Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia pochodnych pterydyny o ogólnym wzorze 1, w którym R1 i R2 sa takie same lub rózne i ozna¬ czaja nizszy rodnik alkilowy albo tez R1 i R2 tworza lacznie z atomem wegla w pierscieniu pte- rydynowym zewnetrzny pierscien spirocykloalki¬ lowy o 4—6 atomach wegla ewentualnie w po¬ staci soli.Okreslenie „nizszy rodnik alkilowy" stosowane w niniejszym opisie odnosi sie do prostych lub rozgalezionych rodników alkilowych o 1—4 ato¬ mach wegla.Korzystne sa zwiazki o wzorze 1, w których R1 i R2 sa takie same i oznaczaja nizszy rodnik alkilowy, taki jak metylowy, a zwlaszcza etylowy.-Zwiazki o wzorze 1 sa przydatne w leczeniu za¬ kazen wywolywanych przez drobnoustroje.Szczególnie przydatne sa: 2-araiino-4-hydroksy- -7,7-dwumetylo-6-fórmylo-7,8-dwuwodoropterydyna, 2-amino-4-hydro -dwuwodoropterydyna, 2^amino-4-hydroksy-7,7- dwu-n-propylo-6-formylo-7,8-dwuwodoropterydyna, 2-amino-4-hydroksy-7Hspirocyklopentylo-6-formylQ- -7,8-dwuwodoropterydyna, 2Hamino-4-hydraksy-7- -spirocyklohexylo-6-formylo-7,8-dwuwodoroptery- dyna.Wiadomo, ze 2-amino-4-hydroksy-6-.hydroksy- -metylo-7,7-dwumetylo-7,8-dwuwodoropterydyna i 2-amino-4-hydroksy-6-metylo-7,7-dwumetylo-7,8- -dwuwodoropterydyna oraz ich postacie tautome- 80 ryczine i dopuszczalne w formacji sole wykazuja dzialanie bakteriostatyczne, szczególnie wobec Cl. perfringens i Derm. dermatonomous, co zostalo opisane w brytyjskim opisie patentowym nr 1 303 171 (belgijski opis patentowy nr 770 577).Obecnie stwierdzono, ze pterydyny o wzorze 1 ewentualnie w postaci ich form tautomerycznych lub dopuszczalnych w farmacji soli, które sa ana¬ logami pterydyn znanych sa równiez przydatne jako zwiazki lantagoniistyczne w metabolizmie drobnoustrojów.Wedlug wynalazku zwiazki o wzorze 1 wytwa¬ rza sie na drodze selektywnego utleniania odpo¬ wiednich pochodnych 6-hydroksyalkilowych & wzorze 2, stosujac nawet lagodne warunki utlenia¬ nia. Utlenianie mozna prowadzic, np. w srodowi¬ sku kwasnym, takim jak wodne roztwory kwasu solnego, mrówkowego lub siarkawego, stosujac jako czynnik utleniajacy powietrze, tlen lub jod, korzystnie w obecnosci antyutleniacza, takiego jak dwutlenek siarki lub kwas askorbinowy. Dodawa¬ nie antyutleniaczy ma na celu rozkladanie, moga¬ cej powstawac w czasie reakcji, wody utlenionej, która moze powodowac rozklad aldehydu i tym samym zmniejszac wydajnosc procesu.Zwiazki o wzorze 2 wytwarza sie stosujac spo¬ sób opisany w brytyjskim opisie patentowym nr 1303171.. Zwiazki o wzorze 1 hamuja wytwarzanie jed¬ nego z enzymów bioracych udzial w biosyntezie 9164391643 3 kwasu dwuhydrofoliowego, mianowicie pirofoski- raazy hydroifisymetylodwuwodoropterydyny, która ma zasadnicze znaczenie dla wzrostu drobnoustro¬ jów, np. bakterii. Moga wiec one byc stosowane in vitro w badaniach farmakologicznych, w testach klinicznych i diagnostycznych majacych na celu, np. poznawanie wlasciwosci bakterii.W przypadku stosowania jako czynnika bakte- riostatycznego stosuje sie stezenie nowego zwiazku 50—500, w szczególnosci 110—160 mg/ml w sto¬ sunku do roztworu, w którym wzrasta drobno¬ ustrój. Zwiazki powyzsze mozna równiez stosowac podczas leczenia zranien, np. po operacjach chirur¬ gicznych lub dla zapobiegania rozwoju bakterii.Ponadto zwiazki o wzorze 1 i ich sole wykazuja niespodziewanie niska toksycznosc w stosunku do zwierzat lub ptaków, np. bydla domowego, co czyni je szczególnie przydatnymi do stosowania w przypadkach zwalczania zakazen drobnoustroja¬ mi, w warunkach opisanych w dalszej czesci ni¬ niejszego opisu.Koenzymy kwasu czterowodorofoliowego sa pod¬ stawowymi metabolitami we wszystkich komór¬ kach w biosyntezie puryn, kwasu tymidylowego, seryny i wielu innych, waznych biologicznie zwiazków. Wiekszosc z tych koenzymów jest jed- noweglowymi adduktami, kwasu czterowodorofolio¬ wego a ich zródlem dla wyzszych zwierzat i ludzi jest pozywienie zawierajace pochodne kwasów fo¬ liowych, zazwyczaj w postaci witamin. Drobno¬ ustroje syntetyzuja koenzymy z prostszych zwiaz¬ ków chemicznych. Na ogól w pierwszym etapie procesu biosyntezy powstaje dwuwodoropterydyna, to znaczy ester pirofosforanowy 2^amino-4-hydro- ksy-6-hydroksymetylo-7,8-dwuwodoropterydyhy, z jego bezposredniego prekursora, w obecnosci enzy¬ mu pirofosfokinazy hydroksymetylodwuwodoropte^ rydynowej. Dwuwodoropterydyny. kondensuje na¬ stepnie z kwasem p-aminobenzoesowym w obec¬ nosci enzymu syntetazy dwuwodoropterydynowej z wytworzeniem kwasu dwuwodoropterydynowego, który z kolei kondensuje z (kwasem glutamino¬ wym, w wyniku czego powstaje kwas