CN110923130B - 微生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供高通透电化学微生物传感器及其制备方法和应用,其中制备步骤包括:S1制备菌液;S2油包水型高内相乳液的制备;S3微生物传感器制备。该生物传感器采用三电极线性循环伏安法检测不同浓度的甲基磺草酮溶液的电化学行为来分析甲基磺草酮对两种不同细菌的急性生物毒性结果进而使实现其应用。通过该方法得到的微生物传感器,检测快速灵敏,可反映不同毒性物质浓度下微生物的应激电流响应。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器电化学领域,具体涉及微生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
农业科技的进步离不开农药的大规模使用。近年来,农药对环境污染的影响,特别是通过土壤经雨淋而后到河流、湖泊等天然水体,从而影响大范围人群的健康问题而日益引起人们的重视。目前在各大水体和沉积物中已监测到了有机氯、有机磷、三唑类和拟除虫菊酯类等多种农药。这些农药通过水生生物体富集、再通过食物链传递进而危害人类的健康。然而,许多农药及其代谢产物的毒性和对环境的影响在使用多年后才被认识到或尚未被完全评估出来。
例如1957年发明的莠去津(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪,阿特拉津,atrazine),是世界上最大的除草剂农药品种。经多年研究发现,莠去津的脱氯与烷基代谢产物会造成严重的地下水体污染,其在环境中的积累30年后仍然可被测出。而在2017年10月莠去津才被世卫组织列为3类致癌物,在欧洲已被禁用。于2000年注册的甲基磺草酮(2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰基)环己烷-1,3-二酮)是莠去津的替代农药,被认为是一种安全的除草剂,用量在近年来快速增加。甲基磺草酮可通过光、植物代谢、土壤微生物代谢、芬顿反应等方式降解。然而,近来的研究表明,甲基磺草酮会造成鱼体DNA损伤,对微生物酯酶有毒性作用,其代谢产物(主要是4-甲砜基-2-硝基苯甲酸,MNBA和2-氨基-4-甲砜基苯甲酸,AMBA)的毒性更强。长期食用含有甲基磺草酮残留的食物会对人畜产生致癌作用,或引起胎儿畸形。这些研究的出现对深入了解甲基磺草酮对环境和生物体的影响至关重要,但所用方法复杂,涉及仪器(高效液相色谱-质谱等)昂贵,处理样品耗时长、分析条件苛刻。因此建立快速测定甲基磺草酮的生物毒性的方法有其迫切性和必要性。
农药的生物毒性可以从对微生物的毒性,最初通过在不同浓度的所测农药的培养基中通过培养微生物数量来反映。但这种做法耗时很长,因细菌多样性、突变性、驯化或菌株感染等因素导致其结果重现性不佳。同时,反映不出引起不同微生物生长结果的影响机理。生物传感器是20世纪60年代发展起来的,由生物或生物有关的敏感元件和物理化学传感器(换能器)相结合,提供定量或半定量分析信息的小型分析仪器。其中利用全细胞微生物作为生物传感器的敏感元件具有制备容易、成本低、检测重现性好、使用寿命长、不易失活等优点。但当前微生物传感器面临的主要问题有用于固定微生物的载体膜制备工艺复杂,测试时膜阻力大,影响被测物质和营养物质在膜中的扩散,测量时间长,影响测量效率和结果准确性等。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于以上所述,本发明的目的之一在于提供微生物传感器的制备方法,以微生物为载体匹配特制电极来构建微生物传感器。
本发明的另一个目的在于提供该微生物传感器在生物毒性测量方面的应用。
