PL88752B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia metabolitu A-27106, stosowanego do leczenia kokcydiozy u ptactwa, a takze do zwiekszania przyswajania pokarmu przez zwierzeta przezuwa¬ jace.W zakres wynalazku wchodzi sposób otrzymy¬ wania metabolitu A-27106, jego formy kwasowej, soli amonowej, litowej, potasowej, rubidowej lub cezowej. Metabolit A-27106 jest biala krystaliczna substancja, stosunkowo dobrze rozpuszczalna w nizszych alkoholach alifatycznych ale zupelnie nierozpuszczalna w nizszych alkanach, posiadaja¬ ca nastepujace wlasciwosci: ciezar czasteczkowy, obliczony z widma masowego, 854; przyblizona a- naliza elementarna: wegiel — 58,78%, wodór — 8,51%, tlen — 27,85%, sód 3,63%; wzór suma¬ ryczny: C42H71016Na; widmo absorpcyjne w pod¬ czerwieni, w chloroformie przedstawione na zala¬ czonym rysunku; w widmie masowym wystepuje sygnal jonu macierzystego przy m/e 854,44630 oraz charakterystyczne sygnaly przy m/e 836,44129, 779,44690, 761,44740; wartosc Rr wynosi 0,49, pod¬ czas chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym, w ukladzie rozwijajacym benzen- -metanol (7:3).Zwiazek w postaci wolnego kwasu jest biala sub¬ stancja o ciezarze czasteczkowym okolo 832 i po¬ siada dajaca sie miareczkowac grupe o wartosci pKa, wynoszacej 7,2. Metabolit A-27106 otrzymuje sie podczas hodowania Streptomyces candidus NRRL 5449 w pozywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i sole nieorga¬ niczne, w warunkach hodowli podpowierzchnio- wej z napowietrzaniem, w obecnosci glukozy i mo- nenzyny, prowadzac proces, az do przeksztalcenia monenzyny w znaczna ilosc metabolitu A-27106.Metabolit A-27106, otrzymany sposobem wed¬ lug wynalazku stosuje sie tio zapobiegania lub le¬ czenia kokcydiozy ptactwa, przez podawanie sku- io tecznej ilosci kompozycji, zawierajacej metabolit A-27106 i dopuszczalny fizjologicznie nosnik, oraz do zwiekszania przyswajania pokarmu przez zwie¬ rzeta przezuwajace, posiadajace rozwiniety uklad przezuwania. Metabolit A-27106 podaje sie tym zwierzetom doustnie w ilosci, zwiekszajacej po¬ ziom propionianu.Kokcydioza jest dobrze znana choroba, wywo¬ lywana przez zakazenie pierwotniakami z jednego lub wiecej gatunków Eimeria lub Isospora, opi- sana szczególowo przez Lunda i Parra w „Dise- ases of Poultry", wyd. 5, wydawcy Biester and Schwarte, Lowa State Uniwersity Press, Ames, la, str. 1056—1096. Ze wzgledu na wysokie straty ekonomiczne, powodowane przez kokcydioze oraz trudnosci zwiazane ze stosowaniem niektórych znanych kokcydiostatyków, trwaja poszukiwania nowych, lepszych srodków.Zwierzeta przezuwajace maja duze znaczenie gospodarcze, dlatego tez zwiekszenie przyswajania przez nie pokarmu jest powaznym problemem. 88 7523 88 752 4 Mechanizm przyswajania wiekszosci skladników pozywienia (weglowodanów) przez zwierzeta prze¬ zuwajace jest bardzo dobrze poznany. Drobnou¬ stroje w zwaczu zwierzecym fermentuja weglo¬ wodany do monocukrów, które z kolei sa prze¬ ksztalcane w pochodne kwasu pirogronowego.Nastepnie na drodze procesów mikrobiologicznych, pirogroniany przeksztalcane sa w octany, maslany lub propioniany, znane pod wspólna nazwa — lotne kwasy tluszczowe..Problemy wzglednej zdolnosci przyswajania lot¬ nych kwasów tluszczowych dyskutowane sa w pracy McCullougha, Feedstuff, 19 czerwca 1971, stronfl |9j Eskelanda i wspólpracowników, J.Am.Scil AmffilWZy jprazjChurcha i wspólpracowni¬ ków — „Digestive Plysiology and Nutrition of Rulnnants", tom 2, ltrony 622 i 625, 1971. Ze wsj^L!tql"Mnyfr|g piej ^yg^g?^ ftjfflfronioniany. a przy ich nie¬ doborze u zwierzat, moze wystepowac ketoza.Dlatego tez zastosowanie preparatu, który pobu¬ dza zwierzeta do wytwarzania propionianów, po¬ zwala na zwiekszenie przyswajania weglowodanów oraz zmniejsza ilosc przypadków ketozy.Monenzyna, z której otrzymuje sie metabolit A-27106, zostala opisana w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3.501.568 jako czynnik A z kompleksu antybiotycznego A3823, jest ona takze srodkiem przeciwko kokcydiozie.Biologicznie czynny metabolit, wedlug niniej¬ szego wynalazku, zostal dowolnie nazywany me¬ tabolitem A-27106. Nazwa ta dotyczy soli sodowej preparatu, który poza tym moze wystepowac w postaci soli amonowej, litowej, potasowej, rubido- wej lub cezowej oraz w postaci wolnego kwasu.Wyjsciowa substancja, z której otrzymuje sie metabolit A-27106 jest monenzyna. Strukture soli sodowej monenzyny przedstawia wzór 1.Sól sodowa monenzyny otrzymuje sie podczas hodowli drobnoustroju Streptomyces cinnamonen- sis, w sposób opisany w opisie patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych nr 3t501,568.Metabolit A-27106 otrzymuje sie z monenzyny lub z grzybni, w której jest wytwarzana monen¬ zyna, w obecnosci glukozy za pomoca enzymu lub enzymów produkowanych przez nowy szczep Streptomyces candidus. Hodowla tego nowego szczepu zostala zdeponowana, bez zastrzezen co do dostepnosci, w kolekcji szczepów w Northern Utilization Ressearch and Development Division, Agricultural Research Service, United States De¬ partament of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, pod numerem NRRL 5449.Poniewaz badania taksonomiczne drobnoustro¬ jów z grupy promieniowców nie sa jeszcze do¬ statecznie pewne, zawsze wystepuje element wat¬ pliwosci w prawidlowym zaklasyfikowaniu nowo odkrytych drobnoustrojów. Najwazniejsze cechy charakterystyczne pozwalaja jednak na stwierdze¬ nie, ze drobnoustrój NRRL 5449, przeksztalcajacy monenzyne w metabolit A-27106, jest najbardziej zblizony do Streptomyces candidus (Krassilnikow) Waksman 1953. Podstawowy szczep zostal opisa¬ ny przez Waksmana w pracy „The Actinomycetes", tom II, Wiliams and Wilkins, Baltimore, 1961, strona 187. Znajduje sie on takze w depozycie w Institute of Microbiology, Buifgers University, New Brunswick, N.J., pod numerem IMRU 3416.Zastosowany w niniejszym sposobie drobnoustrój nalezy uwazac za nowy szczep opisanego powyzej