PT105635A - Dispositivo para a administração eficiente de compostos na pele ou barreiras biológicas, ou através dessas, usando filmes finos absorventes de luz - Google Patents

Abstract

ESTA INVENÇÃO DIZ RESPEITO A UM DISPOSITIVO CAPAZ DE CONVERTER RÁPIDA E EFICIENTEMENTE A ENERGIA CONTIDA NUM PULSO DE LASER (1) NUMA ONDA DE PRESSÃO DE IMPULSO ELEVADO E BANDA LARGA, E ÀS SUAS APLICAÇÕES NA PERMEABILIDADE TRANSITÓRIA DE UMA MEMBRANA BIOLÓGICA (B), INCLUINDO AS CAMADAS EXTERIORES DA PELE, SEM PROVOCAR DANOS NEM DESCONFORTO. É TAMBÉM APRESENTADO UM MÉTODO DE ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS E DE COMPOSTOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS NA PELE OU BARREIRAS BIOLÓGICAS (B), OU ATRAVÉS DESSAS, COM ESSE DISPOSITIVO.

Description

DESCRIÇÃO

DISPOSITIVO PARA A ADMINISTRAÇÃO EFICIENTE DE COMPOSTOS NA PELE OU BARREIRAS BIOLÓGICAS, OU ATRAVÉS DESSAS, USANDO FILMES FINOS

ABSORVENTES DE LUZ

Fundo da invenção

Esta invenção diz respeito a ura dispositivo capaz de converter rápida e eficientemente a energia contida num pulso de laser numa onda de pressão de impulso elevado, e às suas aplicações na permeabilidade transitória de uma membrana biológica, incluindo as camadas exteriores da pele, sem provocar danos nem desconforto. A invenção é descrita em termos de princípios físicos de geração eficiente de laser de ondas de pressão, das propriedades dos materiais absorventes que maximizam a amplitude da onda de pressão e minimizam o seu tempo de subida, e da administração prática de fármacos ou compostos biologicamente ativos na pele ou outras barreiras biológicas, ou através dessas. São dados exemplos para ilustrar a utilização do dispositivo e as suas aplicações. 0 dispositivo distingue-se pelas seguintes características: a utilização de filmes finos (espessura < 200 pm)que absorvem intensamente a luz de lasers pulsados e a utilização de lasers pulsados acessíveis, tais como os lasers de baixa energia (energia do laser < 500 mJ) , em que esse dispositivo é capaz de gerar ondas acústicas transitórias de impulso elevado com tempos de subida curtos (tempo de subida < 50 ns) com baixas densidades de potência ótica {<40 MW/cm2 por pulso). A pele é uma proteção muito eficaz contra a entrada de materiais estranhos, tais como os químicos e os micróbios. A camada mais externa da pele, chamada stratum corneum (SC), tem 1 uma espessura de apenas 10 a 20 μιη, mas é a principal responsável pela impermeabilidade da pele. É constituída por uma dúzia de camadas de corneócitos densamente empacotados e mortos, integrados numa mistura de lipidos com alta organização espacial. A maioria das moléculas penetra na pele por difusão através dos lipidos intercelulares, um caminho tortuoso à volta dos corneócitos que é fortemente obrigado por exigências estruturais e de solubilidade. Por baixo do SC, existe a epiderme viável, que tem uma espessura de 50 a 100 pm e que é vascular. Mais abaixo encontra-se a derme, com uma espessura de 1 a 2 mm e rica em capilares, capaz de limpar a maioria dos penetrantes em poucos minutos [1]. A ideia de administrar fármacos através da pele é ancestral. As tentativas para atingir esse objetivo podem ser divididas em dois grupos: a administração passiva e a administração ativa de fármacos [2]. O primeiro grupo refere-se a formulações de veículos otimizados para aumentar a difusão de um fármaco particular através da pele, incluindo pomadas, cremes ou géis, que podem conter promotores de permeação químicos. De facto, muitos são os químicos que têm a capacidade de aumentar a permeabilidade da pele, tais como o dimetilsulfóxido, o laurocapram (Azone), o 2-n-nonyl-l,3-dioxolane (SEPA), os ácidos gordos e esteres de ácidos gordos, os tensioativos e outros bem conhecidos do sector [3] . No entanto, o aumento da permeação, mesmo de pequenas moléculas, está geralmente associado ao aumento da irritação da pele [4]. Os métodos passivos são eficientes apenas para a administração transdérmica de pequenas moléculas (peso molecular < 500 Da) com lipofilia adequada (coeficientes Kciw de partição n-octanol-água, no intervalo 1 < (log jKqW) < 3) e com menos de 3 grupos de ligação de hidrogénio. Além disso, a formulação do veículo é específica para um dado fármaco. Os métodos de administração ativa de fármacos recorrem a métodos físicos, tais como a assistência elétrica (iontoforese, electroporação), processos mecânicos (micro- 2 agulhas, abrasão, ablação, perfuração, microprojecções), ou ultrassons (sonoforese). Outro método ativo de administração de fármaco consiste na produção de ondas foto-mecânicas por irradiação intensa de laser pulsado de um alvo [5] . As ondas de esforço formadas pela rotura óptica, ablação ou expansão termo-elástica mostraram permeabilizar transitoriamente a SC e facilitar o transporte de macro-moléculas da epiderme viável [6] .

Foram descritas as aplicações técnicas de ondas de esforço na administração de compostos através da camada de células epiteliais. Por exemplo, na publicação US 6,251,099 Bl, Kollias et al [7] descreveram a administração de composto por transitórios de impulso gerados pelos lasers com fluências entre 1 e 7 J/cm2 e larguras de impulso de 20-30 ns, o que corresponde a densidades de energia ótica entre 40 e 300 MW/cm2. Estes pulsos intensos e curtos de laser foram dirigidos para alvos com espessuras entre 0,8 mm (para metais) e 3 mm (para plásticos). Nessas densidades de energia ótica, o mecanismo dominante da interação entre o pulso de laser e o alvo é a ablação do material do alvo e é geralmente acompanhado pela formação de plasma. É assim produzido a ejeção do material da superfície do alvo atingido pelo pulso de laser e o momento de retrocesso associado propaga-se na massa do alvo para atingir a sua superfície oposta como uma onda acústica. A capacidade dessa onda acústica de aumentar temporariamente a permeabilidade da pele foi relacionada com o seu impulso. A administração intradérmica de vastos compostos sem danificar a pele exige impulsos entre 2 e 50 bar/ns [5]. A produção de ondas de pressão com impulsos tão elevados numa área prática de um alvo corrente exige lasers com densidades de energia elevadas que são reconhecidas como complexas e caras, e alternativas têm sido procuradas [8]. 3

Também foram descritos aparelhos para aumentar a administração de fármacos com utilização de densidades de energia ótica inferiores a 10 mJ/cm2. Por exemplo, na publicação US 6,484,052 Bl, Visuri et al [9] descreveram a forma como tais densidades baixas a frequências de pulso de laser entre 100 Hz el MHz podem ser acopladas a uma fibra ótica e inseridas numa parte do corpo humano para aí gerar um campo de radiação acústica. Também descreveram a fixação de um transdutor mecânico com alimentação ótica na extremidade distai da referida fibra, mas não conseguiram especificar as características de tal transdutor. O transdutor será capaz de produzir uma onda de pressão capaz de permeabilizar transitoriamente as barreiras biológicas apenas se apresentar propriedades físicas, fotoquímicas e materiais específicas. A utilização de frequências elevadas de pulso de laser em vez de um único ou de um pequeno número de pulsos de laser não altera as propriedades das ondas de pressão. Portanto, não foi apresentado nenhum transdutor mecânico com alimentação ótica capaz de produzir ondas acústicas capazes de permeabilizar barreiras biológicas.

No campo da caracterização espectral do tecido biológico, Biagi et al descreveram, na publicação US 6, 519,376 B2, um gerador opto-acústico para produzir ondas acústicas ou ultrassons a partir de uma fonte de energia com laser pulsado [10] . A absorção de um pulso de laser por uma camada contendo grafite dirigido para a ponta de uma fibra ótica ligada à fonte laser foi apresentada como produzindo eficientemente pulsos acústicos de banda muito larga. Filmes de grafite pura podem de igual modo ser produzidos com espessuras submicrométricas, conservando no entanto uma resistência mecânica suficiente para serem tratadas em peças de 2,5 cm de diâmetro [11]. Além disso, com uma espessura de 50 nm, a absorvância aparente desses filmes aproxima-se da unidade a 400 nm. Filmes de grafite independentes com estados excitados de vida muito curta [12] podem ser preparados por pirolise de poliacrilonitrilo. No entanto, pulsos 4 acústicos gerados por esse método com camadas contendo grafite nunca foram considerados para a administração de fármacos porque o campo de caracterização do tecido utiliza pulsos de laser da ordem do microjoule, [13] o que é insuficiente para a administração de fármacos com efeitos terapêuticos. Atualmente, não são desejáveis efeitos terapêuticos na caracterização espectral, ou no diagnóstico, dos tecidos biológicos. A multiplicidade de sistemas de administração transdérmica não oculta o facto de permanecerem uma alternativa menor à administração oral ou a injeções hipodérmicas, Um método de administração transdérmica, simples e económico, capaz de administrar uma grande variedade de fármacos através da pele sem provocar dor nem desconforto, e que permite à pele recuperar a sua função protetora poucos minutos após a aplicação, conferiria à administração transdérmica um estatuto idêntico, na prática médica, ao da administração oral ou às injeções hipodérmicas.