本发明的第三个目的在于提供该微生物传感器对水体中甲基磺草酮的生物毒性快速测定方法。
(二)技术方案
为解决所述技术问题,本发明提供微生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备菌液,以土壤细菌胶质芽孢杆菌和大肠杆菌为载体通过培养及后处理工序制备菌液;
S2、制备油包水型高内相乳液,以苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相,以Span80-Tween80为乳化剂体系,以过硫酸铵-亚硫酸氢钠为引发剂体系,以后处理的菌液为水相制备油包水型高内相乳液;
S3、制备微生物传感器,将含细菌的稳定的高内相乳液滴加在处理过的电极表面,于37℃烘干,制备微生物传感器。
上述S1步骤中制备菌液的具体方法包括以下步骤:
A1、在琼脂培养基上分别纯化胶质芽孢杆菌和大肠杆菌,取样接种于各自液体培养基;
A2、在对数生长期时取出,离心分离菌体,用0.85% NaCl溶液洗涤并重新离心分离;
A3、用分散液调整光密度值,便制备而得用于高内相乳液水相的菌液。
其中,在上述方法中大肠杆菌的培养基为本领域所公知的培养基,为LB培养基、SOB培养基以及SOC培养基,优选LB培养基;胶质芽孢杆菌培养基为适合菌体繁殖生长的含氮培养基,其1L培养基的配方为:蔗糖5-10g,K2HPO4 2-5g,MgSO4·7H2O 1.4-5g,CaCO3 2-10g,酵母2g,(NH4)2SO4 0.5-2.5g,FeCl3·6H2O 0.01-0.05g,NaCl 0.2g。优选培养基配方为:蔗糖7g,K2HPO4 3g,MgSO4·7H2O 2.5g,CaCO3 6g,酵母2g,(NH4)2SO4 1.0g,FeCl3·6H2O0.03g,NaCl 0.2g。
进一步地,胶质芽孢杆菌和大肠杆菌的培养条件都为37℃16-32h,优选24h菌液。
进一步地,调整菌液光密度的分散液为其液体培养基或0.85% NaCl溶液,优选0.85% NaCl溶液。
上述S2步骤中的油包水型高内相乳液选取苯乙烯和二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相,其比例为1-7.5:1(W/W),优选为4:1;而乳化剂的总重量占油相比重在8-20%,优选11%;Span80和Tween80的重量比例为7-15:1,优选12.75:1;过硫酸铵和亚硫酸氢钠的量为1:1(W/W),总重为水相重量的1.5-3%,优选2%;油相和水相的比例为1:3-9,优选1:4-7。
上述S3步骤中的电极为玻碳电极或铂片电极,优选玻碳电极。
上述电极处理方法,包括以下步骤:
B1、将玻碳电极用0.05μm的Al2O3粉末进行抛光;
B2、用二次水超声清洗5分钟,再用乙醇超声清洗5分钟,最后用二次水超声清洗5分钟;
B3、清洗好的电极吹干即可。
上述S3步骤中高内相乳液滴至电极表面时滴加的量为20-50μL,优选30μL;且在37℃真空烘半小时至四小时,优选1小时。
本发明的第三目的在于提供水体中甲基磺草酮的生物毒性快速测定方法,包括以下步骤:
C1、制备适合微生物的呼吸基质、电子媒介体和甲基磺草酮标准溶液;
C2、细菌活化:将所得微生物传感器浸泡入呼吸基质30min,而后用去离子水冲洗,晾干;
C3、加入呼吸基质,搭建三电极体系,稳定一段时间,设定电化学测试条件,进行检测;
C4、加入一定量的电子媒介体,搅拌一段时间,进行检测;
C5、加入不同量的甲基磺草酮标准溶液,搅拌一段时间,进行检测。
