Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego, srodka, przeciw kokcydiozie charak¬ teryzujacego sie niska toksycznoscia.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie no¬ we pochodne monoeteru i monotioeteru antybio¬ tyku A2041, o wzorze 1, w którym Me oznacza metyl Y oznacza atom tlenu lub siarki, R ozna¬ cza grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, grupe alkoksyalkilowa o 1—4 atomach wegla w reszcie alkoksylowej i 2—5 atomach wegla w reszcie al¬ kilowej, grupe aJkoksykarlbonyloalkilowa o 1—4 atomach wegla w reszcie alkoksylowej i 2—5 ato¬ mach wegla w reszcie alkilowej, grupe aminoal- kilowa o 2—5 atomach wegla, hydroksyalkilowa, cMorowcoalkilowa lufo grupe o wzorze /R7m-fe- nylo/CHj/n-, w którym R' oznacza grupe alkilo¬ wa o 1—4 atomach wegla, m oznacza liczbe 0—2, a n oznacza liczbe 0—8 oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole kationowe. • Nowe pochodne A2041 o wzorze 1 wyltwairza sie na drodze reakcji antybiotyku A2041 o wzorze 2 lub jego soli ze zwiazkiem eteryfikujacym po¬ chodzacym z odpowiadajacego pierwszorzejdowego alkoholu lub tiolu o wzorze HYR, w którym Y i R maja wyzej podane znaczenie. Reakcje pro¬ wadzi sie w obecnosci rozpuszczalnika, w tempe¬ raturze pokojowej a takze wyzszej.Antybiotyk A2041 i jego sole opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 765 236.Strukture antybiotyku A2041 wyznaczono meto¬ dami dyfrakcji rentgenowskiej. (Noe! D. Janes, Michael G. Chancy, James W Chamiberliin), Ro¬ bert L. Ha/miil i isue Chen, J. Amer. Ohem. Soc, 96 3399—3400 (1973)). Strukture te przedstawia wzór 2.Okreslenie grupa alkilowa i alkoksylowa ozna- czaja rodniki alkilowe i alkoksylowe, zarówno- o 19 96940: i ¦ 3 lancuchu prostym jaik i rozgalezionym. Okres¬ lenie grupa hydroksyalkilowa oznacza grupe jed- nohydrioksyalkilowa o 2—5 atomach wegla, lub w przypadku gdy Y oznacza atom tlenu, grupe 2,3Hdwuhydroksyptropylowa-l.Okreslenie grupa chlorowcxalkiilowa oznacza grupe alkilowa o 2—5 atenach wegla, podstawio¬ na 1^3 atomami chlorowca, takimi jak broim, chlor i fluor. Gdy grupa alkilowa jest podsta¬ wiona dwoma lub trzema atomami chlorowca, wówczas podstawniki te musza byc takie same.Dopuszczalne fizjologicznie sole kationowe sa sOlaimfi utworzonymi z kationów, które nie zwie¬ kszaja toksycznosci zwiazku jako calosci w sto¬ sunku dc- zwierzat cieplokrwistych. Poza tym cha¬ rakter kationu tworzacego sól nie ma istotnego znaiczienla, chociaz w pewnych przypadkach moz¬ na wybrac taki, który wykazuje pewne szczegól¬ ne zalety; jak rozpuszczalnosc lub latwosc kry¬ stalizacji. Przykladami odpowiednich kationów sa kationy metali alkalicznych, jak sodu, potasu i litu, metaM ziem alkalicznych, jak iwapnia, (magnezu i strontu, metali ciezkich jak miedzi i cynku; onaz kation amonowy.Dla uproszczenia wyrazenie pochodna A2041 o- znacza pochodna A2041 zdefiniowana powyzej.Przy uzyciu pewnych wyjsciowych alkoholi lub tioM korzysitne moze byc dodanie kwasowego ka¬ talizatora w celu przyspieszenia reakcji. D|. od¬ powiednich katalizatorów nalezy kwas chiorowo- dbirowy, kwas siarkowy, kwas nadchlorowy, kwas metanosuilfonowy, kwas benzenosullifionowy, kwas toluenosaiilfonowy, dwutlenek selenu i trójifiluorek boru.Dla ulatwienia reakcji mozna dodac rozpuszczal¬ nik, taki jak woda, aceton, benzen, eter, cztero- hydrofuran luib dioksan. Reakcje przeprowadza sie w temperaturze pokojowej, chociaz mozna stoso¬ wac wyzsza temperature.Mimo iz wystarczaja zwykle metody obróbki, niekiedy w celu uzyskania zwiazku o wzorze 1 moze byc wymagane dodatkowe oczyszczenie.Oczyszczenie takie mozna .przeprowadzac dobrze znanymi sposobami, t na przylklad na drodze chro- maitografdi kolumnowej, chromatografii