Descrição da invenção A presente invenção apresenta um dispositivo para administrar moléculas, macro-moléculas ou materiais biológicos ainda maiores através de barreiras biológicas, incluindo a pele, tecidos moles ou membranas celulares, que satisfaz as caracteristicas ideais acima referidas para a administração biológica. 0 método para administrar fármacos e compostos biologicamente ativos com este dispositivo baseia-se na produção rápida e eficiente de transientes acústicos de banda larga, alta-frequência e impulso elevado mediante a absorção de laser pulsado curto por um filme fino, e o seu acoplamento acústico eficaz à barreira biológica, incluindo a pele ou mucosa. No âmbito do presente documento, usamos a expressão "filme fino" para descrever uma camada de material com uma espessura inferior a 200 μιη e superior a uma camada molecular (geralmente maior do que 1 nm), depositada num material mais espesso e rígido 5 (impedância acústica elevada). A presente invenção tem por principal objeto descrever as propriedades moleculares do filme fino que contribuem para a geração rápida e eficiente de uma onda de pressão, incluindo a exigência que esse filme contenha cromóforos que absorvem a maior parte da luz laser incidente e a exigência que esses cromóforos libertam a energia absorvida através de processos não-radiativos com um tempo de vida comparável à largura do pulso de laser, ou mais curto. A eficiência do método é demonstrada com a administração de proteinas e moléculas grandes na pele e a transfecção de genes para células vivas com densidades de energia ótica de 10 MW/cm2 por pulso, ou com densidades inferiores. A. Definições

No âmbito do presente pedido, entende-se por: "Fluência de laser" - a energia de laser por unidade de superfície no material de trabalho, expressa em J/cm2. "Duração do pulso de laser" tl - a largura total ao nível 1/e do pulso de laser [14], e é convenientemente expressa em unidades de nanosegundo, ns. "Densidade de energia ótica" - a densidade de energia de um feixe de laser, em que a densidade de energia é a energia do laser por unidade de superfície de irradiação, expressa em W/cm2,ou mais habitualmente em MW/cm2. "Ablação" - a extração de material por causa da luz incidente. Nos polímeros, essa extração pode ser efetuada por alterações fotoquímicas que incluem a dissolução do polímero. "Transiente acústico" - ondas de choque hipersónicas e ondas acústicas sónicas [15]. 6 "Impulso de um transiente acústico" - taxa de aumento de pressão por unidade de tempo, expressa em unidades de bar/s ou mais habitualmente em bar/ns. "Tempo de subida de um transiente acústico" - o tempo de 10 a 90% do pressão de pico [5], "Banda larga" - uma banda de frequência larga que abrange um espectro de frequência contínuo; quando utilizado para qualificar uma onda de pressão, designa uma emissão acústica com componentes significativos de frequência de dezenas de MHz. "Composto de referência fotoacústica" ~ um composto que absorve a energia radiativa de um pulso de laser, transformando-a rapidamente em calor através de processos não-radiativos, enquanto volta ao seu estado fundamental eletrónico e/ou vibracional. Nesta área, é bem sabido que um composto referência de PAC produz a onda fotoacústica de maior intensidade possivel através da absorção de um pulso de laser de uma dada energia e numa dada configuração na ausência de reações químicas de rede, durante o pulso de laser [16, 17]. "Profundidade de penetração ótica" δ - é a profundidade à qual a intensidade da radiação dentro do material cai para 1/e, habitualmente expressa em cm. "Coeficiente de absorção linear decimal " pa, ou coeficiente de absorção linear - a absorvância dividida pelo comprimento do caminho ótico que atravessa a amostra, expresso em cm-1. B. Princípios físicos

Existem vários métodos descritos na literatura nos quais a onda de pressão é produzida como resultado da interação de um curto pulso de laser com determinado material [18] . Os três 7 a rotura mecanismos de interação mais importantes são dielétrica, a vaporização ou ablação de material, e os processos termo-elásticos. São necessárias fluências elevadas de laser para produzir uma rotura ótica com a consequente formação de plasma e a subsequente produção de uma onda intensa de choque. As fluências de laser intermediárias interagem com líquidos absorventes ou com líquidos transparentes próximos de um contorno de absorção sólido para produzir a rápida expansão térmica e a vaporização explosiva ou, nalguns materiais, a ablação. A entrada de fluências de laser menores em materiais absorventes produz a expansão termoelástica dos materiais. A formação de plasma em resultado de rotura dielétrica conduz a ondas de alta-pressão, mas as energias elevadas exigidas e a sua natureza destrutiva não são práticas para a permeabilização transitória da pele. A onda de pressão gerada pela vaporização explosiva ou pela ablação de material pode assumir a forma de uma onda de choque, tal como acontece com a formação de plasma, enquanto a ejeção de material da superfície atingida pelo laser produz um momento de retrocesso. A onda de choque propaga-se na massa do material e atinge a superfície oposta como uma onda acústica, porque a onda de choque dissipa-se rapidamente e de forma contínua, como uma onda acústica que então decai mais lentamente com o comprimento da propagação [19]. A extensão espacial das ondas de choque limita-se a décimos de milímetros [15, 19] . Por outro lado, a expansão termoelástica transitória gera uma onda acústica. As ondas acústicas que resultam da ablação ou da expansão termoelástica, designadas por "impulsos transitórios", foram empregues na permeabilização transitória das camadas de células epitelíais [7]. A geração de ondas fotoacústicas por expansão termoelástica de um meio absorvente confinado com baixas fluências de laser (abaixo do limite de ocorrência de ablação que depende do material, mas que é geralmente acima de 50 mJ/cm2) pode ocorrer durante o pulso de laser (¾) , sendo esta não destrutiva. 8

Acredita-se que a expansão termoelástica é um método ineficiente para produzir uma onda de pressão a partir de um pulso de laser [20, 21] , e que a eficiência corrente do mecanismo de expansão termoelástica inferior a 0,1% fica muito aquém dos 30% de eficiência obtidos através dos mecanismos de ablação e de formação de plasma [22]. Essa crença motivou a utilização de fluências de laser acima do limite de ocorrência de ablação para gerar impulsos transitórios capazes de permeabilizar transitoriamente o stratum corneum.

No entanto, a amplitude de pressão máxima pmax que pode ser gerada através da expansão termoelástica que segue a absorção de um pulso de laser por um material confinada por um contorno rígido é [18] c.a ,

Pm«H _ 4> (1) em que α é o coeficiente de expansão térmica, CP a capacidade especifica de calor a uma pressão constante, cs a velocidade de som do meio e I0 a densidade de energia ótica do pico. Por exemplo, um alvo em polistireno confinado {cs=2320 m/s, CP=2 J/(g K) e α=7χ10“5 K-1} absorvendo um pulso de laser de 5 ns com 50 mJ em 1 cm2 (I0=10 MW/cm2) deve ser capaz de produzir uma pressão máxima de 80 bar. Trata-se de uma ordem de magnitude inferior à pressão pico típica para a administração transdérmica de fármaco com uma onda de pressão [5] . Todavia, se o tempo de subida da onda fotoacústica acompanha a largura do pulso de laser (tl=5 ns) , o seu impulso máximo atinge 15 bar/ns. Um impulso com essas características é mais do que suficiente para permeabilizar o stratum corneum. Assim, a conversão eficiente da energia do pulso de laser numa expansão termoelástica que recorre a rápidas transições não-radiativas do estado excitado inicial para o estado fundamental do cromóforo rigidamente confinado numa região estreita, tal como na técnica de calorimetria 9 fotoacústica (PAC) [17, 23], será capaz de produzir uma onda acústica com um impulso capaz de permeabilizar o stratum corneum. A amplitude de uma onda foto acústica produzida numa célula de PAC opticamente fina é dada por [23] Δ^ = —--—Hlh MCPpfi (2) em que A é a área irradiada, h a espessura da célula de PAC e ffth a quantidade de energia térmica libertada. a, a compressibilidade isotérmica (β), CP e a densidade (p) referem-se ao meio absorvente dentro da célula. As propriedades termoelásticas de um meio absorvente sólido são habitualmente caracterizadas pelo coeficiente Gruneisen sem dimensão Γ _ α _ etc, 0Ρρβ CP ^2 j em que Cp é a capacidade de calor específico da amostra. A física para os exemplos opticamente finos aplica-se também nos casos em que a absorvância da amostra é de aprox. 1, se a interface inferior for totalmente refletida e a luz atravessar o dobro do meio absorvente [24]. A dependência entre a amplitude da onda foto acústica e a espessura do material absorvente da luz foi também observada quando são utilizados filmes excessivamente absorventes como alvos do pulso de laser [13]. Verificou-se que a pressão máxima produzida pelo processo termoelástico aumentava à medida que a espessura do filme absorvente diminuía. Essa propriedade foi utilizada na conceção de geradores fotoacústicos de ondas ultra-sónicas mais eficientes [10]. A importância da espessura do material absorvente foi negligenciada nas aplicações anteriores de pulsos de laser para produzir impulsos transitórios que permeabilizam a pele. 10