所述微生物呼吸基质可指葡萄糖呼吸基质(0.85% NaCl, 10mM葡萄糖,10mM丁二酸钠,10mM乳酸钠,pH=7.0)或直接是0.85% NaCl溶液,优选0.85% NaCl;所取量为5-20mL,优选15mL;稳定时间可选取5-30min,优选15min。
所述电子媒介体为对苯醌或铁氰化钾,优选对苯醌;配制对苯醌浓度为6.48g/L,加入到呼吸基质中,使最终浓度在0.2-1.2mM之间,优选0.4mM;搅拌时间可选取5-30min,优选10min。
所述甲基磺草酮标准溶液的配制是指配制1g/L或10g/L甲基磺草酮的乙腈溶液100mL,加入到呼吸基质中,每次不多于500μL,使最终浓度在0.5-300 mg/L之间;搅拌时间可选取5-30min,优选15min。
所述电化学测试条件是指设定线性循环伏安法,设置电位在-1.2~0.6V之间,扫描速率为0.005-100mV/s,优选0.05V/s。电化学测试以微生物电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl和饱和KCl二者之一为参比电极组建三电极体系的电化学测量装置。
用抑制率来表示水体中不同浓度甲基磺草酮的生物毒性,抑制率(%)的计算公式如下:
抑制率
其中I0为含微生物传感器的电化学测试系统中在呼吸基质中对苯醌浓度为0.4mM时在-0.25V左右的还原峰电流值,I1为相应的不同浓度甲基磺草酮含量时的还原峰电流值。
所述生物毒性的分析是指当抑制率为正时,所测甲基磺草酮浓度对微生物的呼吸作用有抑制作用,显示生物毒性,当抑制率为50%时的甲基磺草酮浓度为该化合物的IC50,且IC50值越高,毒性越小;当抑制率为负时,所测甲基磺草酮对微生物的呼吸作用没有抑制作用,表现为微生物对甲基磺草酮一定的耐受性和生物降解作用,没有显示生物毒性,显示出对呼吸作用的促进作用。
本发明提供的微生物传感器其特征为一种高通透的、具有内通孔结构的聚合物载体,内界面为亲水结构,且孔体积可达74%以上,极适细菌生存生长。同时,细菌在一开始就被引入内腔结构,适合细菌生长的条件下聚合,尽可能减少膜制备过程中对细菌的不良影响。且制作工艺简单、测量快速、结果重现性好。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
图1揭示出玻碳电极经含胶质芽孢杆菌的高内相乳液聚合后的电极表面的电镜照片,其中(a)-(d)为不同放大倍数情况下高内相乳液聚合所得电极表面高通透聚合物膜的表面形态,(d)中显示胶质芽孢杆菌及其表面的多糖覆盖情况;
图2揭示出胶质芽孢杆菌微生物传感器在不同甲基磺草酮(Mes)浓度下的线性循环伏安法电流I-电位E曲线(呼吸基质为0.85% NaCl),且电子媒介体对苯醌(BQ)加入量为0.4mM;
图3揭示出不同浓度甲基磺草酮对胶质芽孢杆菌微生物传感器的还原峰电流的抑制作用(呼吸基质为0.85% NaCl,对苯醌浓度为0.4mM),其中IC50 = 128 mg/L;
图4揭示出不同浓度甲基磺草酮代谢产物MNBA对胶质芽孢杆菌微生物传感器的还原峰电流的抑制作用(呼吸基质为0.85% NaCl,对苯醌浓度为0.4mM),其中IC50 = 71 mg/L;
图5揭示出不同浓度甲基磺草酮对大肠杆菌微生物传感器的还原峰电流的抑制作用(呼吸基质为0.85% NaCl,对苯醌浓度为0.4mM),其中IC50 = 114 mg/L。
具体实施方式
下面结合实施例和附图1-5,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
胶质芽孢杆菌培养基的配制方法:将0.7 g蔗糖,0.3 g K2HPO4,0.25 g MgSO4·7H2O,0.6 g CaCO3,0.2g酵母,0.1g (NH4)2SO4, 0.003g FeCl3·6H2O和0.02g NaCl溶于100mL去离子水中,调节pH至7.0,于高压蒸汽锅中120℃灭菌20min,自然冷却后使用。