cienko¬ warstwowej, krystalizacji i innymi metodami. Do odpowiednich adsorbentów dla rozdzielania chro¬ matograficznego naleza zel krzemionkowy, tlenek glinowy, FloniB«il (nazwa firmowa krzemianu mag¬ nezu produkcji Moridia Co.), wegiel i zywice jo¬ nowymienne.Korzystnymi pochodnymi A2041 sa te zwiazki o wzorze 1, w których Y oznacza atom tlenu, a R oznacza grupe ailkilowa o 1—6 atomach wegla.Pochodne te wytwarza sie w reakcji A2041, z al¬ koholami,, które sa na ogól latwiej dostepne i tan¬ sze niz wyjsciowe alkohole lub tMe uzywane przy wytwarzaniu innych zwiajzków o wzorze 1.Nowe pochodne A2041 o wzorze 1 sa srodkami bakterioibójczymi, przy czym korzystnie stosuje sie je Jako skuteczne srodki przeciw kokcydiozie. Po¬ chodne A2041 sa skujtecznymi srodkami profilak¬ tycznymi i leczniczymi w przypadku kokcydiozy, zwlaszcza u drobiu. Pochodne A2041 o wzorze 1 sa mniej toksyczne niz antybiotyk A2041 o wzo¬ rze 2. Wiele sposród pochodnych A2041 wykazuje równiez dzialanie roztoczobójaze i insektoibójcze, a ponadto zwieksza wspólczynnik przyswajania pa¬ szy przez przezuwacze.Korzystnie, nowe pochodne o wzorze 1 stosuje sie w postaci srodków, które zawieraja aktywny zwiazek A2041 calkowicie zdyspergowany lub zmie¬ szany z jadalnym, obojetnym, stalym nosnikiem lub rozcienczalnikiem, w celu uzyskania wstepnej mieszanki lub dodatku do paszy. Obojetny nosnik lub rozpuszczalnik stanowi substancja, która nie reaguje z pochodna A2041. Nosnik lub rozcien¬ czalnik korzystnie jest lub' moze byc skladnikiem paszy.Korzystne srodki sa mieszankami paszowymi, w których pochodna A2041 o wzorze 1 Wystepuje w stosunkowo duzych ilosciach. Srodki te dodaje sie do paszy drobiu bezposrednio lub po etapie rozcienczania lub mieszania. Przykladami nosni- ków lub rozpuszczalników odpowiednich dla mie¬ szanek sa skladniki paszy zwierzecej, takie jak^ wysuszone ziarna po destylacji, mielone ziarna sojowe, granulki lucerny, sruta pszeniczna, macz¬ ka- glutenu kukurydzy, pozbawione lisci rosliny wodne, maczka kukurydziana, maczka cytrusowa, resztki po fermentacja, mielone skorupy ostryg, glinka atapulgowa, nadziarno pszenicy, rozpusz¬ czalne skladniki melasy, maczka kaczanów kuku¬ rydzy, jadalne substancje warzywne, maczka z prazonej luskanej soi, pasza sojowa, sojowa macz¬ ka paszowa, grzybnie antybiotyków, grysy sojowe, kaolin, talk i mielony wapien. Korzystnymi roz- icienczalnilkami sa produkty sojowe, takie jak mie¬ lone ziarna sojowe i pasza sojowa, produkty lu- cerny, takie jak granulki lucerny oraz produkty (kukurydziane, takie jak maczka glutenu kukury¬ dzy i grysy kukurydziane, Kompozycje przygotowuje sie przez dokladne zmieszanie lub rozproszenie pochodnej A2041 o 40 wzorze 1 w istalyim obojetnym nosniku, w sposób taki jak scieranie, mieszanie, mielenie lub bebnor- wanie. W pewnych przypadkach pochodna A2041 imozna absorbowac na nosniku przez rozpylanie jej roztworu w obrotowym mlynie zawierajacym 45 roztienczalnik. Przez dobranie odpowiednich roz- cienczalników oraz zmiane stosunku ilosci nosnika do substancji czynnej mozna wytwarzac srodki o dowolnym a zadanym stezeniu. t Mieszanki paszowe wytwarza sie w taki sposób, 50 ze substancja aktywna wystepuje w nich w ilosci —00% wagowych, zas rozpuszczalnik lub nosnik wystepuje odpowiednio w zakresie 05—20% wa¬ gowych mieszanki. Najkorzystniejszy stosunek wy¬ nosi okolo 40% wagowych pochodnej A2041 do 55 okolo 60% wagowych rozcienczalnika. Mieszanki mozna nastepnie rozcienczac dodatkiem do pa¬ szy lub podawac je bezposrednio do paszy dla • zwierzat w celu uzyskania odpowiedniej paszy zawierajacej lekarstwo, która moga jesc zwierzeta. 