PL88377B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób jednoczesnego wytwarzania bacytracyny i proteaz przy uzyciu drobno¬ ustroju zdolnego do równoczesnej biosyntezy obydwu produktów.

Dotychczas znane byly metody wytwarzania bacytracyny oraz metody wytwarzania proteaz niezaleznie od siebie. Szczepy Bacillus subtilis oraz Bacillus licheniformis stosowane do produkcji bacytracyny wytwarzaly niewielkie ilosci proteaz, nie gwarantujac oplacalnosci ich izolowania. Przy wytwarzaniu proteaz natomiast stosowano bakterie z rodzaju Bacillus, promieniowce oraz grzyby z rodzaju Aspergillus i Rhizopus, które z kolei nie mialy zdolnosci biosyntetyzowania bacytracyny, Celem wynalazku bylo opracowanie sposobu prowadzenia procesu biosyntezy tak, aby równolegle z wytwarzaniem bacytracyny uzyskiwac proteazy w ilosciach oplacalnych dla ich izolacji, jak równiez opracowanie metody izolacji z brzeczki fermentacyjnej obu produktów biosyntezy o okreslonych normami wartosciach prze¬ myslowych. Metoda izolacji powinna równoczesnie uwzgledniac stopien czystosci proteaz w zaleznosci od ich zastosowania przemyslowego oraz zapewniac otrzymanie dla celów paszowych bacytracyny w formie jej kom¬ pleksu z Zn.

Sposobem wedlug wynalazku jednoczesne wytwarzanie bacytracyny i proteaz nastepuje w podpo- wierzchniowej hodowli selektanta szczepu Bacillus subtilis 64 I.A.L. Selektant szczepu Bacillus subtilis 641.A.L. otrzymano w znany sposób droga selekcji na podlozu, zawierajacym agar odzywczy po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C. Otrzymany selektant byl najaktywniejszym osobnikiem sposród przebadanych 30 klonów i charakteryzowal sie wysoka aktywnoscia wytwarzania antybiotyku, przy czym w hodowlach w kolbach w okresie pomiedzy 22 a 30 godzina hodowli wykazywal on 30% przyrostu antybiotyku przy 4 krotnym wzroscie zawartosci proteaz, a od godz. 30 do 36 przy niezmienionym poziomie bacytracyny charakteryzowal sie dalszym 40% wzrostem wytwarzania proteaz, w stosunku do szczepu Bacillus subtilis I.A.L. Szczep ten w fermentatorach 14 litrowych, w opisanych warunkach, przy skróconym cyklu hodowlanym, byl aktywnym producentem ba¬ cytracyny, jak równiez proteaz.

Hodowle prowadzono na pozywkach plynnych, w tym równiez na pozywce, opisanej w op. pat. polskim nr 61062, zawierajacym zródlo wegla i azotu oraz sole nieorganiczne, w temperaturze 28°-36°C w ciagu 24-362 88 377 godzin, przy jednakowym lub zmiennym napowietrzaniu w ilosci 0,5-1,5 objetosci powietrza na 1 objetosc pozywki na 1 minute i równoczesnym intensywnym mieszaniu zwlaszcza w poczatkowych 6-12 godzinach hodowli. W tych warunkach napowietrzania wartosc pH brzeczki fermentacyjnej 5,9-6,3 miedzy 6-12 godzina prowadzenia procesu podnosi sie stopniowo do wartosci pH = 6,4—7,5 pod koniec procesu. Nalezy zaznaczyc, ze krótkotrwale przerwy lub ograniczenia doplywu powietrza powoduja wzrost wartosci pH, co wplywa nie¬ korzystnie na wytwarzanie proteaz przy niezmieniajacej sie ilosci wytwarzanej bacytracyny. Bacytracyne izoluje sie z przesaczu brzeczki przy wartosci pH = 5,0—7,0 w postaci kompleksu z cynkiem przez wytracanie 20% roztworem ZnS04.7 H20 i wysolenie za pomoca NaCl, dodawanego w substancji. Z przesaczu wyodrebnia sie nastepnie proteazy, np. przez zageszczenie supernatantu i dialize, lub w odwrotnej kolejnosci i ewentualne frakcjonowane wytracanie za pomoca siarczanu amonowego.

W wyniku procesu otrzymuje sie 180-260 j/ml bacytracyny i jednoczesnie 10000-25000 j/ml proteaz, mierzonych metoda spektrofotometryczna przy 280 nm, po 40 minutowej inkubacji 2% roztworu kazeiny jako substratu z odpowiednio rozcienczonym enzymem, przy wartosci pH = 11,0, w temperaturze 40°C, przyjmujac za jednostke AE2gonm równa 0,001, odpowiadajaca 0,6 jednostki Delft.

Otrzymana sposobem wedlug wynalazku bacytracyna stosowana jest do celów paszowych, natomiast pro¬ teazy sa produktem, wykorzystywanym w wielu galeziach przemyslu, jak np. jako dodatek do srodków pio¬ racych ze wzgledu na optimum pH w zakresie 10—11, tabilnosc w temperaturze 40°—50°C oraz niewrazliwosc na obecnosc polifosforanów w srodowisku. Wytworzone sposobem wedlug wynalazku proteazy moga byc stoso¬ wane równiez w obróbce skór, obróbce tekstylnej oraz regeneracji blon filmowych i in.