大肠杆菌培养基(LB)的配制方法:将1g胰蛋白胨,0.5g酵母提取物,1g NaCl溶于100mL去离子水中,调节pH值至7.0,于高压蒸汽锅中120℃灭菌20min,自然冷却后使用。
微生物的培养方法为:向胶质芽孢杆菌培养基中接种纯化的土壤细菌-胶质芽孢杆菌,于32℃下温水浴培养24h,摇床速度为180rpm; 在LB液体培养基中接种大肠杆菌(ATCC 25922),于37℃恒温水浴培养16h,摇床速度为150rpm。
菌体的收集方法为:将含菌液的液体培养基于5000rpm下离心5min,并用0.85%NaCl 将菌体沉淀洗涤两次,4℃保存于冰箱内待用。当用于制备微生物传感器时,用0.85%NaCl分散,调成光密度OD600为1.0左右的菌体分散液。
实施例1含胶质芽孢杆菌的微生物传感器的制备
高内相乳液的制备:将0.102g表面活性剂Span80 溶于苯乙烯(0.8g)和 EGDMA(0.2g)组成的油相当中。取质量0.016g吐温80溶解在9mL OD600为1.0左右的胶质芽孢杆菌的菌体分散液。加入引发剂过硫酸铵0.08g和共引发剂亚硫酸氢钠0.08g。将此菌悬浮液用于高内相乳液的水相。手摇振荡乳液体系缓慢地将4mL水相滴入1mL油相中,并测定体系电导率,确保乳液体系稳定且其结构为高内相乳液。
电极处理:将玻碳电极用0.05μm的Al2O3粉末进行抛光,将玻碳电极、铂丝电极与Ag/AgCl电极二次水超声清洗5分钟,再乙醇超声清洗5分钟,再二次水超声清洗5分钟。
微生物传感器制备:取上述制备的高内相乳液,滴加30μL于直径为3mm的玻碳电极表面,在37℃下聚合1小时成膜。取其中之一于电镜观察电极表面,检测结果如图1所示。其他电极于4℃保存于冰箱内待用。
采用实施例1制备的含胶质芽孢杆菌的微生物传感器对水体中甲基磺草酮含量的电化学检测。
本实施例1中呼吸基质包括葡萄糖呼吸基质和0.85% NaCl呼吸基质。葡萄糖呼吸基质采用葡萄糖1.8g,丁二酸钠1.62g, 乳酸0.9g,配制1L葡萄糖呼吸基质。用氢氧化钠调到pH为7.0。0.85% NaCl呼吸基质采用氯化钠8.5克,配制1L 0.85% NaCl溶液。
甲基磺草酮标准溶液包括两种,一种为将0.1g甲基磺草酮溶于100mL乙腈溶液而配制1g/L甲基磺草酮标准溶液。另一种为将1.0g甲基磺草酮溶于100mL乙腈溶液而配制10g/L甲基磺草酮标准溶液。
对苯醌溶液则是将对苯醌0.648g溶于水中并定容至100mL,配制而成的6.48g/L对苯醌溶液。
实验方法如下:
将微生物传感器浸入葡萄糖呼吸基质30min,而后用去离子水清洗干净,晾干。将活化好的微生物传感器作为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极,然后将电极连接到电化学工作站上,组建电化学测量装置。常温下用线性扫描伏安法测试电极的氧化与还原电流情况。设置电位扫描范围为-0.6~1.2V,扫描速度为0.1V/s,循环圈数为2圈。
取15mL呼吸基质,向其中加入对苯醌溶液100μL,搅拌15min待体系稳定,用线性循环伏安法测试电流情况,将峰电位为-0.21V的还原峰峰电流计为I0。取15mL上述呼吸基质,向其中分别加入上述对苯醌溶液100μL,取上述甲基磺草酮标准溶液1g/L和10g/L,加入量小于500μL,搅拌15min待体系稳定,分别使最终溶液中甲基磺草酮的浓度为5、10、30、60、90、100、140、200、300mg/L,其线性循环伏安曲线如图2所示。每个样品测试时间为2分24秒。将相应的还原峰峰电流计为I1,计算抑制率并得到抑制率-浓度曲线,如图3所示。胶质芽孢杆菌生物传感器对不同浓度甲基磺草酮的测量结果显示,当甲基磺草酮的浓度小于38mg/L时,抑制率为负,说明在此范围的甲基磺草酮对微生物呼吸作用有促进作用。当甲基磺草酮浓度大于38mg/L时,抑制率为正,说明在此范围内甲基磺草酮对胶质芽孢杆菌的呼吸作用有抑制作用。IC50为128mg/L。同时,其在5~90mg/L(15~265mmol/L)范围内呈现线性响应,相关系数R2=0.9945。
