BR102022005943A2 - Vesículas lipossomais contendo fluopsina c para liberação controlada em tratamento de doenças infecciosas - Google Patents
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Abstract
vesículas lipossomais contendo fluopsina c para liberação controlada em tratamento de doenças infecciosas. a presente invenção descreve quatro variações de vesículas lipossomais com fluopsinac, que compreendem, numa proporção de 1:1mm, fluopsina c e lipídeos, sendo essesselecionados dentre colesterol, fosfatidilcolina de soja (spc) e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (dspe-peg), e, alternativamente, possuir dimetilsulfóxido (dmso) e tampão fosfato (0,1m, ph 7,4) em sua composição, que podem ser tanto injetáveis ou aplicadas de forma dermatológica. para tanto, as vesículas pleiteadas são obtidas a partir da encapsulação da fluopsina c em vesículas lipossomas convencionais e de circulação prolongada, visando à redução da toxicidade deste composto, assim como, aprimorar sua biodisponibilidade sanguínea, mantendo sua atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas de importância clínica.
Description
[001] Trata a presente solicitação de patente de invenção de “VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS”, vesículas lipossomais com fluopsina C (LFc) que podem ser tanto injetáveis ou aplicadas de forma dermatológica e que são obtidas a partir da encapsulação da fluopsina C em vesículas lipossomas convencionais e de circulação prolongada, visando à redução da toxicidade do agente ativo, assim como, aprimorar sua biodisponibilidade sanguínea, mantendo sua atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas de importância clínica.
[002] A presente invenção pertence à seção de necessidades humanas ao campo de preparações para finalidades médicas, mais especificamente, ao campo de preparações caracterizadas por formas físicas especiais, por se tratar de vesículas lipossomais, obtidas a partir da encapsulação da fluopsina C em vesículas lipossomas convencionais.
[003] Os antimicrobianos constituem uma das ferramentas mais poderosas no combate às infecções, envolvendo não só a medicina humana, mas também a veterinária. Entretanto, estamos vivendo uma era da resistência, com microrganismos resistentes às múltiplas drogas (do inglês, multidrug-resistent, MDR). Os MDR dão origem a infecções intratáveis com aumento dos custos econômicos com o tratamento, assistência médica e investimentos na área da saúde. Os microrganismos MDR são responsáveis, a cada ano, por mais de 2,8 milhões de infecções nos Estados Unidos da América (EUA), com cerca de 35 mil mortes apenas nos EUA, totalizando por volta de 50 mil mortes quando dados da Europa são incluídos (LAWS et al., 2019: Antibiotic resistance breakers: current approaches and future directions). A América do Norte tende a apresentar menor mortalidade, uma vez que o atendimento médico e disponibilidade financeira para uso da terapia combinada são melhores em comparação com demais países (LAWS, et al., 2019; XU, et al., 2017: Systematic review and meta-analysis of mortality of patients infected with carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae). Para diversos países do mundo esses custos são extremamente inviáveis, tornando os níveis de resistência antimicrobiana ainda mais elevados (LAWS, et al., 2019; SAVOLDI et al., 2019: Gross national income and antibiotic resistance in invasive isolates: analysis of the top-ranked antibiotic-resistant bacteria on the 2017 WHO priority list). Na América Latina, por exemplo, e outros países mais pobres, a tendência é um quadro ainda mais grave de infecções MDR, devido às altas taxas de resistência antimicrobiana (LAWS, et al., 2019).
[004] Dentre as infecções causadas por microrganismos MDR, o levantamento realizado globalmente pela Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou a família Enterobacteriaceae resistentes a carbapenêmicos (CRE), incluindo Klebsiella pneumoniae como grau crítico. Staphylococcus aureus, também está incluída na lista de prioridades da OMS, como nível de prioridade alto, tanto quanto as cepas resistentes à meticilina como as resistentes ou intermediárias à vancomicina (World Health Organization, 2017: Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics). Também entre os microrganismos em prioridade alta, se encontram diversas cepas, sendo alvo da presente invenção os microrganismos S. aureus tanto resistente a meticilina (MRSA) como resistente à vancomicina (VRSA e VISA, respectivamente) (World Health Organization, 2017). Como grau de prioridade média, se classificam Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e Shigella spp, respectivamente resistentes à penicilina, ampicilina e fluoroquinolona (World Health Organization, 2017).
