Opis patentowy opublikowani): 3041.1977 86829 MKP G§M 19/00 Int. CL» C3#P 13/00 n^i^^^m^^^^^^^^^^^mn^^^mr Twórca wy»ala$lsv: — Uprawniony z patentu: Imperial Chemical Industries Ltd., Londyn, (Wiel¬ ka Brytania) ^^SPW^^^H^-ffPP^ LU Ul ' iHMUUi " ¦I'IM " 'f ' »* H pl^iiMmw iii wmii-w jt u .uw *.Sposób wytwarzania Sirodesmmy A i Przsdrnjotem wynalazku Jest sposób wytwarzana Sirodesminy A. Wedlug wynalazku sposób wytwa¬ rzania Sirodesminy A o wzorze ogólnym przedsta¬ wionym na rysunku, w którym to wzorze n=2, R1 oznacza acetyl a R2 oznacza atom wodoru, polega na tym, %e na pozywce wodnej zawierajacej zródlo przyswajalnego wagla i zródlo przyswajalnego azo¬ tu hoduje sie grzyb Sirodesmium diversum C.M.I. 103J5I9, ekstrahuje odfiltrowana kulture rozpuszczal¬ nikiem organicznym, zasadniczo nie rozpuszczalnym w wodzie, odparowuje ekstrakt do sucha i wyod¬ rebnia Sirodesmine A chromatograficznie.Odpowiednim sz.czep.ein grzyba jest Sirodesmium diyer&um nowealth Mycological Institute (Ferry Lane, Kew, Wielka Erytania) o symbolu katalogowym C.M.I. 1025119.Kultuja rodnie dobrze na konwencjonalnej aga¬ rowej pozywce dla grzybów i po szesciu dniach w pp^zczejtflnyfih koloniach ukazuja sie centralne ob¬ szary grzybni z zarodnikami, otoczone strefa nie¬ dojrzalych nitek (strzepków grzyba), które znajdu¬ ja, sig n# powierzchni lub sa czesciowo albo calko¬ wicie zanurzone. Strefa ta.ni* posiada zabarwienia.Obszar zaro4towaAia jest zwykle ciemnobrazowy.K^ojnórki, zawierajace zarodniki, wylaniaja sie z agaru lub wzrastaja na powierzchni, co moze sie odbywac w sposób dosc intensywny, jak to ma miejsce np. na agarze slodowym, albo tez obserwu- je sie sjtrwktury rzadko rozsiane np. na agarze ty¬ pu Czanek-Do*.Spory, powstale z niewyspecjalizowanych galezi konidioforów, widoczne sa jako dlugie, rzadko roz¬ galeziajace sie lancuccy. Sa to amerospory i didy- , mospory (fragmojspory wystepuja rzadko), które dojrzewaja w postaci wyrastajacych od podstawy platków. Dojrzale spory sa otoczone komórkami o brazpwozóltych sciankach, zwykle dosc grubych.Niektóre iedaak fragmenty scianek sa cienkie, Amerospory maja ksztalt kulisty o srednicy 10/9—Il ^m, podczas gdy didymospory maja ksztalt, zblizo¬ ny do cylindrycznego, ze zwezeniem przy przegro- djzie 18/15—22/X 10/9^15/ ^m i z wygladu przypo- mtaaja dwie amerospory, które sie nie rozdzielily.Zródlami przyswajalnego wegla sa np. wielowo- dorotlenowe alkohole, jak cukier trzcinowy, gliko&a, laktoza, gliceryna lub mannoza, spolimeryzowane weglowodany, jak skrobia, naturalne i syntetyczne oleje lub tluszcze, lub tez mieszaniny dwóch lub wiecej wyzej wymienionych substancji. Pozywka zawiera zwykle 0,1—30% wagowych zródia wegla, korzystnie 2—8% wagowych.Zródlem przyswajalnego azotu sa zwiazki orga¬ niczne lub nieorganiczne, np. azotan