PT103495A - Formulações vesiculares contendo pró-fármacos de ácidos orgânicos, seu processo de preparação, novos pró-fármacos e composições farmacêuticas - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A FORMULAÇÕES VESICULARES CONTENDO UM PRÓ-FÁRMACO, CARACTERIZADA POR COMPREENDER AASSOCIAÇÃO DE UM PRÓ-FÁRMACO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS FRACOS, COM A FÓRMULA GERAL: R1COOH (I) OU R1SO2H (II) EM QUE R1 É PREFERIVELMENTE SELECCIONADO DE ENTRE GRUPOS CONTENDO UM ANEL AROMÁTICO BENZÉNICO, PIRIDÍNICO, PIRAZÍNICO OU PIRIMIDÍNICO OU UMA CADEIA LINEAR, SUBSTITUÍDA OU NÃO SUBSTITUÍDA, SATURADA OU NÃO SATURADA, COMO O ÁCIDO BENZÓICO, BENZENO-SUFÍNICO, CINÂMICO, SALICÍLICO, PIRAZINÓICO, NICOTÍNICO, PIRIDAZINO-CARBOXÍLICO E PIRIMIDINOCARBOXÍLICO, CAPRÓICO, CAPRÍLICO, CÁPRICO, LÁURICO, MIRÍSTICO, PALMÍTICO E ESTEÁRICO; COM UM TRANSPORTADOR VESICULAR LIPOSSÓMICO OU MICELAR, QUE PERMITEM PROTEGER O PRÓ-FÁRMACO DA DEGRADAÇÃO EM PLASMA. A INVENÇÃO REFERE-SE AINDA AO PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES LIPOSSÓMICAS, A NOVOS PRÓ-FÁRMACOS E A COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DESTINADAS A SEREM USADAS NO TRATAMENTO DA TUBERCULOSE E OUTRAS MICOBACTERIOSES.

Description

vesiculares contendo pró-fármacos de ácidos orgânicos, seu processo de preparação, novos pró-fármacos e composições farmacêuticas" A presente invenção refere-se a formulações vesiculares contendo pró-fármacos de ácidos orgânicos, seu processo de preparação e composição farmacêutica. Tais formulações permitem proteger o pró-fármaco da degradação plasmática e são úteis no tratamento da tuberculose e de outras micobacterio-ses. São conhecidos vários ácidos orgânicos com acção antimi-cobacteriana. Estes compostos apresentam frequentemente problemas de absorção ou de penetração celular que restringem muito o seu uso terapêutico. Exemplos conhecidos de tais compostos são o ácido pirazinóico, o agente activo da pira-zinamida e o ácido p-amino-salicilico.

Recentemente no pedido de patente WO2004/062607 foi também demonstrada a actividade farmacológica de uma grande variedade de outros ácidos orgânicos fracos como o ácido ben-zóico e o ácido salicilico contra estirpes de Mycobacterium tuberculosis, pelo que se torna muito importante ultrapassar os problemas referidos.

Uma alternativa que permitiria eliminar os referidos problemas farmacocinéticos dos ácidos orgânicos seria o uso de pró-fármacos dos compostos farmacologicamente activos.

Por pró-fármaco entende-se uma nova molécula obtida pela ligação de uma molécula farmacologicamente activa a uma segunda entidade química. 0 composto resultante apresenta propriedades físico-químicas distintas da molécula original. 0 pró-fármaco pode ser activo por si ou ser inactivo, tornando-se activo após quebra química ou enzimática para dar origem a uma molécula activa. Na forma de pró-fármaco, o composto pode ser absorvido, passar as barreiras necessárias e entrar nas micobactérias. Aí é activado para dar origem ao ácido orgânico que pode assim actuar no local de acção. Para serem efectivos os pró-fármacos têm neste caso de resistir ao processo de absorção e de transporte e dar origem ao a-gente activo, após activação pelas enzimas das micobactérias . A pirazinamida é um exemplo de um pró-fármaco de um ácido orgânico. Este composto permite libertar intracelularmente ácido pirazinóico depois de activado pelas micobactérias. No entanto, como a activação da pirazinamida é efectuada por uma única enzima, a pirazinamidase, é comum o aparecimento de resistências devido a mutações nas micobactérias, o que causa problemas graves na terapia.

De modo a evitar problemas de resistência como o descrito para a pirazinamida foram propostos como pró-fármacos, ésteres do ácido pirazinóico. Alguns documentos de patente revelam o interesse do uso destes compostos no tratamento da tuberculose e de outras micobacterioses. A patente US 4,962,111, de Welch, J. T. e Cynnamon, M. H., referia ésteres de ácido pirazinóico como agentes anti-tuberculose. É reivindicado o uso de ésteres de cadeia curta do ácido pirazinóico como agentes antituberculose. Contudo, os compostos reivindicados demonstraram posteriormente uma estabilidade em plasma muito reduzida (Bergmann, K.E., Cyna-mon, Μ. H., Welch, J.T., "Quantitative structure-activity relationshíps for the in vitro antimycobacterial activity of pyrazinoic acid esters", Journal úf Medicinal Chemistry, 1996, 39: 3394-3400) o que impede o seu uso devido ao facto de serem hidrolisados antes de chegarem ao local de acção. Estes autores referem que a estabilidade dos ésteres do ácido pirazinóico em plasma diminui exponencialmente com o comprimento da cadeia alcoxilica.