[005] Apesar disso, poucos antimicrobianos estão em fase de desenvolvimento contra microrganismos MDR, onde muitos consistem apenas em combinações entre antimicrobianos já comercializados, inibidores de β-lactamases (JACOBS, et al., 2017: Triple combination antibiotic therapy for carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae: a systematic review; SHEU, et al., 2019: Infections Caused by Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae: An Update on Therapeutic Options) ou tentativas de aumento das doses dos fármacos já utilizados para melhorar a taxa de sucesso do tratamento (SHEU, et al., 2019).
[006] Frente ao crescente aumento da resistência aos antimicrobianos por parte dos microrganismos MDR, juntamente as limitações nas opções de tratamentos, pesquisas tem avaliado a atividade antimicrobiana de diversos compostos de origem microbiana. Entre eles, a Fluopsina C mostrou alta atividade inibitória contra cepas clínicas multirresistentes tanto in vitro como in vivo (NAVARRO, et al., 2019: Fluopsin C for Treating Multidrug-Resistant Infections: In Vitro Activity Against Clinically Important Strains and In Vivo Efficacy Against Carbapenemase-Producing Klebsiella pneumoniae; KERBAUY, et al., 2016). Além disso, foi observada baixa frequência de indução de mutantes resistentes ao composto, assim como considerável eficácia no tratamento contra biofilmes bacterianos (KERBAUY, et al., 2016: Effect of a metalloantibiotic produced by Pseudomonas aeruginosa on Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)-producing). Mais recentemente, análises microscópicas mostraram que a Fluopsina C tem sua ação primária na membrana citoplasmática de bactérias Gram- positivas e Gram-negativas, com efeito secundário no septo de divisão celular (NAVARRO, et al., 2020: Determining the Targets of Fluopsin C Action on GramNegative and Gram-Positive Bacteria).
[007] Navarro e colaboradores (2019) afirmaram que a Fluopsina C é um composto promissor para controle de MDR Gram-negativos e Gram-positivos, embora não possam ser ignoradas as toxicidades proporcionadas com seu uso. Outro fator apontado pelos autores é a baixa biodisponibilidade da Fluopsina C no sangue, sendo que o composto não foi detectado nos tempos analisados, havendo também necessidade de melhoria da biodisponibilidade sanguínea da Fluopsina C. Porém, Sharma (2020: Fluopsin C: a potential candidate against the deadly drug-resistant microbial infections in humans) apontou diversos antimicrobianos comercializados que apresentam citotoxicidade baixa e moderada e continuam sendo essenciais para o combate a infecções por MDR. Nesse sentido, a Fluopsina C pode ser uma nova molécula terapêutica contra os microrganismos MDR.
[008] Uma alternativa para diminuir a citotoxicidade e melhorar sua biodisponibilidade é o uso do encapsulamento em lipossomas para liberação controlada do fármaco. Essa técnica vem sendo utilizada na área médica e farmacológica, pois contorna diversas propriedades físico-químicas limitantes dos antimicrobianos, superando as limitações da terapia convencional. Assim, os lipossomas permitem o aumento da biodisponibilidade sem o aumento da concentração do composto ativo assim como a redução de suas toxicidades local e sistêmica (BULBAKE, et al., 2017: Liposomal formulations in clinical use: an updated review). Suas principais vantagens consistem na maior segurança farmacoterapêutica e farmacocinética, além do menor índice de toxicidade local e sistêmica, maior eficácia de seletividade ao alvo e menor tempo de tratamento, o que ocorre em virtude da liberação sustentada do composto ativo na corrente sanguínea, mantendo a concentração deste dentro da faixa terapêutica por um tempo prolongado. Essas vantagens reduzem os custos e garantem melhor qualidade de vida aos pacientes (DRULIS-KAWA, et al., 2010: Liposomes as delivery systems for antibiotics; MACHADO, et al., 2007: Lipossomas aplicados em farmacologia: uma revisão da literatura).
[009] Devido a suas notáveis atividades antimicrobianas, a presente invenção refere-se ao encapsulamento da Fluopsina C em lipossomas, o qual foi realizado, visando à redução da toxicidade do composto, assim como, aprimorar sua biodisponibilidade sanguínea, mantendo sua atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas de importância clínica com vistas a se tornar um potencial produto comercial.