metalu alka¬ licznego lub metalu ziem alkalicznych, sól kwasu nieorganicznego lub organicznego, zawierajaca azot, np. azotan sodu,, potasu, wapnia lub amonu, winian amonu, siarcjzjan amonu lub fosforan amonu. Zród¬ lem przyswajalnego azotu moga byc takze amino- 86 82986 829 kwasy, np. glicyna, makst z nasion, np. z nasion bawelny, lub namoczona w cieczy kukurydza, pep¬ ton, mocznik, wyciag z drozdzy lub miesa. Mozna stosowac mieszanine dwóch lub wiecej wyzej wy¬ mienionych substancji. Odzywka zawiera zwykle 5 zródlo azotu w ilosci równowaznej zawartosci ele¬ mentarnego azotu 0,001—4,0%.Pozywka zawiera zwykle dodatek takich nie¬ zbednych pierwia/tków, jak fosfor, np. w postaci ortofosforanu jednopotasowego lub ortafosforanu ^ dwuamonowego, magnez, np. w postaci siarczanu magnezu lub weglanu magnezu, siarka, np. w po¬ staci siarczanu, lub-potas np. w postaci chlorku po¬ tasu lub weglanu potasu i minimalne ilosci tak zwanych pierwiastków sladowych, jak zelazo, man- 15 gan, cynk, molibden i miedz.Odpowiednia pozywka jest np. pozywka, znana po fiodowle szczepu prowadzi sie w temperaturze w zakresie 15-^35°C, korzystnie okolo 25°C. 20 Korzystnymi organicznymi rozpuszczalnikami, niemieszajacymi sie z woda sa np. chloroform, oc¬ tan etylu, toluen lub eter dwuetylowy, przy czym najkorzystniejszym okazal sie chloroform.Stwierdzono, ze wytworzona mieszanina przeciw- 25 wirusowa zawiera 8 nowych zwiazków, które zosta¬ ly zidentyfikowane jako Sirodesmina A, B, C, D, E, F, G i H.Sirodesmina A 'posiada strukture o wzorze, przed¬ stawionym na rysunku, w którym R1 oznacza gru- 30 pe acetylowa, R2 oznacza atom wodoru a n=2.Wzór przedstawia stereochemie wzgledna.Sirodesmina B ma strukture, przedstawiona tym wzorem, w którym R1 oznacza grupe acetylowa, R2 oznacza atom wodoru a n=4. Sirodesmina C sta- 35 nowi zwiazek o przedstawionym wzorze, w którym R1 oznacza grupe acetylowa, R2 oznacza atom wo¬ doru, a n=3.Trzy zwiazki: Sirodesmina A, B i C zawieraja pierscieniowe ugrupowanie epi-/n/-tiadwuketopipe- 40 razyny. Znane sa równiez inne zwiazki, zawieraja¬ ce to ugrupowanie i wykazujace wlasnosci przeciw- wirusowe takie, jak Aranotina i Apoaranotina, np. z brytyjskiego opisu patentowego nr 1 238 327 oraz Gliotoxin, jednakze zwiazki te wykazuja mniejsza 45 aktywnosc od skladników mieszaniny lub slabsze dzialanie terapeutyczne.Potraktowanie v mieszaniny przeciwwirusowej dwutlenkiem siarki prowadzi do otrzymania innego zwiazku, posiadajacego wlasnosci przeciwwirusowe, 50 tj. Sirodesminy J.Poszczególne zwiazki Sirodesminy A, B, C, D, £, F, G, H oraz J posiadaja nastepujace charaktery¬ styki chemiczne: Sirodesmina A. Wzór sumaryczny C2oH26N208S2. 