对比例1检测甲基磺草酮的一种主要代谢产物(4-甲砜基-2-硝基苯甲酸,MNBA)的毒性
分别取0.1g和1g MNBA配制1g/L和10g/L的 MNBA的乙腈标准溶液100mL。将上述实施例2中制得的胶质芽孢杆菌微生物传感器组建三电极测试体系,取15mL上述呼吸基质,向其中加入上述对苯醌溶液100μL,搅拌15min待体系稳定,用线性循环伏安法测试电流情况,将还原电位为-0.26V处的还原峰峰电流计为I0。取15mL上述呼吸基质,向其中分别加入上述对苯醌溶液100μL,取上述MNBA标准溶液1g/L和10g/L,加入量小于300μL,搅拌15min待体系稳定,分别使最终溶液浓度为2、5、10、20、30、60、100、190mg/L。将相应的还原峰峰电流计为I1。计算抑制率并得到抑制率-浓度曲线,如图4所示。胶质芽孢杆菌微生物传感器对不同浓度MNBA的测量结果显示当MNBA浓度大于16mg/L时,抑制率为正,IC50为71mg/L。说明其毒性比甲基磺草酮更强。此结果与文献报道的一致。同时,其在5~60mg/L(22~260mmol/L)范围内呈现线性响应,相关系数R2=0.9995。
实施例2含大肠杆菌的微生物传感器的制备
按实施例1中所述配制方法和步骤用大肠杆菌分散液代替胶质芽孢杆菌分散液,制备微生物传感器。
采用实施例1制备的含大肠杆菌的微生物传感器对水体中甲基磺草酮含量的电化学检测。
按实施例1中所述实验方法和步骤用于实施例2中的大肠杆菌微生物传感器测定呼吸基质中不同浓度的甲基磺草酮的生物毒性,以及-0.18 V左右的还原峰电流变化情况计算抑制率和浓度的关系,结果如图5所示。大肠杆菌微生物传感器在呼吸基质为0.85%NaCl时,对不同浓度甲基磺草酮的测量结果显示在甲基磺草酮浓度小于10mg/L范围内抑制率为负,表现为对细菌呼吸的促进作用。而超过10 mg/L时,抑制率为负值,IC50为114mg/L,比胶质芽孢杆菌微生物传感器所得数据低,说明甲基磺草酮对大肠杆菌的毒性比对胶质芽孢杆菌要强一些。同时,其在8~60mg/L(24~177mmol/L)范围内呈现线性响应,相关系数R2=0.9927。
实施例3改变聚合物膜孔结构的微生物传感器的制备
改变高内相乳液制备中水相与油相比例,并按实施例1、2所述实验方法制备及测试甲基磺草酮的急性生物毒性,结果如下表1所示。
表1 不同聚合物膜孔结构的微生物传感器对甲基磺草酮的急性生物毒性检测
结合图1和表1中的数据,可得出制备高内相乳液时水相比例小,影响膜的通透结构形成,会降低微生物传感器的灵敏性。同时,在保证一定膜通孔结构的基础上,菌液含量的提高,膜传质阻力同样会增加,降低电流响应信号,但不影响急性生物毒性检测数据。
结合实施例1、2、3的测试数据表明,本发明制备的高通透微生物传感器可快速灵敏地测出除草剂甲基磺草酮对不同微生物的生物毒性。在低浓度情况下,甲基磺草酮对微生物呼吸作用有促进作用,而在较高浓度下则表现为抑制。本发明所述方法制备的微生物传感器,并不局限于大肠杆菌和胶质芽孢杆菌。所测化合物的生物毒性,也不局限于甲基磺草酮及其代谢产物。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.微生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、制备菌液,以土壤细菌胶质芽孢杆菌和大肠杆菌为载体通过培养及后处理工序制备菌液;