[010] A Fluopsina C encapsulada em lipossomas supera o problema de insolubilidade do fármaco quando administrado por via intravenosa ou tópica. A principal vantagem da Fluopsina C encapsulado em lipossoma é que a distribuição do fármaco nos tecidos é aumentada resultando em maior eficácia terapêutica e redução dos efeitos colaterais tóxicos do fármaco, resolvendo, portanto, os problemas atualmente identificados no estado da técnica.
[011] No atual estado da técnica, estão presentes diversas anterioridades que descrevem o uso de lipossomas como carreadores de fármacos, visto sua importante ação para sistemas de liberação controlada de ativos. Também se encontram alguns documentos que se referem às ações antimicrobianas e antifúngicas de Fluopsina C, bem como sua obtenção. Entretanto, nenhuma das anterioridades descreve vesículas lipossomais contendo fluopsina C para liberação controlada em tratamento de doenças infecciosas, as quais possibilitam a redução da toxicidade e a melhoria da biodisponibilidade do fármaco, conforme observado na presente invenção.
[012] A anterioridade US10533018B2, intitulada "Antimicrobial prochelators to target drug-resistant bacteria and methods of making and using the same", descreve uma pró- droga antibacteriana que tem como alvo bactérias resistentes a antibióticos. O pró- fármaco requer ativação por uma enzima, como enzimas β-lactamase bacterianas, que seletivamente convertem um prochelator de ligação não tóxico e não metálico em um agente quelante de metal tóxico que aproveita a metalobiologia ao longo da interface patógeno-hospedeiro para exacerbar a morte bacteriana.
[013] A anterioridade WO2004050095A1, intitulada "Use of a known substance for the treatment of cancer and bacterial and fungal infections", refere-se a uma entidade química previamente conhecida, Fluopsina C, e seu uso como um agente para o tratamento de câncer e infecções bacterianas e fúngicas, bem como dois novos isolados bacterianos de Pseudomonas sp., que produzem Fluopsina C. A invenção também se refere a composições farmacêuticas e métodos para o tratamento de câncer e infecções bacterianas e fúngicas com Fluopsina C.
[014] A anterioridade BRPI0809164B1, intitulada "Composição para administração tópica e composição farmacêutica compreendendo a referida composição", refere-se a composições para a administração de agentes bioativos lipofílicos a um indivíduo, cujos agentes bioativos lipofílicos podem ser liberados por qualquer via de administração. Em formas de realização, o agente bioativo lipofílico pode estar contido em lipossomas. Assim, a composição descrita compreende: um concentrado lipossômico em combinação com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável possuindo pelo menos um melhorador de permeação, que é o etoxidiglicol; em que o concentrado lipossômico compreende: um fosfolipídeo selecionado a partir do grupo que consiste em lecitina, lisolecitina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidil glicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, ácido lisofosfatídico, lisofosfatidilserina, PEG- fosfatidiletanolamina, PVP- fosfatidiletanolamina, e combinações dos mesmos; pelo menos um agente bioativo lipofílico, que é a Coenzima Q10; e pelo menos um solubilizante; e em que a composição compreende Coenzima Q10 em uma quantidade de 1,25% em peso a 5% em peso da composição e etoxidiglicol em uma quantidade de 2% em peso a 8% em peso da composição.
[015] A anterioridade WO2013131164A1, intitulada "Composição farmacêutica contendo lipossomas convencionais e lipossomas de circulação prolongada para o tratamento da leishmaniose visceral", refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento da leishmaniose visceral caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e de lipossomas de circulação prolongada como sistema entregador de fármacos leishmanicidas. Essa composição pode ser utilizada no preparo de um medicamento para o tratamento das leishmanioses, podendo ser administrada por via intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. O uso desse sistema permite que a droga atinja com eficiência todos os sítios de infecção pelo parasito, sendo que os lipossomas peguilados promovem o direcionamento mais efetivo de fármacos leishmanicidas para a medula óssea e o baço, enquanto lipossomas convencionais atuam no direcionamento do fármaco para o fígado.