Orientar a escolha dos materiais pela sua opacidade e rigidez -as quais são características essenciais mas não suficientes para um funcionamento ótimo do dispositivo - conduz a uma escolha imprecisa de alvos metálicos com espessura superior a 0,8 mm ou de alvos plásticos com espessura superior a 1 mm, como os materiais absorventes [7]. A Figura 1 compara transientes acústicos produzidos quando a mesma intensidade de pulso de laser é absorvida por uma superfície de 1 cm2 de um plástico preto de 1 mm de espessura, ou por filmes com 10 a 30 micrómetros de espessura com uma forte absorção no comprimento de onda de excitação, ambos confinados por uma cobertura de vidro e absorvendo mais de 80% da luz de laser. Reduzindo a espessura do alvo, a amplitude das ondas de pressão aumenta, como ilustrado na Figura 2. Este facto altera o paradigma da geração de impulso transiente de alta-pressão através de lasers pulsados, pois torna-se possível reduzir drasticamente a energia da fonte de laser pulsado otimizando o dispositivo que converte a energia do pulso de laser numa onda foto acústica. A maximização da eficiência da conversão de energia laser num transiente acústico por via de processos termoelásticos exige a seleção de materiais que convertem a energia do pulso de laser em calor com a duração do pulso de laser, filmes finos (h baixos) com absorvâncias superiores à unidade, e materiais com elevados coeficientes Gruneisen. Por conseguinte, um dispositivo destinado à conversão rápida e eficientemente da energia de um pulso de laser numa onda foto acústica deve incorporar, numa camada muito fina, um composto que absorbe intensamente a luz ao comprimento de onda do pulso de laser, e que converte em calor toda a energia absorvida durante esse pulso de laser. Os compostos referência de PAC satisfazem essas propriedades. É possível aumentar a intensidade da onda foto acústica desde que as modificações ultrarrápidas de volume estrutural acompanhem o decaimento não-radiativo que ocorre durante o pulso de laser. 11

Em aplicações anteriores de impulsos transitórios de alta pressão para administração transdérmica de compostos, não foi apreciado o carácter decisivo das propriedades dos materiais absorventes na determinação da forma e da amplitude da pressão transitória. A Figura 3 apresenta simulações para um intermediário com vários tempos de decaimento e para dois intermediários com diferentes tempos de decaimento e frações da energia de laser libertada. Quando medida por um transdutor de 2,25 MHz, a amplitude dos transientes acústicos diminui por um fator de 2 quando o tempo de vida do estado eletrónico intermediário aumenta de 10 para 100 ns, mesmo perante a conversão total da energia do laser em calor, O tempo de subida do transiente acústico desloca-se também para tempos mais compridos, conforme seria de esperar. Na presença de dois intermediários, se um deles apresentar uma duração de vida superior à do pulso de laser, o transiente acústico obtido é sempre mais pequeno, do que aquele que pode ser obtido com um composto referência de PAC, a não ser que o volume dos produtos seja superior aos reagentes ou que a entalpia-padrão dos produtos seja inferior à dos reagentes e que a reação seja exotérmica.

Reações exotérmicas podem produzir mais calor - e assim transientes acústicos mais intensos - do que os compostos referência de PAC. A amplitude de tais transientes acústicos também aumenta se as reações exotérmicas são acompanhadas por um aumento no volume estrutural por causa da fragmentação dos materiais, como é geralmente o caso da ablação induzida por laser. Todavia, o impulso desses transientes acústicos apenas aumentará se o tempo de subida do transiente acústico permanecer curto. Transientes de esforço gerados por expansão termoelástica a fluências de laser de sub-ablação seguem rL quando são utilizados materiais referência de PAC como cromóforos porque, por definição, apresentam tempos de vida mais curtos do que tl, e têm uma assinatura bipolar com componentes de tensão ou de 12 compressão. Sabe-se que quando a .fluência do laser ultrapassa o limite de ablação, observa-se uma onda de compressão adicional nos últimos tempos devido ao retrocesso ablativo [25] 0 tempo de subida do retrocesso ablativo diminui à medida que a fluência de laser aumenta e não depende de rL [25, 26] . 0 mecanismo de produção de pressão através da ablação laser implica o crescimento de bolhas, que apresenta um tempo de crescimento de aprox. 100 ns e coloca um limite mais baixo para as larguras do pulso de pressão [20]. Para as fluências de laser muito superiores ao limite de ocorrência de ablação, as altas intensidades dos transientes acústicos compensam os seus tempos de subida relativamente longos, e impulsos transitórios elevados podem ser criados. Apesar de ser do conhecimento básico na arte [5] , não satisfaz a necessidade de uma fonte de laser simples e acessível para a administração transdérmica ativa de· uma grande variedade de compostos, ou a transfecção de plasmídeo através de membranas celulares. Filmes finos de materiais com limites baixos de ocorrência de ablação com laser pulsado de nanosegundos, de preferência inferiores a 50 mJ/cm2, podem ultrapassar essas limitações. Foram relatados limites de ocorrência de ablação com laser pulsado abaixo de 50 mJ/cm2para alguns filmes poliméricos com coeficientes de absorção linear elevados no comprimento de onda de excitação [27, 28].

Coeficientes de absorção linear muito altos são também muito importantes porque a banda espectral do transiente acústico é determinada pela banda espectral do pulso de laser quando [14] 1 (4) em que τχ, é a duração do pulso de laser. Assim, o perfil do transiente acústico seguirá o de um pulso de laser de rL=10 ns num polimero tipico (cs=2500 m/s) quando pa>>400 cnf1. Quando são incorporados compostos referência de PAC em quantidades 13 suficientes em materiais de suporte adequados, isto é nos quais a profundidade de penetração ótica (<5=1/(2.3pa) é inferior a 10 pm, a duração do pulso de laser de nanosegundos e o seu pico de energia determinam a largura de banda e a. intensidade do transiente acústico. A amplitude dos transientes acústicos diminui quando tl é significativamente maior do que o rácio da profundidade de penetração ótica para a velocidade das ondas longitudinais. A diminuição da amplitude do transiente acústico com o aumento de fL é mais acentuada com frequências elevadas [2 9] . A conversão rápida e eficiente da energia de pulso de laser gera transientes acústicos de banda muito larga, com larguras de banda nas dezenas ou centenas de MHz, consoante a largura do pulso de laser. Para pulsos de laser suficientemente curtos, a frequência central do ultrassom gerado desloca-se para frequências mais elevadas quando a profundidade de penetração ótica do material absorvente diminui. Por exemplo, para a excitação com laser Nd:YAG a 1064 nm, materiais à base de grafite têm profundidades de penetração ótica de 10 a 50 micrómetros, ao passo que a profundidade de penetração ótica do aluminio é de 10 nm, o que desloca a frequência central do ultrassom gerado de 2,1 para 12 MHz [30]. As transformadas rápidas de Fourier dos transientes acústicos revelam essa propriedade, como ilustrado na Figura 4. Esta experiência usou um transdutor de 225 MHz porque os componentes de alta frequência da largura de banda medem-se melhor com transdutores de alta frequência.

Para a permeabilização transitória da pele e da mucosa, é desejável que a largura de banda do transiente acústico se estenda a altas frequências (frequências superiores a 20 MHz) porque o limite de cavitação desloca-se para energias mais elevadas com frequências mais altas, embora as frequências altas sejam mais intensamente absorvidas por tecidos biológicos. As bolhas de cavitação transitórias devem ser evitadas porque podem provocar danos nos tecidos biológicos quando atingem tamanhos da 14 ordem do milímetro e colapsam. A probabilidade da exposição a transientes acústicos produzir cavitação inercial (ou transitória) mede-se pelo índice mecânico (MI) MI - ^rmax

em que prmax é a pressão negativa (de tração) do pico e f é a frequência central (nominal) dos transientes acústicos. Um valor mais elevado de MI aponta para uma probabilidade maior de ocorrência de cavitação, a equação acima indicada significando, por conseguinte, que a amplitude de pressão mínima que satisfaz o limite de cavitação aumenta com a frequência ultrassónica (31, 32] . Por outro lado, a atenuação de uma frequência acústica de 10 MHz com uma coluna de água de 3 cm é de apenas 7%, mas aumenta para 85% para um componente de pressão de 50 MHz [20] . Frequências muito elevadas estão presentes nos transientes acústicos quando pulsos de laser curtos (rL<20 ns) são absorvidos por referências de PAC confinadas em camadas muito finas (espessura inferior a 10 mícrómetros). As referências de PAC devem ter um coeficiente de absorção muito alto no comprimento de onda do pulso de laser para poder absorver a maioria do pulso de laser na espessura do filme onde são incorporadas. Tendo em conta a atenuação acústica acima referida, é também desejável que a fonte da onda de PAC esteja perto da pele. A conceção dos dispositivos com camadas de absorção muito pequenas confinadas em suportes finos deve também considerar os limites para o que pode ser considerado como geração de uma onda acústica plana. O critério é que o raio do feixe de laser r deve ser escolhido para satisfazer essa condição