Selektant 64 szczepu Bacillus subtilis I.A.L. wyodrebnia sie w sposób nastepujacy: Spory szczepu Bacillus subtilis I.A.L., zawieszone w 0,85% roztworze NaCl wylewa sie w ilosci po 0,1 ml na plytki Petriego, zawierajace po 20 ml podloza odzywczego o skladzie, pepton 10 g, NaCl 5g, wyciag miesny 2,25 g, agar 20 g, woda destylowana do objetosci 1 litra, przy pH podloza 7,2. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 32°C ocenia sie wizualnie liczbe kolonii, wyrosnietych na agarze. Do dalszej kontroli zdolnosci wytwarzania proteaz wybiera sie losowo po okolo 30 kolonii z tych plytek, na których wzroslo po okolo 102 kolonii. Wsród kilkudziesieciu zbadanych klonów, klon oznaczony numerem 64 wykazywal wybitnie zwiekszona zdolnosc wytwarzania pro¬ teaz.

Przyklad I. Pozywka produkcyjna Sklad % wagowych Maka sojowaodtluszczona 5 Makaziemniaczana 2 CaC03 1 MgS04.7H20cz. 0,33 (NH4)2S04cz. 0,2 MnS04 .5H20cz. 0,01 woda wodociagowaad 100 Make sojowa i make ziemniaczana zawieszono w wodzie wodociagowej w temperaturze 80°C i po schlo¬ dzeniu do temperatury 35°C dodano pozostale skladniki pozywki. Wartosc pH pozywki doprowadzono do 7,1 za pomoca 6n NaOH i sterylizowano w temperaturze 120°C w ciagu 60 minut.

Pozywke szczepiono 24 godzinnym materialem posiewowym selektanta 64 I.A.L. Bacillus subtilis w ilosci 1% objetosciowo, hodowanego na bulionie z 2,25 g wyciagu miesnego, 10 g peptonu oraz 5 g NaCl w litrze.

Wytwarzanie bacytracyny i proteaz prowadzono w temperaturze 34°C w ciagu 24 godzin w szklanych fermentorach o pojemnosci 14 1, podajac do hodowli 1 objetosc powietrza (objetosc hodowli) minute przy ciaglym mieszaniu z szybkoscia 700 obrotów/minute. Wartosc pH w 6 i 12 godzinie fermentacji wynosila 6,3 a wartosc koncowa pH wynosila 6,95. Uzyskano 200 j/ml bacytracyny i 13370 j/ml proteaz. Prowadzac proces w sposób podany powyzej, ale z ograniczonym w poczatkowej fazie doplywem powietrza, uzyskuje sie w godzi¬ nach 6 i 12 wartosc pH = 7,35 i 7,65 odpowiednio, a koncowa wartosc pH wynosila 8,35. W 24 godzinie hodowli uzyskano 153 j/ml bacytracyny oraz niska wydajnosc proteaz, wynoszaca 1169 j/ml.

Przyklad II. Sklad pozywki i sposób jej przygotowania oraz warunki napowietrzania i mieszania, jak w przykladzie I. Hodowle prowadzono Wttemperaturze 32°C. Wartosc pH w 6 i 12 godzinie fermentacji wyno¬ sila 6,25 i 6,10 odpowiednio, a wartosc koncowa pH w 24 godzinie hodowli wynosila 6,8. Uzyskano 262 j/ml bacytracyny oraz 13280 j/ml proteaz.

Przyklad III. Sklad pozywki i sposób jej przygotowania, jak w przykladzie I. Hodowle prowadzono88 377 3 przy zmiennym napowietrzaniu, podajac w czasie od 0 do 12 godzin 1 objetosc powietrza (objetosc hodowli) minute, a nastepnie do 36 godziny 0,5 objetosci powietrza (objetosc hodowli) minute, oraz przy zmiennym mieszaniu w czasie od 0 do 12 godzin przy 800 obrotach/minute, a nastepnie przy 600 obrotach/minute.

Wartosc koncowa pH wynosila 7,1. Uzyskano 207 j/ml bacytracyny oraz 11420 j/ml proteaz.

Przyklad IV. Pozywka produkcyjna Sklad Maka sojowa Skrobia ziemniaczana Maka rybna CaC03 stracony Kwas mlekowy techniczny 40% (NH4)2 S04, techniczny K2HP04, MgS04, techniczny Olej sojowy surowy Sladowe ilosci soli Mn, Zn i CO Woda wodociagowa do 1 litra Sposób przygotowania pozywki oraz warunki hodowli, jak w przykladzie II. Hodowle prowadzono w ciagu godzin. Wartosc koncowa pH wynosila 7,3. Uzyskano 178 j/ml bacytracyny oraz 25760 j/ml proteaz.