Também na patente US 5,643,912, dos mesmos inventores, é referido o uso de compostos do mesmo tipo para combater in-fecções de Micobacterium avium. O facto dos compostos serem lábeis em plasma impede mais uma vez a sua utilização clinica. O pedido de patente WO 2004/062607 refere-se também a um método de tratamento da tuberculose que usa ácidos orgânicos fracos ou seus precursores. No entanto não soluciona o problema da baixa estabilidade dos ésteres de ácidos orgânicos em plasma. A vantagem destes compostos pareceria evidente pois as esterases são abundantes nas micobactérias e portanto seria fácil a activação do pró-fármaco in situ. Apesar disto, tal hipótese não foi validada pelos resultados da investigação, devido ao facto de no plasma humano também existirem esterases e estas hidrolisarem o pró-fármaco antes atingir as cé-lulas-alvo, impedindo-o de actuar. É conhecido pela literatura que as experiências de administração de lipossomas e de outras formulações vesiculares a ratos conduzem a acumulação das vesículas preferencialmen- te nos órgãos ricos em células do sistema retículo endoteli-al (SRE), nomeadamente fígado, baço, medula óssea e pulmões, devido a sofrerem fagocitose pelos macrófagos aí existentes. Os macrófagos são células pertencentes ao SRE e estão na primeira linha das defesas do organismo, apresentando funções de fagocitose e destruição de corpos estranhos. 0 facto de os sistemas lipossómicos serem fagocitados pelos macrófagos permite que sejam usados para transportar fármacos para os macrófagos infectados, aumentando deste modo a concentração de fármaco nos locais que mais necessitam de tratamento. 0 problema das infecções por micobactérias prende-se com a sua capacidade de interferirem com os mecanismos bacteri-cidas dos macrófagos permanecendo no interior dos mesmos por longos períodos de tempo em estado de latência e, posterior-mente, originarem uma reinfecção. A obtenção de concentrações de fármaco intracelulares te-rapeuticamente relevantes como as conseguidas com as formulações lipossomais de fármacos é pois fundamental no tratamento destas micobacterioses. 0 principal reservatório do agente etiológico da tuberculose (M. tuberculosis) é o homem, embora em alguns casos o gado bovino (M. bovis) possa também constituir um reservatório importante. Algumas micobacterioses são específicas dos animais só afectando o homem quando este está imunodeprimi-do. As infecções por M. avium em indivíduos imunodeprimidos constituem o exemplo mais importante em termos de saúde pública deste tipo de micobacterioses.

Verificámos inesperadamente ao sintetizar ésteres de cadeia longa para incorporação em lipossomas que os mesmos não só apresentavam uma actividade antimicobacteriana elevada como ainda eram excepcionalmente estáveis a hidrólise plas-mática, especialmente após incorporação em lipossomas.De facto, a incorporação dos pró-fármacos em vesículas como li-possomas ou micelas permite proteger os compostos da hidrólise plasmática mantendo ao mesmo tempo a actividade dos mesmos. Concluímos que combinando um pró-fármaco com uma estrutura adequada com uma formulação vesicular seria possível obter um produto farmacêutico que liberta o ácido fraco no local de acção protegendo a hidrólise do pró-fármaco pelas esterases do soro. Considera-se no âmbito da presente invenção que a expressão "vesicular" abrange qualquer estrutura encerrada delimitando uma cavidade interna, habitualmente preenchida com um fluido.

Verificámos ainda, recorrendo a estudos de hidrólise de vários ésteres de ácidos orgânicos, que os ésteres do ácido benzóico com cadeias alcoxilicas longas são particularmente resistentes à hidrólise em plasma, o que revela a possibilidade de aumentar a resistência a hidrólise dos pró-fármacos de ácidos orgânicos no plasma e possibilitar assim a resolução do problema anteriormente referido. A presente invenção refere-se portanto a novas formulações vesiculares contendo pró-farmacos de ácidos orgânicos fracos associados com um transportador vesicular, seja li-possómico ou micelar, bem como ao respectivo processo de preparação, a alguns novos pró-fármacos de ácidos orgânicos fracos e a composições farmacêuticas consistindo nas formulações referidas.

Os lipossomas são sistemas vesiculares constituídos por micropartículas ou nanopartículas lipídicas. A incorporação do pró-fármaco em lipossomas permite proteger o pró-fármaco enquanto em circulação no organismo. Outros sistemas vesiculares constituídos por micropartículas ou nanopartículas, mesmo que não lipídicas, como por exemplo as microemulsões, são igualmente reivindicadas na presente invenção, pois constituem meios que permitem proteger de forma eficaz o fármaco quando em circulação. Todos estes sistemas, com particular interesse pelo micelar, têm igualmente a vantagem de serem naturalmente fagocitados pelas células do sistema reticuloendotelial e permitirem atingir uma concentração e-levada do pró-fármaco em órgãos ricos em células deste sistema .

Os pró-fármacos da presente invenção são derivados de ácidos orgânicos da fórmula geral:

RiCOOH (I) ou RíS03H (II) em que

Pq é preferivelmente seleccionado de entre grupos contendo um anel aromático benzénico, piridínico, pirazínico ou pirimi-dínico ou uma cadeia linear, substituída ou não substituída, saturada ou não saturada, como o ácido benzóico, benzeno-sufínico, cinâmico, salicílico, pirazinóico, nicotínico, pi-ridazino-carboxílico e pirimidino-carboxílico, capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico.

Tipicamente tais ácidos possuem um pKa entre 1 e 5. São itens conhecidos dos peritos na especialidade numerosos pró-fármacos de ácidos carboxílicos que podem ser usados para libertar o ácido carboxílico após activação. São exemplos os derivados ésteres, amidas e ésteres aciloxialquilicos.

Especialmente preferidos como pró-fármacos adequados para as novas formulações vesiculares são os ésteres de ácidos fracos usados nas formulações vesiculares da presente invenção, com a fórmula qeral: em que

Ri é como anteriormente definido para as fórmulas (I) e (II) acima; e R2 é seleccionado de entre um grupo aromático substituído ou não substituído, ou de cadeias alquílicas, lineares ou ramificadas, saturadas ou não saturadas.

Os substituintes preferidos para Ri são o ácido pirazi-nóico, o ácido benzóico e o ácido cinâmico e para R2 são oc-tilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo e fenilo.

Os pró-fármacos preferidos para uso nas formulações vesiculares da presente invenção são os que têm um número de á-tomos de carbono nas cadeias alcoxílicas tal que permite a obtenção para o pró-fármaco de um logaritmo do coeficiente de partilha octanol/água preferivelmente superior a 3. 0 logaritmo do coeficiente de partilha pode ser facilmente calculado por um perito na especialidade. 0 coeficiente de partilha é importante para que o pró-fármaco continue associado a parte lipofílica da vesícula e não se difunda para o meio aquoso.