60 Mieszanke rozcienczona dodatkiem pozywienia mozna dalej rozcienczyc substancjami, takimi jak maczka kukurydziana lub maczka sojowa przed wprowadzeniem do paszy zwierzat. Rozcienczenie moze równiez ulatwic równomierne rozprowadze- 65 nie substancji akjtywnej w gotowej paszy. Gotowa 5 96940 6 pas*za jest taka, która zawiera tluszcze, proteiny, weglowodory, mineraly, witaminy i inne skladni¬ ki pozywienia.Przy stosowaniu profilaktycznym, stosunkowo nasika zawartosc pochodnej A2041 o wzorze 1 w paszy drobiu wystarcza do uzyskania dobrej o- chirony drobiu przed kokcydioza. Na przyklad nie¬ toksyczna ilosc pochodnej A2041 podaje sie kur¬ czetom, najkorzystniej droga pokairmowa codzien¬ nie w ilosci okolo 0,001—0,05*/o dziennego spozy¬ cia pozywienda, korzystniej w ilosci 0,0025^0,01%.Najkorzystniejsza dawka bedzie oczywiscie zmie¬ niac sie w za1eznosci od okolicznosai, takich jak * rodzaj i nasilenie zakazertia kokicydiowegp, które ma byc leczone, dzienne spozycie paszy przez ptalkii i inne warunki. Przed padaniem ptactwu pozywienia zawierajacego lekarstwo', mieszanke rozprowadza sie równomiernie w paszy na drodze mieszania.Przy podawaniu pochodnej A2041 o wzorze 1, kuirczaki broilefów karmi sie pozywieniem zawie¬ rajacym pochodna A2041 od pierwszego' dnia zy¬ cia. TV samo stosuje sie dla broilerów i innych kurczaków hodowanych na mieso, jak równiez dla inwentarza zapasowego stada niosek lub stada zairodowegb •broilerów. Inwentarz zapasowy sta¬ da niosek karmi sie pasza lecznicza minimum przez 14—2i2 tygodni.Pochodna A2041 lub jej sól mozna równiez do¬ dawac bezposrednio do podstawowego pozywienia* które moze zawierac nastepujace skladniki: od¬ padki miesa i kosci, Witamine B12, maczke dro¬ biowa, maczke z luskanej soi, maczke z wysuszo¬ nej lucerny, maczke z glutenu kukurydzy, sprosz¬ kowany owies, mielony jeczmien, maczke kukury¬ dziana, srute pszeniczna, suszone ziarna i rozpusz¬ czalne skladniki po fermentacji serwatki, hydro- ksyanalog soli wapniowej metioniny, ryboiflawine, pantotenian wapnia, chlorek choliny, niacyne, tluszcz zwierzecy, dwusiarczek sodowy menadionu, dodatek witaminy E, butyiowanx hydroksytoduen, paOimiltynian wiltaminy A, deaktywowany sterol zwierzecy, weglan wapnia, odfluorowany fosforan, chlorek sodu, jodan wapnia, tlenek manganu, tle- 40 nek cynku, wodiorotlenek kobaltowy i weglan ko¬ baltu.Do podstawowej dziennej racji kompozycji pa¬ szy dodaje sie pochodna A2041 w ilosci okolo 0,001—0,05% wagowych ostatecznej mieszaniny.Skladniki sa starannie mieszane, aby kurczeta dostawaly odpowiednie ilosci skladników.Dzialanie przeciw koksydiozie pochodnych A2041 jest zilustrowane zwalczaniem przez rózne zwiazki infekcji wywolanych przez pojedyncze gatunki Ei- meroa taneilla, Eimeriia necatrix, Eimeria mivati i Eimeria brunetti oraz iniekcje wywolana przez rózne gatunki Eimeria maxiima i Eimeria tenella u kurczat. W badaniach tydh, grupy piecdu sied¬ miodniowych kurczat karmiono pasza zawierajaca równomiernie rozproszona pochodna A2041. Po 48 godzinach tej diety, kazdego ptaka zakazono za- rodndkucjacymi oocytamd badanych gatunków Ei- merii.Inne grupy pieciu siedmiodniowych kurczaków karmiono pasza, która nie zawierala pochodnej A2041. Pewne z tych grup zakazono równiez Ei¬ meria po 46 godzinach i uzywano je jako zainfe- ktowane grupy kontrolne. Inne z tych grup nie zostaly zainfekowane Eimeria i spelnialy zadania niezaifli/fekowanych grup kontrolnych. Wyniki oce¬ niano w siedem dni po zaszczepieniu.Ptaki wazono, zabijano i badano zmiany cho¬ robowe w wyniku kokcydiozy. Wielkosc zmian chorobowych w wyniku kokcydiozy wyrazano w skali dowolnej, od zera (brak sladów kokcydiozy) do czterech (maksymalne zmiany patologiczne dla danej badanej Eimerii). Procentowe zmniejszenie zmiiam