55 Wyniki analizy elementarnej C 49,7%; H 5,4%; N 5,8%; S 12,8%. Udzial poszczególnych pierwiast¬ ków, obliczony na podstawie wzoru sumarycznego C2oH26N208S2', jest nastepujacy: C 49,4%; H 5,4%; N 5,8%; S 13,2%. Widmo masowe nie wykazuje pi- 00 ku macierzystego, a jedynie wyrazny pik, odpowia¬ dajacy /M-52/©. . Otrzymana wartosc m/e wynosi 422, 1731, zas obliczona na podstawie wzoru suma¬ rycznego C20H2JN2O8 równa jest 422, 16i89. wyniku reakcji z trójmetylosililoimidazolem w 65 benzenie, w temperaturze 60°C, w czasie S godzin powstaje pochodna dwu-trójmetylosililowa. ; Widmo masowe tej pochodnej nie wykazuje" pikii macierzystego, lecz jedynie slaby pi&, odpowiada¬ jacy /M-CHg/0. Wyznaczona na tej podstawie war¬ tosc m/e wynosi 615, 1689, zas wzorowi sumarycz¬ nemu pochodnej C25H89N208SiSi2 odpowiada war¬ tosc 615, 1686.Acetylowanie. Reakcja Sirodesminy Az bezwod¬ nikiem octowym w pirydynie, w ciagu 1 tygodnia, w temperaturze 22°C daje dwuoctan o temperatu¬ rze topnienia 186—189°C. Analiza tego zwiazku da¬ la nastepujace wyniki: C 50,5%; H 5,3%; N 4,9%; Wzorowi sumarycznemu dwuoctanu C^HjoNaCioSj odpowiada sklad: C 50,7%; H 5,2% N 4,9%. Naj¬ wyzszemu pikowi /M-S/© w widmie masowym od¬ powiada wartosc m/e, równa 506,1871. Wartosc m/e, obliczona na podstawie wzoru sumarycznego C^HsdNgOio, wynosi 506,1901.Reakcja Sirodesminy A z bezwodnikiem octowym w pirydynie w ciagu 1 godziny, w temperaturze 22°C daje jednooctan. Wyniki analizy tego zwiazku sa nastepujace: C 49,9%; H.5,3%; N 5,3%; S 11,7%.Wzorowi sumarycznemu jednooctanu C^H^NgOjSg odpowiadaja udzialy C 50,6%; H 5,3%; N 5,2%; S 112,1%.W widmie masowym pojawia sie maly pik dla /M-S/©, a odpowiadajaca mu wartosc m/e wynosi 496 oraz mocny pik dla /M-S2/© przy wartosci m/e równej 4G4.Hydroliza Sirodesminy A i0,l n metanolowym roz¬ tworem HC1 daje iDesacetylosirodesmine A topnie¬ jaca w zakresie 198^201°C. Wyniki analizy tego zwiazku sa nastepujace: C 48,4%; H 5,6%; N 6,0%; S 14,3%. Wzorowi sumarycznemu C18H24lN207S2 od¬ powiadaja udzialy C 48,8%; H 5,6%; N 6,3%; S 14,4%.Widmo masowe nie wykazuje piku macierzyste¬ go, a jedynie wyrazny pik, odpowiadajacy /M-Sg/© przy wartosci m/e 380.W wyniku reakcji Sirodesminy A z trójfenyló- fosfina powstaje pochodna monosiarczkow|a, dla której znaleziono: C 52,7%; H 5,7%; N 5,8%; S 7,1%.Obliczono ze wzoru C2oH26Nji08S: C 52,9%; H 5,8%; ^ 6—2%; S 7,0%.Widnio masowe. iZaobserwowano jon czasteczko¬ wy o m/e 454.Sirodesmina B. Wzór sumaryczny C^^fi^A* Analiza: znaleziono C 43,4%; H 4,9%; N 4,9%; S 22,8%.Obliczono dla wzoru Cgo^eN^O^: C 43,6%; H 4,8%; N 5,1%; S 23,3%.Widmo masowe. Widmo masowe nie wykazuje piku macierzystego, a jedynie wyrazny pik, odpo¬ wiadajacy /M-S4/©, przy m/e 422. Widmo to jest identyczne z widmem Sirodesminy A. W wyniku reakcji z dwu-trójmetylosililotrójfluoroacetamidem w srodowisku benzenu, w temperaturze 50?C, w ciagu 3 godzin powstaje ipochodna