PL91092B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób radioimmunologi¬ cznego oznaczania substancji biologicznych, zwlaszcza hormonów, w plynach ustrojowych, przy uzyciu swoistych przeciwcial, kowalencyjnie zwiazanych z nierozpuszczal¬ nym nosnikiem.

Metody radioimmunologiczne, oparte na ilosciowym wiazaniu hormonu ze swoistym dla niego przeciwcialem, pozwalaja na oznaczanie nanogramowych ilosci hormo¬ nów w surowicach, ekstraktach tkankowych i plynach ustrojowych. W chwili obecnej metody te ze wzgledu na wysoka czulosc i swoistosc stanowia jedyna mozliwosc dokladnego oznaczania hormonów we krwi ludzkiej i sa szeroko stosowane w laboratoriach klinicznych i nauko¬ wo-badawczych. Powstalo wiec zapotrzebowanie na kom¬ pletny, wystandaryzowanyzestaw odczynników, pozwala¬ jacych na rutynowe wykonywanie analiz.

Dotychczasowe sposoby przeprowadzania radioimmu- nologicznych oznaczen hormonówwplynach ustrojowych, wykonywane za pomoca metody podwójnych przeciwcial lub tzw. fazy stalej, wykazuja duzo wad analitycznych.

Metoda podwójnych przeciwcial, polegajaca na wytra¬ ceniu kompleksu hormonu ze swoistym dla niego przeciw¬ cialem za pomoca drugiego przeciwciala, skierowanego przeciwko przeciwcialu, zwiazanemu w kompleks, wyma¬ ga uzycia trzech róznych surowic, jest pracochlonna w wy¬ konaniu i daje wynik dopiero po 3 - 5 dniach. Wynik ten uzalezniony jest od stalych dysocjacji dwu róznych kom¬ pleksów, znajdujacych sie w roztworze,przez coobciazony jest dodatkowym bledem.

W metodach fazy stalej do oddzielenia kompleksu od hormonu wolnego zamiast drugiego przeciwciala uzywane sa nierozpuszczalne sorbenty takie, jak talk, wegiel akty¬ wowany lub probówki, ewentualnie krazki z tworzyw sztucznych. Sa to jednak metody oparte na nieswoistych wlasciwosciach sorbcyjnych tych nosników, wobec czego pozbawione sa podstaw teoretycznych i nie zapewniaja nalezytej powtarzalnosci wyników.Dla podniesienia swo¬ istosci metod fazy stalej próbowano stosowac przeciwcia¬ la, kowalencyjne zwiazane z nierozpuszczalnym rozdrob¬ nionym nosnikiem. Jednakze stosowane do tego celu nosni¬ ki takie, jak proszek celulozowy czy hydrofilne zele (agar i jego pochodne), nie spelniajazadowalajaco swojego zada¬ nia ze wzgledu na zbyt rozwinieta powierzchnie i efekt sita molekularnego. Dodatkowa trudnosc w wykonaniu anali¬ zy sprawia sposób równomiernego rozdawkowania bardzo malych ilosci nosnika.

Sposób wedlug wynalazkupozbawionyjestwaddotych¬ czas stosowanych metod i polega na reakcji pomiedzy przeciwcialem, immobilizowanym na krazku bibuly, a hormonem, znajdujacym sie w roztworze. Kowalencyjne przywiazanie przeciwciala do bibuly zostalo osiagniete przez aktywacje grup -OH w celulozie za pomoca prostej reakcji np. bromocjanowania. Fakt, ze przeciwciala zosta¬ ly zwiazane zkrazkami bibuly, a nie rozdrobnionym nosni¬ kiem w zasadniczy sposób upraszcza metodyke postepo¬ wania. Krazki bibuly z przylaczonascisleokreslonailoscia przeciwcial umieszcza sie w roztworach, zawierajacych sladowa ilosc hormonu znakowanego i próby badane, wzglednie wzorcowe roztwory hormonów, sluzace do spo¬ rzadzenia krzywej kalibracyjnej. Po 15-20 godzinnej inku- 91 092/ 91 092 bacji w temperaturze pokojowej, krazki plucze sie woda i oznacza ich radioaktywnosc. Ilosc zwiazanego przez krazki hormonu znakowanego maleje wraz ze wzrostem stezenia hormonu nieznakowanego w mieszaninieinkuba- cyjnej. Pozwala to z prostolinijnego odcinka krzywej ka- libracyjnej odczytac ilosc hormonu, zawartego w próbie badanej.

Test wykonuje sie w sposób bardzo prosty, przy czym pomijane sa klopotliwe zabiegi oddzielania i plukania sladowych ilosci osadów za pomoca kilkakrotnego wiro¬ wania w ochlodzonych wirówkach, badz tez ich saczenia przez saczki membranowe.