chorobowych obliczono przez odejmowanie srednich zmian w grupie leczonej od srednich zmian w zainfekowanej grupie kontrolnej, dziele¬ nie tej róznicy przez srednia zmian chorobowych w zainfekowanej grupie kontrolnej i mnozenie u- zyskanej sumy przez 100.Procentowy zysk wagi obliczono traktujac zysk wagi normalnej grupy kontrolnej jako 100 pro¬ cent.Wyniki tych badan przedstawiono w tablicach 1—5.Tatoario a 1 (tekst 1) Skutecznosc pochodnych A2041 przeciwko Eimeria tenella u broilerów Eter A2041 * Metyflowy Etylowy Zainfekowana grupa /kontrolna Nielzaindiekowana grujpa kontrolna Procentowa zaiwairtOisc w paszy 0,005 0,00165 0,005 0,00165 _ . — Procentowa smiertelnosc2 0 0 45 — Procentowy zysk Wagi 98 95 95 • 88 83 100 Sredniife zmiany chorobowe w zoladku 0,1 3,7 0£ 2,4 4/) — Procentowe zmniejszenie zmian chorobowych 98 95 40 —96940 7 8 Tablica 1 (tekst 2) Skutecznosc pochodnych A2041 przeciwko Eimeria tenella u broilerów Eter A20411 N-propyilowy Izopropylowy Metoksyetyllowy ZaiiTifiekowania grupa ktoffitrolna Niezaliinfekowana grupa kontrolna Procentowa zawartosc w paszy l! 4 0^0025 0,0025 — Procentowa smiertelnosc2 0 0 0 0 — Procentowy zysk wagi 06 87 05 00 55 100 Srednie zmiany chorobowe w zolajdlkiu 0 1,8 2,3 2,9 3,6 — Procentowe zimniejlszeriie zmian diiotobowych 100 50 <40 <40 — — 1 Trzy grupy po piec ptaków karmiono pasza z lekarstwem; cztery grupy po piec ptaków jako kontrolna grupa zainfekowana 2 Wskutek kokcydiozy Tablica 2 Skutecznosc pochodnych A2041 przeciwko Eimeria necatrix u broilerów Eter A20411 i N^propylowy Metylowy Zainfekowana giriupa kontrolna . Zainfekowana grupa kontrolna Procentowa zawartosc w paszy 0,01 0,005 0,0025 0,02 0,01 — " Procentowa smiertelnosc2 0 6,7 0 6,7 26,7 85 " Procentowy zysk wagi 89 92 63 95 40 18 100 Srednie zmiany choro-bowe w jelicie 0 0,2 1,6 0,67 2,5 3,9 7 Procentowe zmniejszenie zmian chorobowych 100 05 59 I 83 — 1 Trzy grupy po piec ptaków karmiono pasza z lekarstwem i cztery grupy po piec ptaków stanowily grupe kontrolna 2 Wskutek kokcydiowy Pochodne A2041 o wzorze 1 zapewniaja równiez poprawe wspólczynnika przyswajalnosci paszy przez przezuwacze, które maja rozwiniete dziab¬ nie pierwszego zoladka. Mlode przezuwacze, glów¬ nie te nieodstawione od piersi, sa zwierzetami monogastryiciznyimi. Gdy mlode przezuwacze za¬ czynaja zywic sie pozywieniem stalym, zaczyna sie równiez rozwijac dzialanie pierwszego zolad¬ ka, przy czym powieksza sie flora bakteryjna pierwszego zoladka. Gdy zwierze zywi sie pasza stala przez jakis czas, dzialanie jego pierwszego zoladka osiaga pelen rozwój i zachowuje to dzia¬ lanie przez cale zycie zwierzecia. Wsród waznych z punktu widzenia gospodarki zwierzat przezuwa¬ jacych znajduje sie bydlo, owce i kozy.Pochodne A2041 o wzorze 1 zwykle zwiekszaja wspólczynnik przyswajalnosci paszy gdy ^podaje 50 55 sie je przezuwaczom doustnie w ilosci okolo 0,25— —il2,5 mg/kg/dzien. Najkorzystniejsze wyniki uzy¬ skuje sie przy stosowaniu 0,5—7,4 mg^kg/dzden.Korzystnym sposoibem podawania zwiazków o wzo¬ rze 1 jest mieszanie ich z pasza zwierzat, jednakze mozna je podawac w inny sposób, na przyklad ja¬ ko pastylki wlewajac wprost do gardla, duze pi¬ gulki lub kapsulki. Dawki w róznych postaciach oporzadza sie siposobami dobrze znanymi w wete¬ rynarii. Kazda indywidualna dawka powinna za¬ wierac zwiazek o wzorze 1 w ilosci bezposrednio zwiazanej z wlasciwa dzienna dawka dla zwie¬ rzecia, któremu sie ja podaje.Zdolnosc zwiazków o wzorze 1 do zwiekszenia wspólczynnika przyswajalnosci paszy przez prze¬ zuwacze uwidoczniono przykladowo w nastepu¬ jacym badaniu w zywym organizmie:96940 9 10 Tablica 3 Skutecznosc pochodnych A2041 przeciwko Eimeria mivati u broilerów {— Eter A20411 