15 em que cs é a velocidade do som na amostra, rL é a largura do pulso de laser e z é a distância entre a superfície da camada absorvente e o detetor. Um apoio estrutural com x= 1 mm, com valores de cs=2500 m/s e tl=10 ns, exige r>>0,2 mm. Assim, é possível focar um feixe de laser para um raio de 1 mm e ainda produzir uma onda acústica plana. A diferença notável de um dispositivo com esta configuração é que uma densidade de energia de 10 mJ/cm2 por pulso numa área de 0,03 cm2 corresponde a um pulso de laser de 0,3 mj. Energias desta magnitude para durações de pulso de alguns nanosegundos estão imediatamente disponíveis nos lasers de fibra pulsado, lasers cristais bombeado por díodos ou outros lasers de estado sólido, os quais atingem também frequências na ordem das centenas de kHz. Tais lasers são portáteis, compactos, duráveis, acessíveis, fáceis de operar e não exigem manutenção. Ά conceção de conversores foto acústicos eficientes de energia do laser pulsado deve também considerar o facto que a geração da onda de pressão na presença de um contorno rígido conduz a uma pressão mais elevado do que perante um contorno livre [18]. Revelou-se que a restrição acústica do conversor foto acústico através de pratos de quartzo aumentava a amplitude das ondas foto acústicas de 20 MHz por um fator de quase 100 [33] . Além disso, no caso de um transiente acústico gerado por expansão termoelástica, a presença de um contorno rígido transforma um transiente de pressão que consiste numa compressão seguida de uma rarefação num impulso de compressão unidirecional [34] . A conversão eficiente da energia do pulso de laser permite utilizar fluências de laser abaixo de 100 mJ/cm2 para gerar transientes acústicos intensos e maioritariamente compressivos. A otimização das propriedades termo elásticas do material de apoio contribui também para o aumento da amplitude dos transientes acústicos gerados por expansão termo elástica de um filme fino confinado contendo um material referência de PAC. Os 16 líquidos orgânicos possuem propriedades termo elásticas que podem também ser descritas por coeficientes elevados de Griineisen, e formam excelentes contornos acústicos com superfícies sólidas [35]. A confinaçâo de um filme fino entre a janela e a camada fina de um líquido orgânico com Γ elevado contribui ainda mais para o aumento da eficiência da conversão da energia do pulso de laser numa onda foto acústica. Líquidos tão heterogéneos como o tetracloreto de carbono, o bromobenzeno, a acetona ou o acetonitrilo, têm propriedades termo elásticas que conduzem a ondas foto acústicas de amplitude elevada [23] . Sabe-se que os elastómeros tais como a borracha, o neopreno, o viton ou o poliuretano, têm coeficientes de expansão elevados, o que é por vezes compensado por outras características. É sobejamente conhecido na arte que, quando uma onda acústica que percorre um meio (meio 1) percuta o contorno de um segundo meio (meio 2), são geradas ondas refletidas e transmitidas (ou refratadas). 0 coeficiente de transmissão é dado por

j. _ A _ 2τ]ζ{Ζ2 A A+A em que A2 e Ai são a amplitude inicial no meio 1 e a amplitude final no meio 2, e Z± e Z2 são as impedâncias acústicas nos dois meios. A transmissão completa entre os dois meios exige Ζι=Ζ2. A presença de vazios no dispositivo é a principal causa de ineficiência. Os vazios são frequentemente preenchidos por ar, apresentando uma impedância acústica drasticamente diferente em relação aos outros materiais que compõem o dispositivo, o que se traduz na transmissão acústica muito fraca e na perda de eficiência do dispositivo. Assim, torna-se necessário assegurar um bom acoplamento acústico entre o filme fino do dispositivo no qual é gerado a onda foto acústica e todas as peças para o dispositivo que a onda foto acústica deve atravessar para 17 atingir a pele. .Adicionalmente, um bom acoplamento acústico entre o dispositivo e a pele ou a mucosa é também necessário. A impedância acústica da pele é Zskin=l,54 MRayl [1 MRayl =lxl06 kg/ (m2 s) ] , semelhante à da água (ZWater=lf48 MRayl), mas muito diferente da dos metais (2flluminum=17 MRayl, Zsteei=A6 MRayl), apesar de estar relativamente próxima das dos plásticos (2Tefion=2,97 MRayl, i^poiyethyiene-1, 76 MRayl, 2p0iyStyrene—2,42 MRayl) . A parafina (2Paraffin=l/8 MRayl), o glicerol (Zgiyceroi=2, 3 MRayl), o grafite (Zgraphite=2,7 MRayl), o acetato de celulose (2ceiiniose=3,2 MRayl) ou o gel de contacto constituem materiais interessantes para um bom acoplamento acústico com a pele. A administração eficiente de ondas acústicas para a pele exige a seleção de materiais que apresentam impedâncias acústicas próximas de Zskin· 0 problema da discrepância da impedância acústica pode também ser resolvido através do uso de camadas múltiplas correspondentes em série, em que a impedância ótima para cada camada é igual à média geométrica da impedância das camadas de cada lado. C. Química dos materiais

Alvos rígidos e intensamente absorventes estão amplamente disponíveis. No entanto, as considerações detalhadas acima também apelam para materiais com propriedades de compostos referência de PAC, com coeficientes elevados de absorção linear, incorporados num camada absorvente fina com coeficientes Gruneisen elevados, um bom acoplamento acústico entre a camada absorvente de luz e todos os materiais nos quais o transiente acústico se propaga em direção à pele, com um bom acoplamento acústico com a pele e, de preferência, com reflexão da luz transmitida na parte traseira do dispositivo para promover uma segunda passagem através da camada absorvente. Em alternativa, em vez de usar materiais incorporando filmes finos com propriedades de compostos referência de PAC, o filme fino e absorvente de luz pode ser fabricado com polímeros com limites baixos de ocorrência de ablação com laser pulsado de 18 nanosegundos. Estas são as orientações para realizar dispositivos que convertem eficientemente a energia de pulso de laser em transientes acústicos de banda larga, curta duração e intensidade elevada. Δ Figura 5 apresenta um diagrama de trabalho da execução preferencial de um dispositivo respeitando essas orientações. Os exemplos aqui fornecidos tencionam ilustrar diferentes métodos para obter materiais adequados para a conversão rápida e eficiente da energia de pulso de laser num transiente acústico, mas a seleção dos materiais está apenas limitada pelas orientações acima referidas.

Apresenta-se uma lista não exaustiva de compostos de referência PAG que podem ser incorporados em camadas finas: orto-hidroxibenzofenona e moléculas semelhantes que passam por transferências ultrarrápidas e foto induzidas de átomos de hidrogénio ou de protão intramolecular que voltam rapidamente para o estado fundamental original; complexos Mn111 de meso-tetrafenilporfirina (MnTPP) e outros complexos paramagnéticos com processos de relaxação ultrarrápidos de transferência metal-ligando e/ou ligando-metal; complexos com bandas de transferência de carga que voltam ao estado fundamental através de recombinação ultrarrápida de carga; β-carotene e outros sistemas que decaem rapidamente para o estado fundamental através de intersecções cónicas; grafite e outros materiais capazes de transferir muito rapidamente a sua energia eletrónica para modos de fonão seguidos de arrefecimento na escala de tempo do sub-nanosegundo [36]; materiais semicondutores com estados transientes com tempo de vida curto, ou outros materiais, ou misturas de materiais, com processos ultrarrápidos de relaxação não-radiativa. Tais processos ultrarrápidos não-radiativos podem conter, para além da relaxação térmica, modificações do volume estrutural que resultam rapidamente em intermediários com volumes molares maiores do que os reagentes. Os compostos referência de PAC na camada fina podem também ser excitados por vibrações com pulsos de laser infravermelho, desde que os modos 19 vibracionais, ou a combinação de modos vibracionais, excitados com luz de infravermelhos volte muito rapidamente ao estado vibracional fundamental, como é o caso, por exemplo dos espectros foto acústicos da água e de outros materiais. É possivel produzir filmes poliméricos finos de forma económica graças a várias técnicas. Por exemplo, a técnica de revestimento giratório {spin-coating) padrão produz filmes com espessuras compreendidas entre 1 e 10 micrómetros. Os corantes qualificados como referências de PAC devem ser incorporados em grandes quantidades no polímero e o dispositivo deve ser concebido para fornecer o confinamento e a rigidez exigidos para um funcionamento eficiente. A incorporação de quantidades maiores de corante no polímero é facilitada pela introdução de longas cadeias alquílicas, tais como nas meso-tetra (undecil)porfirinas. As propriedades das referências de PAC estão também presentes em tais compostos quando complexos com iões paramagnéticos, tais como o Mn111 em presença de contra-iões como os iões halogenetos, os carboxilatos, etc. Tais referências de PAC estão identificadas no presente trabalho por MnTAP e presumem a presença de um contra-ião. Para ilustrar a utilização e o desempenho dos filmes finos poliméricos, apresentamos no Exemplo 1 o método para produzir um dispositivo para a administração transdérmica de fármaco com um filme fino polimérico incorporando grandes quantidades de MnTAP. Outra classe de compostos com propriedades adequadas para incorporar nesses filmes poliméricos é a dos corantes absorventes no infravermelho próximo concebidos, por exemplo, para bloquear a luz de laser no infravermelho próximo. O Exemplo 2 descreve a fabricação de um dispositivo com um desses corantes, que tem a vantagem de usar pulsos de laser no infravermelho próximo para produzir ondas foto acústicas. Lasers no infravermelho próximo podem distribuir uma determinada fluência laser a um custo mais baixo do que os laser visíveis ou de ultravioletas. 20

As células solares sensibilizadas por corantes são atualmente fabricadas com uma camada com uma espessura de poucos micrómetros de nanocristais de titânio T1O2, depositados numa lamela de vidro. As camadas muito finas assim obtidas oferecem uma área de superfície muito larga que pode ser utilizada para adsorver corantes. 0 Exemplo 3 ilustra a fabricação de dispositivos com camadas muito finas de Ti02 com meso tetra-(sulfonilfenil)porfirinato de manganésio (MnTTPS), que se comporta como uma boa referência foto acústica nessas condições [37], 0 mesmo exemplo também abrange materiais semicondutores que absorvem intensamente num comprimento de onda de excitação, tais como o hematite, sob a forma de filmes mesoporosos nanocristalinos a-Fe203, com recombínação geminai rápida do electrão-buraco [38].