Constitui também objecto da presente invenção certos novos pró-fármacos sem os inconvenientes anteriormente mencionados, como o pirazinoato de dodecilo, o pirazinoato de tetradecilo, o pirazinoato de hexadecilo,o benzoato de decilo ou o cinamato de octilo.

Devido à natureza lipofílica, os pró-fármacos dos ácidos orgânicos são especialmente apropriados para serem incorporados com elevado rendimento em lipossomas, um sistema co-loidal de transporte de fármacos, não sendo geralmente necessário efectuar a separação do fármaco não incorporado.

Tal facto constitui uma vantagem muito importante, especialmente do ponto de vista da preparação industrial.

Os pró-fármacos da presente invenção são também adequados para uso em outros sistemas coloidais de transporte de fár-macos como complexos macromoleculares, nanocápsulas, micro-esferas, e micelas. Estes sistemas coloidais possuem partículas geralmente entre 50 nm e 2 μτη de diâmetro, são biodegradáveis e não tóxicos. O sistema de transporte preferido da presente invenção é o lipossomal. Os lipossomas são formados por dispersão de fosfolípidos num meio aquoso, tendo a zona polar afinidade para a água e outras substâncias polares enquanto que a zona apoiar tem afinidade para zonas apoiares como por exemplo caudas de fosfolípidos vizinhos. Esta característica faz com que quando dispersos num excesso de água os fosfolípidos se arranjem em bicamadas. As cabeças polares ficam voltadas para o exterior onde contactam com as moléculas de água e as caudas ficam voltadas para o interior encostadas umas as outras. Os lipossomas não são mais do que vesículas formadas por uma ou mais bicamadas de fosfolípidos rodeando um espaço interno aquoso. A importância terapêutica dos lipossomas assenta na capacidade que estas vesículas têm de incorporar tanto substâncias hidrofílicas como lipofílicas. As primeiras são encapsuladas no espaço interno aquoso, enquanto que as segundas são incorporadas nas membranas lipídicas.

Dependendo do modo de preparação, os lipossomas variam consideravelmente em tamanho e no número de lamelas. De um modo geral, dizem-se vesículas unilamelares, se apenas possuem uma bicamada de fosfolípidos e vesículas multilamela-res, caso possuam várias bicamadas de fosfolípidos. Ambos os tipos de vesículas podem ser classificados de acordo com o seu diâmetro em pequenas (0.025-0.1 μπι) e grandes (> 0. lpm) . A classificação, pode também ser feita atendendo ao seu modo de preparação, o que faz surgir várias subdivisões para cada tipo de vesículas.

Os lipossomas mais comuns são as vesículas multilamelares grandes (MLV), que são constituídos por várias bicamadas de fosfolípidos envolvendo um espaço interno aquoso. Estes sistemas possuem geralmente diâmetros entre 100 nm e 4 μπι, podendo tal diâmetro ser controlado por exemplo através da passagem sob pressão por orifícios calibrados. Quando um sistema de MLV é submetido a sonicação usando uma sonda, formam-se vesículas mais pequenas, conhecidas por vesículas unilamelares pequenas (SUV) que contêm apenas uma bicamada lipídica envolvendo o espaço interno aquoso. São qeralmente utilizados na preparação dos lipossomas da presente invenção fosfolipidos, colesterol e seus derivados e outras moléculas lipídicas ou não lipídicas. Exemplos incluem os sequintes lípidos, hidroqenados ou não hidrogena-dos, isoladamente ou em mistura: fosfatidilcolina (PC) fos-fatidilglicerol (PG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoilfosfatidil-colina (DPPC), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dieste-aroilfosfatidilcolina (DSPC), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dioleilfosfatidil-glicerol (DOPG), colesterol ou seus derivados (Chol), esfin-gomielina (SM), ácido araquidónico, a esfingosina, ganglió-sidos, ceramidas, fosfatidil-inositol (PI) e ácido fosfatí-dico (PA). Pode ser adicionado material lipídico ou não li-pídico aos lipossomas, de modo a facilitar a associação dos lipossomas com as células-alvo, a internalização dos lipossomas pelos macrófagos ou até aumentar o seu tempo de meia vida em circulação. São exemplos destes compostos anticorpos, ceramidas, polietilenoglicol e lípidos conjugados com polietilenoglicol.

Micelas podem ser preparadas usando combinações de ácidos gordos com excipientes farmacêuticos surfactantes, preferivelmente polivinilpirrolidona, polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis copolímeros contendo polietilenoglicol e polipropilenoglicol, ésteres de sorbitano etoxilados, lípidos conjugados com polietilenoglicóis ou dodecilsulfato de sódio e outros compostos equivalentes.

Os pró-fármacos de ácidos carboxílicos podem ser preparados a partir desses mesmos compostos por métodos conhecidos dos técnicos na especialidade.

Os derivados ésteres podem ser obtidos, por exemplo, pela reacção de um ácido fraco com cloreto de tionilo ou com um reagente adequado para sintetizar o respectivo haleto de ácido e subsequente reacção do haleto de ácido obtido com o álcool ou fenol para produzir o pró-fármaco.

Tais derivados ésteres podem ainda ser obtidos a partir de outros grupos funcionais, por exemplo por reacção de um ácido com um álcool, em meio ácido, com rendimento adequado. Estas reacções alternativas são conhecidas e são facilmente postas em prática sem necessidade de investigação adicional .

Um processo preferido de acordo com a presente invenção para incorporação de pró-fármacos de ácidos orgânicos em li-possomas compreende a liofilização de uma solução de lipidos e pró-fármaco e posterior hidratação do liofilizado. Tal processo permite a obtenção de lipossomas estéreis, a rápida transposição para escala industrial e facilidade de preparação de uma formulação que pode ser conservada na forma lio-filizada por largos períodos de tempo antes de ser hidratada, e o seu armazenamento e distribuição naquela forma.