[016] A anterioridade PT1443900E, intitulada "Composições de veículo lipídico com estabilidade melhorada no sangue", refere-se a composições lisossômicas possuindo um tempo de vida longo em circulação. Estes lipossomas incluem a incorporação de lipídeos negativamente carregados que não incluem zwiteriões. Para tanto, os lipossomas compreendem ao menos um agente biologicamente ativo em que os referidos lipossomas possuem um diâmetro médio entre 80-200 nm +/- 25 nm; e possuem uma temperatura de transição (Tc) de, pelo menos, 38 °C, (a) em que a(s) bicamada(s) ordenadas dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lipídeos que formam vesículas, que são fosfolipídeos ou esfingolipídeos; (ii) pelo menos 1% molar de um ou mais ácidos fosfáticos cada um acoplado a uma unidade não-zwiteriônica que é um álcool, um ácido, uma cetona, um éster, um éter, uma amida, um aldeído, um ciclitol ou um sacarídeo; (iii) 5% molar a menos do que 20% molar de colesterol; ou (b) em que as bicamada(s) ordenadas dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lipídeos que formam vesículas, que são fosfolipídeos ou esfingolipídeos; 1 (ii) pelo menos 1% molar de ácido fosfático acoplado a uma unidade não-zwiteriônica; (iii) 5% a menos do que 10% de colesterol; e em que em l(a) e 1(b), o referido agente biologicamente ativo está associado com as bicamada(s) ordenada(s) ou está encapsulado num espaço aquoso definido pelas referidas bicamada(s) ordenada(s).
[017] A anterioridade PT2299977E, intitulada "Lipossomas para distribuição de fármacos e métodos para preparação destes", proporciona lipossomas que são úteis para distribuição de agentes bioativos, tais como produtos terapêuticos, que compreendem entre 25% e 45% (mol/mol) de um lipídeo aniônico, menos de 10% de colesterol (mol/mol) e um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em agentes antitumorais de molécula pequena, antibióticos, antifúngicos, e agentes anti-inflamatórios em que o lipossoma foi exposto a um cátion bivalente a uma concentração entre 0,1 mM e 1 mM.
[018] A anterioridade PT1781255E, intitulada "Composições e métodos para tratamento da leucemia", refere-se a métodos e composições para o tratamento de uma neoplasia num mamífero e, em particular, a formulações farmacológicas lipossomais para o tratamento da leucemia, as quais compreendem o alcaloide da vinca vincristina, encapsulado em lipossomas, em combinação com dexametasona.
[019] Ainda que estejam presentes no atual estado da técnica diversas anterioridades que se referem a lipossomas contendo ativos de interesse médico, nenhuma delas antecipa a presente invenção, cujas vesículas lipossomais contendo Fluopsina C possuem estabilidade satisfatória, alta solubilidade e biodisponibilidade, com atividade antimicrobiana semelhante ao ativo livre, porém com reduzida citotoxicidade e maior concentração no sítio ativo de ação. Assim, a presente invenção contribui positivamente com o atual estado da técnica, ao viabilizar o uso de Fluopsina C lipossomal para o controle de infecções causadas por cepas bacterianas de importância clínica.
[020] A presente invenção tem como objetivo disponibilizar vesículas lipossomais contendo Fluopsina C com alta eficiência terapêutica, liberação controlada e efeitos colaterais reduzidos.
[021] A presente invenção descreve quatro variações de vesículas lipossomais com fluopsina C, que compreendem, numa proporção de 1:1mM, Fluopsina C e lipídeos, os quais são selecionados dentre colesterol, fosfatidilcolina de soja (SPC) e 1,2-Distearoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG) e que podem ser tanto injetáveis ou aplicadas de forma dermatológica. Para tanto, as vesículas pleiteadas são obtidas a partir da encapsulação da fluopsina C em vesículas lipossomas convencionais e de circulação prolongada, visando à redução da toxicidade deste composto, assim como, aprimorar sua biodisponibilidade sanguínea, mantendo sua atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas de importância clínica.
[022] A presente invenção apresenta como principais vantagens: ✓ Disponibilizar vesículas lipossomais contendo fluopsina C que apresentam satisfatória estabilidade físico-química; ✓ Disponibilizar vesículas lipossomais contendo fluopsina C que promovem aumento da solubilidade e biodisponibilidade do fármaco; ✓ Disponibilizar vesículas lipossomais contendo fluopsina C que possui atividade antimicrobiana semelhante à do fármaco livre; ✓ Disponibilizar vesículas lipossomais contendo fluopsina C com liberação controlada e citotoxicidade reduzida nos testes in vitro, e com capacidade de manter a Fluopsina C por mais tempo e em maior concentração no sítio ativo de ação.