dwuwodo- rofoliowy. Kwas ten jest redukowany enzyma¬ tycznie do kwasu czterowodorofoliowego, jak to ma miejsce, np. u bakterii i innych drobnoustro¬ jów.Synteze kwasu dwuwodorofoliowego z podsta¬ wowych elementów, to znaczy pterydyny, kwasu p-iaminobeinzoesiowego ii kwasu glutaminowego oraz nastepne przeksztalcenie w kwas czterówodorofo- liowy mozna hamowac dwoma róznymi sposobami.'"'W pianwisjzym z mian, nip. [siuifoiniaimiidy zastepuja fcwas p-aminobenzeosowy w powyzszym cyklu re¬ akcji. Dzieki wiernemu podobienstwu struktural¬ nemu do kwasu p-aminóbenzoesowego, sulfonami¬ dy i podobne czynniki dzialajace kompetytywnie biora udzial w biosyntezie i uniemozliwiaja pow¬ stawanie kwasu dwuwodoropterydynowego i dwu¬ wodorofoliowego. Sa wiec one tym samym anty- metabolitami w stosunku do metabolitu kwasu p-aminobenzoesowego. Znane sa równiez zwiazki bedace inhibitorami enzymu reduktazy kwasu dwuwodorofoliowego w stadium syntezy, w którym wytwarzany jest kwas czterowodorofoliowy. Znacz- 4 na ilosc pochodnych pirymidyny wykazuje dziala¬ nie przeciw drobnoustrojom oparte na tego ro¬ dzaju blokadzie.Udowodniono, ze tego rodzaju inhibitory moga dzialac synergistycznie z sulfonamidami, to zna¬ czy mioze wystepowac podwójna blokada i silne wzajemne wzmocnienie dzialania przeciwbakteryj- nego obu zwiazków. Wzrost aktywnosci przeciw drobnoustrojom osiaganx przy zastosowaniu takiej kombinacji jest 0 wiele wyzszy niz mozna bylo oczekiwac na podstawie indywidualnej aktywnosci leku i wlasciwosci drobnoustroju, który jest tylko w niewielkim stopniu wrazliwy na dzialanie po¬ szczególnych zwiazków, natomiast staje sie.bardzo wrazliwy ma dzialanie ich mieszaniny.Postulowano takze hipotetycznie, ze antymeta- bolity dwuwodoropteirydyny moga hamowac bio¬ synteze kwasu dwuwodioropteirynówego i kwasu d,wiuwodoriafioliiowiego (Hitchingis i DurchaM, Advan- ces in Bnizymology, 27, 417—468, 1965). Okazalo sie jednak, ze testowane pod tym katem zwiazki byly albo nieaktywne, ailibo zibyt toksyczne lub czasami i (nieaktywne i toksyczne, jak np. zwiazki opisa¬ ne iw brytyjskich opisach patentowych nr nor 981.506 i 987.916.Wiadomym jest, ze warunkiem wstepnym uzy¬ skania skutecznego dzialania antagonistycznego dwuwodoropterydyny jest, aby stosowany zwiazek byl inhibitorem fosfokinazy, nie bedac jednak an- tymetabolitem diwuwodoropterydyny, która jest ko¬ enzymem bioracym"udzial w reakcji hydroksylo- wania fenyloalaniny i tyrozyny, prekursorów ka- techoloamin, takich np. jak norepinefryna,' które pelnia wazna funkcje regulatorów ukladu sercowo- -naczyniowego. Taki efekt antymetaboliczny mo¬ ze prowadzic do nadmiernej toksycznosci w sto¬ sunku do ptaków i ssaków, które sa zwykle nara¬ zone na zakazenia drobnoustrojami.Stwierdzono obecnie, ze zwiazki o wzorze 1 i ich sole w pelni odpowiadaja powyzszym wyma¬ ganiom, to znaczy sa inhibitorami fosfokinazy hy- droksymetylodwuwodoropterydynowej oraz wyka¬ suja niska toksycznosc w stosunku do biorców,. ¦co zostalo wykazane na przykladzie kurczat i szczurów. Zwiazki powyzsze nie tylko same ha¬ muja rozwój drobnoustrojów,- chociaz w zakresie ograniczonym do niektórych bakterii, takich miedzy innymi jak Staphylocoocus aureus, Streptococcus pyoganes, Stre(ptococcus faecalis, Bsicherichia coli, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Pseudomonas aerugenosa, Pasterella multocida, ale równiez wy¬ kazuja silny efekt synergistyczny w polaczeniu z czynnikami kompetytywnymi kwasu p-amino¬ benzoesowego, np. sulfonamidami i podobnymi zwiazkami, lub w polaczeniu z niektórymi inhibi¬ torami reduktazy kwasu dwuwodorofoliowego, np. pirymidynami ii zwiazkami pokrewnymi, albo tez w polaczeniu z oboma wymienionymi wyzej typa¬ mi czynników aktywnych przeciw droibnousiirojorri.Znana jest kompozycja stosowana do testowa¬ nia lub zwalczania zakazen drobnoustrojami, za¬ wierajaca zwiazek o wzorze i w ilosci wystarcza¬ jacej dio uzyskania efektu wzmozenia aktywnosci, w polaczeniu ze skuteczna iloscia czynnika kom- petytywnego lub inhibitora, lub obu tych substan- 40 45 50 55 6091 cji.. Omawiane mieszaniny sa przydatne w zwal¬ czaniu , zakazen,wywolywanyeh przez takie pier¬ wotniaki lub bakterie, które syntetyzuja przynaj¬ mniej glówna czesc niezbednego koenzymu kwasu ozterowodorofoliowego, to znaczy przez drobno¬ ustroje, które odpowiednio wchlaniaja omawiana mieszanine lekórw oonaz w stosunku do których mie- szanina~^w$to&uje efekt synefgistyczny polegajacy na zaklóca^U/-syntezy koenzymów kwasu oatero- wodorofoliowegD. Przykladowo, stwierdzono, ze omawiiane komipozycje sa przydatne