drobnoustroju. Aczkolwiek S. candidus NRRLh5449 i znany szczep sa do siebie podobne pod wzgle^ dem ogólnej morfologii grzybni i barwy oraz wy- !0 gladu sporów, wystepuja miedzy nimi dostateczne- róznice, by mozna bylo opisywany drobnoustrój uwazac za nowy szczep. Przykladowo, znany dro¬ bnoustrój nie koaguluje mleka i powoli uplynnia zelatyne, podczas gdy nowy szczep wyWoluje ko- is agulacje po 14 dniach i nie uplynnia zelatyny w ciagu 21 dni. Ponadto, co jest najbardziej rwazne, hodowla szczepu IMRU 3416 nie przeksztalca' mo¬ nenzyny w metabolit A-27106. ^ ,; Drobnoustrój, który przeksztalca monenzyne w metabolit A-27106, zostal wyizolowany z próbek gleby, pobranej w Turcji na górze Ararat. Porcje gleby zawieszono w jalowej wodzie destylowanej i nanoszono na agar odzywczy. Plytki z zaszcze¬ pionym agarem inkubowano w temperaturze 25—35°C, az do uzyskania widocznych kolonii. Po zakonczeniu inkubowania, wybrane kolonie dro¬ bnoustroju przenoszono za pomoca jalowej ezy platynowej na skosy agarowe. Po inkubowaniu skosów uzyskiwano odpowiednia ilosc inokulum szczepu NRRL 5449.W badaniach taksonomicznych szczepu S. candi¬ dus NRRL 5449 stosowano metody, zalecane przez International Cooperative Project for Deseription and Deposition of Streptomycetes i postepowanie, opisane przez Shirlinga i Gottlieba w pracy „Met- hods for Characterization of Streptomyces Species", International Bulletin of Systematic Bacteriology, 16, 313—340(1966) oraz inne uzupelniajace testy.Symbol ICP dotyczy pozywek, opisanych przez 40 Shirlinga i Gottlieba, pozostale pozywki zostaly opisane przez Waksmana, w cytowanej pracy.Barwy opisywano zgodnie z nomenklatura, peda- na przez Kelly'ego i Judda w „The ISC—NBS Method of Designating Colors and a Dictionary 45 of Color Names", okólnik 553, Departament Han¬ dlu Stanów Zjednoczonych, 1955 rok. Oznaczenia w nawiasach dotycza serii barw wedlug Tresnera i Backusa, „System of Color Wheels for Strepto¬ myces Taxonomy", Appl, Microbiol., 11, 335(1963). 50 Oznaczenia z tablic barw sa podkreslone, a w nawiasach kwadratowych podane sa oznaczenia wedlug Maerza i Paula (Dictionary of Color, McGraw-Hill, N.Y., 1950).Streptomyces NRRL 5449 charakteryzuje sie 55 prostym lub pofaldowanymi sporoforami i obec¬ noscia 10 do 50 sporów o ksztalcie owalnym do lekko cylindrycznego i przecietnych wymiarach 1,165X0,57 \x. Spory, obserwowane w mikroskopie elektronowym, sa gladkie. Grzybnia powietrzna 60 jest zazwyczaj biala. W temperaturze 26°C obser¬ wuje sie jedynie wzrost wegetatywny, zas w tem¬ peraturze 45°C wzrostu nie obserwuje sie. Naj¬ wiekszy wzrost i sporulacja zachodzi w zakresie temperatur 30—37°C. 65 Zgodnie z przyjetym postepowaniem wzrost5 88 752 6 drobnoustroju NRRL 5449 badano, stosujac szereg pozywek stosowanych w badaniach promieniow¬ ców oraz jednolite i standardowe postepowanie.Charakterystyka hodowlana'4 na róznych pozyw¬ kach przedstawiona jest ponizej.ICP 1 Wzrost wyrazny; spód bladozólty [11C1]; brak grzybni powietrznej i sporów; brak rozpusz¬ czalnych pigmentów.ICP 2 Wzrost obfity; spód lekkozólty [10J3]; obfita grzybnia powietrzna i spory, (W) biala a; brak rozpuszczalnych pigmentów.ICP 3 Wzrost dobry; spód bladozólto-zielony [10C1]; dobra grzybnia powietrzna i spory, (W) biala a; brak rozpuszczalnych pigmentów.ICP 4 Wzrost dobry do obfitego; spód umiar¬ kowanie zólty [10H4]; dobra do obfitej grzybnia i spory, (W) biala a; brazowe rozpuszczalne pig¬ menty.ICP 5 Wzrost obfity; spód umiarkowanie poma- ranczowo-zólty [1016]; obfita grzybnia powietrzna i spory, (Y) bladozólta 2db; jasnobrazowe rozpusz¬ czalne pigmenty.ICP 7 Wzrost dobry; spód bladozólto-zielony [10B1]; dobra grzybnia powietrzna i spory, (W) biala a; brak rozpuszczalnych pigmentów.Pozywka Glicerynowo-Glicynowa — Wzrost ob¬ fity; spód sredniobrazowy [11J4]; obfite zarodni¬ kowanie i grzybnia powietrzna, (W) biala a i (Y) bladozólta 2db; lekkojasnobrazowe rozpuszczalne pigmenty.Pozywka Emersona — Wzrost obfity; spód sza- rawo-zólty [12H3]; brak grzybni powietrznej i spo¬ rów; brak rozpuszczalnych pigmentów.Pozywka Benetta — Wzrost dobry; spód jasno- zólty [1112]; skapa grzybnia powietrzna i spory, (W) biala a; brak rozpuszczalnych pigmentów.Pozywka Czapka — Wzrost obfity; spód umiar¬ kowanie pomaranczowo-zólty [11J7]; obfita grzy¬ bnia powietrzna i spory, (W) biala a; brak roz¬ puszczalnych pigmentów.Pozywka Glukozowo-Asparaginowa — Wzrcst wyrazny do dobrego; spód bladozólto-zielony [10B1]; brak grzybni powietrznej i sporów; brak rozpuszczalnych pigmentów.Pozywka z jablczanem wapnia — Wzrost obfity; spód szarawo-zólty [11E4]; obfita grzybnia po¬ wietrzna i spory, (Y) bladozólta 2ba; lekkobrazo- we rozpuszczalne pigmenty.Agar odzywczy — Wzrost dobry; spód blado¬ zólto-zielony [10C1]; brak grzybni powietrznej i sporów; brak rozpuszczalnych pigmentów.Badano wybrane wlasciwosci fizjologiczne dro¬ bnoustroju, stosujac standardowe postepowanie i uzyskujac wyniki podane w tablicy 1.Wyniki badania przyswajania wegla przez drobnoustrój NRRL 5449 przedstawiono w poniz¬ szym zestawieniu, symbole uzyte w którym maja nastepujace znaczenie: + — przyswajanie, dobry wzrost; (+) — prawdopodobne przyswajanie, wzrost wy¬ razny do ubogiego; (—) — przyswajanie watpliwe, wzrost nieznaczny lub brak; — — brak przyswajania, brak wzrostu.Tablica 1 Obserwowana wlasciwosc Dzialanie na mleko zbierane Redukcja azotanów wytwarzanie melani- ny pozywka z tryptonem i wyciagiem drozdzo¬ wym agar tyrozynowy Uplynnianie zelatyny wymagania tempera¬ turowe Wyniki klarowanie, koagula¬ cja po 14 dniach tak nieznaczne brak wytwarzania brak w ciagu 21 dni 26°C — tylko wzrost wegetatywny, —37°C — dobry wzrost wegetatywny; dobra grzybnia po¬ wietrzna i spory 43—55°C — brak wzrostu.Zródlo wegla Rafinoza D-fruktoza Cellobioza L-arabinoza D-mannitol Ramnoza Celuloza Dekstroza D-ksyloza Inozytol —C(nie pochodzacy z weglowodanów) Przyswajanie + (+) (+) (+) (+) (+) (-1^) do (-) (+) + (-) do (+) Do hodowli S. eandidus NRRL 5449 mozna sto¬ sowac wiele róznych pozywek, niektóre jednak z nich sa szczególnie korzystne ze wzgledu na ekonomike procesu, optymalna wydajnosc i la¬ twosc izolowania otrzymanego produktu. Przykla¬ dowo, dla fermentacji w duzej skali korzystnymi zródlami wegla sa: inwertowany cukier lub sy¬ rop kukurydziany, chociaz moze byc równiez sto¬ sowana fruktoza, glukoza, maltoza, skrobia, ino¬ zytol i podobne weglowodany. Podczas przeksztal¬ cania w metabolit A-27106, pozywka fermentacyj¬ na, w której hoduje sie S. eandidus NRRL 5449, musi zawierac zródlo glukozy, niezbednej dla uzys¬ kania wydajnego przeksztalcenia. Obecnosc glu¬ kozy jest niezbedna dla wytworzenia przez hodo¬ wany drobnoustrój S. eandidus NRRL 5449 enzy¬ mów, sluzacych do przeksztalcania monenzyny w metabolit A-27106. Korzystnymi zródlami azotu sa peptony, maka sojowa, mieszaniny aminokwa¬ sów i podobne. Do odzywczych soli nieorganicz¬ nych, które moga wchodzic w sklad pozywki ho¬ dowlanej, naleza zwykle rozpuszczalne sole, zdol¬ ne do oddawania zelaza, sodu, potasu, jonu amo¬ nowego, wapnia, fosforanu, chlorku, weglanu i podobnych jonów.W sklad pozywki powinny takze wchodzic sla¬ dowe pierwiastki, niezbedne dla wzrostu i roz- 40 45 50 55 607 88 752 8 woju drobnoustroju. Zazwyczaj znajduja sie one w postaci zanieczyszczen w innych skladnikach pozywki w ilosci, pokrywajacej zapotrzebowanie drobnoustroju.Poczatkowa wartosc pH pozywki hodowlanej moze byc rózna. Korzystnie jest jednak przed za¬ szczepieniem, doprowadzic pH pozywki do war¬ tosci od okolo 5,7 do okolo 7,5, w zaleznosci od jej rodzaju. Podobnie, jak w przypadku innych pro¬ mieniowców, pozywka w miare postepu fermen¬ tacji alkalizuje sie i wartosc pH moze wzrosnac od poczatkowej 5,9 do okolo 6,9 lub wyzszej, pod¬ czas okresu wzrostowego drobnoustroju. Wartosc koncowa pH reguluje sie, przynajmniej czesciowo, poziomem wyjsciowym pH, dodatkiem buforów oraz dlugoscia okresu wzrostowego. Mozna takze regulowac wartosc pH za pomoca dodawania kwasu lub zasady, dobre jednak wyniki osiaga sie bez dodatkowej regulacji.Tak samo, jak i inne drobnoustroje z gatunku Streptomyces, szczep NRRL 5449 wzrasta w ho¬ dowli z napowietrzaniem. Rozmnazanie w malej objetosci mozna z powodzeniem prowadzic na skosach agarowych, plytkach, w kolbach na trze- sawce lub w kolbach kulturowych. Dla produkcji w wielkiej skali korzystnie jest stosowac hodowle podpowierzchniowa z napowietrzaniem, w duzych fermentorach.Pozywke fermentacyjna w jalowym fermento- rze mozna zaszczepiac, w celu zapoczatkowania fermentacji, zarodnikujaca zawiesina drobnoustro¬ ju. Bardziej jednak korzystne jest zaszczepianie inokulum wegetatywnym, gdyz w przypadku po¬ staci zarodnikujacej nastepuje opóznienie wzrostu.Inokulum wegetatywne przygotowuje sie, zaszcze¬ piajac mala porcje pozywki postacia zarodnikuja¬ ca lub fragmentami grzybni. Otrzymuje sie wte¬ dy swieza, aktywna hodowle drobnoustroju. Ta¬ kie inokulum przenosi sie do duzego fermentora.Dla wzrostu inokulum wegetatywnego stosuje sie pozywke taka sama, jak do fermentacji w duzej skali, mozna jednak stosowac równiez inne po¬ zywki.Drobnoustrój S. candidus NRRL 5449 wzrasta w zakresie temperatur od okolo 26°C do okclo 40°C. Najlepszy wzrost i zarodnikowanie zachodzi jednak w temperaturze okolo 32—37°C.Tak samo, jak we wszystkich procesach fer¬ mentacji podpowierzchniowej z napowietrzaniem, przez pozywke podczas fermentacji przepuszcza sie jalowe powietrze. Dla wydajnego wzrostu dro¬ bnoustroju i wytwarzania metabolitu A-27106, ilosc powietrza, przepuszczanego podczas produk¬ cji w duzej skali, powinna byc wieksza o$l 0,1 objetosci na minute na objetosc pozywki. Najwyz¬ sza wydajnosc uzyskuje sie, przepuszczajac co naj¬ mniej 1/3 do 1/2 objetosci powietrza na minute, na objetosc pozywki.Dla przeksztalcenia monenzyny w metabolit A-27106 niezbedny jest rózny czas fermentacji. W procesie przeksztalcania monenzyny w metabolit A-27106 zasadnicze znaczenie ma obecnosc odpo¬ wiedniej ilosci glukozy. Na ogól, jesli pozywka zawiera odpowiednia ilosc glukozy, a stezenie mo¬ nenzyny wynosi od okolo 0,1 do okolo 1,0 g na litr pozywki, calkowite przeksztalcenie monenzyny w metabolit A-27106 zachodzi w ciagu okolo 36—72 godzin. Najlepsze wyniki uzyskuje sie, gdy stezenie monenzyny wynosi 0,5—0,7 g na litr po- zywki. Odpowiednia ilosc glukozy wynosi od oko¬ lo 2,0 do okolo 2,5% wagowych w stosunku do pozywki. Do sprawdzania stezenia glukozy mozna stosowac papierki wskaznikowe. W przypadku, gdy stezenie glukozy spadnie ponizej okolo 2%, nalezy jej ilosc uzupelniac.Poniewaz do przeksztalcania monenzyny w me¬ tabolit A-27106 wykorzystywany jest system enzy¬ matyczny S. candidus, nie ma zasadniczego zna¬ czenia przygotowywanie enzymu o wysokiej czys- tosci. Przykladowo, mozna liofilizowac przesaczo¬ na brzeczke fermentacyjna i przechowywac ja w ciagu dwóch tygodni. Przed uzyciem rozpuszcza sie liofilizat w wodnym roztworze buforu i stosu¬ je w objetosci, wynoszacej w przyblizeniu 1/6 objetosci pierwotnej. Wydajna konwersje uzysku¬ je sie po 72 godzinach, stosujac 2,5 g liofilizowa¬ nego preparatu oraz 25 mg monenzyny.Aktywny system znajduje sie zarówno w prze¬ saczonej brzeczce, jak i w komórkach. Preparaty enzymatyczne o wyzszej czystosci uzyskuje sie z wyizolowanych komórek. Komórki te po zamro¬ zeniu mozna przechowywac w ciagu co najmniej trzech miesiecy. Po rozmrozeniu komórki zawie¬ sza sie w roztworze buforowym. Zawiesine w bu¬ forze oczyszcza sie dodatkowo, stosujac ultra¬ dzwieki i nastepnie odwirowanie. Oczyszczone szczatki komórek zawiesza sie powtórnie w bu¬ forze i dializuje. Stosujac powyzsza* metode, otrzy¬ muje sie z 200 g komórek brzeczki fermentacyjnej ilosc oczyszczonego liofilizatu, wystarczajaca do przeksztalcenia glukozy i 25 mg monenzyny w me¬ tabolit A-27106.Przebieg procesu przeksztalcania mozna kon- 40 trolowac, stosujac chromatografie cienkowarstwo¬ wa na zelu krzemionkowym (typ F-254, E-N La¬ boratories, Inc., Elmsford, N,Y.). Wartosc Rf w ukladzie rozwijajacym benzen-metanol (7:3) wy¬ nosi dla monenzyny 0,62, zas dla metabolitu 45 A-27106 odpowiednio 0,49. Do wywolywania sto¬ suje sie odczynnik wanilinowy, który przygotowu¬ je sie dodajac 2 ml dymiacego kwasu siarkowego do roztworu 3 g waniliny w 100 ml bezwodnego etanolu. 