Em alternativa, os lipossomas podem ser obtidos adequadamente por hidratação de um filme contendo fosfolípidos e pró-fármaco.

Em resumo, um processo de preparação de uma formulação lipossomal de acordo com a invenção compreender preferivelmente os seguintes passos: a. esterificação de um ácido orgânico fraco de fórmula geral :

RiCOOH (I) ou RjW (II) em que

Ri é preferivelmente seleccionado de entre grupos contendo um anel aromático benzénico, piridínico, pirazínico ou pi-rimidínico ou uma cadeia linear, substituída ou não substituída, saturada ou não saturada, como o ácido benzóico, benzeno-sufínico, cinâmico, salicílico, pirazinóico, nico-tínico, piridazino-carboxílico e pirimidino-carboxílico, capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmíti-co e esteárico. b. obtenção de uma solução contendo os lipidos e o pró-fármaco obtido no passo a), num solvente adequado; c. remoção do solvente por evaporação ou liofilização; e b.hidratação do produto obtido.

Para a preparação de sistemas vesiculares micelares de acordo com a presente invenção utilizam-se os pró-fármacos de ácidos orgânicos em associação com transportadores micelares que compreende combinações de ácidos gordos com excipientes farmacêuticos surfactantes, preferivelmente polivinilpirrolidona, polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis copolímeros contendo polietilenoglicol e polipropilenoglicol, ésteres de sorbitano etoxilados, lípidos conjugados com polietilenoglicóis ou dodecilsulfato de sódio e outros compostos equivalentes. Não obstante, gualguer processo conhecido dos técnicos da especialidade para a preparação de sistemas vesiculares, pode ser usado, sem gue se saia do espirito e âmbito da presente invenção.

Os sistemas vesiculares da presente invenção contendo o pró-fármaco podem ser administrados por diversas vias como a intravenosa, a intramuscular, a intraperitonial ou por inalação. A actividade de pró-fármacos de ácidos orgânicos foi testada sobre micobactérias e verificámos gue os mesmos tinham uma actividade in vitro superior a do ácido orgânico original .

Confirmámos através das experiências realizadas gue a incorporação dos pró-fármacos em vesículas os protegem da degradação plasmática e da degradação por ésterases hepáticas. Por fim, usando macrófagos infectados com M. tuberculosis verificámos gue os pró-fármacos na sua forma vesicular eram activos sobre micobactérias intracelulares o gue tendo em atenção a fagocitose natural dos lipossomas por células do SRE torna os pró-fármacos lipossómicos especialmente indicados para o tratamento da tuberculose e outras micobacterio-ses. A combinação de pró-fármacos de ácidos orgânicos com um transportador vesicular que permite o aumento da estabilidade dos referidos pró-fármacos em plasma assim como a modificação da farmacocinética dos referidos compostos, o que confere a formulação características que potenciam a actividade dos compostos. Uma vez que as moléculas em questão apresentam acção contra micobactérias a formulação poderá ser usada no tratamento da tuberculose e outras micobacterioses.

Em consequência, a presente invenção tem também por ob-jecto composições farmacêuticas compreendendo uma formulação vesicular como acima definida adequada para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido orgânico fraco de fórmula geral (I) ou (II)como acima definida. A presente invenção será agora melhor descrita com referência aos desenhos anexos, nos quais: A figura IA é um gráfico mostrando claramente que o composto ç-í-3 quer na forma livre quer encapsulado em lipossomas, apresenta uma actividade antibacilar, in vivo, 5 a 10 vezes superior a da pirazinamida (PZA) e do ácido pirazinóico (P0- A figura 1B é um gráfico de barras representando os mesmos resultados da figura lã. A figura 2A mostra os resultados comparativos de vários compostos, quer na forma livre quer em lipossomas relativamente ao controlo, ao tratamento com PZA ou POA. A figura 2B mostra o efeito bactericida quer na forma livre quer na forma lipossomal de três novos compostos da presente invenção, o pirazinoato de dodecilo, o pirazinoato de tetradecilo e o pirazinoato de hexadecilo.

Igualmente, os seguintes exemplos ilustram a síntese de pró-fármacos de ácidos orgânicos, a sua preparação e a caracterização de preparações lipossómicas contendo pró-fármacos de ácidos orgânicos, a estabilidade das formulações em plasma e em homogenato de fígado e também a actividade dos pró-fármacos na forma livre e vesicular.

Exemplo 1 ~ Síntese do pirazinoato de dodecilo A 26.5 mmol de ácido pirazinóico (3,3 g) adicionaram-se 25 ml de cloreto de tionilo e aqueceu-se a solução em refluxo por duas horas tendo-se observado ao longo do tempo o a-parecimento de um tom rosado na solução, que foi progressivamente escurecendo. Evaporou-se o excesso de cloreto de tionilo e purificou-se o cloreto de ácido pirazinóico por sublimação, obtido e sob a forma de cristais pontiagudos brancos. Os cristais foram imediatamente dissolvidos em 13 ml de diclorometano e a mistura foi colocada num banho de gelo. De seguida juntaram-se 26,5 mmol de dodecanol e 3,70 ml de tri-etilamina destilada, a qual foi adicionada lentamente. A re-acção deu-se durante cerca de meia hora no banho de gelo, e prosseguiu a temperatura ambiente. Foi posteriormente aquecida em refluxo por uma hora e deixou-se durante cerca de 12 horas a temperatura ambiente. Após este tempo foi novamente aquecida em refluxo por mais 40 minutos sendo a reacção controlada por cromatografia em camada fina (TLCs) usando como eluente hexano e acetato de etilo (5:1). A mistura foi então filtrada e o filtrado foi lavado com 20 ml de água destilada e também com 20 ml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio. A solução foi tratada com sulfato de magnésio anidro e o solvente foi evaporado. O composto obtido foi purificado por duas cromatografias em coluna seguidas, usando como eluente hexano e acetato de etilo 5 : Após identificação e confirmação da estrutura por ressonância magnética nuclear (RMN) e infra-vermelho (IV), obteve-se o produto puro sob a

forma de um sólido branco com aspecto ceroso com p.f. 33-34°C sendo o rendimento final após todas as purificações 46%. V (cm'1) = 1723. A caracterização por RMN encontra-se na tabela I