Etylowy Metylowy N-propylowy Zainfekowana grupa komfcrolina Niezainfekowana gruipa kontrolna Froioentowa zawairtosc w paszy 0,02 0,01 0,005 0,02 0,01 0,005 0,01 0,005 0,0025 — — Procentowa smiertelnosc 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Procentowy zysk wagi 79 99 103 103 94 70 98 97 94 44 100 Srednie zmiany chorobowe w jelicie 0 0 0 0 0,27 1,0 0 0 0,27 1,75 — Procentowe zmniejszenie zmian chorobowych 100 100 100 100 85 43 100 100 85 — — 1 Cztery grupy ipo ipiec ptaków 2 Wskutek kokcydiozy T flbli ca 4 Skutecznosc pochodnych A2041 przeciwko Eimeria brunetti u broilerów Eter A2041 * Metylowy N^propylowy Zainfekowana grupa kontrolna • Niiiezalirufekowana grupa kontrolina Procentowa ¦zawairtoisc w paszy 0,02 0,01 0,005 0,01 0,005 0,0025 — — Procentowa smiertelnosc2 0 0 0 0 0 0 0 0 K Procentowy zysk wagi 83 74 70 89 89 95 51 100 Srednie zmiany chorobowe 0 0 0,87 0 0 0,80 0,85 — Procentowe zmniejszenie zimian chorobowych .100 100 — 100 100 — — 1 Cztery grupy ipo- ipiec ptaków 2 Wskutek kokcydiozy Plyn z pierwszego zoladka mlodego wolu uzy¬ skano przy uzyciu rurki chirurgicznie umieszczo¬ nej w pierwszym zoladku. Mlodego wolu karmio¬ no pasza bogata w ziarno, o nastepujacym skla¬ dzie: 69,95% grubo mielone ziarno ,00% mielone kaczany kukurydzy 8,00% maczka sojowa (50% protein) ,00% maczka lucerny ,00% melasa 0,60% mocznik 55 65 0,50% fosforan dwuwapniowy 0,50% weglan wapnia 0,30% sól 0,07% mieszanka witamin A i D2* 0,05% mieszanka witaminy E** 0,03% mieszanka sladowa mineralów*** 1 Zawierajaca w 454 g: 2 000 000 jedn. witaminy A, 227 200 jedn. witaminy D| oraz 385,7 g paszy sojowej z dodatkiem l«/i oleju; ** wysuszone ziarna po destylacji kukurydzy z substan¬ cjami rozpuszczalnymi zawierajace 20 000 jedn. octanu d- -alfa-tokoferylu na 450 g; *** zawierajaca tlenek manganowy, jodek potasu, weglan kobaltu, tlenek miedzi i siarczan cynkowy.96940 11 12 Tablica 5 Skutecznosc pochodnych A2041 przeciwko lacznej infekcji Eimeria maxima i Eimeria tenella u broilerów Eter A2041* Metyflowy .N-ipropylowy Zainfekowana grupakontrolna Niezafiinifiekolwaina grupa kontrolna Procentowa izawartoisc wpaiszy 0,0(2 0,01 0,005 0,01 0,005 0,0025 — Procentowa smiertel- nosc2 0 6,7 0 0 0 0 " " Procentowy zysikwaigi 98 82 68 98 96 94 /1 100 Zimliany chorobowe w jeOiiiciie srednie zamiany chorobowe 0 0,07 0,07 0 0,07 0,13 0,79 procentowe zonlniieljisze- niie zmflan chorobo¬ wych 100 91 91 1:00 91 84 — " Zimliany chorobowe w zoladku srednie zmiany chorobowe 0,2 2,87 3,47 0 0,07 2,67 3,3 " procentowe zmniejsze¬ nie! zmlian chorobo¬ wych 94 — — 100 98 — — 1 Trzy grupy ,po piec ptaków karmiono pasza z lekarstwem; cztery grupy po piec ptaków jako kontrolna girupa izainfekftbwana 2 Wskutek kokcydiiozy Próbke cieczy z pierwszego zoladka odicedzono przez cztery warstwy materialu do odciskania se-' rów i zebrano przesacz. Substancje stala, zatrzy¬ mana przez material rozprowadzono ponownie w dostatecznej objetosci buforu fizjologicznego, by uzyskala oryginalna objejtosc plynu zoladkowego i zawiesine te ponownie odcedzono. Uzyty bufor wedlug artykulu Cheng i inni w J. Daky Sei. 38, 1225—1230 (1955) ma nastepujacy sklad: g/litr skladnik 0,316 Na2HP04 0,152 KH2P04 2,260 NaHC03 0,375 KC1 0,375 NaCL 0,112 MgS04 0,050 CaCl2-2H20 0,008 FeS04-7H20 0,004 MnS04-H20 0,004 ZnS04-711*0 0,002 CuS04-5H20 0,001 CoCljj-eHgO Oba przesacze polaczono i pozostawdiono, az na powierzchni wydzielila sie substancja stala. Od¬ dzielono czysta warstwe, rozcienczono tym samym bufotrem (1 :1), uregulowano pH do wartosci 6,8— —7,0.Rozcienczony plyn zoladkowy (10 ml) umiesz¬ czono iw kolibie o (pojemnosci 25 iml z 40 rang wspo¬ mnianej paszy, dodatkowymi 5 mg bialka sojo¬ wego i