50 Metabolit A-27106 znajduje sie zarówno w brzeczce, jak i w grzybni. W zwiazku z tym opra¬ cowano sposób, pozwalajacy na maksymalne odzyskiwanie produktu z obu zródel. Przyklado¬ wo, brzeczke fermentacyjna saczy sie i ekstrahuje 55 odpowiednim rozpuszczalnikiem metabolit A-27106 z przesaczu i osadu. Z plynów ekstrakcyjnych odzyskuje sie produkt, stosujac zwykle, znane sposoby.W innej wersji, osad z brzeczki, zawierajacy 60 skladniki pozywki i grzybnie, mozna stosowac z pominieciem ekstrakcji i wyodrebniania jako zródlo metabolitu A-27106, korzystnie po usunie¬ ciu wody. Przykladowo, brzeczke mozna liofilizo¬ wac i stosowac jako domieszke do pokarmu. Mo- 65 zna równiez sporzadzac, po odciagnieciu czesci9 88 752 wody, rzadka zawiesine, która nadaje sie jako do¬ datek do mokrych pokarmów.Nie stosuje sie zadnego sposobu wyodreb¬ niania, polegajacego na jednokrotnej ekstrakcji.W jednym z zadowalajacych sposobów brzeczke po fermentacji saczy sie, stosujac pomoc filtracyj¬ na. Osad ekstrahuje sie polarnym rozpuszczalni¬ kiem, na przyklad metanolem. Ekstrakt metanolo¬ wy zateza sie i dolacza do przesaczu. Polaczone roztwory ekstrahuje sie dwukrotnie polowa obje¬ tosci chloroformu. Ekstrakty chloroformowe zage¬ szcza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac oleista pozostalosc o barwie ciemnobursztynowej.Oleisty produkt odbarwia sie na weglu aktyw¬ nym, stosujac chloroform i okolo 20 g wegla na gram produktu. Eluaty zageszcza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem i otrzymuje bezbarwny do bladozóltego, oleisty produkt. Olej rozpuszcza sie w minimalnej ilosci chloroformu i poddaje chro¬ matografii na kolumnie z zelem krzemionkowym, stosujac jako rozpuszczalnik octan etylu. Eluaty kontroluje sie, stosujac chromatografie cienkowar¬ stwowa. Zanieczyszczenia eluuje sie octanem ety¬ lu, a metabolit A-27106 mieszanine octanu etylu i metanolu.Metabolit A-27106 w postaci soli sodowej jest biala krystaliczna substancja, o temperaturze top¬ nienia okolo 170—175°C (z rozkladem). Metabolit A-271,06 tworzy bardzo latwo hydraty lub inne solwaty. W tym przypadku temperatura topnienia jest na ogól nizsza o kilka stopni.Analiza elementarna metabolitu A-27106 dala nastepujace wyniki: wegiel 58,78, wodór 8,51, tlen 27,85 oraz sód 3,63%. Wartosci te sa zgodne z wzo¬ rem empirycznym C42H71016 i teoretycznym skla¬ dem, wynoszacym: wegiel 59,00, wodór 8,37, tlen 29,94 oraz 2,42°/o.W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie metabo¬ lit A-27106 nie wykazuje praktycznie pasm absor¬ pcji w zakresie powyzej okolo 235 //.Widmo absorpcyjne metabolitu A-27106 w pod¬ czerwieni, w chloroformie, przedstawione jest na zalaczonym rysunku. Wystepuja w nim nastepu¬ jace glówne pasma absorpcji, przy dlugosci fali 3,1, 3,36, 6,39, 6,83, 7,1, 7,25, 7,9, 8,1, 8,3, 8,67, 8,8 9,04, 9,22, 9,51, 9,66, 10,03, 10,26, 10,66, 11,23, ir,47, 11,83 oraz 12,15 mikronów.W widmie masowym metabolitu A-27106 wyste¬ puje jon macierzysty oraz inne charakterystyczne sygnaly, wymienione w tablicy 2.Tablica 2 [ . m/e obliczono £54,46230 836,45229 779,45490 761,44540 zaobserwo¬ wano 854,44630 836,44129 779,44690 761,44740 Fragment C42H71016Na * • (M+) C42H69013Na (M+ - H20) C40H68Q13Na [M+ -(CH30+G02)] C40HC6O12Na [M+ — Powyzsze dane potwierdzaja zalozony wzór su¬ maryczny i ciezar czasteczkowy 854 dla soli sodo¬ wej metabolitu A-27106.Metabolit A-27106 jest na ogól dobrze rozpu- szczaihy w wysoce polarnych rozpuszczalnikach, a nierozpuszczalny w niepolarnych, natomiast wy¬ kazuje rózna rozpuszczalnosc w rozpuszczalnikach " umiarkowanie polarnych. Przykladowo, jest on rozpuszczalny w nizszych alkoholach alifatycz¬ nych, czesciowo rozpuszczalny w fenolu, eterze ~ etylowym i acetonie oraz prawie nierozpuszczalny w cieklych nizszych alkanach.Miareczkowanie potencjometryczne formy kwa¬ sowej metabolitu A-27106 w wodzie, przy poczat¬ kowym pH, wynoszacym 8, wykazuje obecnosc jednej, dajacej sie miareczkowac grupy i wartosc pKa 7,2.Sól jednosodowa jest naturalna postacia meta¬ bolitu A-27106. Z soli sodowej latwo mozna otrzy¬ mac kwas, natomiast z kwasu sól amonowa i sole z metalami alkalicznymi. Rózne sole z metalami zachowuja sie czasami, jak sole kwasów karboksy- lowych z metalami alkalicznymi, czasami podob¬ nie, jak chelaty.W celu przejscia w inna forme, metabolit A-27106 rozpuszcza sie w wodnym roztworze roz¬ puszczalnika, na przyklad w mieszaninie metano¬ lu i wody, i dodaje kwas, na przyklad kwas sol¬ ny, do pH=5 lub nizszego. Metanol odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostaly roz¬ twór wodny ekstrahuje sie chloroformem. Ekstrakt chloroformowy suszy sie i odparowuje, otrzymu¬ jac wolny kwas.Metabolit A-27106 moze byc stosowany w for¬ mie kwasowej lub poddawany dalszym modyfika¬ cjom, polegajacym na miareczkowaniu wodnym roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego lub amoniaku. Otrzymuje sie odpowiednio sól litowa, rubidowa, cezpwa lub amonowa. Metabolit w po¬ staci wolnego kwasu i soli z metalami alkaliczny¬ mi wykazuje aktywnosc biologiczna.Dokladna struktura metabolitu A-27106 nie jest znana. ;Wiadomym jest, ze do przeksztalcenia mo- nenzyny w metabolit A-27106 niezbedna jest glu¬ koza, która jest zuzywana nawet w przypadku nie¬ obecnosci komórek S. candidus. Ciezar czasteczko¬ wy metabolitu A-27106 odpowiada ciezarowi mo- nenzyny z reszta glukozowa.Poza silnie zablokowana przestrzennie trzecio¬ rzedowa grupa hydroksylowa w pierscieniu E, w czasteczce glukozylomonenzyny powinno sie znaj¬ dowac piec