w zwalczaniu zakazen wywolywanych przez Staphylococcus au- reus, Bseudomonas aerugenosa i PasteureMa mul- tocida..W szczególnosci stwierdzono, ze w wyniku la¬ czenia, zwiazków o wzorze i z niewystarczajaca normalnie dla skutecznego dzialania iloscia czyn¬ nika kompetytywnego i/lub inhibitora, otrzymuje s{e kompozycje wykazujace jako calosc skuteczne dzialanie przeciw drobnoustrojom. Daje sie. to szczególnie zauwazyc w przypadku gdy ilosc zwiazku o wzorze 1 jest tak mala, ze nie wywo¬ luje praktycznie zadnego dzialania przeciw drobno¬ ustrojom, natomiast w przypadku mieszaniny dzia¬ lanie to jest znaczne lub, w niektórych przypad¬ kach, bardzo znaczne. Tak wiec zastosowanie zwiazku o wzorze 1 w ilosci skutecznie wzmaga¬ jacej dzialanie uzywanego jednoczesnie czynnika kompetytywnego i/lub inhibitora, pozwala na znaczne zmniejszenie ilosci tych dwóch skladni¬ ków niezbednej dla zahamowania rozwoju bakte- riL Okreslenie „skuteczna ilosc" stosowane w od¬ niesieniu do okreslen „inhibitor" reduktazy kwasu dwuwodorofoliowego lub „czynnik . kompetytyw- ny" kwasu p^aminobenzoesowego oznacza albo ta¬ ka ilosc czynnika kompetytywnego lub inhibitora, która wykazuje wystarczajace dzialanie przeciw drobnoustrojom, przy czym dzialanie to jest wzma¬ gane przez zastosowanie zwiazku o wzorze 1, albo ilosc czynnika kompetytywnego lub inhibitora, która jest niewystarczajaca dla uzyskania dziala¬ nia przeciw drobnoustrojom w polaczeniu ze zwiaz¬ kiem o wzorze i daje kompozycje dzialajaca sku¬ tecznie jako czynnik hamujacy rozwój drobno¬ ustrojów. Okreslenie „ilosc skutecznie wzmagaja¬ ca dzialanie" oznacza taka ilosc zwiazku o wzorze 1, która zwieksza aktywnosc inhibitora i/lub czyn¬ nika kompetytywnego i tym samym polepsza sku¬ tecznosc dzialania calej mieszaniny.Nalezy zwrócic uwage, ze inhibicje procesów biosyntetycznych za pomoca opisywanych czynni¬ ków mozna rozpatrywac we wszystkich trzech przypadkach jako antagonistyczne dzialanie kom- patytywne i dlatego wzmacnianie dzialania moze zachodzic pomiedzy wszystkimi trzema rodzajami zwiazków. Okreslenia, „inhibitor", „czynnik kom- petytywny" i „wzmacnianie" dzialania przez zwiaz¬ ki o wzorze 1, sa okresleniami nieprecyzyjnymi i sluza jedynie dla wygodniejszego sposobu nazy¬ wania odpowiednich typów skladników w miesza¬ ninie opisanej i zastrzezonej w omawianym zglo¬ szeniu patentowym.Aktywnosc hamujaca wobec pirofósfokinazy hy- droksymetylodwuwodoropterydynowej mozna ozna- 613 6 czac na drodze pomiarów przenoszenia koncowych reszt fosforanowych adenozynotrójfosforanu (ATP- -y-Psz) do dwuwodoropterydyny. Stwierdzono sto¬ sujac taki tekst, ze stezenie niezbedne do zaha- mowania w 5Ó°/o wytwarzania dwuwodoropterydy¬ ny (IC50) obliczone wedlug takiego testu dobrze koreluje z wynikami uzyskanymi na podstawie in¬ nego rodzaju testu, w czasie którego mierzono sto¬ pien inhibicji enzymów, bioracych udzial w wy-- i-o twarzamiu 2-amino-4-hydroiksy-6-hydroksymetylo-7, 8-dwuwodoropterydyny i kwasu dwuwodoroptery- nowego. Test taki mozna wykonywac w prosty sposób, np. inkubuja^c ekstrakt z hodowli E. coli z kwasem p-aminobenzoesowym-7-C14, adenozyno- trójfosforanem, jonami magnezu i dwuwodoropte- rydyna.Ilosc wytwarzanego kwasu dwuwodoptecynowe- go-C14 mozna oznaczac ilosciowo po oddzdeleriiu nieprzereagowanej czesci wyjsciowego kwasu p- namiinoibenzoesioweigo, nip. za pomoca chromatogra¬ fii,. Stwierdzono, ze zwiazki które wykazuja w tym tescie wartosc IC50 okolo 100 \jlM lub nizsza, moz¬ na uwazac za przydatne jiatoo czynniki wzmacnia¬ jace dzialanie, pod warunkiem, ze ich toksycznosc wobec kregowców jest na dopuszczalnym poziomie.Korzystnie jest, aby wartosc IC50 wynosila 25 \iM lub mniej, np. w granicach 2—12 ^M, przy czym, a pozadane aby wartosc ta byla nizsza od 7 [iM.Jak to juz wyjasniono powyzej, sprawa zasadni- cza jest by zwiazek o wzorze 1 nie byl w stopniu niedopuszczalnym toksyczny w stosunku do ukla¬ du sercowo-naczyniowego ssaków i ptaków. Ponie¬ waz niska toksycznosc jest tym samym jodstawo^ wym wymaganiem, indeks terapeutyczny, w które- go definicje wchodzi zarówno wartosc toksyczno¬ sci jak i aktywnosci, moze byc z powodzeniem stosowany jako kryterium wyboru zwiazków o wzorze 1, wykazujacych wzmacnianie dzialania przeciw drobnoustrojom. 