dwu-trójmetylc- sililowa. Widmo masowe tej pochodnej nie wyka¬ zuje piku macierzystego, lecz jedynie slaby pik, odpowiadajacy [M-/S+CHS/]©, przy m/e 647,1445, podczas gdy wzorowi sumaryczneniu CasHsgN^SsS^ ' •odpowiada wartosc m/e, równa 647,1407.10 Sirodesmina C. Wzór sumaryczny: C2oH26N208S8.Analiza: znaleziono C 46,3%, H 5,1%; N 5,5%; S 1)8,0%. Wyliczono dla wzoru: C^g^OgSs: C 46,3%; H 5,0%; N 5,4%; S 18,5%. Widmo masowe.Stwierdzono wyrazny pik, odpowiadajacy /M«A/©, przy m/e 422. Taki sam pik odpowiada wzorowi sumarycznemu Ca^e^OgSs.Sirodesmina D. Wzór sumaryczny: C20H26N2O8Sx, w którym x prawdopodobnie oznacza liczbe 4.Widmo masowe nie wykazuje piku macierzystego, ale wyrazny pik, odpowiadajacy /M-Sx/0, przy m/e 422.Sirodesmina E. Wzór sumaryczny: C20HwN2O8Sx, w którym x prawdopodobnie oznacza liczbe 3.Widmo masowe nie wykazuje piku macierzystego, 15 ale wyrazny pik, odpowiadajacy /MtSx/©, przy m/e 422.Sirodesmina F. Wzór strukturalny C20H26N2O8Sx, w którym x prawdopodobnie oznacza liczbe 3.Widmo masowe nie wykazuje piku macierzystego, ale wyrazny pik, odpowiadajacy /M-Sx/0, przy m/e 422.Sirodesmina G. Wzór strukturalny C20H26N2O8S2.Analiza: znaleziono C 49,7%; H 5,4%; N 5,7%; S 12,6%. Wyliczono dla wzoru C20H^i2O^S2: C 49,4%; H 5,4%; N 5,8%; S 13,2%. Widmo masowe nie wykazuje piku macierzystego, ale wyrazny pik, odpowiadajacy /M-S2/0, przy m/e 422.Hydroliza Sirodesminy G przy uzyciu 0,1 n me* tanolowego roztworu HC1 daje Desacetylosirodes- mine G, topniejaca w zakresie 195—196,5ÓC.Na podstawie analizy elementarnej znaleziono C 48,4%; H 5,5%; N 6,5%; S 14^6%. Dla wzoru CisH^NfOySg wyliczono: C 48,4%; H 5,5%; N 8,3%; S 14,4%. Widmo masowe ni* wykazuje piku macie¬ rzystego, ale wyrazny pik, odpowiadajacy /M-Sa/0, przy wartosci m/e, wynoszaee} 360. Acetylowanie Sirodesminy G bezwodnikiem octowym w srodo¬ wisku pirydyny, w temperaturze pokojowej, w cia¬ gu 0 diii daje dwuoctan Skodesminy G o tempe¬ raturze topnienia 159—159,5°C.Sirodesmina H. Wjfiór strukturalny C20H28N2O8Sx.Widmo masowe nie wykazuje piku macierzystego, ale wyrazny pik dla /M-Sx/0, przy m/e 422.Sirodesmina J. Wzór strukturalny C^Hj^O^, Analiza tego zwiazku dala nastepujace wyniki: C49,8%; H 5,5%; 10,5%. Ula wzoru strukturalne¬ go CjjoH^OaSj, wyliczono: C 49,4%; H 5,4%; N ,B%. Widmo masowe nie wykazuje piku macie¬ rzystego, ale wyrazny pik dla /M-S2/©, przy m/e 422 i slaby pik dla /M^S/0, przy m/e 454.Sirodesminy A, B, C, D, E, P, G, H i J i icfh pochodne rozdziela sie metoda chromatografii cien¬ kowarstwowej na zelu krzemionkowym G.F. Po wywolaniu plytke spryskuje sie roztworem kwasu chromowego i ogrzewa. Najpierw pojawia sie pla¬ ma zólta, a nastepnie czarna. Wartosci wspólczyn¬ nika rozdzialu Rf przy uzyciu trzech róznych ukla¬ dów rozpuszczalników przedstawia tablica 