dalszych grup hydroksylowych, podat¬ nych na reakcje tworzenia prostych estrów takich, jak octan., Obecnosc wszystkich tych reaktywnych centr potwierdzona zostala doswiadczalnie w re¬ akcji estryfikacji.Na podstawie powyzej przedstawionych danych fizycznych mozna dla metabolitu A-27106 zapro¬ ponowac strukture, wyrazona wzorem 2. Zrozu¬ mialym jest, ze powyzsza struktura reprezentuje jedynie hipoteze robocza.Metabolit A-27106 jest mniej toksyczny niz mo- nenzyna.Podczas podawania dojelitowego grupie szesciu myszy w dawce 50 mg/kg padla jedna na szesc 40 45 50 55 6088 752 11 zas w dawce 100 mg/kg padly trzy z szesciu my¬ szy* W podobnym tescie, podczas którego podawano grupie szesciu myszy dojelitowo monenzyne przy dawce 10 mg/kg padla jedna z szesciu, natomiast w dawce 20 mg/kg trzy z szesciu myszy.Dla, zapobiegania lub leczenia kokcydiozy u ptactwa, podaje sie nietoksyczna, skuteczna kokcydiostatycznie ilosc metabolitu A-27106, ko¬ rzystnie doustnie. Przy ustaleniu odpowiedniej ilosci metabolitu A-27106 nalezy brac pod uwage wiele czynników, na ogól dodaje sie w ilosci 0,005 do 0,05% w stosunku do niezawierajacego innych leków pozywienia, korzystnie 0,01 — 0,04%. Meta¬ bolit A-27106 mozna podawac w rózny sposób, ale najbardziej korzystnym jest podawanie z dopu¬ szczalnym fizjologicznie nosnikiem, szczególnie ze spozywanym przez ptaki pokarmem.Metabolit A-27106 poprawia takze przyswajanie pokarmu przez zwierzeta przezuwajace, posiadaja¬ ce rozwiniety uklad przezuwania. Mlode przezu¬ wajace, szczególnie nie odstawione jeszcze od ssa¬ nia, funkcjonuja jako zwierzeta jednozoladkowe.Z chwila rozpoczecia spozywania pokarmów sta¬ lych, zaczyna sie u nich rozwijac system przezu¬ wania i wzrost flory bakteryjnej w zwaczu. Po calkowitym przejsciu na pokarm staly, system przezuwania rozwija sie w pelni i pelni swoje funkcje przez caly okres zycia zwierzecia. Do waznych gospodarczo zwierzat przezuwajacych nalezy bydlo, owce i kozy.Metabolit A-27106 dziala skutecznie w zwieksza¬ niu przyswajania pokarmu przy podawaniu do¬ ustnym w ilosci od okolo 0,05 mg/kg dziennie do okolo 2,5 mg/kg dziennie. Lepsze rezultaty osiaga sie, podajac w ilosci od okolo 0,1 mg/kg dziennie do okolo 1,5 mg/kg dziennie. Korzystnym sposo¬ bem podawania metabolitu A-27106 jest mieszanie go z pokarmem, mozna jednak podawac go w in¬ ny sposób, na przyklad w postaci tabletek, wle¬ wek lub kapsulek. Przygotowuje sie te postacie, stosujac znane w farmacji weterynaryjnej sposo¬ by. Kazda pojedyncza dawka powinna zawierac 12 40 zacych do gatunku ciezkich brojlerów. Kurczeta podzielono na piec grup po 15 sztuk kazda, kaz¬ da z kolei grupe podzielono na trzy podgrupy.Pierwszej grupie, traktowanej jako grupa kontrol¬ na, nie podawano zadnych preparatów i przetrzy¬ mywano ja w dobrych warunkach. Druga grupe zarazano kokcydioza, podajac doustnie 105 zarod¬ nikujacych oocytów Eimeria tenella. Grupe trze¬ cia, czwarta i piata zarazano podobnie, jak druga, ale po 24 godzinach podawano z pozywieniem me¬ tabolit A-27106 w stezeniu odpowiednio 100, 150 i 200 czesci na milion.Po uplywie siedmiu dni po zakazeniu, ptaki wa¬ zono, zabijano i badano uszkodzenie wywolane kokcydioza. Objawy kokcydiozy klasyfikowano, wyrazajac je w umownie przyjetej skali od zera do czterech. W tabeli przedstawionej w dalszej czesci opisu, przy kazdym typie uszkodzen poda¬ wano ilosc ptaków. Do grupy zerowej zaliczano kurczeta, u których nie stwierdzono zadnych objawów kokcydiozy; do pierwszej kurczeta z naj¬ mniejszymi, dajacymi sie zauwazyc objawami ko¬ kcydiozy; do drugiej kurczeta z umiarkowanymi zmianami, polegajacymi na nieznacznym krwoto¬ ku lub jego braku oraz przy braku powazniejszych uszkodzen tkanek; do trzeciej kurczeta, u których zaobserwowano krwotok, opuchniecie jelita sle¬ pego i znaczne zmiany w tkankach, oraz do czwar¬ tej ptaki z objawami krwotoku i wystepujacymi w jelicie slepym skrzepami krwi i szczatkami ko¬ mórek nablonka. Ptaki zaliczone do czwartej lub nizszej grupy mozna na ogól wyleczyc, jesli nie zakaza sie ich w dalszym ciagu kokcydioza.Stosujac powyzsze postepowanie, uzyskano re¬ zultaty przedstawione w tablicy 3.U ptaków leczonych, z duza iloscia uszkodzen, obecnosc krwi w kale byla skapa lub zadna i wy¬ dawaly sie one byc w dobrej kondycji. Wieksze znaczenie ma wiec duzy przyrost wagi niz ilosc uszkodzen.Przeprowadzone badania wykazaly, ze metabo¬ lit A-27106 zabija na ogól drobnoustrój E. tenella Tablica 3 Grupa ptaków 1 2 3 4 Zakazenie E. tenella nie tak tak tak tak Ilosc metabolitu A-27106 w pokar¬ mie w czesciach na milion 0 0 100 150 200 Przecietny przy¬ rost wagi w gra¬ mach 162 67 157 150 166 Typ uszkodzen 0 0 4 3 1 0 0 1 3 0 2 0 0 0 1 0 3 0 o 3 1 0 4 0 7 7 metabolit A-27106 w ilosci, odpowiadajacej dzien¬ nej porcji podawanej leczonemu zwierzeciu.Ponizej opisano zastosowania metabolitu A-2710J3.Leczenie kokcydiozy metabolitem A-27106. W doswiadczeniu stosowano grupe, skladajaca sie z 75 sztuk tygodniowych, wychowanych w inkuba¬ torze kurczat krzyzówek rodzaju meskiego, nale- przed umiejscowieniem sie w komórkach nosiciela, dlatego tez korzystnym jest podawanie zapobie¬ gawcze.Inne badania wykazaly, ze metabolit A-27106 jest bardziej smaczny i mniej toksyczny dla pta¬ ków, niz monenzyna.Przeprowadzono takze szereg innych badan nad88 752 13 14 zastosowaniem metabolitu A, zarówno pojedynczo, jak tez w polaczeniu z monenzyna. Wykazaly one, ze chociaz metabolit A-27106 nie powoduje wiek¬ szego przyrostu wagi w dawce 0,04%, niz w daw¬ ce 0,01%, to jednak wyzsze dawki skutkuja w nie¬ których przypadkach uszkodzen jelita slepego. Nie stwierdzono objawów toksycznosci przy podawa¬ niu wiekszych dawek.Monenzyna i metabolit A-27106, podawane lacz¬ nie, wykazuja co najmniej sumujaca sie skutecz¬ nosc, natomiast toksycznosc w tym przypadku jest Tablica 4 Skladnik Zmielona kukurydza Maka sojowa ekstra-. 