40 Indeks terapeutyczny jest pojeciem .zdefiniowa¬ nym jako stosunek najwyzszej dopuszczalnej daw¬ ki do najmniejszej skutecznej dawki i w wiekszo¬ sci przypadków jest on wiekszy od 10, a jest od¬ powiedni na poziomie wynoszacym co najmniej 5, 45 ale w wyjatkowych przypadkach moze wynosic lofkolo 3 dla ludzi i nawet 2 dla zwierzat.Znanych jest wiele zwiazków dzialajacych kom- petytywmie w stosunku do kwasu p^ammobenzioeso- wego i wykazujacych aktywnesc przeciwko drob- 50 noustrójom. Zwiazki dzialajace przeciw drobno¬ ustrojom i zawierajace w czasteczce siarke, opisa¬ ne w Merck Index, 8 wydanie, 1968 rok, strony 994—1007, wymienia sie w niniejszym opisie je¬ dynie dla przykladu. 55 Dla opisywanych celów korzystne sa sposród znanych zwiazków, które sa czynnikami kompe- tytywnymi, nastepujace sulfonamidy lub ich do¬ puszczalne w farmacji sole: sulfanilamid, sulfa- diazyna, sulfametizazol, sulfapirydyna, sulfatiazol, 60 .sulfamerazyna, sulfametazyna, sulfizoksazol, sul- fadoksyna, sulfiazomydyna, sulfachloropirydazyna, 2-4p-aminofenylo/sulfonainldo-3-metoksypirazyna/ /kelfizyna, a-amiinoHp-toluenosulfonamid, 5-siuilfiani^ lamido-^,4-dwiumetylo|pirymMyna, 4-(N,-acetylosul- 65 fanilamiido)-5, 6-dwiumetokisypirymidynia, 3-sulfarn-91643 8 lamMo-4,5-dwumetyloizoksazol,- 4jsulfanUamido-5- -metoksy-6-decylooksypirymidyna, •sulfaindnameto- ifesyna, 4-p-(«-hydroksychinilinylo-4^azo)-fenylosul- fanilamido-5,'6Hdwumetoiksyiiiryniiidyna, sulfadime- toksynia, sulfametaksazol, sulfachinoksalina oraz p-i(2Hmetylo-8-hydir fanttamido-5,6-dwiUflixetcta^^ Brzykla- •dem nie nalezacych do grupy sulfonamidów czyn¬ ników dzialajacych kampetatywnie jest kwas p- -amtiinosalicylowy (PAS) oraz p,p'-dwuaminodwu- fenylosulfon.Chociaz znanych jest wiele zwiazków, które wy¬ kazuja aktywnosc przeciw drobnoustrojom i sa in¬ hibitorami reduktazy kwasu dwuhydrofoliowego, dla celów niniejszego opisu mozna przykladowo wymienic zwiazki przedstawione w opisach paten¬ towych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr. nr. 2.658.897, 2.767.183, 3.021.332, 2.937.084, 3.322.765, 2.909.522, 2.624.732, 2.579.259, 2.945.859, 2,576.939, 2.926.166, 2.607.710, 2.749.345 oraz 2.749.344.Ddia opisywanych celów korzysttJhymi inhibitorami sa nastepuijace zwiazki lub ich dopuszczalne w far- (macjd sole: 2,4^wuaimdino-6-etylio-5-p-chlorofeniyl!0- piryimidynia (ipirymetaminia),. 2,4-dwoalmino-5-(3,,4,, S^-frójmertoksybenEylo/ipiry^^ (trimetoprim), 2,4^wiuamdno-5-/3^4,-dwujTietoiksybenzylo/ipirymi- dyna Cdiawarydynia), 2,4-dwuamino-5-/2,^izapropy- -4*-chlorofenoksy/ipirymidyna. 2,4-dwu)amino-5- -metylo-6-II-rz.^butylopirydo/2,3,-d/-pirymidyna, 2,4-dwuamino-5-metylo-6- imidyria, 2,4-dwuaiiilino-6-benzylop«irydo/2,3-d/piTy- mi,dyna, 2,4Hdwuammo-5-/6-trójanetyleno/chinazoli- na, 2,4-dwuamino^5-/6-czterometyleno/chinazolina, 2,4-dw1ua!mJilno-5-/2^4^5,^t^ójmeltoiksybanzylLo/|pirymi- dyny, 2,4-dwuamitio-5-/2'-etylo-4,,5,jdwumetoksy- benzylo/ipirymadyna oraz 2,4-dwuamino-5-/2,-niety- -4',5'^dwumetoksybenzylo/piryimddyna.Najbardziej korzystnymi mieszaninami sa ta¬ kie, w których sklad wchodzi zwiazek o wzorze 1, szczególnie taki, w którym podstawniki R1 i R2 sa takie ^same i oznaczaja rodnik metylowy lub ety¬ lowy, oraz czynnik dzialajacy kompetytywnie, ta¬ ki jak sulfadiazyny, sulfametoksazol, sulfadoksy- na lub sulfachinoksalina albo inhibitor, taki jak trimetoprim, diawerydynia lub pdrymetamina.Z punktu widzenia mozliwosci uzyskania dzialania synerigistycznego podczas stosowania kombinacji róznych czynników kompetytywnych i inhibitorów - oraz mozliwosci zwiekszenia skutecznosci dziala¬ nia zwiazków o wzorze 1, korzystnie jest stoso- wiac mieszanine (potrójna, w której sklad wchodzi zwiazek o wzorze 1, jeden z korzystnych czynni¬ ków dzialajacych kompetytywnie oraz jeden z ko¬ rzystnych inhibitorów. Przykladowo, kombinacje sulfadiazyny i ,trimetoprimu, sulfametazolu i tri¬ metoprimu, sulfadoksyny i trimetoprimu oraz sul- fachinoksaliny i diiawerydyny w polaczeniu ze zwiazkiem o wzorze 1, wykazuja zwiekszona sku¬ tecznosc dzialania-w porównaniu do indywidual¬ nych zwiazków lub mieszanin podwójnych.Zwiazki o wzorze 1, zarówno pojedynczo jak i w mieszankach z czynnikiem kompetytywnym iAub inhibitorem, podaje sie pozajelitowo, domiejsoowo, doodbytniczo lub doustnie lacznie z odpowiednimi nosnikami. Formy do podawania doustnego lub dobodbytniczego przygotowuje sie w^ postaci po¬ jedynczych dawek, takich jak tabletki, oplatki, ampulki lub czopki zawierajace okreslona ilosc kazdego zwiazku lub w postaci proszków albo gra- - mulek, roztworów i zawiesin w wodzie i innych cieczach, albo w postaci masci lub past do sto¬ sowania miejscowego.Do stosowania pozajelitowego przygotowuje sie jalowy roztwór lub zawiesine w wodzie lub in- io nej cieczy. Formy gotowe leku przygotowuje sie ' stosujac znane sposoby i uzywajac jedna lub wie¬ cej nastepujacych substancji pomocniczych: roz- cienczalniikd, roztwory izotoniczne w stosunku do krwi, bufory, srodki zapachowe, srodki wiazace, srodki rozpraszajace, substancje powierzchniowo czynne, materialy do powlekania i smarowania, srodki konserwujace, bakteriostatyki,' antyutlenia- cze, podstawy do czopków i masci oraz inne do- n puszczalne w farmacji substancje pomocnicze.Gotowe postaci farmaceutyczne zawierajace zwia?