. Suporte de polímero polyhipe microcelular obtido pelo processo das Reivindicações 1-9. Lisboa, 5 de Novembro de 2012 2