[023] A fim de possibilitar melhor o entendimento da presente invenção, serão feitas referências às figuras descritas a seguir: ✓ FIG. 1: Morfologia das formulações lipossomais e seus controles por Microscopia Eletrônica de Varredura em aumento do 30000x. Onde: A. DSPE- PEG DMSO. B. SPC DMSO. C. DSPE-PEG DMSO+F. D. SPC DMSO+F; ✓ FIG. 2: Curva de liberação da Fluopsina C livre e lipossomal in vitro utilizando células de Franz. Medidas em milimolar (mM), pelo tempo, em horas; ✓ FIG. 3: Viabilidade celular de células LLC-MK2 analisadas pelo método de redução do MTT em presença de diferentes concentrações de Fluopsina C livre e formulações lipossomais em relação ao controle de células não tratadas. Onde: A. DSPE-PEG DMSO. B. SPC DMSO. C. DSPE-PEG DMSO+F. D. SPC DMSO+F. E. Fluopsina C livre. C, controle de células não tratadas; ** p < 0,01; **** p < 0,0001.
[024] As vesículas lipossomais contendo fluopsina C para liberação controlada em tratamento de doenças infecciosas, com tamanhos entre 0,8 e 0,08 μm são disponibilizadas em quatro variações, as quais se constituem de Fluopsina C e lipídeos, numa proporção de 1:1 mM; sendo os lipídeos selecionados dentre colesterol, fosfatidilcolina de soja (SPC) e 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG); e, alternativamente, possuir Dimetilsulfóxido (DMSO) e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4) em sua composição, sendo: ✓ Variação 1 (DSPE-PEG+F): fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,54 mM; colesterol, numa concentração de 0,41 mM; 1,2-Distearoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG), numa concentração de 0,05 mM; e Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 100% do volume de Fluopsina C; ✓ Variação 2 (DSPE-PEG DMSO+F): fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,54 mM; colesterol, numa concentração de 0,41 mM; 1,2- Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG), numa concentração de 0,05 mM; Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; dimetilsulfóxido (DMSO), numa proporção de 10% do volume de Fluopsina C; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 90% do volume de Fluopsina C; ✓ Variação 3 (SPC/F): fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,7 mM; colesterol, numa concentração de 0,3 mM; Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 100% do volume de Fluopsina C; ✓ Variação 4 (SPC/DMSO/F): fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,7 mM; colesterol, numa concentração de 0,3 mM; Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; dimetilsulfóxido (DMSO), numa proporção de 10% do volume de Fluopsina C; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 90% do volume de Fluopsina C.
[025] As quatro variações lipossomais produzidas são descritas na Tabela 1, sendo que todas tiveram a proporção entre lipídios e Fluopsina C mantidas em 1:1 mM. Além das variações, também foram produzidas variações controle, sem o composto ativo (DSPE- PEG DMSO, DSPE-PEG, SPC DMSO, SPC). Para tanto, alíquotas foram retiradas de uma solução de clorofórmio estoque de cada lipídio de acordo com a concentração descrita na Tabela 1. As amostras foram levadas ao fluxo de N2 para evaporação do solvente, dando origem ao filme lipídico (HUA, et al., 2013: The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies). As amostras DSPE-PEG/DMSO/F e SPC/DMSO/F tiveram a Fluopsina C inicialmente diluída em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e em seguida adicionado 90% de tampão fosfato (0,1M, pH 7,4) para dar origem a suspensão da emulsão e incorporação passiva da Fluopsina C. As demais amostras (DSPE-PEG/F e SPC/F) tiveram incorporação ativa da Fluopsina C adicionado durante o processo de formação do filme lipídico. Após a formação deste, foi adicionado tampão fosfato para dar origem as vesículas lipossomais multilamelares.
[026] Após ressuspensas, as amostras foram homogeneizadas em vórtex entre 1 e 30 minutos e sonicadas também entre 1 e 30 minutos, formando vesículas lipossomais. Após, as vesículas lipossomais foram extrusadas em Mini Extrusor (Avanti Polar Lipids, Inc.) com membranas de policarbonato com poros 0,4 μm. Tabela 1: Composição das formulações lipossomais (mM): fosfatidilcolina de soja (SPC), 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG), Dimetilsulfóxido (DMSO).
[027] Para determinação da eficiência da encapsulação, as amostras lipossomais passaram pelo processo de ultracentrifugação, em centrífuga Minispin com o uso de filtros (Amicon Ultra 0,5mL Ultracel 10K Regenerated Cellulose 10.000 NMVVL). A eficiência de encapsulação Fluopsina C (EE%) foi obtida de acordo com a equação:
Tabela 2: Eficiência de encapsulação média (EE%) para as diferentes formulações lipossomais.