Filmes finos de materiais com limites de ocorrência de ablação por laser pulsado abaixo dos 50 mJ/cm2 também satisfazem as orientações acima referidas para a conversão rápida e eficiente da energia de pulso de laser num transiente acústico. É o que ocorre, por exemplo, com o tereftalato de polietileno (PET) [39], a poliimida [40] e polímeros de triazeno [28]. Esses polímeros apresentam também fortes absorções nos UV, com coeficientes de absorção linear decimal de pa=l/6xl05 e de 2,5xl05 cm"1 a 248 nm para o PET e a poliimida, respetivamente [27] , e pa«105 cm-1 a 308 nm para os polímeros de triazeno [28, 41]. Com coeficientes de absorção tão elevados, é possível obter filmes com espessuras de 200 nm que absorvem mais de 99% do pulso de laser incidente num comprimento de onda apropriado, e que sofrem uma ablação com a produção dos transientes acústicos de alta amplitude a fluências de laser abaixo de 100 mJ/cm2. A Figura 1 compara ondas foto acústicas produzidas por diferentes dispositivos sob a mesma fluência de laser (10 mj/cm2), sendo detetadas por um transdutor de 2,25 MHz da Panametrics (modelo A106S) e armazenadas digitalmente num 21

osciloscópio (Tektronix DAS .601, 1 Gs/s, dois canais). A excitação utilizou a terceira harmónica de um laser Nd:YAG da Spectra-Physics Quanta Ray GCR 130 (largura de pulso de 5-6 ns) com uma energia por pulso ca. de 10 mJ/cm2 a 355 nm. As amplitudes relativas de tais transientes acústicos dependem da sensibilidade do transdutor para com as várias frequências acústicas presentes na onda de transiente acústico. Assim, a amplitude dos transientes acústicos medida pelo transdutor revela apenas a eficiência da conversão foto acústica conseguida pelos dispositivos. Contudo, as amplitudes dos transientes acústicos produzidos pelos dispositivos concebidos de acordo com as orientações acima referidas são mais elevadas do que aquelas da onda de pressão geradas por um alvo de polistireno preto com uma espessura de 1 mm. O Exemplo 4 apresenta a influência dos coeficientes de absorção linear na largura de banda da onda acústica transitória. A utilização de um transdutor Panametrics de 225 MHz (modelo V2113) mostra que a transformada rápida de Fourier dos transientes acústicos gerados por filmes com coeficientes de absorção linear mais elevados têm frequências ultrassónicas que chegam aos 200 MHz (Figura 4). Estas frequências elevadas mostram que o transiente acústico acompanha a duração do pulso de laser (ca. 6 ns). D. Avaliação biológica

A melhor forma para avaliar o desempenho das ondas foto acústicos geradas por esses dispositivos na promoção da administração transdérmica de grandes moléculas e materiais biológicos é através de modelos animais com estruturas da pele muito semelhantes à pele humana. O melhor modelo animal para testar a permeação da pele é o minipig, tendo em conta as semelhanças entre as características da pele humana e do minipig e a sua permeabilidade similiar a diferentes fármacos [42]. A 22 prova de principio da eficácia dos dispositivos aqui revelados é apresentada nos Exemplos 5 a 8 através de 2 entidades clinicamente pertinentes: a porfirina e a proteína. As porfirinas e os derivados são geralmente utilizados como fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica do cancro. A sua utilização no tratamento dos cancros da pele e as afeções cutâneas, tais como as queratoses actínicas, o carcinoma das células escamosas, a doença de Bowen (carcinoma das células escamosas intra-epiteliais) ou carcinoma das células basais, é limitada pela difusão lenta dessas grandes moléculas através da pele. A administração transdérmica de 5,10,15,20-tetrakis(2,6-fluoro-3-N-metilsulfamoilfenilo)porfirina (F2TPPMet, peso molecular de 1131 Da) na pele de minipig com dispositivos ora apresentados é descrita nos Exemplos 5 e 7. As proteínas são actualmente administradas por agulhas hipodérmicas para o tratamento de várias doenças e distúrbios. A injeção subcutânea de insulina (peso molecular de 6 kDa) para o tratamento da diabetes é um exemplo muito pertinente. Os Exemplos 6 e 8 descrevem a administração intradérmica eficiente de proteína fluorescente verde (GFP, peso molecular de 27 kDa)através dos dispositivos ora apresentados.

Para a realização dos testes in vivo e in vitro recorreu-se a quatro minipigs obtidos através do IMIDRA (Instituto Madrileno de Investigación y Desarrollo Rural, Agrário y Alimentario) -Aranjuez (Madrid). Todos os animais eram fêmeas, com idades compreendidas entre os 6 e 8 meses, brancas com pintas castanhas e um peso médio de 56,8 kg (66,2; 57,1; 43,5 e 60,6 kg) . Foram rececionados na Estação Zootécnica Nacional, Vale de Santarém, onde foram alojados em caixas individuais de 1,5 m2, alimentados com uma dieta padrão para suínos e água ad libitum, durante um período de aclimatação de três semanas. O estudo foi realizado de acordo com as orientações éticas portuguesas numa licença emitida pela Direção de Serviços de Saúde e Proteção Animal, ref. 0420/000/000/2007. 0 acesso à ração foi suspenso 24 horas 23 antes do tratamento. Os dorsos dos animais foram rapados 24 horas antes da aplicação in vivo das formulações dermatológicas. As formulações foram as mesmas para a administração transdérmica passiva e a administração transdérmica com ondas foto acústicas. Os dispositivos de conversão foto acústica e o laser utilizados nessas experiências foram descritos acima. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia. A pré-medicação utilizada 30 minutos antes foi a seguinte: Azaperone (Stresnil® - Veterinária ESTEVE - Espanha), injeção intramuscular de 2 mg/kg + sulfato de atropina, 50 mg SC. A indução foi feita com quetamina (Clorketam® - Vétoquinol, França), 20 mg/kg, injeção intramuscular. A anestesia foi mantida com intubação endotraqueal, utilizando ventilação espontânea com 2-3 1/min de oxigénio + 3% isoflurano {Isoflo® - Veterinária ESTEVE, Espanha). As amostras foram recolhidas em 3 minipigs sob a anestesia acima descrita. Aliquotas de pele com 20x20x10 (comprimento, largura, profundidade) foram obtidos por excisão cirúrgica. Após todas as recolhas de amostras de pele, os animais foram sacrificados com uma overdose de tiopental sódico (25 mg/kg) + 20 ml de cloreto de potássio 7,5%. O quarto minipig foi submetido a mais 3 semanas de alimentação com dieta padrão para suinos e água ad libitum, sendo também depois sacrificado.

Foram retiradas secções de pele do dorso dos minipigs após terem sido sacrificados, as quais foram congeladas e conservadas a uma temperatura de -10°C até à sua utilização nos testes in vítro. Antes de cada teste in vítro, a quantidade necessária de pele de minipig foi lentamente exposta à temperatura ambiente. Todos os testes foram realizados à temperatura ambiente.

As amostras de pele recolhidas após as experiências foram analisadas por microscopia no sentido de avaliar a profundidade de penetração dos compostos desejados, ou foram alvo de um procedimento de extração para avaliar as quantidades presentes sob a pele. A avaliação da profundidade de penetração por 24 microscopia fluorescente ou por microscopia confocal exigiu a fixação dos tecidos. A primeira etapa na fixação foi a imersão em paraformaldeido (solução aquosa 4%) durante pelo menos 24 horas. A seguir, as amostras foram transferidas para uma solução de sacarose 25% durante pelo menos 48 horas. Depois desse tratamento, as amostras de pele tornam-se mais densas do que a solução de sacarose. Uma aliquota foi extraída com pinça saca-bocados, congelada em gelo seco e depois montada num suporte com composto Tissue-Tek O.C.T. compound (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Países-Baixos) e seccionada em lâminas com espessuras controladas e selecionadas entre 25 e 100 mm num crióstato. As amostras de pele foram recolhidas em lâminas de microscópio e mantidas refrigeradas até serem analisadas através de microscopia fluorescente e microscopia confocal. Em alternativa, em vez de usar paraformaldeido como fixador, as amostras de pele foram diretamente congeladas em gelo seco.

Um método específico foi concebido para avaliar as quantidades de F2TPPMet administradas sob a pele. Do cm2 da área de pele experimental, foi retirado uma amostra de 4 mm e totalmente seccionado em partes tão pequenas quanto possível com um bisturi. Essas partes foram transferidas para um copo em vidro com um certo volume de diclorometano, sendo esmagado com um triturador YSTRAL Micro Shaft 6G. Depois, os resíduos de pele triturada passam por um procedimento de extração durante 6 horas com um solvente adequado. Para o F2TPPMet, o diclorometano representa a escolha correta considerando a lipofilia da pele e da porfirina. As curvas de calibração do excipiente farmacológico administrado na pele foram realizadas no extrator por solvente para validar a metodologia utilizada. Finalmente, a massa administrada na pele é determinada para cada ensaio substituindo a sua fluorescência na curva de calibração. O sinal de fluorescência das imagens de fluorescência foi também quantificado através da análise da luminosidade do F2TPPMet administrado sob a pele [43] após delimitação das áreas onde a 25 fluorescência é observada. 0 procedimento de extração para a administração transdérmica passiva versus ativa de F2TPPMet confirmou os dados obtidos através da microscopia de fluorescência, nomeadamente o aumento na quantidade de F2TPPMet administrada perante a utilização de uma onda de pressão de banda larga e impulso elevado enquanto método de administração transdérmica ativa. A proteína fluorescente verde (GFP) tem um peso de 27 kDa, isto é muito superior às proteínas com efeitos terapêuticos, tais como a insulina (5,8 kDa). Por outro lado, a GFP tem uma emissão e uma absorção da luz características e intensas, o que facilita a sua análise com técnicas de fluorescência, nomeadamente a microscopia confocal. Foi utilizada aqui como modelo para a administração intradérmica de proteínas. Além disso, plasmídeos de codificação de GFP estão disponíveis no comércio, nomeadamente os plasmídeos à base de vetores gWIZ. 0 nível de expressão de GFP após a transfecção conduzida por plasmídeos gWizGFP pode ser monitorizado por fluorescência, com excitação a 47 0-480 nm e emissão a 510 nm, 0 Exemplo 9 apresenta a prova de princípio in vitro da transfecção de plasmídeo com gWizGFP.