S2、制备油包水型高内相乳液,以苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相,以Span80-Tween80为乳化剂体系,以过硫酸铵-亚硫酸氢钠为引发剂体系,以后处理的菌液为水相制备油包水型高内相乳液;
油包水型高内相乳液选取苯乙烯和二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相,其比例为1-7.5:1(W/W);而乳化剂的总重量占油相比重在8-20%;Span80和Tween80的重量比例为6-15:1;过硫酸铵和亚硫酸氢钠的重量比例为1:1(W/W),总重为水相重量的1.5-4%;油相和水相的比例为1:3-9;
S3、制备微生物传感器,将含细菌的稳定的高内相乳液滴加在处理过的电极表面,于37℃烘干,制备微生物传感器;
S3步骤中的电极为玻碳电极或铂片电极,且上述电极处理方法,包括以下步骤:
B1、将玻碳电极用0.05μm的Al2O3粉末进行抛光;
B2、用二次水超声清洗5分钟,再用乙醇超声清洗5分钟,最后用二次水超声清洗5分钟;
B3、清洗好的电极吹干即可;
上述S3步骤中高内相乳液滴至电极表面时滴加的量为20-50μL;且在37℃真空烘半小时至四小时。
2.根据权利要求1所述的微生物传感器的制备方法,其特征在于,S1步骤中制备菌液的具体方法包括以下步骤:
A1、在琼脂培养基上分别纯化胶质芽孢杆菌和大肠杆菌,取样接种于各自液体培养基;
A2、在对数生长期时取出,离心分离菌体,用0.85% NaCl溶液洗涤并重新离心分离;
A3、用分散液调整光密度值,便制备而得用于高内相乳液水相的菌液。
3.根据权利要求2所述的微生物传感器的制备方法,其特征在于,所述大肠杆菌的培养基为本领域所公知的培养基,为LB培养基、SOB培养基以及SOC培养基其中一种;胶质芽孢杆菌培养基为适合菌体繁殖生长的含氮培养基,其1L培养基的配方为:蔗糖5-10g,K2HPO4
2-5g,MgSO4·7H2O 1.4-5g,CaCO3 2-10g,酵母2g,(NH4)2SO4 0.5-2.5g,FeCl3·6H2O0.01- 0.05g,NaCl 0.2g。
4.根据权利要求3所述的微生物传感器的制备方法,其特征在于,胶质芽孢杆菌和大肠杆菌的培养条件都为37℃16-32h,其中调整菌液光密度的分散液为其液体培养基或0.85%NaCl溶液。
5.一种微生物传感器,其特征在于,根据权利要求1-4任意一项所述的方法制备而成。
6.一种根据权利要求5所述的微生物传感器的应用,其特征在于,该微生物传感器用于对于水体中甲基磺草酮的生物毒性快速测定。
7.一种基于权利要求6所述的微生物传感器在水体中甲基磺草酮的生物毒性快速测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
C1、制备适合微生物的呼吸基质、电子媒介体和甲基磺草酮标准溶液;
C2、细菌活化:将所得微生物传感器浸泡入呼吸基质30min,而后用去离子水冲洗,晾干;
C3、加入呼吸基质,搭建三电极体系,稳定一段时间,设定电化学测试条件,进行检测;
C4、加入一定量的电子媒介体,搅拌一段时间,进行检测;
C5、加入不同量的甲基磺草酮标准溶液,搅拌一段时间,采用三电极线性循环伏安法检测不同浓度的甲基磺草酮溶液的电化学行为进行生物毒性结果判断。
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