Exemplo 2 - Síntese do pirazinoato de tetradecilo

Repetiu-se o processo de síntese do pirazinoato de dode-cilo de acordo com o exemplo 1, mas usaram-se 26,5 mmol de 1-tetradecanol. Para a purificação do composto por cromato-grafia em coluna, usou-se como eluente hexano e acetato de etilo (1:1). Obteve-se o produto puro sob a forma de um sólido branco com aspecto ceroso de p.f. 43-44°C sendo o rendimento final após todas as purificações de 42%. V (cm'1) = 1722. A caracterização por RMN encontra-se na tabela I.

Exemplo 3 - Síntese do pirazinoato de hexadecilo

Repetiu-se o processo de síntese do pirazinoato de dode-cilo de acordo com o exemplo 1, mas usaram-se 26.5 mmol de 1-hexadecanol. Para a purificação do composto por cromato-grafia em coluna, usou-se como eluente hexano e acetato de etilo (1:1) . Obteve-se o produto puro sob a forma de um sólido branco com aspecto ceroso de p.f. 53-54°C sendo o rendimento final após todas as purificações de 41 %-Y (cm-1) = 1723. A caracterização por RMN encontra-se na tabela I.

Exemplo 4 - Síntese de benzoato de decilo A 25 mmol de trietilamina recentemente destilada foram adicionadas a uma solução de 12 mmol de 1-decanol em 25 ml de éter etílico seco. A mistura foi colocada sob agitação e 12,8 mmol de cloreto de benzoílo foram então adicionados gota a gota. Um condensador de refluxo foi adaptado e a reac-ção foi deixada sob agitação durante duas horas. De seguida adicionou-se 30 ml água e a agitação foi mantida por mais 15 minutos. A fase etérea foi lavada com uma solução aquosa de HC1 a 5% (2x30 ml) e depois com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (2 x 30 ml) . Finalmente a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio e o solvente removido por evaporação sob vácuo. O benzoato de octilo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel usando hexano: acetato de etilo 5:2 como eluente. O produto foi obtido sob a forma de líquido incolor. O rendimento após as purificações foi de 74%.

Exemplo 5 “ Síntese de cinamato de octilo

Repetiu-se o processo de síntese do benzoato de octilo de acordo com o exemplo 4, mas usaram-se 12 mmol de- octanol que reagiu com 12,8 mmol de cloreto de cinamilo. Obteve-se um óleo com um rendimento de 71%.

Exemplo 6 " Síntese da N-tetradecilpirazinamida

Repetiu-se o processo de síntese do pirazinoato de tetracilo de acordo com o exemplo 2, mas usaram-se 26.5 minol de te-tradecilamina. Para a purificação do composto por cromato-grafia em coluna, usou-se como eluente hexano e acetato de etilo (1:1). Obteve-se o produto puro sob a forma de um sólido branco com p.f. 80-81 °C, sendo o rendimento final após todas as purificações de 28 %.

Tabela I

Desvios químicos ífe (ppm) de íl!C RMN dos ésteres derivados do ácido pirazinóico (em ClDCl-Jj. referência (CH3) 4Si) .C12- pirazinoato de dodecilo, C14 - pirazinoato de tetradecilo e C16) pirazinoato de hexadecilo Z<mp. R - -(CH2)„CH3 bu 0.81 (3H, t, J=6.6 Hz, .< 1.22- 1.40 IM. m, mm , 1.45 (2H, m, -C yH2-)' 1-84 (2H, Γ, -Cy , 4.45 (2H, t, JMM Hz, 0¾¾] 8.75 (1H, dd, J-2.4, 1.2 Hz, 8.78 (1H, d, J=2.4 Hz, 9.32 (1H, d, >1. 2 Hz, Sm 0.81 (3H, t, J= 6.6 Hz, &*»%)* 1.14-1.32 IZM* í;Sdí S'^.'íí i 1.37 (2H, m, 1-76 m, Μ1 “C;,· .7. -1 1 4.38 (2H, t, J=1, 0Hz, -OCi-ífc-) 8.67 (1H, dd, J=2.4, 1.2 Hz, 8..70 (1H, d, 9.25 (1H, d, J-1.2 Hz, -u 0.88 (3H, t, Hz, , 1.21-1.40 (57¾ m, ί 3>v:.;' Rn r 1.45 (2H, m, -CvH2~), 1.83 (21 sm, , 4.45 (2H, t, J=6.8 Hz, -dds·^-·) 8.75 (1H, dd, 0¾¾ 1.2 Hz, vWíí&i r 8.77 (1H, d, J-2.4 Hz, C«JIJ r 9.32 (1H, d, 0KL.2 Hz, CfAJ5

Tabela I (cont.)

Exemplo 7 “ Preparação de lipossomas por hidratação de um filme de lípido e fármacos.

Pesaram-se os diferentes lípidos (20 (imole) e o pró-fármaco (2 (amole), transferiram-se para um balão de fundo redondo, dissolveram-se em clorofórmio e evaporou-se o solvente orgânico num evaporador rotativo de modo a formar um filme lipídico. Secou-se o balão em bomba de vácuo para remoção de restos de clorofórmio e adicionou-se 1 ml de tampão fosfato isotónico pH ΊΛ (PBS) a uma temperatura pelo menos 10°C superior a temperatura de transição de fase (TC) dos lípidos presentes. De seguida agitou-se o balão durante cinco minutos de forma a hidratar completamente o filme lipídi-co, esperaram-se alguns minutos e voltou-se a agitar durante mais cinco minutos.