1 howana rozpuszczalni- kami, odluszczona, do¬ brze zmielona, o za¬ wartosci bialka 50% Tluszcz zwierzecy (lój) Suszona maczka ryb¬ na o zawartosci bial¬ ka 60% Rozpuszczalny wyciag z kukurydzy Fosforan dwuwapnio- wy, spozywczy | Mieszanina witamin I (witaminy A, D, E, K i B12, cholina, nia- cyna, kwas pantote¬ nowy, ryboflawina, biotyna i glukoza) Mieszanina pierwiast¬ ków sladowych (siar¬ czan manganowy, tle¬ nek cynku, jodek po¬ tasu, siarczan zelaza¬ wy i weglan wapnio¬ wy) Kwas 2-amino-4-hy- droksymaslowy (ana¬ log hydroksylowy me- tioniny) Metabolit A-27106 Weglan wapniowy Chlorek sodowy Mieszanka pierwiast¬ ków sladowych Mieszanka witaminy A i D2*) Mieszanka z witamina E**) Propionian wapnia o/ , o 50,00 Si',08 6,5 ,0 4,0 1.8 0,5 0,2 0,1 0,02 0,5 0,3 0,03 0,07 0,05 0,15 O ' 453,6 ¦ 282 59 45,4 36,3 ,9 ,4,5 ,18 0,9 0,18 4,54 2,72 2,272 0,635 0,45^ 1,361 1 *) Mieszanka zawiera w jednym kilogramie 4 405 286 jednostek miedzynarodowych witaminy A, 500,441 jednostek miedzynarodowych witaminy D2 oraz 843 g pokarmu z ziarna sojowego z dodatkiem 1% oleju.**) Suszone granulki rozpuszczalnego wyciagu z kukurydzy, zawierajace 44,050 jednostek miedzy¬ narodowych octanu a-tokoferolu w jednym kilo¬ gramie. 40 45 55 nizsza, niz przy podawaniu monenzyny w ilosci, odpowiadajacej sumie obu preparatów.Zmodyfikowany pokarm dla kurczat, zawiera¬ jacy metabolit A-27106, przeznaczony do leczenia kokcydiozy.Wysokokaloryczny pokarm, przeznaczony dla u- zyskiwania szybkiego przyrostu wagi kurczat, przy¬ gotowuje sie wedlug przepisu, przedstawionego w tablicy4. .. . , Wymieszany pokarm prasuje sie w pastylki i podaje zwierzetom w ilosci okolo 9,8 kg dziennie.Odpowiada to dziennej dawce metabolitu A-27106, wynoszacej okolo 300 mg na jedno zwierze.Wszystkie powyzsze skladniki miesza sie, sto¬ sujac zwykle sposoby mieszania pokarmu. Kur¬ czeta karmiono tym pokarmem i woda bez ogra¬ niczen i chroniono przed zarazeniem kokcydioza.Przyrost wagi byl porównywalny z przyrostem u kurczat karmionych taka sama, ale nie zawiera¬ jaca metabolitu A-27106, dieta.Zwiekszanie przyswajania pokarmu przy dodat¬ ku metabolitu A-27106.Plyn ze zwacza wolu uzyskiwano poprzez chi¬ rurgicznie zainstalowana przetoke otwarta w zwa- czu. Wól byl karmiony gruboziarnistym pokar¬ mem o nastepujacym skladzie: 69,95% grubo zmielonej kukurydzy % zmielonych kaczanów kukurydzy 8 % maki sojowej, zawierajacej 50% bialka % maczki z alfaalfa % melasy 0,6 % mocznika 0,5 % fosforanu dwuwapniowego 0,5 % weglanu wapniowego 0,3 % chlorku sodowego 0,07% mieszaniny witaminy A i D2*) 0,05% mieszaniny witaminowej E**) 0,03% mieszaniny pierwiastków sladowych ***) Próbke plynu ze zwacza saczy sie przez cztery warstwy plótna i zbiera przesacz. Czesci zatrzy¬ mane na plótnie zawiesza sie w buforze fizjolo¬ gicznym, w objetosci równej objetosci plynu uzytego do saczenia, i zawiesine saczy sie. Stosuje sie bu¬ for, opisany przez Chenga i wspólpracowników w J. Dairy Sci., 38, 1225, (1955), o nastepujacym skladzie: Skladnik Na2HP04 KH2P04 NaHC03 KC1 NaCl MgS04 CaCl, ff/litr 0,316 0,152 2,260 0,375 0,375 0,112 0,038 65 *) Mieszanina zawiera w jednym kilogramie 1 405 286 jednostek miedzynarodowych witaminy A, 500 441 jednostek miedzynarodowych witaminy Da oraz 843 g pokarmu z ziarna sojowego z dodatkiem 1% oleju..**) Suszone granulki rozpuszczalnego wyciagu z kukurydzy, zawierajace 44 050 jednostek miedzy¬ narodowych octanu d-a-tokoferolu w kilogramie.***) Mieszanina zawiera tlenek manganawy, jodek potasowy, weglan kobaltu, tlenek miedzi i siarczan cynku.15 88 752 16 FeS04-7H20 MnS04 ZnS04-7H20 CuS04-5H20 CaCL 0,008 0,004 0,004 0,002 0,001 Oba przesacze laczy sie i pozostawia do odsta¬ nia. Klarowna warstwe oddziela sie, rozciencza buforem w stosunku 1:1 i doprowadza pH do war¬ tosci 7,0. ml rozcienczonego plynu ze zwacza wlewa sie do kolby o pojemnosci 25 ml i dodaje 40 mg opisanego pokarmu, dodatkowo 5 mg bialka so¬ jowego oraz testowany zwiazek. Do doswiadcze¬ nia uzywa sie cztery kolby z identyczna zawar¬ toscia. Do kontroli stosuje sie dwa zestawy po cztery kolby. Zawartosc kolb analizuje sie na poczatku i po 16 godzinach inkubowania w tem¬ peraturze 38°C. Wartosc pH po zakonczeniu in¬ kubowania mierzy sie, dodaje po 2 ml 25°/o roz¬ tworu kwasu metafosforowego i pozostawia kol¬ by do odstania. Supernatant analizuje sie za po¬ moca chromatografii gazowej na zawartosc pro- pionianu, octanu i maslanu. Testowane zwiazki znacznie zwiekszaly wytwarzanie propionianu.Wyniki tekstu porównywano statystycznie z wy¬ nikami z prób kontrolnych. W tabeli 5 podano stosunek stezenia lotnych kwasów tluszczowych w zaleznosci od ilosci dodawanego metabolitu A-27106 do ich stezenia w kolbach kontrolnych.Tablica 5 Ilosc metabolitu Al-27106 w rozcien¬ czonym plynie ze zwacza w mkg/ml 1 0,2 Propionian 2,15 1,42 1,02 Maslan 0,73 0,96 ,91 Calkowita . zawartosc lotnych kwasów tluszczo¬ wych 1,03 0,98 1,07 1 % 67,8 kg/tone 615,1 90,7 Ulepszony pokarm dla bydla, hodowanego na mieso. Gruboziarnisty pokarm dla bydla miesne¬ go ma nastepujacy sklad: Skladnik Dobrze zmielona kukurydza Zmielone kaczany kukurydzy Maka alfa-alfa, odwodniona, o zawartosci bialka 17% Maka sojowa, odluszczona, ekstrahowana rozpuszczalnikami, zawartosc bialka 50% Melasa Mocznik Metabolit A-27106 Fosforan dwuwapniówy spozywczy Ponizsze przyklady ilustruja przedmiot wyna lazku. 