- zek o wzorze 1 w polaczeniu z czynnikiem dzia¬ lajacym kompetytywnie lub inhibitorem, moga byc przygotowane w postaci zestawu skladajacego sie z osobno zapakowanych porcji poszczególnych skladników wraz z instrukcja stosowania' w tej postaci. W instrukcji powinien byc opisany sposób podawania oraz wskazania dotyczace przydatnosci tego leku.Zwiazki o wzorze i stosowane zarówno indywi- 80 dualnie jak równiez w polaczeniach z czynnikami kompetytywnymi i/lufo inhibitorami oraz poszcze¬ gólne zwiazki dzialajace kompetytywnie i inhibi¬ tory, moga byc stosowane w postaci dopuszczal¬ nych ia farmacji soli z kwasami nieorganicznymi i organicznymi, np. chlorowodorowym, bromowo- dorowym, siarkowym, octowym, cytrynowym, wi¬ nowym, mlekowym, mialeinowym lub salicylowym, albo, szczególnie w przypadku sulfonamidów o dzialaniu kompetytywnym, w postaci soli z zasa- 40 darni, takimi jak wodorotlenek sodowy, potasowy, czterometyloamoniowy lub amoniak.Udzial ilosciowy czynnego terapeutycznie zwiaz¬ ku o wzorze i w kompozycjach leczniczych moze sie zmieniac w szerokim zakresie. W zaleznosci 45 od celu i sposobu uzycia kompozycja moze zawie¬ rac zwiazek o wzorze 1 oraz czynnik kompetytyw- ny i/lub inhibitor w odpowiednich proporcjach ilosciowych. W przypadkach uzycia. in vivo poza¬ danym jest np. czesto uzyskanie okreslonych pro¬ so porcji poziomu poszczególnych skladników w su¬ rowicy krwi lub plynach tkankowych, korzystnie w ciagu przedluzonego okresu czasu. W zaleznosci od stopnia wchlaniania, wydalania i rozkladu in¬ dywidualnych skladników, ich poczatkowe stezenie 55 i wzajemne proporcje moga byc rózne od oczeki¬ wanego in vivo w tkankach.Kompozycja i wielkosci dawek zalecane do ogól¬ nego stosowania w schorzeniach ludzi i zwierzat musza byc przystosowane do wymagan organizmu €0 poszczególnego biorcy i rodzaju choroby, aktyw¬ nosci czynnika * kompetytywnego liub inhiJbitcira wobec drobnoustroju, okresu póltrwania i toksycz¬ nosci skladników in viivo oraz innych wymagan praktycznych'. 65 Kompozycja farmaceutyczna moze np. zawierac91 okolo 1—30, korzystnie 5—15 czesci wagowych zwiazku o wzorze 1 lub równowazna ilosc jego soli, 1—30, korzystnie 5—15 czesci czynnika kom¬ petytywnego lub równowazna ilosc jego soli oraz/ /lub 1 czesc inhibitora lub równowazna ilosc jego soli.Wielkosc dawek zalezy od rodzaju drobnoustro¬ ju i w zwyklych wtarunkach wynosi do cikolo 60 mg/kg zwiazku o wzorze 1 i tylez samo czyn¬ nika kompetytywnego oraz do okolo 7,5 mg/kg inhibitora, podawanych w róznych dawkach dziennych. Kompozycje podaje sie ludziom w pojedynczych dawkach, zawierajacych' ipo 750 mg zwiazku o wzorze 1, do 750 mg czynnika kompe¬ tytywnego i/lub do 25 mg inhibitora. Korzystna wielkosc dawki dla doroslych wynosi do ckolo 200 mg zwiazku o wzorze 1, do okolo 200 mg czynnika kompetytywnego i/lub okolo 25 mg in¬ hibitora.Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca zwia¬ zek o wzorze 1 w polaczeniu z czynnikiem kom- petytywnym iAub inhibitorem jest takze przydat¬ na w postaci roztworu do przemywania ran, np. pooperacyjnych, gdyz zapobiega rozwojowi ba¬ kterii. Mozna przykladowo stosowac roztwór prze- ciwbakteryjny o nastepujacym korzystnym skla¬ dzie: 1—30 mg/ml zwiazku o wzorze 1, 1—30 mg/ml czynnika kompetytywnego i/lub 0fc03—1 mg/ml inhibitora, rozpuszczonych w dopuszczal¬ nych w farmacja rozpuszczalnikach, odpowiednich do uzytku zewnetrznego.Efekt polegajacy na wzmaganiu dzialania zwiaz¬ ków o wzorze 1 moze byc stosunkowo latwo uwi¬ doczniony i wykorzystywany in vitro do celów badawczych i praktycznych. Daije to mozliwosc sta¬ wiania diagnozy i indentyfikacji flory bakteryjnej a nastepnie wyboru sposobu leczenia.W celu oznaczania wrazliwosci drobnoustrojów mozna rozmaitymi kompozycjami nasycac porowa¬ te krazki, np. bibulowe, lub agar odzywczy albo inna pozywke odpowiednia dla wzrostu bakterii.Takie materialy nasycone zwiazkiem o wzorze i w mieszaninie z czynnikiem kompetytywnym i/lub inhibitorem mozna dostarczac lub sprzedawac le¬ karzom, szpitalom i klinikom. Typowy krazek te¬ stowy moze byc impregnowany roztworem zawie¬ rajacym 5^50 ng/ml kwasu p-aimiinobenzoesowego