Descrição das Figuras A Figura 1 compara ondas foto acústicas produzidas por diferentes dispositivos sob a mesma fluência de laser (10 mJ/cm2) , sendo detetadas por um transdutor de 2,25 MHz da Panametrics (modelo A106S) e armazenadas digitalmente num osciloscópio (Tektronix DAS 601, 1 Gs/s, dois canais). A excitação utilizou a terceira harmónica de um laser Nd:YAG da Spectra-Physics Quanta Ray GCR 130 (largura de pulso de 5-6 ns). No eixo das ordenadas PA representa o sinal fotoacústico em mV. No eixo das abcissas t representa o tempo e as unidades são o segundo. 26 A Figura 2 mostra a diminuição da amplitude de ondas acústicas transitórias quando aumenta a espessura do filme absorvente, no caso pela adsorção sucessiva de camadas de nanoparticulas de TÍO2 numa lâmina de vidro. Quando uma segunda camada é adsorvida e a espessura do filme aumenta para o dobro, a amplitude de onda acústica transitórias gerada pelo tetra-(sulfonilfenil)porfirinato de manganésio (MnTPPS) é reduzida para metade. No eixo das ordenadas PA representa o sinal fotoacústico em mV. A Figura 3 ilustra a simulação de ondas foto acústicas vistas por um transdutor de 2,25 MHz quando são produzidas pelo decaimento não-radiativo de um intermediário com um tempo de decaimento de 10 ou por um intermediário com um tempo de decaimento de 100 ns, as ondas foto acústicas produzidas por dois intermediários consecutivos com tempos de vida de 10 e 100 ns, cada um deles gerado com 50% da energia por pulso do laser. A amplitude das ondas foto acústicas diminui por um fator de 2 quando o tempo de vida do estado eletrónico intermediário aumenta de 10 para 100 ns e o seu tempo de subida é mais longo, reduzindo assim o impulso da onda acústica transitória. No eixo das ordenadas PA representa o sinal fotoacústico em unidades normalizadas. No eixo das abcissas t representa o tempo e as unidades são o segundo. A Figura 4 mostra a transformada rápida de Fourier de ondas foto acústicas detetadas por um transdutor de 225 MHz da Panametrics, após a excitação com laser pulsado de um disco de poliestireno preto comercial com uma espessura de 634 pm (linha a tracejado) e de um filme de poliestireno com 38 pm de espessura contendo MnTAP (linha a cheio), ambos absorvendo mais de 99,9% da luz de um laser a 48 4 nm. A excitação dos filmes utilizou um OPO da EKSPLA, modelo PG-122 bombeado por um laser NL301G NdrYAG da EKSPLA proporcionando pulsos com duração de 4-6 ns. No eixo das ordenadas A representa a amplitude normalizada da distribuição 27 espectral, e unidades dB. No eixo das abcissas f representa as frequências e as unidades são o MHz. A Figura 5 representa um esquema em corte transversal não à escala, de um exemplo de um dispositivo para administração de compostos numa formulação farmacológica adequada (A), através de barreiras biológicas (B) onde uma extremidade de uma guia ótica (7) é conectada a uma fonte de luz laser pulsada e a outra extremidade é dirigida para uma camada fina absorvente (4), cuja espessura deve situar-se entre 0.01 e 100 pm e preferivelmente entre 0.1 e 20 pm, de um filme contendo um composto referência de PAC. A guia ótica oferece direccionalidade com ou sem o contacto físico entre a fonte de luz laser e a camada absorvente contendo o composto referência de PAC. Um pulso de laser (1) pode ser orientado e/ou focado numa parte do filme (4) e os pulsos de laser subsequentes, com durações de pulso entre 0.1 e lOOns e preferivelmente entre 0.5 e 20ns, podem ser guiados para a mesma zona ou para diferentes partes do filme (4). Uma janela rígida (3) é transparente ao comprimento de onda do pulso de laser (1) que é seletivamente absorvido pelo composto referência de PAC incorporado no filme fino (4). A luz transmitida através do filme (4) é opcionalmente refletida por um elemento de suporte espelhado, entre 0.1 e lOmm e preferivelmente entre 0.2 e 2mm, na sua face frontal (5) , o que permite uma segunda passagem da luz através do filme (4) aumentando a sua absorção. A onda foto acústica produzida no filme (4) é opcionalmente transmitida através de um elemento de suporte (5) para a barreira biológica (B), como por exemplo a pele, sendo o acoplamento acústico entre o dispositivo e a pele favorecido pela formulação farmacológica (A) que contém o fármaco que deve se entregue na pele. 0 contacto próximo entre a janela (3), o filme fino (4) e o elemento de suporte (5) é assegurado por um elemento estrutural (6), que pode ser de construção substancialmente rígida ou flexível, ou um vedante ou um cimento. Este elemento estrutural pode incorporar uma tecnologia 28 para orientar o pulso da luz laser (1) e distribuir subsequentes pulsos de laser, entre 0.1 e 100mJ/cm2 e preferivelmente entre 0.5 e 50mJ/cm2, para diferentes partes do filme (4). A Figura 6 compara a microscopia de fluorescência da administração transdérmica passiva (A) e ativa (B) de uma porfirina com um peso molecular ca. 1 kDa através da pele de um minipig, com o dispositivo do Exemplo 1 e 12 pulsos de laser, de 355 nm com fluências de 10 mj/cm2 focados numa área de 1 cm2 e um tempo de incubação na pele de 20 minutos. A Figura 7 mostra a microscopia confocal da administração transdérmica ativa de uma porfirina com um peso molecular ca. 1 kDa através da pele de um minipig, com o dispositivo do Exemplo 3 e 6, pulsos de laser de 355 nm com fluências de 10 mJ/cm2 e um tempo de incubação na pele de 20 minutos. O modo confocal caracteriza-se pela utilização da detecção a 1150 V, um tamanho de orificio de 111,44 pm e excitação da amostra a 514 nm. A Figura 8 mostra a microscopia de fluorescência (A) e a microscopia confocal (B) da administração transdérmica ativa de GFP (peso molecular de 27 kDa) através ensaios pós-morte em pele de minipig com o dispositivo do Exemplo 1 usando 6 pulsos de luz laser de 355 nm com fluências de 50 mj/cm2 e um tempo de incubação na pele de 20 minutos. O modo confocal caracteriza-se pela utilização da deteção a 1150 V, um tamanho de orificio de 111,44 pm e excitação da amostra a 488 nm. A Figura 9 mostra a microscopia de fluorescência da administração transdérmica ativa de uma porfirina com peso molecular ca. 1 kDa através da pele de um minipig in vivo com o dispositivo do Exemplo 1 usando 12 pulsos de laser de 355 nm com fluência de 10 mJ/cm2 e um tempo de incubação na pele de 20 minutos. 29 A Figura 10 mostra a microscopia . de fluorescência da administração transdérmica ativa de GFP através da pele de um minipig in vivo com o dispositivo do Exemplo 1 usando 12 pulsos de laser de 355 nm com fluência de 10 mJ/cm2 e um tempo de incubação na pele de 20 minutos. A Figura 11 mostra a microscopia de fluorescência de GFP produzida após a administração in vitro do plasmideo gWizGFP em células COS-7 usando o dispositivo do Exemplo 1 com pulsos de laser de 532 nm com fluência de 55 mJ/cm2. Vinte e quatro horas após a irradiação laser, a expressão de GFP nas células foi observada por microscopia de fluorescência (DMIRE200 Leica). As amostras celulares foram excitadas a 488 nm.

Descrição Detalhada da Invenção

Exemplo 1

Geração de transientes acústicos por dispositivos incorporando filmes poliméricos de espessuras micrométricas O ineso-tetraundecilporfirinato de manganésio é um bom composto referência de PAC e foi incorporado em grandes quantidades num filme de poliestireno. O filme foi produzido pela técnica de revestimento giratório (spin-coating) numa lamela de vidro. 0 vidro funciona enquanto janela e encontra-se confinado no outro lado por uma cobertura de plástico refletivo. Este dispositivo rigido absorve de mais de 90% de luz laser de 355 nm, o material absorvente cumpre os critérios das boas referências de PAC, a camada absorvente tem uma espessura ca. 30 pm, e o material em contacto com a pele tem uma impedância acústica próxima de Zsicin. A impedância acústica entre todos os elementos do dispositivo pode ser melhorada recorrendo a meios acopladores apropriados, tais como géis de acoplamento acústico, parafina ou glicerina. O desempenho deste dispositivo quando excitado por pulsos de laser de 355 nm gerados pela terceira harmónica de um laser Nd:YAG com 30 uma densidade de energia de 10 mJ/cm2 e medidos por um transdutor de 2,25 MHz, é comparado na Figura 1 com o desempenho de um plástico de poliestireno comercial com 1 mm de espessura e uma janela de vidro similar.