1.Zwiazek Sirodesmina A Sirodesmina B Sirodesmina C Sirodesmina D Sirodesmina E Sirodesmina F Sirodesmina G Sirodesmina H Sirodesmina J Deaacetylo- sirodesmina A dwuoctan Sirodesminy A Desacetylo- sirodesminy G dwuoctan Sirodesminy G monooctan | Sirodesminy A monosiarczek | Sirodesminy A Tabli Toluen: octan etylu, 1:2 0,23 0,07 0,17 0,31 0,36 0,42 0,38 0,23 0y38 0,23 0,39 0,33 0,52 0,31 0^24 cal - Chloroform: : metanol: kwas mrówkowy, 95 : 4:1 0,35 0,24 0,29 0,29 0,33 0,35 0,39 0,28 0,35 0,24 0,51 0,27 0,55 0,45 0 0,29 Chloroform: : octan etylu, 1:2* 0,06 0,14 0,25 0,27 0,34 0,32 0,17 0,28. 0,15 0,36 .W3 0,49 0,26 0,19 1 Stadesminy A—H rozdzielono metoda chroma¬ tografii cieklej pod cisnieniem. Zastosowano chro¬ matograf 820, f-my Du Ptint z E.T.H.; faza trwa¬ la, srednica wewnetrzna ii mX2,l m.m. o gradiencie fazy ruchomej 0—1,25% redestylowanego alkoholu w 2;2,4-trójmetylopentanie w czasie 50 minut i pod cisnieniem 140 kG/cra*. Otrzymana wyniki zesta¬ wiono w tablicy 2, w której w kolumnie pierwszej podano zwiazek, a w kolumnite drugiej czas reten¬ cji.Tatoliea 2 as Zwiazek Sirodesmina G Sirodesmina E Sirodesmina A+D Slródfcsmina *€ \ Sirodesmina H 1 Sirodesmina B 1 Sixodes_mina:F Czas retencji, minuty. 5 23,5 50,0 ,0 40,0. 44,0 1 49,0 I86 829 Tablica 3 Sirodesmina A Wegiel Nr 1 2 3 6 ' 4' 6 8 8a Podstawnik CH2OH CH8 H H H H CH3 CH« CH8 , CH8CO.O H H H- Sygnal ,72 6,86 6,86 6,94 4,26 ,78 8,71 8,98 9,06 7,90 7,44 8,04 ,52 Stala sprzeze - nia (Hz) 16 7 14*) Dwu- urefcan Sygnal (t) 4,9 ,10 6,85 6,32 6,52 4,32 ,84 8,76 9,01 9,09 7,93 7,42 7,98 ,10 Stala sprzezenia /Hz/ 12 16 7 14 •/ Stala sprzezenia z wodorem w pozycji 8a wynosi 8,5 Hz Tablica 4 Sirodesmina B Wegiel 2 3 6' 4' 6 8 8a Podstawnik CH2OH CH* H H H H CH8* CH8 CH8 CH8CO.O H H H Sygnal (*) ,88 6,97 6,74 7,32 4,46 4,84 8,74 9,04 9,08 7,98 7,49 8,14 ,24 Stala sprzeze¬ nia (Hz) */ 7 14*/ Dwu- uretan Sygnal W ,16 6,96 6,33 6,67 4,73 ,72 8,77 8,98 9,04 7,86 7,47 8,01 4,56 Stala sprzezenia /Hz/ 16 7 14**/ 1 */ (Po dodaniu D£0 stala sprzezenia wynosi 12 Hz •*/ Stala sprzezenia z wodorem w pozycji 8a wynosila 9 Hz.Sirodesminy mozna latwo zidentyfikowac na pod¬ stawie widma JRM. W tablicach 3—9 zestawiono wyniki badania protonów Sirodesmin A, B, C, D, E, iF, G, H i J w spektrofotometrze Varian HA 100, w deuterowanym chloroformie jako rozpuszczalni¬ ku, jesli nie zaznaczono inaczej, stosujac tetrame- tylosilan jako wewnetrzny standart /x=10,0/.Dwu-uretan przygotowano w tubie spektrofoto¬ metru, dodajac izocyjanianu trójchloroacetylu. O- znaczenia numerowe wegla sa takie same, jak we wzorze ogólnym7 przedstawionym na rysunku.' 