Para a determinação da eficácia de incorporação (EE), retirou-se uma aliguota da suspensão lipossomal obtida após a hidratação e outra da suspensão lipossomal obtida após centrifugação, remoção do sobrenadante e ressuspensão do sedimento em PBS no volume original que tinha antes de ser cen-trifugada. As EEs foram então calculadas como a razão entre a concentração do composto na suspensão de lipossomas res-suspendidos/concentração do composto na suspensão de lipossomas inicial. As tabelas 2a 6 mostram resultados de EE obtidos com várias formulações de diferentes pró-fármacos.

Todas as suspensões preparadas foram observadas ao microscópio óptico com contraste de fase a uma ampliação de 4 OOx.

Tabela II

Eficácia de incorporação do pirazinoato de dodecilo em lipossomas de diferentes composições lipídicas obtidos por hidratação de um filme de lípido e fármacos

Formulação lipídica EE (%) 93.1 94.7 82.7 87.0 90.2 87.2

DPPC

DMPC DMPC:DMPG (7:3) DMPC:DMPG (9:1) DPPC:DPPG (7:3) DPPC:DPPG (9:1)

Tabela III

Eficácia de incorporação do pirazinoato de tetradecilo em lipossomas de diferentes composições lipidicas

Formulação lipídica EE (%) DMPC 97 DPPC 90 DMPC:DMPG (9:1) 90.4 DMPC 91.5 DPPC 94.2 DMPC:DMPG (9:1) 76.3

Tabela IV

Eficácia de possomas de dratação de incorporação do pirazinoato de hexadecilo em li-diferentes composições lipidicas obtidos por hi-um filme de lipido e fármacos

Formulação lipídica EE (%) DMPC 95.2 DPPC 96.7 DMPC:DMPG (9:1) 97.9 DMPC 73.7 DPPC 83.9 DMPC:DMPG (9:1) 68.94

Tabela V

Eficácia de incorporação do cinamato de octilo (CO) e do benzoato de decilo (BD) em lipossomas de diferentes composições lipidicas obtidos por hidratação de um filme de lipido e fármacos

Formulação li- Composto EE (%) pídica incorporado DMPC CO 92.2 DPPC CO 94.5 DMPC BD 94.1 DPPC BD 93.4

Tabela VI

Eficácia de incorporação do tetradecilpirazinamida (A14) e hexadecilpirazinamida (A16) em lipossomas de diferentes composições lipidicas obtidos por hidratação de um filme de lipido e fármacos

Formulação li- Composto EE (%) pídica incorporado DMPC AI 4 95.2 DPPC AI 4 96.4 DMPC:DMPG 9:1 A14 98.6 DMPC A16 97.0 DPPM A16 98.1 DMPG:DMPG 9:1 A16 98.4

Exemplo õ ~ Preparação de lipossomas pelo método de hidratação de um liofilizado contendo lípidos e pró-fármaco.

Prepararam-se soluções contendo 20 μιηοΐθ de lípidos e 2 imole de pró-fármaco em 10 ml de terc-butanol que foram filtradas por filtros esterilizantes. Estas soluções foram de seguida congeladas em azoto líquido e liofilizadas durante 24 horas.

Após liofilização, as soluções, foram hidratadas por adição de 1 ml de PBS, a uma temperatura pelo menos 10°C superior a temperatura de transição de fase (TC) dos lípidos presentes usando agitação por banho de ultra sons durante dois minutos. As eficácias de incorporação (EE) foram obtidas da mesma maneira descrita para a preparação de lipossomas por hidratação de um filme lipídico e estão representadas na tabela VII.

Todas as suspensões preparadas foram observadas ao microscópio óptico com contraste de fase a uma ampliação de 400x.

Tabela VII

Eficácias de incorporação dos pirazinoato de dodecilo (C12), tetradecilo (Cu) e hexadecilo (Ciô) em lipossomas de diferentes composições lipídicas obtidos pelo método de hidratação de liofilizado contendo lípidos e pró-fármaco

Formulação li- Composto EE% pídica incorporado DMPC C12 95.6 DMPC C14 98.2 DMPC C16 97.3 DPPC C14 97.4

Exemplo comparativo - Estabilidade do pirazinoato de dodecilo, pirazinoato de tetradecilo e pirazinoato de hexadecilo na forma livre e encapsulados em lipossomas frente a plasma humano.

Para cada um dos compostos na forma livre em estudo, juntou-se num tubo de ensaio de vidro: 750 μΐ de plasma, 700 μΐ de PBS e 50 μΐ da solução mãe do composto (3,6E-3M). Os tubos de ensaio foram a incubar a 37°C com agitação, e de cinco em cinco minutos, foram retiradas alíquotas de 150 μΐ para tubos de ensaio com 600 μΐ de acetonitrilo (ACN), que foram seguidamente centrifugados. O sobrenadante foi depois retirado e injectado em HPLC. Os valores das áreas obtidas nos cromatogramas de cada composto permitiram determinar o tempo de meia-vida para cada um dos compostos.

Para os compostos na forma lipossomal juntou-se num tubo de ensaio de vidro: 750 μΐ de plasma, um volume de suspensão lipossomal que permitiu obter uma concentração final de fár-maco em cada tubo de 2E-3 M e PBS até perfazer um volume final de 3000 μΐ. Os tubos de ensaio foram incubados a 37°C com agitação e em tempos específicos foram retiradas aliquo-tas de 150 μΐ para tubos de ensaio com 600 μΐ de ACN, que foram seguidamente centrifugados. O restante procedimento foi seguido tal como no estudo da estabilidade dos fármacos na forma livre.

Tabela VIII

Comparação do tempo de meia vida em plasma de pró-fármacos na forma livre com o tempo de meia vida obtido para os mesmos pró-fármacos na forma vesicular (MLV de DMPC). C12 - pi-razinoato de dodecilo, Qú - pirazinoato de tetradecilo, Chr* pirazinoato de hexadecilo

Tempo de meia vida (min)

Composto Forma livre Forma vesicular itmo Cl 2 X5 78 ^ Λ v—·* is 158 €16 214

Estabilidade dos fármacos isolados em homogenato de figado

Para cada um dos compostos na forma livre juntou-se num tubo de ensaio de vidro: 50 μΐ de homogenato de figado de rato, 1400 μΐ de solução salina PBS e 50 μΐ da solução-mae do composto (3,6E-3M). Os tubos de ensaio foram a incubar a 37°C com agitação e de minuto em minuto foram retiradas alí-quotas de 150 μΐ para eppendorfs com 600 pl de ACN, que foram centrifugadas. O sobrenadante foi depois retirado para frascos de autosampler e injectado em HPLC para quantificação.