[028] A caracterização dos lipossomas foi realizada pela medição do Potencial Zeta (PZ), Índice De Polidispersão (PDI), diâmetro hidrodinâmico lipossomal. O diâmetro médio dos lipossomas foi determinado utilizando o espalhamento dinâmico de luz (do inglês, Dynamic Light Scattering ou DLS) assim como para medidas de PDI e PZ foram realizados utilizando o analisador de partículas NanoPlus (Micromeritics Instrument Corporation, EUA). As análises de PZ, PDI e diâmetro lipossomal foram realizadas em dois momentos, considerando tempo 0 (logo após a produção) e com 90 dias de armazenamento, sendo que o armazenamento sob refrigeração a 4°C foi analisado com lipossomas em solução e liofilizados.
Tabela 3: Caracterização físico-química das formulações lipossomais. Dados obtidos de diâmetro hidrodinâmico (nm), Potencial Zeta (PZ, em mV) e Índice de Polidispersão (PDI) médios para cada formulação em diferentes condições de armazenamento e tempo.
[029] As quatro variações de vesículas lipossomais contendo Fluopsina C e seus respectivos controles foram fixados e analisados em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) (Fig. 1) para verificar a morfologia das vesículas. Observa-se que houve alto grau de deformidade para as amostras lipossomais controles (Fig. 1, A e B), enquanto as amostras de Fluopsina C lipossomal apresentaram formato esférico com grande uniformidade morfológica, principalmente em DSPE-PEG DMSO+F (Fig. 1 C), com tamanhos condizentes com a caracterização química.
[030] Testes de liberação da Fluopsina C livre e lipossomal foram determinados para as melhores formulações obtidas nos testes anteriores (Fig. 2). Foram utilizadas células de Franz, preenchidas com tampão fosfato (pH 7,4 a 0,1 M) acrescido de 10% de DMSO em constante agitação, mantida em banho termostatizado na temperatura de 37°C, garantindo condições sink. Em geral, os testes mostraram diminuição na liberação da Fluopsina C encapsuladas em relação ao ativo livre.
[031] Testes de determinação da citotoxicidade da Fluopsina C lipossomal in vitro também foram realizados. Em semelhança ao realizado por Navarro (2019: Fluopsin C for Treating Multidrug-Resistant Infections: In Vitro Activity Against Clinically Important Strains and In Vivo Efficacy Against Carbapenemase-Producing Klebsiella pneumoniae) e Kerbauy (2016: Effect of a metalloantibiotic produced by Pseudomonas aeruginosa on Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)-producing), a linhagem de células LLC- MK2 foi cultivada em uma placa de 96 poços em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino, a uma densidade de 2,5 x 104 células/poço e incubada por 24 horas a 37°C em atmosfera de CO2 a 5%. Com 100% de confluência, as células não aderentes, em suspensão, foram removidas por lavagem com Tampão fosfato-salino esterilizado (0,1M, pH 7,2). Assim, as amostras lipossomais foram submetidas à diluição seriada com meio RPMI, de 32 μg/mL a 0,25 μg/mL, e foram incubadas por 24 horas nas mesmas condições anteriores, assim como seus devidos controles lipossomais. A viabilidade celular foi determinada pelo método de redução de MTT (brometo de dimetiltiazol difenil tetrazólio) de acordo com a recomendação do fabricante. Para interpretação dos resultados, foi utilizado o método de regressão não linear, para verificação da concentração citotóxica de 50% e 90% para 24 horas (CC50/24h e CC90/24hs, respectivamente).
[032] A citotoxicidade em células LLC-MK2 foi obtida tanto para a Fluopsina C livre como para as formulações lipossomais SPC DMSO+F (variação 4) e DSPE-PEG DMSO+F (variação 2) e seus respectivos controles, SPC DMSO e DSPE-PEG DMSO, onde os dados são apresentados na Figura 3 e Tabela 4.
[033] Através dos testes ANOVA e múltiplas variáveis de Dunnett’s obteve-se os gráficos exibidos na Figura 3 para as amostras analisadas. A tendência observada nos gráficos foi condizente com a análise por regressão não linear.