9,956 0,6 0,044 0,5 45,4 90,32 45,4 ,44 0,399 4,54 60 Przyklad I. Otrzymywanie metabolitu A-27106 z monenzyny przy pomocy S. candidus.Drobnoustrój S. candidus NRRL 5449 hoduje sie na skosach agarowych z pozywka Benetta i otrzy¬ muje dobrze rozwiniete kolonie. Kolonie usuwa sie ze skosów i zawiesza w 10 ml jalowej wody.Zawiesine dzieli sie na cztery czesci i dodaje do kolb trzesawkowych o pojemnosci 500 ml, zawie¬ rajacych po 100 ml pozywki wegetatywnej o na¬ stepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Rozpuszczalny wyciag kukurydziany*) 25 g Laktoza 10 g Maltoza 10 g Siarczan zelazawy siedmiowodny 0,01 g Siarczan magnezowy siedmiowodny 2 g Fosforan jednopotasowy 2 g Weglan wapniowy 2 g Woda odmineralizowana do 1,1 litra Cztery zaszczepione kolby inkubuje sie w tem¬ peraturze 30°C, na trzesawce obrotowej o 250 ob¬ rotach na minute, w ciagu 24 godzin. Porcjami po 10 ml otrzymanej hodowli wegetatywnej za¬ szczepia sie 15 kolb o pojemnosci 500 ml, zawie¬ rajacych po 100 ml wyjalowionej pozywki fer¬ mentacyjnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Wyciag miesny Kazeinowy pankreatyczny hydrolizat peptonu Chlorek sodowy Gliceryna Weglan wapniowy Woda odmineralizowana do Wartosc pH powyzszej pozywki wynosi 7,2. Po zaszczepieniu calosc inkubuje sie w ciagu 72 go¬ dzin w warunkach, opisanych uprzednio.W fermentorze o pojemnosci 40 litrów przygo¬ towuje sie pozywke produkcyjna o nastepuja¬ cym skladzie: Skladnik Olej pclisiloksanowy (srodek przeciwpienny) Gliceryna Dekstroza Kazeinowy pankreatyczny hydrolizat peptonu Wyciag miesny Chlorek sodowy Weglan wapniowy Woda odmineralizowana Poczatkowa wartosc pH wynosi 7,0. Pozywke sterylizuje sie w autoklawie w temperaturze 120°C pcd cisnieniem 1,05—1,4 atmosfery, w ciagu 30 mi¬ nut. Wartosc pH pozywki po sterylizacji wynosi 7,6.Ilosc g g g g 2 g 1 litra do Ilosc g 375 g 625 g 125 g 125 g 125 g 50 g 24 litrów *) Nazwa firmowa „Nadrisol", producent Natio¬ nal Distiller's Products Company, USA.88 752 17 18 Do jalowej pozywki dodaje sie 25 g oczyszczo¬ nej monenzyny, rozpuszczonej w 200 ml etanolu i zaszczepia sie 700 ml inokulum wegetatywnego z drugiego stadium, przygotowanego w sposób, opisany powyzej.Przez pozywke przepuszcza sie powietrze w ilos¬ ci okolo 1 litra na minute i miesza, stcsujac zwykle mieszadlo o 420 obrotach na minute. In- kubuje sie w temperaturze 30°C, w ciagu okolo 114,5 godzin.Przebieg fermentacji kontroluje sie, stosujac chromatografie cienkowarstwowa na zelu krze¬ mionkowym, opisana uprzednio. Poczatkowo wy¬ krywa sie obecnosc tylko monenzyny, pózniej powstajaca druga plamka wskazuje na obecnosc metabolitu A-27106, przy koncu fermentacji wi¬ doczna jest tylko plamka, .odpowiadajaca metabo¬ litowi.Przyklad II. Wyodrebnianie i oczyszczanie metabolitu A-27106.Brzeczke fermentacyjna, otrzymana w spcsób opisany w przykladzie I, saczy sie, stosujac pomcc filtracyjna. Osad grzybni ekstrahuje sie okolo 5 li¬ trami metanolu w temperaturze pokojowej. Eks¬ trakt metanolowy saczy sie i przesacza zateza pod zmniejszonymi cisnieniem w celu usuniecia meta¬ nolu; Pozostaly koncentrat wodny laczy sie z prze¬ saczem brzeczki. Polaczone roztwory, w ilosci o- kolo 22 litry, ekstrahuje sie dwukrotnie polowa objetosci chloroformu. Polaczone ekstrakty chlo¬ roformowe zageszcza sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem, otrzymujac okolo 400 ml oleistego pro¬ duktu o ciemnobursztynowej barwie.Oleisty produkt odbarwia sie, przepuszczajac przez kolumne z 10 kg wegla aktywnego typu Pittsburg 12X40. Eluuje sie chloroformem, eluaty odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem i otrzy¬ muje sie okolo 500 ml bezbarwnego do bladozól- tego produktu.Odbarwiony oleisty produkt rozpuszcza sie w minimalnej ilosci chloroformu i chromatografuje przez kolumne, wypelniona $5 kg zelu krzemion¬ kowego typu Grace, wielkosc 62, zawieszonego w octanie etylu. Sposób eluowania i kontrolowania za pomoca chromatografii cienkowarstwowej zos¬ tal uprzednio opisany. Po usunieciu zanieczysz¬ czen octanem etylu, metabolit A-27106 eluuje sie z kolumny stosujac mieszanine octanu etylu i me¬ tanolu (19:1). Polaczone frakcje, zawierajace me¬ tabolit, odparowuje sie do sucha pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i otrzymuje bezpostaciowy, pra¬ wie bialy produkt, który- przemywa sie heksa¬ nem i suszy. Otrzymuje sie okolo 12,84 g metabo¬ litu A-27106, jednorodnego chromatograficznie.Przyklad III. Otrzymywanie metabolitu A-27106 przy zastosowaniu S. cinnamonensis i S. candidus.W przykladzie tym opisano inna metode wytwa¬ rzania metabolitu A-27106.Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 hoduje sie zazwyczaj, zgodnie z opisem patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych nr 3.501.568, w 55 ml pozywki w kolbach trzesawkowych o pojemnosci 250 ml.Po 47 godzinach inkubowania otrzymuje sie ino¬ kulum wegetatywne, które dodaje sie do 220 ml pozywki w kolbie trzesawkowej o pojemnosci 1 litr.Inkubuje sie w ciagu 21 godzin, otrzymujac ino¬ kulum do zaszczepiania pozywki w fermentorze.W fermentorze o pojemnosci 40 litrów przygoto- wuje sie, wyjalawiana cieplnie, pozywke o naste¬ pujacym skladzie: Skladnik Ilosc Glukoza 75P g Maka sojowa 625,0 g Olej sojowy 500,0 g Oleinian metylu 500,0 g Olej polisiloksanowy (srodek przeciwpienny) 5,0 g Chlorek potasowy 2,5 g Fosforan dwupotasowy 2,5 g Chlorek manganawy czterowodny 15,0 g Chlorek zelazowy jednowodny 7,5 g Weglan wapnia 25,0 g Woda odmineralizowana do 24 litrów Wartosc pH, wynoszaca 5,5, podnosi sie do 8,0 za pomoca 15 ml 10 n roztworu wodorotlenku po¬ tasowego. Zaszczepiona pozywke inkubuje sie w temperaturze 32°C, w ciagu 234 godzin. Po uply¬ wie 42 godzin napowietrzanie zwieksza sie z po¬ czatkowego okolo 1 litr na minute do okolo 2,3 litra na minute. Jednoczesnie zwieksza sie szyb¬ kosc mieszania z 500 do 700 obrotów na minute.Wytwarzanie monenzyny w zasadzie konczy sie po uplywie 210 godzin, na co wskazuje chromato¬ grafia cienkowarstwowa z zastosowaniem do wy¬ wolywania Bacillus subtilis ATCC 6633.Po uplywie 234 godzin zawartosc fermentora sterylizuje sie w celu inaktywacji S. cinnamonen¬ sis i dodaje nastepujace skladniki: Skladnik Dekstroza Maka sojowa , Chlorek manganawy czterowodny Weglan wapniowy Siarczan zelazowy szesciowodny Fosforan dwupotasowy Oleinian metylu Olej sojowy Woda odmineralizowana Ilosc 750 g 625 g 155 g 12,5 g 7,5 g 2,5 g 250 ml 250 ml do 24 litrów.Wartosc pH doprowadza sie do 8,0 za pomoca 215 ml 5 n wodorotlenku sodowego i pozywke wy¬ jalawia sie. Po zaszczepieniu