Warunki analityczne wieludotychczas stosowanych me¬ tod pozwalaly na pomiar hormonów w surowicachdopiero po 2-3krotnym ich rozcienczeniu. Sprawa uwzgledniania, badz nieuwzgledniania tego wstepnego rozcienczenia su¬ rowic, jest zródlem wielu kontrowersji i utrudnia porów¬ nywanie wyników, uzyskiwanych przez rózne laboratoria.

Sposób wedlug wynalazku pozwala wykonywac pomiar w surowicach nierozcienczonych, a wiec prowadzi do oznaczenia rzeczywistej zawartosci hormonu w próbie.

Przyklad: Do 3000 krazków, wycietych z bibuly fil¬ tracyjnej, o srednicy 0,5 cm, zawieszonych w 600 ml wody dodano 600 ml 4% wodnego roztworu CNBr. Reakcje bromocjanowania prowadzonoprzez20minutw pH = 10,5 - 11,0, utrzymywanym przez automatyczne dawkowanie 2N NaOH, przy lagodnym mieszaniu. Nastepnie krazki przeplukano na lejku ochlodzona woda i 0,1 M buforem weglanowym o pH = 8,5. Natychmiast po odmyciu krazki umieszczono w 450 ml buforu weglanowego, zawierajace¬ go 300 ng gammaglobuliny przeciwko ludzkiemu hormo¬ nowi wzrostu (tj. 0,5 ng/cm2) i lagodnie mieszano przez noc , w temperaturze 4°C. Nastepnie krazki po przemyciu 0,5M NaHC03, woda, 0,1M buforem octanowym o pH = 4,0, woda i 0,5 M roztworem glicynyprzechowywano w buforze fosforanowym o pH = 7,4, zawierajacym 0,05% azydku sodu w temperaturze 4°C. Przydatnosc tak przygotowa¬ nych krazków do oznaczen radioimmunologicznych sprawdzono w sposób nastepujacy. Do szeregu probówek dano po 10 fil (0,5 ng) hormonu wzrostu, znakowanego 40 jodem radioaktywnym, rfastepnie do czesci probówek do¬ dano po 0,5 ml kalibrujacych roztworów, zawierajacychod 0,0625 do 16 ng hormonu wzrostu, a do pozostalych po 0,1 ml badanych surowic i 0,4 ml buforu weronalowego, za¬ wierajacego 0,2% albuminywolowej. Bufor tenbyl uzywa¬ ny do rozcienczania wszystkich pozostalych roztworów.

Wyniki obliczano w stosunku do próbek odniesienia, za¬ wierajacych tylko hormon znakowany i 0,5 ml buforu weronalowego. W kazdej z probówek umieszczano krazek bibuly i poddawano je wytrzasaniu przez 15-20 godzin, w temperaturze pokojowej, po czym krazki oplukiwano woda i liczono ich radioaktywnosc. Ilosc impulsów, znale¬ ziona na krazkach, zmniejszala sie wraz ze wzrostem stezenia hormonu nieznakowanego w mieszaninie inkuba- cyjnej. Zakres stezen hormonu nieznakowanego, wktórym zachowana byla prostolinijnosc krzywej kalibracyjnej wy¬ nosil od 0,0625 do 8,0 ng, co pozwalalo oznaczyc od 0,6 do 80 ng hormonu wzrostu w 1 ml surowicy, gdyz do analizy brano po 0,1 ml surowicy. Zakres ten moze byc jednak regulowany iloscia przylaczonych do krazka bibuly prze¬ ciwcial, co w zaleznosci od potrzeb umozliwia oznaczanie zarówno malych, jak i duzych ilosci hormonu. Analiza wielu róznych surowic wykazala, ze ilosc oznaczanego w nich hormonu wzrostu proporcjonalnie malala wraz z rozcienczaniem surowicy.

Opisana metoda daje mozliwosc wprowadzeniana rynek znacznie tanszych i dogodniejszych w uzyciu zestawów, niz dotychczas dostepnych zestawów podwójnych prze¬ ciwcial do radioimmunologicznych oznaczen hormonów. .%/..

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób radioimmunologicznego oznaczania substancji biologicznych, zwlaszcza hormonów, w plynach ustrojo¬ wych przy uzyciu swoistych przeciwcial, kowalencyjnie zwiazanych z nierozpuszczalnym nosnikiem, znamienny tym, ze swoiste przeciwciala przylacza sie kowalencyjnie do bibuly, uprzednio zaktywowanej, korzystnie bromocy- janem. Sklad wykonano w DSP, zam 2245'ZC Druk w UPPRL, n..k!al i:>:'. -i 20 *