Este exemplo ilustra o aumento da eficiência da conversão foto acústica conseguida com um dispositivo construído de acordo com as orientações descritas nesta invenção, quando comparado com a eficiência de um simples plástico preto previamente conhecido na arte.

Exemplo 2

Geração de ondas acústicas transitórias por dispositivos de espessuras micrométricas incorporando corantes que absorvem no infravermelho

Corantes que absorvem no infravermelho são utilizados no fabrico de proteções oculares contra radiação laser e podem também exibir propriedades semelhantes aos compostos referência de PAC. Um filme incorporando o corante comercial EPOLIGHT 1178 da Epolin, que exibe forte absorção a 1064 e 355 nm, foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. As ondas foto acústicas produzidas pelo filme incorporando o corante EPOLIGHT 1178 foram comparadas com as ondas foto acústicas produzidas pelo corante MnTAP utilizando iguais absorvâncias dos filmes e fluências do laser a 355 nm, e as mesmas condições experimentais. Os filmes produziram ondas foto acústicas similares, o que demonstra que o corante EPOLIGHT 1178 exibe propriedades de referência foto acústica de PAC. A Figura 1 compara as ondas foto acústicas geradas com o dispositivo incorporando EOPLIGHT 1178, com um seu análogo incorporando MnTAP, para a mesma fluência de laser.

Este exemplo mostra que uma vasta gama de comprimentos de onda de luz laser pode ser empregue na conversão eficiente de 31 luz pulsada em ondas foto acústicas, desde que se sigam as orientações reveladas nesta invenção.

Exemplo 3

Geração de ondas acústicas transitórias por dispositivos incorporando camadas de T1O2 nanoestruturado com espessuras nano ou micrométricas.

Os métodos fisicos utilizados para produzir camadas finas de Ti02 nanoestruturado sob uma superfície de vidro são sobejamente conhecidos na área das células solares sensibilizadas por corantes. Contrariamente a tais aplicações, os dispositivos de administração transdérmica de fármacos não requerem a utilização de sinterização para promover uma boa condutividade elétrica entre as nanopartículas de TÍO2. A sinterização pode inclusivamente reduzir a superfície de contacto.

Depois de ter adsorçâo de uma quantidade suficiente de tetra-(sulfonilfenil)porfirinato de manganésio (MnTPPS) que garanta uma absorção de luz laser a 355 nm superior a 90%, a lamela é seca e uma fina camada de glicerol é adicionada para garantir o acoplamento acústico com uma folha refletiva de metal colocada em cima dela. Este dispositivo é irradiado a partir da sua face posterior, isto é, o feixe do laser entra pela lamela de vidro, atravessa-a e é absorvido pelo corante adsorvido nos nanocristais de TÍO2. A luz que não é absorvida pelo corante pode ser absorvida ou refletida pela superfície metálica, o que bloqueia qualquer luz de atravessar o dispositivo. Uma camada de partículas de TÍO2 de tamanhos maiores, por exemplo 100 a 200 nm, pode ser incorporada no dispositivo de modo a aumentar a dispersão de luz e, consequentemente aumentar o caminho ótico e a probabilidade da absorção da luz laser pelo corante adsorvido. A Figura 1 as ondas foto acústicas medidas com este dispositivo 32 e respetiva excitação a 355 nm com as dos dispositivos descritos nos exemplos anteriores, para a mesma fluência de luz laser.

Exemplo 4

Geração de ondas acústicas transitórias por dispositivos com elevados coeficientes de absorção linear O corante MnTAP pode ser incorporado em grandes quantidades em filmes finos de poliestireno. Um filme de 38 pm de espessura foi fabricado com uma absorvância de 1,8 a 647 nm, o que corresponde a uma absorvância superior a 5 a 484 nm. Desta forma, o filme fino apresenta pa>>1300 cm-1 e a banda espectral do transiente foto acústico que pode produzir será determinada pela banda espectral do pulso de laser absorvido pelo filme fino. O filme foi confinado entre uma janela de quartzo e a superfície de um transdutor de 225 MHz da Panametrics, sendo excitado pelo 0P0 da EKSPLA, modelo PG-122 bombeado por ura laser NL301G Nd:YAG da EKSPLA o que gera pulsos com duração de 4 a 6 ns a 484 nm. A transformada rápida de Fourier das ondas foto acústicas geradas leva à distribuição espectral apresentada na Figura 4. Observam-se componentes de frequência significativos até 200 MHz neste sinal e esta mesma figura compara o sinal obtido para um disco comercial de poliestireno preto com uma absorvância superior a 5 a 484 nm para as mesmas condições experimentais. O sinal obtido por este último dispositivo não revela componentes de frequência significativos acima de 50 MHz.

Exemplo 5

Administração transdérmica in vitro de uma porfirina com um peso molecular ca. 1 kDa

Uma formulação dermatológica com F2TPPMet foi obtida dissolvendo 5 mg desta porfirina em 0,556 mL de etanol absoluto, de seguida adicionando 1,737 mL de propileno glicol, 0,22 mL de Azone e 0,3 mL de água. A mistura foi vigorosamente misturada 33 num vortéx e sonifiçada para facilitar a solubilização, para que possa ser adicionada a uma base de gel constituída por água (76,65%), 96% etanol (15%), glicerina (6%), trietanolamina (1,35%) e carbopol 940 (1%). A mistura resultante foi agitada mecanicamente para alcançar a completa homogeneização. Nesta formulação, a concentração final de porfirina é de 0,1% e a de Azone é de 4%.

Esta formulação foi aplicada num quadrado de aproximadamente 2x2 cm de pele de minipig pós-morte e o dispositivo do Exemplo 1 pressionado gentilmente contra a formulação e a pele, sendo disparados 12 pulsos de laser com a segunda harmónica (532 nm) de um laser Nd:YAG com uma energia por pulso de 50 mJ. A área irradiada foi de aproximadamente 1 cm2. O dispositivo foi removido imediatamente após a irradiação e a área de aplicação coberta com uma camada de 1 mm da formulação dermatológica durante 20 minutos (sob condições de oclusão). Uma vez o tempo decorrido, a formulação foi removida com uma espátula e a pele limpa com algodão embebido em etanol, até que nenhum vestígio da porfirina permanece-se visível na pele e no algodão. Os tecidos foram fixados com o procedimento acima descrito e analisados por microscopia de fluorescência (Figura 6) . A Figura 6 também mostra a microscopia de fluorescência obtida através da administração transdérmica passiva com a mesma formulação dermatológica e igual tempo de incubação (sob condições oclusivas). A Figura 7 mostra os resultados de uma experiência similar mas utilizando o dispositivo do exemplo 3 e a sua análise através de microscopia confocal.

Exemplo 6

Administração transdérmica in vitro de uma proteína com um peso molecular ca. 21 kDa 34 A formulação dermatológica contendo a proteína fluorescente verde {GFP) foi preparada de igual forma ao Exemplo 5, substituindo F2TPPMet por GFP.

Esta formulação foi aplicada em amostras de pele de minipigs utilizando o dispositivo do Exemplo 1 e o protocolo do Exemplo 5, nomeadamente promovendo a administração transdérmica de GFP com 12 pulsos de laser de 50 mJ cada e com 20 minutos de tempo de incubação {sob condições de oclusão). A microscopia fluorescência e confocal representativas destas amostras de pele encontram-se na Figura 8. A administração transdérmica passiva de igual formulação dermatológica e igual tempo de incubação (sob oclusão) não leva à presença de uma quantidade mensurável de GFP na pele.

Exemplo 7

Administração transdérmica in vivo de uma porfirina com um peso molecular ca. 1 kDa

Os testes transdérmicos in vivo passivos e ativos foram realizados no dorso de minipigs. Em cada teste, a formulação dermatológica contendo a porfirina foi aplicada numa área pré-determinada pelo tempo de incubação desejado, sob condições oclusivas. Uma vez o tempo decorrido, a formulação foi removido com uma espátula e a pele limpa com algodão embebido em etanol, até que nenhum vestígio da porfirina seja visível na pele e no algodão. As amostras de pele foram cirurgicamente removidas e os animais sacrificados. A formulação dermatológica empregue foi descrita no Exemplo 5. 0 tratamento dos animais foi descrito acima. Os animais sob o efeito da anestesia encontram-se calmos, pelo que a aplicação das formulações é realizada com a mão utilizando luvas cirúrgicas. Cada aplicação da formulação cobre uma área circular de pele de aproximadamente 3 cm em diâmetro e uma espessura de 35 alguns milímetros de gel foi aplicada. 0 local de aplicação destinado à administração transdérmica passiva foi coberto um penso oclusivo. O local destinado à administração transdérmica ativa foi coberto com o dispositivo descrito no Exemplo 1 e sujeito a 12 pulsos de laser de 355 nm, com fluências de 10 mJ/cm2. O dispositivo foi retirado e uma fina camada de gel recolocada na área de aplicação e coberta com um penso oclusivo. 0 penso foi removido após 20 minutos da aplicação e o dorso do animal foi limpo. As amostras de pele foram recolhidas como descrito anteriormente em três dos minipigs. Cada amostra é aproximadamente retangular com dois cm de lado e uma espessura de 1 cm. 0 quarto minipig foi mantido vivo durante 10 dias para subsequente avaliação. Em nenhum caso, nomeadamente no animal que foi mantido vivo, foram revelados efeitos secundários derivados da utilização da formulação com e sem o tratamento laser.

Após o tratamento fixativo, cada amostra foi seccionada em lâminas para posterior avalização por microscopia de fluorescência e microscopia confocal. A Figura 9 mostra exemplos representativos de imagens obtidas por microscopia de fluorescência. Em 20 minutos, a porfirina encontra-se distribuída pela epiderme enquanto o stratum corneum se mantém intacto.