szybko rozwijajaca sie hodowle wegetatywna Streptomyces candidus NRRL 5449, calosc inkubuje sie w ciagu 137 go¬ dzin, w temperaturze 30°C i przy napowietrzaniu jalowym powietrzem w ilosci okolo 1 litra na mi¬ nute. Do mieszania stosuje sie normalnie uzywane mieszadlo, poczatkowo przy 120 obrotach na mi¬ nute, po uplywie 16 godzin 420 obrotach na minu¬ te, a po 40 godzinach 500 obrotach na minute. Do fermentora dodaje sie 400 g porcje dekstrozy w 44, 66,5, 89, 97, 113 i 127 godzinie fermentacji. W 72 i 99 godzinie dodaje sie po 175 g weglanu wapnio¬ wego.Przebieg fermentacji kontroluje sie, stosujac chromatografie cienkowarstwowa. Po uplywie 137 40 45 50 55 6019 88 732 godzin wytwarzanie metabolitu A-27106 jest w za¬ sadzie zakonczone. Metabolit A-27106 wyodrebnia sie i oczyszcza w sposób, opisany w przykladzie II.Przyklad IV. Wytwarzanie metabolitu A-27106 przy zastosowaniu preparatu enzymatycz¬ nego produkowanego przez S. candidus.S. candidus NRRL 5449 hoduje sie w skali 100 litrów w sposób, opisany w przykladzie I. Komór¬ ki izoluje sie z brzeczki fermentacyjnej na drodze saczenia pod zmniejszonym cisnieniem, dzieli na porcje po 200 g i zamraza. Dwie takie porcje po rozmrozeniu w temperaturze pokojowej zawiesza sie w 0,05 m buforze fosforanowym o pH=5,8.Otrzymane 600 ml zawiesiny poddaje sie w ciagu minut dzialaniu ultradzwieków, po czym wiru¬ je w ciagu 30 minut przy 10.000 obrotach na mi¬ nute. Szczatki komórek zawiesza sie w 100 ml bu¬ foru i dializuje w ciagu 18 godzin, stosujac 5 li¬ trów chlodnego roztworu buforu. Do 50 ml dia¬ lizatu dodaje sie 120 mg D-glukozy i 25 mg mo- nenzyny w 2 ml etanolu. Calosc miesza sie w cia¬ gu 72 godzin, w temperaturze 30°C, a nastepnie saczy. Przesacz ekstrahuje sie 100 ml chlorofor¬ mu. Ekstrakt chloroformowy zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i chromatografuje na kolumnie z 10 g zelu. Po elucji octanem etylu otrzymuje sie jedynie slady' monenzyny. Natomiast po elucji octanem etylu i metanolem (19:1) uzys¬ kuje sie 17 mg metabolitu A-27106, identycznego z otrzymanym w przykladzie II.Przyklad V. Wytwarzanie metabolitu A-27106 w postaci wolnego kwasu 100 mg meta¬ bolitu A-27106, otrzymanego w postaci soli sodo¬ wej w sposób, opisany w przykladach I i II, roz¬ puszcza sie w 100 ml mieszaniny metanolu i wody (1:1). Otrzymany roztwór miareczkuje sie do war¬ tosci pH=3, za pomoca 1 n kwasu solnego, po czym odparowuje metanol pod zmniejszonym cisnieniem.Pozostalosc ekstrahuje sie dwukrotnie 100 ml chlo¬ roformu. Ekstrakt chloroformowy suszy sie nad siarczanem magnezu i odparowuje pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Otrzymuje sie 85 mg formy kwa¬ sowej metabolitu A-27106.Metabolit A-27106 w formie kwasowej jest bia¬ la bezpostaciowa substancja o ciezarze czasteczko¬ wym okolo 832. Aktywnosc biologiczna wolnego kwasu jest w przyblizeniu taka sama, jak aktyw¬ nosc soli sodowej.Przyklad VI. Wytwarzanie soli cezowej me¬ tabolitu A-27106. 97,3 mg formy kwasowej metabolitu A-27106, przygotowanej w sposób, opisany w przykladzie V, rozpuszcza sie w 100 ml mieszaniny metanolu i wody (1:1). Otrzymany roztwór miareczkuje sie do pH^7,l za pomoc^ 1 n roztworu wodorotlenku cezowego. Metanol odparowuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, a pozostalosc ekstrahuje sie dwie- ma takimi samymi porcjami chloroformu. Ekstrakt chloroformowy suszy sie nad siarczanem magne¬ zu i odparowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Otrzymuje sie biala bezpostaciowa substan- cje. Analiza elementarna wykazuje obecnosc oko¬ lo 13e/o metalu.Przyklad VII. Wytwarzanie soli litowej meta¬ bolitu A-27106.Postepuje sie w sposób analogiczny do opisane¬ go w przykladzie VI, stosujac zamiast wodorotlen¬ ku cezowego wodorotlenek litowy. Sól litowa me¬ tabolitu jest biala substancja, wykazujaca pewne cechy uporzadkowania krystalicznego, przy braku jednak obrazu krystalicznego podczas badania promieniami Rentgena.Przyklad VIII. Wytwarzanie soli amonowej metabolitu A-27106.Powtarza sie postepowanie z przykladu X, sto¬ sujac zamiast wodorotlenku cezowego wodorotle¬ nek amonowy. Otrzymuje sie sól amonowa meta¬ bolitu A-27106 o wlasciwosciach takich samych, jak inne postacie. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania metabolitu A-27106 lub jego formy kwasowej, amonowej, litowej, potaso¬ wej, rubidowej albo cezowej, znamienny tym, ze drobnoustrój Streptomyces candidus NRRL 5449 hoduje sie w pozywce, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i sole nieorganiczne, w wa¬ runkach hodowli podpowierzchniowej z napowie¬ trzaniem, w obecnosci glukozy i monenzyny, az do przeksztalcenia monenzyny w znaczna ilosc meta¬ bolitu A-27106.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako pozywke hodowlana stosuje sie jalowa po¬ zywke, otrzymywana za pomoca sterylizacji po¬ zywki hodowlanej, w której wytwarza sie monen- zyne podczas hodowli drobnoustroju Streptomyces cinnamonensis w warunkach podpowierzchnio- wych z napowietrzaniem.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze odsaczona brzeczke fermentacyjna liofilizuje sie, porcje liofilizatu rozpuszcza sie w wodnym roz¬ tworze buforu i miesza z glukoza i monenzyna, az do wytworzenia znacznej ilosci metabolitu A-27106, który nastepnie wyodrebnia sie z mieszaniny re¬ akcyjnej.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wyodrebnia sie z brzeczki mase komórkowa, oczyszcza komórki za pomoca dzialania ultradzwie¬ kami, wirowania i dializy, po czym oczyszczony dializat poddaje sie w wodnym roztworze buforu reakcji z glukoza i monenzyna, az do otrzymania znacznej ilosci metabolitu A-27106, który wyodre¬ bnia sie z mieszaniny reakcyjnej. 15 20 25 30 35 40 45 5088 752 CH3XcHz CH3 0A| HjCO-CH h O HÓCHz g H CH; *C~CN O CHs Wzór i LirU f»i_s. CHj HsC—CH HsCO-CH CH5 H /° CHs Wzór 2 A-27106 iooo^ooo 3000 aoo 2000 (CM") 15001400000 1200 1100 1000 950 900 850 800 750 700 i 650 PL