Do 4 litrów przesaczu brzeczki o aktywnosci bacytracyny 178 j/ml i aktywnosci proteolitycznej 25760 j/ml dodatno 114 ml 20% roztworu ZnS04.7 H20 przy pH = 6 (11 gramatomów Zn**) 1 mol bacytracyny, to jest 0,715 g Zn** (105 j. bacytracyny), oraz 400 g NaCl. Mieszanine pozostawiono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym osad Zn-bacytracyny oddzielono przez dekantacje i wirowanie.

Uzyskany roztwór (4,1 1) zawieral 114 mg suchej masy/ml; 6,3 mg bialka/ml oraz 17700 j proteazy/ml o 73% aktywnosci proteolitycznej.

Roztwór zageszczono okolo czterokrotnie w wyparce prózniowej w temperaturze 30—35°C, wytracony osad oddzielono i przemyto woda. Z polaczonych roztworów oddzielono nastepnie zwiazki drobnoczasteczkowe (wprowadzone podczas izolacji antybiotyku sole nieorganiczne i skladniki pozywki) przez 24 godzinna dialize w pradzie wody wodociagowej, badz przepuszczenie przez kolumne z adsorbentem typu Wofatyt MBI lub filtry membranowe.

Uzyskany w ten sposób roztwór zawieral 27 mg suchej masy/ml, 5,9 mg bialka/ml oraz 64% aktywnosci proteolitycznej w odniesieniu do roztworu po oddzieleniu Zn-bacytracyny. Bezposrednie odparowanie tego roz¬ tworu w suszarce rozpylowej Minor typ 53 firmy Nitro Atomizer (Dania) w temperaturze 50°C doprowadzilo do uzyskania z 1 litra roztworu wyjsciowego po oddzieleniu Zn-bacytracyny 11,8 g preparatu proteolitycznego o aktywnosci 840 j/mg suchej masy, co stanowi 56% wydajnosci. Preparat jest oczyszczony okolo pieciokrotnie w przeliczeniu na sucha mase przy praktycznie nie zmienionej aktywnosci wlasciwej.

Przyklad V. Zageszczony i oczyszczony od zwiazków drobnoczasteczkowych roztwór, otrzymany, jak w przykladzie IV, poddano frakcjonowanemu wysalaniu za pomoca technicznego siarczanu amonowego, zawierajacego okolo 20% zanieczyszczen. Z 1 litra roztworu przy wysyceniu 60% siarczanu amonowego otrzy¬ mano 2,3 g preparatu o aktywnosci 3741 j/mg suchej masy, co stanowi 48% wydajnosci. Preparat jest oczyszczo¬ ny 25 razy w przeliczeniu na sucha mase, przy okolo czterokrotnie zwiekszonej aktywnosci wlasciwej.

Przyklad VI. Z brzeczki, zawierajacej 15,540 j proteazy/ml, oddzielono Zn-bacytracyne sposobem, jak w przykladzie IV, a roztwór, zawierajacy 100 mg suchej masy/ml, 6,4 mg bialka/ml oraz 10140 j pro¬ teazy/ml, poddano frakcjonowanemu wysoleniu przy pomocy technicznego siarczanu amonowego. Wytracony przy 60% wysyceniu osad rozpuszczano w wodzie (1/10 objetosci wyjsciowego roztworu) i poddawano dializie w pradzie wody wodociagowej w iagu 24 godzin. Uzyskany po oddzieleniu zwiazków drobnoczasteczkowych roztwór suszono w suszarce ro^' »ylowej Minor. Przy 10% stracie w procesie suszenia z 1 litra roztworu po oddzieleniu Zn-bacytracyny otrzymano 6,3 g preparatu proteolitycznego o aktywnosci 1161 j/mg suchej masy z wydajnoscia 73%. Preparat jest oczyszczony okolo dziesieciokrotnie w przeliczeniu na sucha mase przy okolo trzykrotnie zwiekszonej aktywnosci wlasciwej. 45,0 g ,0 g 3,0 g 4,0 g 7,5 g 2,0 g 1,0 g 0,2 g ,0 g4 88 377

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób jednoczesnego wytwarzania bacytracyny i proteaz w procesie hodowli Bacillus subtilis I.A.L. na plynnym podlozu zawierajacym zródlo wegla, azotu i soli mineralnych, w warunkach tlenowych przy wartosci pH do 7,5, znamienny tym, ze stosuje sie selektant szczepu Bacillus subtilis 64 I.A.L., otrzymany w wyniku selekcji naturalnej, prowadzac hodowle w temperaturze 28—36°C w ciagu 24—36 godzin, przy jednako¬ wym lub zmiennym napowietrzaniu w ilosci 0,5—1,5 objetosci powietrza na 1 objetosc pozywki na 1 minute i intensywnym mieszaniu, utrzymujac wartosc pH = 5,9—6,3 miedzy 6—12 godzina procesu, a nasivpnie przy stopniowo wzrastajacym pH do wartosci 6,4—7,5 pod koniec procesu, po czym wytworzona bacytracyne izoluje sie w postaci kompleksu z cynkiem przy wartosci pH = 5—7 i z pozostalego roztworu izoluje sie proteazy przez zageszczenie roztworu i frakcjonowane wytracenie siarczanem anionowym. Prac. Poligraf. UP PRL naklcd 120+18 Cena 45 zl