badanym zwiazkiem. W kazdym badaniu uzywano cztery identyczne kolby. Stosowano rów¬ niez dwie grupy po cztery kolby porównawcze.Prowadzono kontrole w czasie zerowym i kontrole po 16 godzinach inkubacji. Wszystkie kolby za¬ wierajace substancje badana inkubowano w tem¬ peraturze 38PC w ciagu 16 godzin. Po inkubacji mierzono pH i dodano do kazdej kolby 2 ml 25 procentowego kwasu metafosforowegoi. Pozostawio¬ no próbki do ustania sie i substancje znad roz¬ tworu analizowano w chromatografie gazowym poszukujac zwiazków propionianu, octanu i mas- 40 lamu. Zwiazki aktywne wydatnie zwiekszaja wy¬ twarzanie propionianu w porównaniu z próbkami kontrolnymi.Wyniki uzyskane dla badanych zwiazków po^ równano statystycznie z wynikami kontrolnymi. 45 W tablicy 6 podano stosunek stezen lotnego kwasu tluszczowego (VFA) w kolibach zawierajacych ba¬ dane zwiazki oraz w kolbach kontrolnych.Pewne pochodne A2041 sa równiez substancja¬ mi insektobójczyimi i roztoczobójczymi. Na pr.zy- 50 klad eter metylowy i eter etylowy, jak równiez inne pochodne eterowe A2041 sa substancjami wy¬ kazujacymi aktywnosc w zwalczaniu owadów ta¬ kich jak Prodenia eridania i mucha domowa oraz przeciwko roztoczom, gdy stosuje sie je w ilosciach 55 równiez niskich, jak 1000 ppm, a takze sa aktyw¬ ne przeciwko larwom komarów, gdy stosuje sie je w ilosci zaledwie 20 ppm.Pochodne A2041 Oi wzorze 1 hamuja równiez wzrost innych organizmów patogennych. Na przy- 60 klad zarówno eter etylowy, jak i metylowy A2041 ham/uja rozwój Baccilus subtilis i Myctobacterium avium w stezeniu zaledwie 0,5 mikrogramatal.Pochodne A2041 o wzorze 1 sa mniej toksyczne niz antybiotyk A2041 o wzorze 2. Ostra toksycz- 65 nosc antybiotyku A2041 dla myszy, przy podawa-96940 13 U Tablica 6 Zwiekszenie wspólczynnika przyswajalnosci paszy pod dzialaniem pochodnych A2041 Pochodne A2041 Eter /metylowy Eter etyloiwy Plyn zoladkowy rozcdenozfony Hig/iml ,00 1,00 0,25 ,00 1,00 0,25 Octan 0,04 1,00 0,92 0,97 0,88 0,87 Piropioindan 1,91 1.14 1,00 1,73 lv02 1,08 Maslltan 055 0,77 1,03 0,63 1,20 1,24 Calkowita zawartosc VFA 0,81 1,15 0,03 0,85 0,77 0,73 niiu doustnym i wyrazona jako LD50, wystepuje przy 10 imig/kg. Ostre toksycznosci róznych po¬ chodnych A2041, przy podaniu doustnym, wyra¬ zone jako LD50 wystepuja u myszy przy nastepu¬ jacych ilosciach: Pochodna A2041 LD60/mg/kg/ eter metylowy 43+8 i 70±10 eter etylowy 113130 eter n^propylowy 38+6 eter izopropylowy 20—36 Porównanie dzialania eteru n^propyloweigo A2041 z dzialaniem antybiotyku A2041 w badaniach kar- miemia szczurów przynosi daUsze dowody zalet po¬ chodnych A2041. W badaniach tych piec szczurów kazdej plci badaino w oiagu 14 dni dla kazdej daw¬ ki. Srednie zmiany wagi dala i srednie ilosci przy¬ jetego pokarmu obliczono dla kazdej grupy. Po¬ równanie wyników tych badan podaino w taiblicy 7.Ponizsze przyklady objasniaja sposób wytwarza¬ nia zwiazków o wzorze 1.Przyklad I. Sól sodowa antybiotyku A2041 dodano 500 ml wody. Waartosc pH tego roztworu wyregulowano do 3,0 pnzez dodanie 6 normalnego kwasu chlorowodorowego. Uzyskany roztwór mie¬ szano przez godzine, a nastepnie ekstrahowano ta¬ ka saima objetoscia dilorofiormu. Uzyskamy eiksitrakt chloroformu odparowano w prózni do uzyskania substancji suchej.Uzyskana pozostalosc rozpuszczono w 10 ml mie- 45 50 szaminy benzenu i octanu etylu (7:3) i ten roz¬ twór poddano chromatogiraifLi w kolumnie 2—X61 — om z zelem krzemianowym (Woetei). Wymywanie badano metoda chromatografii cienkowarstwowej.Frakcje zawierajace eter metylowy A2041 polaczo¬ no i odjparowano do sucha pod próznia. Pochodna eteru metylowego A2041 (1,4 g) krystalizowano z roztworu metanolu i wody. Uzysikany zwliazek posiada temperature topnienia 