Para cada uma das formulações lipossomais preparadas, juntou-se num tubo de ensaio de vidro: 50 μΐ de homogenato, volume de suspensão lipossomal para uma concentração final de fármaco em cada de 2E-3 M e PBS até perfazer um volume final de 1500 μΐ. Os tubos foram incubados a 37°C e para a recolha de amostras e análise seguiu-se o mesmo procedimento elaborado no estudo da estabilidade dos fármacos lipossómi-cos em plasma.

Tabela IX

Comparação do tempo de meia vida em homogenato de figado de rato de pró-fármacos na forma livre com o tempo de meia vida obtido para os mesmos pró-fármacos na forma vesicular (MLV de DMPC). C12 - pirazinoato de dodecilo, C14 - pirazinoato de tetradecilo, C16- pirazinoato de hexadecilo

Tempo de meia vida (min) Composto Forma livre Forma lipossomal (DMPC) p.;? 2 54: 4 155 yj -x . ηη ,”·. >&· «1 >· ? V L i ** £16

Actividade 1 ~ Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI)

Foi usada a estirpe de referência Mycobacterium tubercu-losis H37Ra. Os compostos testados foram os ésteres Cu, Cu e a pirazinamida (PZA) e o ácido pirazinóico (POA). Para todos os compostos prepararam-se soluções-mãe em dimetilsul-fóxido (DMSO) com a concentração de 8 mg/ml. A concentração mínima inibitória (CMIs) foi determinada pelo método de diluições sucessivas. Utilizou-se o meio de cultura Myco (nutriente Broth- Difco, lOg/L; Middlebrook 7H9 - Difco, lOg/L, glucose, 0,05% e tween80, 0,01%) suplementado com OADC (Difco) e ajustou-se o pH a 5.5. A cada tubo de ensaio de cada galeria das várias diluições sucessivas do composto a testar, foi adicionado um volume específico do inoculo bacteriano de modo a obter 101 2 3 CFU/ml (Unidades Formadoras de Colónias-NTOs tubos foram incubados durante cerca de 21 dias a 37°C. Periodicamente controlou-se o aparecimento de turvação no tubo controlo (sem qualquer composto). Após aparecimento de turvação no controlo, registaram-se os resultados, sendo o valor de CMI a concentração mínima de composto capaz de inibir o crescimento de micobactérias (ausência total de turvação no primeiro tubo de diluição sucessiva). Os estudos foram feitos em triplicado para cada composto a testar. Como esperado a CMI para o PZA foi de XQ0*|i.§/3r&, Os resultados encontram-se na tabela X.

Tabela X

Concentrações Mínimas Inibitórias determinadas para os diferentes compostos. POA - ácido pirazinóico; PZA - pirazinami-da; Ci2~ pirazinoato de dodecilo, Cu - pirazinoato de tetra-decilo, Cm·" pirazinoato de hexadecilo

Composto CMI ίμ^/tòj POA 100-200 PZA 100-200 C12 20-40 C14 10-20 C16 20-40

Os compostos Cst# Cu e C-u apresentaram, in vitro, uma CMI cerca de 10 vezes inferior ao POA e ao PZA, com maior efeito bactericida quando em contacto directo com o bacilo da tuberculose, a um PH de 5,5. 1 - Actividade antimicobacteriana dos vários compostos na 2 sua forma livre e encapsulada usando macrófagos infectados 3 com Mycobacterivm tuberculosis.

Para avaliar a actividade antimicobacteriana usou-se uma cultura celular de macrófagos de rato - a linha celular J774.A1 aplicando os métodos convencionais (Anes e col., Nat Cell Biology, 2003) .

Resumidamente, os macrófagos foram cultivados em meio DMEM, com alta concentração de glucose, suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, em placas de cultura de tecidos com 24 poços, a 37-®C» numa atmosfera com 5% de dióxido de carbono. Quando se obteve uma confluência de cerca de 80%, as células foram infectados com M. tuberculosis H37Ra, de modo a que cada poço ficasse com um inoculo de 10E6 micobactérias/ml.

Após 3 horas de internalização nos macrófagos, espera-se obter 1 a 5 bacilos por célula infectada e um total de cerca de 10E4-5 bactérias/ml por cada poço de cultura. De seguida procedeu-se a lavagem da cultura infectada com o tampão PBS a pH 7, por três vezes de modo a eliminar todas as bactérias não internalizadas pelos macrófagos. Adicionou-se novo meio DMEM com ou sem composto a testar. 0 período de incubação de 7 dias, com renovação do meio de cultura a cada 3 dias. Os compostos foram adicionados ao fim de 3 horas de internalização, permanecendo em contacto com as células infectadas até renovação do meio DMEM.

Ao fim de 3 horas, 1 dia, 3 dias, 5 dias e de 7 dias, do início da infecção, as bactérias intracelulares foram recuperadas por lise dos macrófagos infectados com IGEPAL (Sigma) a 1% em água. A esta concentração o detergente lisa os macrófagos sem afectar a viabilidade das micobactérias.

Após diluições sucessivas deste lisado em água, as bactérias sobreviventes foram cultivadas em meio Middleebrook 7H10, suplementado com OADC da Difco e, após incubação a 37¾ durante cerca de 2 semanas, procedeu-se a contagem das Unidades Formadoras de Colónias (CFUs). Cada ensaio foi feito em triplicado em experiências independentes.