jako czynnik kompetytywnego, 0,5-^5 jig/ml inhi¬ bitora reduktazy kwasu dwuwodorofoliowego oraz okolo 10—100 [ig/ml zwiazku o wzorze 1 w mie- szaninie wodnego naparu i wyciagu papainowego z miesni konskich.Ponadto, takie testy farmalkoloigicizne okreslajace stopien wzmagania aktywnosci czynników kom- petytywnych lub inhibitorów, moga równiez byc przydatne dla charakteryzowania bakterii w od¬ niesieniu do ich' wrazliwosci i opornosci, np. w stosunku do stosowanego indywidualnie czynnika kiompetytywnego. Tego rodzatfu badania, obejmuja¬ ce rózne, opisane w niniejszym opisie kompozycje moga -byc" takze -podstawa do okreslania skladu poszczególnych postaci farmaceutycznych, przezna¬ czonych do ogólnego stosowania. Toksycznosc zwiazków o wzorze 1 jest na ogól znacznie nizsza od toksycznosci zwykle stasowanych czynników 64S kompetytywnych lub inhibitorów. Pozwala to na utrzymanie lub wzrost aktywnosci przeciwbakte- ryjnej leków przy jednoczesnym podwyzszeniu in¬ deksu terapeutycznego i zmniejszeniu ich toksycz- nosci i dzialan ubocznych.Stwierdzano takze, ze zwiazki o wzorze 1 wzma¬ gaja aktywnosc omawianych czynników kompe¬ tytywnych i/lub inhibitorów wobec zakazen wy¬ wolywanych przez drobnoustroje u zwierzat do- io mowyeh, w tym bydla, np. przez Pasteurella mul- tocida, a szczególnie w przypadkach ^kokcidiozy wywolywanej przez pierwotniaki. Takie trójsklad¬ nikowe kompozycje zawierajace zwiazek o wzo^ rze 1 w polaczeniu z czynnikiem kompetytywnym, takim jak sulfachinoksalina 1 inhibitorem, takim jak diawerydyna, dzialaja skutecznie w nizszym stezeniu niz czynnik kompetytywny lub ^inhibitor, stosowane oddzielenia. Wykazujac zwiekszona aktywnosc, sa one skuteczne wobec róznych dro- bnoustrojów z gatunku Eimeria, wywolujacych choroby bydla. Stwierdzono, ze szczególnie sku¬ teczne dzialanie wykazuja kompozycje zawierajace 2-amino-4-hydroksy-6-fermylo-7,7-dwumetylo-7,8- -dwuwodoropterydyne, nawet w niskich stezeniach wynoszacych 20 czesci na milion.Przyklad I. 2-amino-4-hydroksy-6-formylo- 7,7-dwumetylo-7,8-dwuwodoropterydyna (wzór 1, w którym R1 = R2 = grupa metylowa).Zawiesine zawierajaca 0,449 g 2-amdno-4-hydro- ksy-6-hydroksymetylo-7,7-dwumetylo-7,8-dwuwodo- ropterydyny (zwiazek o wzorze 2, w którym R1 = R2 = grupa metylowa) w 5 ml 2 m kwasu solnego miesza sie w ciagu nocy w powietrzu, w tempe¬ raturze pokojowej. Otrzymuje sie mieszanine o barwie ciemnoczerwonej, która oczyszcza sie sto¬ sujac zywice jonowymienna Amberlit CG50 w far¬ mie wodorowej i eluujac zabarwiony na zólto produkt woda. Pierwsze frakcje o odczynie kwas¬ nym odrzuca sie. Eluat zateza sie do malej obje- 40 tosci pod zmniejszonym cisnienieni. Pozostalosc sa¬ czy sie i otrzymuje 0,13 g surowego zwiazku ty¬ tulowego, w postaci krysztalów o barwie zóltej, ciemniejacych przy ogrzewaniu w temperaturze powyzej 240°C. Powyzszy produkt rozpuszcza sie 45 w mieszaninie wody i metanolu, a nastepnie roz¬ twór powoli zateza sie i odsacza wytracony kry¬ staliczny produkt, ciemniejacy podczas ogrzewa¬ nia w temperaturze powyzej 260°C. - Przyklad II. 2-amino-4-hydroksy-6-formylo- 50 7,7^awumetylo-7,8^dwuwodoropterydyna (wzór 1, w którym R1 = R2 = grupa metylowa).Przez mieszanine zawierajaca lfl g 2-amino-4- -hydrc^sy-6-hydroksymetylo-7,7-dwumetylo-7,8- -dwuwodoropterydyny (wzór 2, R1 = R2 = grupa 55 metylowa) w 20 ml nasycanego wodnego roztworu kwasu siarkowego przepuszcza sie, mieszajac mie¬ szanine tlenu i dwutlenek siarki (1:2), w ciagu 7,5 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymana -zawiesine prawie bezbarwnej substancji pozosta- 60 wia'sie w ciagu nocy w temperaturze 0°C, prze¬ puszcza sie w ciagu 5 minut dwutlenek siarki, sa¬ czy i przemywa osad lodowatozimnym kwasem siarkowym. Otrzymuje sie 1,112 g slabo rozpusz¬ czalnego adduktu tytulowego aldehydu z kwasem 65 siarkowym. Przesacz zateza sie pod zmniejszonym91643 11 12 cisnieniem do objetosci okolo 10 ml, wysyca dwu- tlenkiem siarki i pozostawia w ciagu kilku dni w temperaturze 0°C, otrzymuje sie dodatkowo 57 mg adduktu. W celu wyodrebnienia aldehydu zawiesine adduktu w 20 ml wody ogrzewa sie w temperaturze 70°C i przepuszcza strumien azotu, w ciagu okolo 20 min. az do zaprzestania Wydzie¬ lania sie dwutlenku siarki. Otrzymana zawiesine ochladza sie do temperatury 0°C i saczy. Otrzy¬ muje sie 0,748 g czystego zwiazku tytulowego.Przyklad III. 2-ainino-4-hydroksy-6-formylo- ~7,7-dwurnetylo-7,8-dwuwodoropterydyna (wzór 1, w którym Rr = R2 =.grupa etylowa).Da cieplego Eóztworu 450 nig oksymu 2-amimo- -4-(l ',1,^wuetylo-3,-,hydroik^yacetonytloamino-0- hydroksy-5-nitropirymidyny w 0,1 m roztworze wodorotlenku sodowego, dodaje sie porcjami dwu- tionin sodowy, az do zmiany barwy roztworu z czerwonej na bladozólta. Roztwór odparowuje sie, produkt ekstrahuje etanolem i odsacza nieroz¬ puszczalnie produkty nieoriganikizne. Ekstrakcje po- wtsirza sie, laczy ekstrakty i odpairowuje do sucha pod zmniejszonym' cisnieniem. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w minimalnej ilosci wody i nanosi na kolumne z wymieniaczem jonowym Amberlit CG-50 w formie wodorowej. Podczas elucji woda otrzymuje sie dwa glówne pasma fluoryzujace. Po odparowaniu pierwszego z nich otrzymuje sie zwiazek tytulowy w postaci jasincpomaranGzowe¬ go proszku. Druga frakcja zawiera pochodna 6-hy- droksymetylowa o wzorze 2, w którym R1 = R2 = grupa etylowa w postaoi jasnozóltego proszku o temperaturze topnienia powyzej 300°C (z rozkla¬ dem). Zwiazek ten utlenia sie do pochodnej 6-for- mylowej w sposób opisany w przykladzie I.Przyklad IV. 2-amino-4-hydroiksy-6-formylo- 7,7-diwuetylo-7,8-drwmwodoropterydyna (zwiazek o wzorze 1, w (którym R1 = R2 = grupa etylowa).Przez zawiesine 1,1 g 2-amino-4-hydroksy-6- -hydroksymetylo-7,7Tdwuetylo-7,8-dwuwodoropte- rydyny (wzór 1, w którym Rl = R2 = grupa ety¬ lowa) w 20 ml nasyconego roztworu wodnego kwasu siarkowego przepuszcza sie tlen i dwutle¬ nek siarki w sposób opisany w przykladzie II.Polaczone addukty, otrzymane w postaci stalej pozostalosci po odsaczeniu oraz po zatezeniu prze¬ saczu pod zmniejszonym cisnieniem, wytwarza sie zawiesine w 20 - ml wody i w temperaturze 70°C przepuszcza strumien azotu, podobnie jak w przy¬ kladzie II. Zawiesine ochladza sie do temperatury 0°C i saczy otrzymujac czysty zwiazek tytulowy.Przyklad V. 2-amino-4-hydroksy-6-formylo- 7,7-dwumetylo-7,8-dwuwodoropterydyna (wzór 1, w którym R1 = R2 = grupa n-propylowa).Powtarza sie postepowanie z przykladu II, sto¬ sujac jako substancje wyjsciowa 1,3 g 2-amino-4- -hydroksy-6-hydroksyinetylo-7,7-dwu-n-propylo- -7,8-dwuwodoropteirydyny (wzór 2, w którym R1 = R2 = grupa n-propylowa) w postaci zawiesiny w ml kwasu siarkowego. Z otrzymanego adduktu z. kwasem siarkowym wyodrebnia sie czysty zwia¬ zek tytulowy w sposób opisany w przykladzie II.Przyklad VI. Potencjalne zwiazki antago¬ nistyczne wobec pterydynjfr o wzorze 1, mozna testowac oznaczajac efekt inhibicji jaM wywie¬ raja one wobec enzymów odpowiedzialnych za biosynteze kwasu dwuwodoropterynowego, miano¬ wicie fosfokinazy hydiroksymetylodwuwodoropte- rydynowej i syntetazy kwasu dwuwodoropteryno- wego, nazywanych skrótowo w dalszej czesci fos- fokinaza i syntetaza. Schemat reakcji dla po¬ szczególnych enzymów jest nastepujacy: Fosfokinaza 2^ainino-4-hyidTolksy-6-hydrokisymetylo-7,8-dwu- wodoropterydyna + adenozynotrójfosforan Mg2+ 40 45 50 55 65 dwuwodoropterydyna + adenozynomonofosforan.Symtetiaza dwuwodoropterydyna + kwias p^aminobenzoeisowy Mg2+ kwas dwuwodoroplterynowy + pirofosforan.Aktywnosc wobec fosfokinazy oznacza sie mie¬ rzac przenoszenie koncowych reszt fosforanowych ATP — y —P82 do dwuwodoropterydyny, a nastep¬ nie porównujac wyniki ze stopniem hamowania fosfokinazy przez testowany zwiazek.Testowany zwiazek o wzorze 1 diodaje sie do probówek testowych z rozmaitymi kompozycjami zawierajacymi wymienione metabolity i enzymy.Sklad kompozycji jest nastepujacy: (I) 2-amiino-4- -hydraksy-6-hydroksymetylo-7,8-dwuwodorqptery- dyna w stezeniu 800 jAmolarnym, kinazy otrzymane z ekstraktu E. coli i oddzielone od syntetazy przy zastosowaniu Sephadexu G-100, wedlug metody opisanej przez Richeya i Browna w J. Biol. Chem., 224, 1582-1592(1969), (III) 3 mili- mole ATP-y-P82, (IV) — 0,10 m zobojetnionego, niie znakowanego ATP, (V) — 0,02 m MgCl2.6H20, (VI) — 0,1 m CgCl2 . 6H20, (VII) — zródlo fosfo¬ kinazy i syntetazy, (VIII) — zwiazek testowany w stezeniiu 0,93 X 10_am, (IX) — 0,04 mM kwasu p-aminobenz oesowego-Ci4.Jak to przedstawiono powyzej, probówki 1—9 zawieraja zródlo fosfokinazy, znakowany ATP, 0,02 mola MgCl2 • 6H20 oraz znakowany kwas p-amino- benzoesowy, probówki 2—9 zawieraja dodatkowo 2Hamino-4-hydroiksy-6-hydToksymeitylo-7,8-dwuwo- doropterydyne, a pirobówiki 4—9 ponadto testowa¬ ny zwiazek. W kontrolnych probówkach 10—12 znajduje sie zródlo fosfokinazy i syntezy, nie zna¬ kowany ATP, 0,1 m MgCl2 • 6H2O oraz znakowany kwas p-aminobenzoesowy.Probówki 1—9 zawierajace poszczególne skladniki w ilosciach podanych w tablicy I, dopelnia sie do 200 |jl1 woda destylowana, inkubuje w ciagu 60 minut w temperaturze 37°C, a nastepnie ochladza w lodzie i dodaje 20^1 roztworu dekstrozy o ste¬ zeniu 72,1 mg/ml oraz 5 p/l heksokinazy o stezeniu 2000 jednostek/ml i pozostawia na" okres 15 minut w temperaturze (pokojowej. Do ikazdej z probówek dodaje isie 10 mg wegla aktywnego Darco G-60 i wstrzasa od czasu do czasu w ciagu. 