115—117°C, (a)25D+ +75,00 (c=l, CR&H); pK'a (66% wodny roztwór o^umetyloformamadu) 7,1.Analiza. Obliczono dla wzoru: C5oH8(,017 (procent): C, 62,61; H, 9,04; O, 28,35.Znaleziono (•/•): C, 63,88; H, 8,07; O, 27,66.Wielkosci Rf dla pochodnej eteru metylowego A2o£l podano w przykladzie X.Przyklad II. Antybiotyk 2041 w formie kwa^ sowej <400 mg) rozpuszczono w metanolu (10 ml) i dodiano 5 ml wody. Po odstaniu w dajgu 1 godzi¬ ny roztwór odparowano pod próznia. Uzyskana pozostalosc poddano chromatografii w sposób opi¬ sany w przykladnie I w oelu uzyskania eteru me¬ tylowego A2041.Przyklad III. Sposoibem z przykladu II przy uzyciu odpowiedniego ailkoholiu pieriwsizorzedoiwieigo, uzyskano nastepujace pochodne A2041: eter 2,2,2- -trójahlolroetyOowy — Rf=0,90 oraz eter 2,2,2^trój- iduoroetylowy — Rf=0y84.Przyklad IV. Antybiotyk A2041 w formie kwasowej (10 g) rozpuszczono w n-propanolu (200 ml). Roztwór ten pozostawiono w temperaturze po¬ kojowej na* jeden tydzien, a nastepnie odparowano Tablica 7 Badania karmienia szczurów Zwiazek Porównawczy A2041 Eter propylowy A2041 Stezenie ppm — Samiec zmiana wagi ciala (g) +58,2 +31,4 —29,8 +77,8 +45,2 +66,6 pasiza (g) 238 224 147 281 221 288 Samica 1 zmiana wagf ciala (g) +43,2 +20,2 -^25,4 +34,0 +36,0 +31,6 pasza' (g) 236 180 137 224 218 22915 do sucha w prózni. Uzyskana .pozostalosc stanowi¬ la mieszanine wyjsciowego A2041 oraz produktu.Mieszanine te rozpuszczono w 20 ml mieszaniny benzenu i octanu etylu (7:3) i roztwór ten wpro¬ wadzono do kolumny 4X120 cm zawierajacej zel ]qrzemiionkowy (klasy 62), przemywajac mieszanina benzenu i octanu etylu (3:2) i spryskujac H2S04 dla detekcji. Zadana pochodna eteru nHpropylo- wego A2041 wymywano z kolumny przed wymy¬ ciem zwiazku wyjsciowegoi.Frakcje zawierajace pochodna eteru n-propylo- wego A2041 polaczono i odparowano do sucha. Po¬ zostalosc rekrystalizowaino z mieszaniny acetonu z woda i uzyskano 4,15 ig eteru n-propylowego A2041 o temperaturze topnienia 114—.116°C, ( fic= ty/lofformamidu) 7,8.Analiza. Dla wzoru C^H9d017: obtoczono (°/o): C, 63,26; H, 9,19; O, 27,55 znaleziono (%): C, 63,60/ H, 9,74; O, 26,87.Wielkosci Rf dla pochodnych eteru nipropylowe- go A2041 podano w przykladnie I.Przyklad V, Sposobem z przykladu IV i przy uzyciu odpowiedniego alkoholu lub etioflu uzyskano nastepujace zwiazki: pochodna eteru hydirofcsyetyiLowiego A2041, krystali- zowaina z mieszaniny acettondtrylu i wody; o tem¬ peraturze topnienia 120^1i22°C; pochodna eteru izopropylowego A2041 o temperaturze topnienia 158—160°C oraz pochodna eteru 2-metofcsyetylQwe- go Ai2041, o temperiatuirze topnienia 128—130°€.^Przyklad VI. Antybiotyk A2041 w formie kiwasowej (400 mg) dodaino do roztworu za^^bra- jacegio aceton (10 ml), metanotiol (100 ml) oraz kwas p-toiluenosullifonowy (10 mg). Uzyskany roz¬ twór pozostawiono w temperaturze pokojowej na 16 godzin, a nastepnie odparowano do sucha w prózni.Uzyskana pozostalosc rozpuszczono w minimal¬ nej ilosci mieszaniny benzenu i octanu etylu (4:1).Rto0twór ten podano do kolumny 2X40 cm zawie¬ rajacej zel kirzemdanowy (klasa 62). Przemywanie mieszanina benzenu i octanu etyilu (4:1) dalo frak¬ cje zawierajace pochodna tioeteru metylowego A2041. Frakcje te polaczono i odparowano w próz¬ ni. Uzyskana w ten sposófb pozostalosc rekrystali- zowano z mlieszaniiny acetontitrylu i wody i uzyska¬ no 1<19 mag pochodnej tioeteru 'metylowego A2041.Przyklad VII. Sposobem z przykfladu VI przy uzyciu odpowiedniego alkohoOu lub tioiu uzyskano nastepujace zwiazki: pochodna eteru nipentylowego A2041; +Rf=0,95, pochodna eteru 2-arakioetyilowego A2041: Rf=*0,19, =0,82, pochodna eteru 2^minoetyloiwego A2041; Rf=049, pochodna tioeteru etylowego A2041; Rf=0,70, pochodna- eteru benzylowego A2041; Rf=0,87, pochodna eteru fenylowego A2041; Rf=0,4J8, oraz pochodna tioeteru toliilowego A2041; -HRf=0,88.Przyklad VIII. Antybiotyk A2041 w formie kwasowej (500 mg) rozpuszczono w n-butanoiu (25 ml) i dodano 0,01 N kwas chlorowodorowy (2,5 ml).Uzyskany roztwór pozostawiono w temperiatuirze po¬ kojowej na okres 72 godzin, a nastepnie odparowa¬ no do sucha w prózni. 