[034] Pelos cálculos de regressão podemos observar que DSPE-PEG DMSO+F (variação 2) reduziu em 54% e 48% a toxicidade em CC50 e CC90, respectivamente, em relação à Fluopsina C livre (Tabela 4). Enquanto SPC DMSO+F (variação 4) obteve redução de 69% e 88% da citotoxicidade em CC50 e CC90, respectivamente, também em relação à Fluopsina C livre.
[035] A amostra lipossomal controle DSPE-PEG DMSO não afetou significativamente a viabilidade das células, mesmo na maior concentração testada, 100% das células estavam viáveis.
Tabela 4: Concentrações citotóxicas de 50% (CC50) e 90% (CC90) em 24 horas para as amostras analisadas in vitro utilizando células LLC-MK2 de acordo com o teste MTT.
[036] Testes para determinação da concentração inibitório e bactericida mínima da Fluopsina C livre e lipossomal foram realizados. A concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) foram determinadas com as formulações lipossomais que foram mais efetivas nos testes anteriores. Uma curva de dose- resposta foi elaborada de 13,3 μg/mL a 0,2 μg/mL contra Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 e Staphylococcus aureus N-315, sendo realizadas comparações com seus devidos controles lipossomais e Fluopsina C livre. Os testes CIM e CBM foram realizados pelo método de microdiluição em caldo MHB e MHA (Mueller-Hinton caldo e ágar, respectivamente) segundo as normas do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012) em semelhança a Navarro e colaboradores (2019).
[037] A Fluopsina C apresentou atividade antibacteriana para as cepas Gram-negativa e Gram-positiva testadas. Os valores de CIM e CBM testados foram iguais para cada cepa e em todas as apresentações da Fluopsina C. Assim, valores de CIM e CBM de 1,66 μg/ml e 0,41 μg/ml foram detectados para K. pneumoniae ATCC 10031 e S. aureus N-315, respectivamente.
[038] Os resultados mostraram que as vesículas lipossomais DSPE-PEG DMSO+F (Variação 2) além de satisfatória estabilidade físico-química apresenta atividade antimicrobiana semelhante ao composto livre frente às cepas K. pneumoniae ATCC 10031 e S. aureus N-315, com vantagens quanto à liberação controlada e citotoxicidade reduzida nos testes in vitro.
[039] Dessa forma, as vesículas lipossomais contendo Fluopsina C representam uma excelente alternativa para emprego do composto antimicrobiano, no controle de infecções causadas por cepas bacterianas de importância clínica, podendo ser injetáveis, administradas pelas vias intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou venosa; ou aplicadas de forma dermatológica para liberação controlada de Fluopsina C.
Claims (8)
1. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS caracterizadas por se constituírem de Fluopsina C e lipídeos, numa proporção de 1:1 mM; sendo os lipídeos selecionados dentre colesterol, fosfatidilcolina de soja (SPC) e 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG); e, alternativamente, possuir Dimetilsulfóxido (DMSO) e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4) em sua composição.
2. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por possuírem tamanho entre 0,8 e 0,08μm.
3. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, na variação 1 (DSPE-PEG+F), serem caracterizadas por compreenderem fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,54 mM; colesterol, numa concentração de 0,41 mM; 1,2- Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE-PEG), numa concentração de 0,05 mM; e Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 100% do volume de Fluopsina C.
4. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, na variação 2 (DSPE-PEG DMSO+F), serem caracterizadas por compreenderem fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,54 mM; colesterol, numa concentração de 0,41 mM; 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina polietilenoglicol 2000 (DSPE- PEG), numa concentração de 0,05 mM; Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; dimetilsulfóxido (DMSO), numa proporção de 10% do volume de Fluopsina C; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 90% do volume de Fluopsina C.
5. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, variação 3 (SPC/F), serem caracterizadas por compreenderem fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,7 mM; colesterol, numa concentração de 0,3 mM; Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 100% do volume de Fluopsina C.
6. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, variação 4 (SPC/DMSO/F), serem caracterizadas por compreenderem fosfatidilcolina de soja (SPC), numa concentração de 0,7 mM; colesterol, numa concentração de 0,3 mM; Fluopsina C, numa concentração de 1 mM; dimetilsulfóxido (DMSO), numa proporção de 10% do volume de Fluopsina C; e tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), numa proporção de 90% do volume de Fluopsina C.
7. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas por serem injetáveis ou aplicadas de forma dermatológica para liberação controlada de Fluopsina C.
8. VESÍCULAS LIPOSSOMAIS CONTENDO FLUOPSINA C PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadas por serem administradas pelas vias intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou venosa.
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