Comparando com o controlo, ou com tratamento com PZA ou POA, a figura IA mostra claramente que o composto C12 quer na forma livre quer encapsulado em lipossomas, apresenta uma actividade antibacilar, in vivo, 5 a 10 vezes superior. Esse efeito é mais exacerbado ao fim de 7 dias de infecção em que nos primeiros 3 casos as bactérias retomam capacidade de se replicarem intracelularmente enquanto nos compostos com C12 se observa uma latência. Na figura 1B representando os mesmos resultados em gráfico de barras o efeito dos compostos com C12 torna-se ainda mais evidente. A encapsulação em lipossomas aumenta em cerca de 50% o efeito bactericida, rela- tivamente ao C12 na forma livre, não se observando, contudo uma diferença significativa entre a formulação DPPC e a DMPC. Na figura 2A apresentam-se os resultados comparativos com todos os compostos, quer na forma livre quer em liposso-mas relativamente ao controlo, ao tratamento com PZA ou POA. Qualquer dos pró-fármacos foi mais bactericida, quer na forma livre quer encapsuladas que o pró-fármaco de referência. Entre os 3 novos compostos o C12 foi o que apresentou maior efeito bactericida quer na forma livre quer na forma lipos-somal (Figura 2B).

Lisboa, 31 de Maio de 2007

Claims (18)

1. Formulação vesicular contendo um pró-fármaco, caracterizada por compreender a associação de um pró-fármaco de ácidos orgânicos fracos, com a fórmula geral: RiCOOH (I) ou RsSCIíH (II) em que Ri é preferivelmente seleccionado de entre grupos contendo um anel aromático benzénico, piridínico, pirazínico ou pirimidí-nico ou uma cadeia linear, substituída ou não substituída, saturada ou não saturada, como o ácido benzóico, benzeno-sufínico, cinâmico, salicílico, pirazinóico, nicotínico, piri-dazino-carboxílico e pirimidino-carboxílico, capróico, caprí-lico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico; com um transportador vesicular lipossómico ou micelar.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o pró-fármaco ser um derivado éster de ácidos orgânicos fracos de fórmula geral: um em que Ri é como anteriormente definido para a reivindicação 1; e R2 é seleccionado de entre um grupo aromático substituído ou não substituído, ou de cadeias alquílicas, lineares ou ramificadas, saturadas ou não saturadas.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por Rl ser preferivelmente ácido pirazinóico, ácido benzóico ou ácido cinâmico.

4. Formulação de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por R2 ser preferivelmente seleccionado de entre o grupo octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo ou feni-lo.

5. Formulação de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada por o pró-fármaco ser preferivelmente pirazinoato de dodecilo.

6. Formulação de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizada por ser o pró-fármaco ser preferivelmente pirazinoato de tetradecilo. i'S* *$5'

7. Formulação de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracteri-zada por o pró-fármaco ser preferivelmente pirazinoato de he-xadecilo.

8. Formulação de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracte-rizada por o pró-fármaco ser preferivelmente benzoato de deci-lo.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracteri-zada por o pró-fármaco ser preferivelmente cinamato de octilo.

10. Formulação de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracte-rizada por o pró-fármaco possuir preferivelmente um logaritmo do coeficiente de partilha octanol/água (log P) superior a 3.0.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 1 a 10, caracteri-zada pelo facto de o transportador vesicular incluir pelo menos um lípido, hidrogenado ou não hidrogenado, ou uma mistura de lipidos, seleccionados de entre: fosfatidilcolina, fosfati-dilglicerol, dimiristoilf osfati- dilglicerol, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfati-dilglicerol, diestearoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfati-dilglicerol, dioleilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilglice-rol, colesterol ou seus derivados, esfingomielina, ácido ara-quidónico, esfingosina, gangliósidos, ceramidas, fosfatidili-nositol e ácido fosfatidico.

12. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada a formulação vesicular lipossomal estar na forma liofilizada ou hidratada.

13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto de o transportador micelar compreender ainda combinações de ácidos gordos com excipientes farmacêuticos surfactantes, preferivelmente polivinilpirroli-dona, polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis copolimeros contendo polietilenoglicol e polipropilenoglicol, ésteres de sorbitano etoxilados, lipidos conjugados com polietilenoglicóis ou dodecilsulfato de sódio.

14. Formulação de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o transportador vesicular compreender ainda outras moléculas neutras ou carregadas de natureza não lipidica ou não surfactante.

15. Processo de preparação de uma formulação lipossomal de a-cordo com as reivindicações 1 a 12 e 14, caracterizado por compreender os seguintes passos: a. esterificação de um ácido orgânico fraco de fórmula geral: RiCOOH (I) ou (II) em que Ri Θ preferivelmente seleccionado de entre grupos contendo um anel aromático benzénico, piridínico, pirazinico ou pirimidí-nico ou uma cadeia linear, substituída ou não substituída, saturada ou não saturada, como o ácido benzóico, benzeno-sufínico, cinâmico, salicílico, pirazinóico, nicotínico, piri-dazino-carboxílico e pirimidino-carboxílico, capróico, caprí-lico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico. b. obtenção de uma solução contendo os lípidos e o pró-fármaco obtido no passo a), num solvente adequado; c. remoção do solvente por evaporação ou liofilização; e d. hidratação do produto obtido.

16. Pró-fármaco éster de álcoois ou fenóis de ácidos orgânicos, com a fórmula geral: R' iCOOR' 2 (V) ou RNStWz (VI) em que R'i é preferivelmente seleccionado de entre os grupos contendo um anel aromático benzénico ou pirazinico; e t.;f£ é seleccionado de entre o grupo octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo ou fenilo.

17. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação anterior, ca-racterizada por o pró-fármaco ser preferivelmente o pirazinoa-to de dodecilo, o pirazinoato de tetradecilo, o pirazinoato de hexadecilo, o benzoato de decilo ou o cinamato de octilo.

18. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma formulação vesicular de acordo com as reivindicações 5 a 14 adequada para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido orgânico fraco de formula geral (I) ou (II), para o tratamento de micobacterioses em particular da Tuberculose . Lisboa, 6 de Agosto de 2007