Exemplo 8

Administração transdérmica in vivo de uma proteína com um peso molecular ca. 27 kDa A formulação dermatológica empregue encontra-se descrita no Exemplo 6. O dispositivo foi descrito no Exemplo 1. O protocolo utilizado foi apresentado no Exemplo 7. O tempo de incubação após a aplicação da formulação foi mantido nos 2 0 minutos. Após o tratamento fixativo, seguiu-se a avaliação por microscopia de fluorescência que revelou a presença de GFP em várias zonas da 36 epiderme, enquanto o stratum corneum se manteve intacto, Figura 10.

Exemplo 9

Administração de genes ín vitro A prova da administração funcional in vitro de genes em células foi realizada em células COS-7 cultivadas no meio Dulbecco' s Modified Eagle Médium com 10% de soro bovino e antibióticos {penicilina/estreptomicina), numa incubadora de cultura de células a 37 °C e uma atmosfera de 5% de CO2. Ao atingir uma confluência de 90%, as células foram colhidas, semeadas em placas de cultura e incubadas a 37°C por 24 horas. Antes da aplicação das ondas de pressão nas células, uma solução aquosa do plasmídeo de DNA que codifica a GFP (gWizGFP, Aldevron, Fargo, ND) foi adicionada ao meio de cultura numa concentração de 100 pg/mL. O dispositivo do Exemplo 1 foi pressionado contra a parte traseira no poço da cultura de células e os pulsos de laser disparados por três minutos com a segunda harmónica de um laser Nd:YAG {532 nm, 10 Hz, 31 mJ/pulso) . A área irradiada foi de aproximadamente 0,57 cm2. Vinte e quatro horas depois da irradiação com o laser, a expressão de GFP nas células foi observada por microscopia de fluorescência (DMIRE200 Leica). As células também foram visualizadas usando transmissão. A Figura 12 apresenta a microscopia de fluorescência da GFP expressa em células COS-7.

Outras Realizações

As pessoas especializadas na arte reconhecem que há muitas outras maneiras de praticar esta invenção usando pulsos de laser de nanosegundos ou de picossegundos, camadas finas de materiais que absorvem intensamente a luz e formam intermediários com tempos de vida semelhantes ou mais curtos que a duração do pulso de laser, para além dos exemplos acima descritos. Os compostos 37 que podem ser entregues na pele, ou. através da pele, podem ser aplicados em formulações farmacêuticas antes ou depois da ação das ondas acústicas transitórias geradas nas finas camadas absorventes quando estas absorvem o pulso do laser. 0 confinamento e o contacto da fina camada absorvente com a pele pode ser mediado por uma variedade de materiais com impedâncias semelhantes, desde que sejam suficientemente espessos para ter rigidez mas também suficientemente finos para que a onda acústica permaneça plana. Pulsos de laser no ultravioleta, visível e infravermelho podem ser utilizados para a excitação eletrónica, vibrónica ou vibracional.

Assim, os exemplos dados não são limitativos do âmbito da invenção mas sim meras exemplificações. Portanto, o leitor deve determinar o âmbito da invenção pelas suas reivindicações e seus equivalentes legais, e não pelos exemplos dados.

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Lisboa, 12 de Março de 2014. 41

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um dispositivo para a conversão da energia de um pulso de laser (1) emitida pela respetiva fonte de laser pulsado (2) numa onda acústica transitória de impulso elevado e banda larga, especialmente capaz de aumentar a administração de pelo menos um composto numa formulação farmacêutica adequada (A) a uma barreira biológica alvo (B) , ou através dessa barreira biológica, incluindo a pele ou tecidos moles, caracterizado por: o dito pulso de laser (1) ter uma densidade de potência ótica entre 0,1 e 40 MW/cm2, e preferencialmente entre 1 e 10 MW/cm2, e o dispositivo incluir - uma camada fina (4) de um material conversor que inclui pelo menos um sistema molecular, em que esse sistema molecular absorve a maior parte da energia contida no dito pulso de laser (1) e gera uma onda acústica transitória de impulso elevado e banda larga no dito material conversor devido a expansão térmica e/ou expansão do volume estrutural e/ou fotodecomposição; - um elemento estrutural ou de ligação (6) disposto de forma a manter a dita camada fina (4) de um material conversor e preferivelmente também uma janela (3) e um elemento de suporte (5) em contacto próximo, garantindo desta forma um acoplamento acústico entre todas as três partes; - a dita fonte de laser pulsado (2) é disposta de forma a iluminar substancialmente o dito filme fino (4) de um material conversor com o dito pulso de laser (1), onde o dito pulso de laser (1) tem um comprimento de onda que é substancialmente absorvido pelo dito filme fino (4) do material conversor. 1
2. 2. Um dispositivo segundo a reivindicação 1 em que o dito filme fino (4) de um material conversor é um filme de um óxido mesoscópico nanocristalino ou de partículas de calcogénios, com uma área de superfície interna muito elevada, incorporando uma camada de pelo menos uma referência fotoacústica adsorvida às nanopartículas, caracterizado por a referida referência fotoacústica absorver a maior parte do pulso de laser (1).
3. 3. Um dispositivo segundo a reivindicação 1 em que o dito filme fino (4) de um material conversor é um filme polimérico incorporando pelo menos uma referência fotoacústica, caracterizado por a referida referência fotoacústica absorver a maior parte do pulso de laser (1).
4. 4. Um dispositivo segundo a reivindicação 1 caracterizado por o dito filme fino (4) de um material conversor é uma camada de uma solução contendo pelo menos um sistema molecular que absorve a maior parte do pulso de laser (1), e preferencialmente o solvente tem parâmetros termoelásticos elevados, pelo menos expressos pelo respectivo coeficiente de Griineisen.
5. 5. Um dispositivo segundo a reivindicação 1 caracterizado por o dito filme fino (4) de um material conversor ser um filme polimérico, preferencialmente com um limite para a ocorrência de ablação abaixo da fluência de laser de 50 mj/cm2 para lasers com pulsos de nanossegundos.
6. 6. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por: a espessura da dita camada fina (4) do material conversor situar-se entre 0,01 e 400 pm, e preferencialmente entre 0,1 e 20 pm, 2 e o dispositivo inclui uma janela (3) disposta entre a dita camada fina (4) do material conversor e a dita fonte de laser pulsado (2), onde a dita janela (3) é substancialmente rigida e substancialmente transparente ao dito pulso de laser (1) e tem uma impedância acústica que é elevada relativamente à da camada fina (4) do material conversor e confina a expansão ou projeção da dita onda acústica transitória no seu lado da dita camada fina (4) do material conversor.
7. 7. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por: a dita camada fina (4) do material conversor absorver mais de 99% do pulso de laser incidente numa profundidade inferior a 100 pm a partir da superfície do dito material conversor exposto ao dito pulso de laser (1), preferencialmente no infravermelho, que promove a excitação eletrónica e/ou vibracional e/ou rotacional na dita camada fina (4) do material conversor, e o dispositivo opcionalmente inclui a dita janela (3).
8. 8. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por a dita fonte de laser (2) gerar pulsos de laser com durações de pulso entre 0,1 e 100 ns, e preferencialmente entre 0,5 e 20 ns.
9. 9. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por a dita fonte de laser pulsado (2) gerar energias por pulso entre 0,1 e 100 mJ/cm2, e preferencialmente entre 0,5 e 50 mJ/cm2.
10. 10. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizado por adicionalmente incluir um elemento de suporte (5) colocado do outro lado da camada fina (4) do material conversor relativamente à janela (3) , especialmente colocado entre a dita camada fina (4) do material conversor e a barreira biológica alvo {B} , de forma a que o dito elemento de suporte 3 (5) evita a irradiação direta do laser, especialmente protegendo a barreira biológica alvo (B) da irradiação direta do laser, e tem uma impedância acústica pré-definida especialmente próxima da impedância acústica da dita barreira biológica alvo (B), e é preferencialmente espelhado para refletir a maior parte do pulso de laser (1) que não é absorvido pela dita camada fina (4) outra vez através da camada fina (4) e dita janela {3}, proporcionando assim uma segunda passagem do pulso de laser (1) através do dispositivo.
11. 11. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caraeterizado por a espessura do dito elemento de suporte (5}, opcionalmente espelhado, se situar entre 0,1 e 10 mm, e preferencialmente entre 0,2 e 2 mm.
12. 12. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caraeterizado por o dito elemento estrutural e/ou de ligação (6) ser um vedante ou um cimento.
13. 13. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 12 caraeterizado por adicionalmente incluir uma guia ótica (7) capaz de substancialmente dirigir o dito pulso de laser (1) da dita fonte de laser pulsado (2) para a dita camada fina (4) do material conversor, onde a dita guia ótica (7) é preferencialmente pelo menos uma fibra ótica com uma ponta acoplada à fonte de laser pulsado (2) e a outra ponta dirigida à dita janela {3).
14. 14. Um dispositivo segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caraeterizado por a dita guia ótica (7) ser movivel ou dirigida para uma ótica movivel, e dirige, através de controle externo ou remoto, incluindo por meios incorporados no elemento estrutural (6), pulsos de laser (1) sucessivos para partes mais pequenas e diferentes da camada fina (4} que absorve a maior parte do pulso de laser (1) , de tal forma que uma sequência de 4 pulsos de laser é absorvida era locais diferentes mas uma parte substancial da camada fina (4) acaba por ser irradiada. Lisboa, 12 de Março de 2014. 5