10 minut.Wegiel usuwa, sie saczac przez filtr Milipore AP 250 2000'. Wegiel i filtr przemywa sie trzykrotnie ml zimnej wódy, a nastepnie mierzy radio¬ aktywnosc wegla i filtru.Wartosc radioaktywnosci dla zawartosci probó¬ wek 2 i 3 przyjmuje sie za wartosci maksymalne, gdyz probówki te nie zawieraja zwiazku testowa¬ nego i tym samym wartosc inhibicji enzymu wy-91643 13 14 nosi 0%. Procent inhibicji uzyskiwany w miesza¬ ninach z pozostalych probówek oblicza sie wiec porównujac ich radioaktywnosc z maksymalna, oznaczona w podany powyzej sposób.Zawartosc probówek 10—12 analizuje sie chro¬ matograficznie w sposób opisany ponizej stosujac jako piróby kontrolne mieszaniny z probówek 10 i 11 nie zawierajace testowanego zwiazku (0°/o in¬ hibicji) i przyjmowane za 100%. Procent inhibicji wykazywany przez zawartosc probówek w tym tescie mozna wiec wyliczac w odniesieniu do po¬ wyzszego testu, przez porównywanie odpowiednich chromait oigraimów.Aktywnosc testowanego zwiazku o wzorze i wo¬ bec syntetazy (oznaczano mierzac wytwarzam? e kwasu dwuwodoropterynowego-C1*. Pule dwuwo- doropterydyny przygotowuje sie z 50 ^1 0,1 m zo- bcijetmiiEinego ATP, 50 fil 0,1 m M'gCl2 6H20, 100 fil 0,1 dwutiiotreitolu, 100 \d 0,4 m tEnis^buforu io war¬ tosci pH 8,3, 25 [xl 0,876 \im 2-amino-4-hydroksy- -6-hydrolksymetylo- 7,8-dwuwodtoropterydyny eraz 170 \d roztworu zawierajacego fosfokinaze. Miesza¬ lo ul 0,1 m MgCl2.6H20, 20 fil 0,1 m diitiotretiitolu, fil 0,4 m tris-buforu o wartosci pH 8,3, 10 fil" 0,4 mm kwasu p-aminobenzoesowego-C14 i 20 [xl roztworu zawierajacego fosfokinaze i syntetaze w znianiej alktyiwnosici. Do jedrnej z probówek dodaje sie zwiazek testowany i obie dopelnia woda desty¬ lowana do 200 |jl1.Wszystkie 7 probówek inkubuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze 37°C, chlodzi ledem i pod¬ daje, lacznie z kontrolnymi probówkami 10—12 analizie chromatograficznej.Po 100 fil zawartosci. kazdej, z probówek nanosi sie na bibule Whatmana nr 3MM (2X20 cm) i roz¬ wija w ukladzie zstepujacym 0,1 m buforem we^ dlug Sorensema o pH 7,0 skladajacym sie z roz¬ twór6w fosforanów potasowego i sodowego, na od¬ leglosc 10—15 cm. Z wairbo-sci wzglednych polozen plamek, pochodzacych ze skladników z róznych probówek, wylicza sie procent inhibicji syntetazy -w odniesieniu do próbek kontrolnych 10 i 11 wy¬ kazujacych 0°/o inhibicji.Zwiazki, które wykazuja 50% inhibicji w ste- Tablica I Nr probówki l 2 3 4 6 7 8 9 Kontrola 11 12 I (ii fil fil fJLl fil fil fil fil fil fil II 100 [ii 100 [ii 100 fil 100 fil 100 fil 100 fil 1 100 fil 100 fil 100 fil — III . fil fil fil fil fil fil fil fil - 15 \xl — IV — fil fil fil V fil fil fil fil fil fil fil fil ul — VI — fil (ii (ii VII — (ii fil fil VIII Stezenie j koncowe 1 2,5 xl0"6 m 2,5 xl0"6 m lxl0-6 m lxl0-6 m lxlQ-6 m 0,93x10 4 m 0,93 xl O-4 m lxl0-5 m IX — fil fil (ii X 0/ /o inhibicji 44 33 Si 55 98 95 79 mine inkubuje sie w ciagu 60 minut w tempera¬ turze 37°C, szybko ochladza w lodzie i dodaje do roztworu w temperaturze pokojowej 100 [ii dek- strozy o stezeniu 72,1 mg/ml oraz 20 fil heksoki- nazy o stezeniu 2000 jednostek/ml. Calosc pozo¬ stawia sie w temperaturze pokojowej w ciagu 15 minut.Do pieciu probówek, z których kazda zawiera roatiwor skladajacy sie z 10 fil 0,1 m MigGl2 • H20, jil . 0,4 \*m kwasu p-aminobenzoesowego-C14, |jil 0,1 m dwutiotreitolu oraz 20 fil 0,4 m trisbu- foru o wartosci pH 8,3 dodaje sie po 80 fil przy- t gotowanej uprzednio* puli wraz z syntetaza i/lub zwiazkiem 'testowym, zgodnie z programem przed¬ stawionym w tablicy II. Zawartosc kazdej z pro¬ bówek uzupelnia sie nastepnie woda destylowana do 200 fil.Dwie probówki feontrolne zawieraja kazda mie¬ szanine o nastepujacym skladzie: 10 [ii 0,1 m ATP, Tablica II 55 09 .Nr'¦"* probówki 1 2 3 4 Kontrola 6 7 Synte¬ taza + -u -h + — — Stezenie koncowe badanego zwiazku — . 8,7 Xl0~5 m 1 xl0"5 m 2,5 Xl0-6 m i — 1 x IO"5 m /o inhibicji — 9 0 83 i zeniiu 100 j^m, lub miniejiszym — sa uzyteczne ja¬ ko czynniki wzmacniajace dzialanie przeciw drob¬ noustrojom i jesli posiadaja odpowiednio niski po-91643 ifr 16 ziom toksycznosci,, moga wchodzic w sklad mie¬ szanin omawianych w niniejszym opisie.' ^Stwierdzono, ze 2-amino-4-hydroksy-7,7-dwuety- lo-6-formylo-7,8-dwuwodorapterydyna i jej analog 7,7-dwumetylowy wykazuja zdolnosc do 50% inhi- .bicji w stezeniu 5,5 ^m. PL