96940 16 45 50 55 Uzyskana*pozostalosc rozpuszczono w minimalinej ilosci mieszaniny benzenu i octanu etylu (4:1). Roz¬ twór ten wprowadzono do kolumny 2X50 cm za¬ wierajacej zel krzemionkowy (klasa 62). Wymywa^ nie mieszanina benzenu i octanu etylu (4:1) dalo frakcje zawierajace pochodna eteru n-toutyOowego A2041. Frakcje te polaczono i odparowano pod próz¬ nia. Uzyskana pozostalosc rekrystailizowano z mie¬ szaniny acetonitrylu i wody otrzymujac 156 mg po¬ chodnej eteru n-butylowego A2041; Rf=0J93.Tablica 8 Wartosci Rf Uklad rozpuszczalniików 65 Bibula roztwór: woda; meta¬ nol; aceton (12 : 3 :1) doprowadza sie do pH ,5 przy uzyciu NH^OH, a nastepnie obniza pH do* 7,5 przy uzyciu H,PG4 roztwór: woda; meta¬ nol; aceton (12 : a : 1) doprowadza sie do pH ,5 przy uzyciu NH40H,| a nastepnie obniza pH do 7,5 przy uzyciu roz¬ cienczonego HC1 roztwór wodiny 1% ketonu metylowodzo- butyllowegoi i 0,5°/o NH4OH benzen nasycony woda woda: etanol: kwas octowy (70 :24: 6) roztwór wodny l#/o pi- peryny i 2% kwasu p- -tbluenofeiulLfonowego Chromatografia cien¬ kowarstwowa —• zel krzemionkowy octan etylu (1:1) octan etylu: benzen octan etylu: chloroi- tform <2 :1) Chiromatograifiia cien¬ kowarstwowa — ce¬ luloza roztwór woda: meta¬ nol: aceton (12 : 3 :1) doprowadza sie do pH ,5 przy uzyciu NH4OH, a nastepnie obniza tpH do 7,5 przy uzyciu rozcienczonego HC1 0,41 0,50 0,34 0,49 0,61 0,71 0,66 0,23 0,43 0,35 0,74 0,44 0,57 0,52 0,57 0,66 0,41 0,49 0,27 0,53 0,33 0,70 0^6 0,68 0,67 0,74 0,48 0,30 0,38 0,67 H 117 96940 18 Tablica. 9ia Uklad rozpuszczalników Chromatografia cienkowarstwowa — zel krzemionkowy octan etylu: benzen (2:1) 5 Pochodne A2041 A2041 (wzorzec) Eter metylowy Eter etylowy Eter n-propylowy Eteri hyldroksyetylowy Eter izopropylowy Eter 2^rmeltO(k!syetyJLawy Wair- ttoisci Rf 0,31 0,39 0,53 0,58 0,14 — — M-^»r,«B».:- .-.-~ Tempera¬ tura top¬ nienia , — — — —. 158—160 128—130 Przy¬ klad Nr I, II IX IV V V V Tablica 9ib Uklad rozpuszczalników Chromatografia cienkowarstwowa — zel krzemionkowy benzen: acetOnlitryli (1:1) Pochodne A2041 A2041 (wzorzec) Eter n-propylowy Eter 2^aim(iinoety[liowy Tioeter p^toliilowy Eter benzylowy 'Eter butylowy Eter imetoiksylkariboi- nyilometylowy Tioeiter etylowy Eter trójfliuoroetylowy Eter 'trótfcMoiroetylowy Tioeter metylowy Eter n-butyloWy Eter nrpentylowy Wartosci Rf 0,79 0,82 0,19 o,m - 0,87 0,48 0,82 0,70 0,84 0,90 0,59 0,93 0,95 Przyklad Nr IV VII VII VII VII VII VII III III VI VIII VII 1 Przyklad IX. Pochodna eteriu etylowego A2041 wytwonzo-no z antybiotyku A2041 i etanolu w spo¬ sób wedlug Przykladu IV, relkrystailiizowano' z ace- tonitryiu. Temperatura topnienia wynosila LI7— 120°C, (a)25+74,23 (c=l, CHgOH); pKa' (66% wodny roztwór dwumetylotforimaimidu) 8,0.Analiza. Dla wzoru C51H88017: obliczono (°/o): C, 62,94; H, 9,11; O, 27,95. znaleziono (%): C, 63,34; H, 9,12; O, 27,95.Pnzyklad X. Stosujac rózne bibuly oraz u- klady dla chromatografii cienkowarstwowej, przy uzyciu Baoaiilus siublitis ATOC 6633 (pH) jalko tes¬ towego orgaoizamu bioautogirarrcznego wyznaczono wartosci iRf idla pochodnych eteru etylowego, ime- tylloiwego, nnpropylowegO' oraz innych eterów i tio- eterów antybiotyku A2041.Wyniki zestawiono w tablicach 8, 9a i 9b. War¬ tosci dla antybiotyku A2041 podano jato wzorzec porównawczy. PL PL PL PL