55 60 65 Sirodesmina C w roztworze, w temperaturze po¬ kojowej istnieje jako mieszanina dwóch podobnych substancji. Jako odpowiednik mozna wymienic trój- siarczek Spirodesminy E.W widmie J.R.M. niektóre sygnaly sa podwojone, gdy pomiaru dokonuje sie w benzenie lub cztero- chlorometylenie, w temperaturze pokojowej. Wid¬ ma sa mniej skomplikowane, gdy sie je mierzy w wyzszych temperaturach.Sirodesmina C w czterochloroetylenie.A/ w temperaturze pokojowej:86 829 1 Wegiel Nr ' L 4' 6 3 6 T a b 1 Podstawnik CH8 CH8 CHgCO.O CH8 H ic a 5 Sygnal t 8,70 9,01 8,00 6,78 4,66 8,76 9,09 6,96 4,93 | B/ w temperaturze 120^C: Sygnaly, wywolane weglami 5* i 4' z grupa me¬ tylowa jako podstawnikiem, sa mniej ostre, dwie linie dla 3-metylu zlewaja sie w pojedyncza linie, jak równiez dwie linie dla 6-H zlewaja sie w sze¬ roka pojedyncza linie.Pochodna uretanowa Sirodesminy C w cztero- chloroetylenie.A/ w temperaturze pokojowej: Tablica 6 Wegiel Nr ' % 4' 6 Podstawnik CH8 ClisCO.O CH8 NH Sygnal t 8,83 9,07 8,07 0,99 1,09 8,86 9,15 1,03 1,21 8,94 B/ w temperaturze 120°C.Sygnaly, wywolane przez wegle w pozycji 5* i 4', oraz podstawnik octanu metylu w pozycji 6 sta¬ ja sie bardzo ostre, a sygnaly wywolane przez NH uretanu daja dwie linie.Sirodesmina C w benzenie.A/ w "temperaturze pokojowej.Tablica 7 Wegiel Nr ' 4' 6 6 Podstawnik Sygnal t CH2 CH8 CH,00.0 CH8 H 9,01 9,25 8,52 7,03 4,23 9,06 9,37 7,13 4,50 9,04 9,41 9,00 40 B/ w temperaturze 78°C.Podwojone sygnaly zaczynaja wyraznie zlewac sie, ale proces nie przebiega do konca.Tablica 8 Sirodesmina D Wegiel Nr •3 :5r 6 '8 8 • 8a 4' ' Podstawnik CH8 H H H CH8C0.0 H H H CHs CH8 CH8 H Sygnal t 6,92 6,58 7,24 4,62 7,94 7,35 8,20 ,39 8,90 8,98 8,77 6,09 Stala sprze¬ zenia /Hz/ 16 14*/ 7 50 55 60 Tablica 9 Sirodesmina G Wegiel Nr 2 3 6 ' 4' 6 8a Podstawnik CH2OH CH2OH CH8 H, H H CH8 CH8 CH8 CHgCO.O H H Sygnal ,82 6,53 6,91 6.80 4,50 6,10 6,78 8,93 9,01 7,29 8,29 ,72 Stala sprze¬ zenia /Hz/ 7 • 14*/ */ Stala sprzezenia z wodorem w pozycji 8a wynosi 9 Hz.Glówne rezonanse j.r.m. (wartosci roztworu COCl3) Sirodesmin E, F, H, J i Desacetylosirodes- miny G sa nastepujace: Sirodesmina E: 9,02 /CH8/; 8,93 /CH3/; 8,95; 8,83; 8,77; 7,90 /CH3OO.O/; 6,96 /NCH8/; 6,79; 5,34.Sirodesmina F: 9,06 /CH3/; 9,00 /CH8/; 8,73 /CH8/; 7,93 /CH3CO.O/; 7,29; 6,95; 6,79 /NCH8/; 5,30.Sirodesmina H: 9,01 /CH3/; 8,93 /CH8/; 8,79 /CH8/; 7,98 /CHgCO.O/; 6,93 /NCH3/; 6,41; ,25.Sirodesmina J: 9,03 /CH3/; 8,98; 8,94; 8,79; 8,73; 7,01 /CH8CO.O/; 7,88; 6,84 /NCH3/; 6,50; 5,11.Desacetylosirodesmina G: 9,01 /CH8/; 8,98 /CH8/; 8,77; 8,33; 7,38; 7,13; 6,87 /NCH3/; 6,80; 6,14; 5,4—5,9; 4,7—5,0.Widmo w podczerwieni.Widma Sirodesmin w podczerwieni sa do siebie bardzo podobne. Glówne maksima absorpcji bada¬ nych zwiazków rozproszonych w cieklej parafinie sa nastepujace: ' Tablica 10 Zwiazek */ Stala sprzezenia z wodorem w pozycgi 8a wynosfi 9 Hz, Sirodesmina A Sirodesmina B Sirodesmina C Sirodesmina D Sirodesmina E Sirodesmina F Sirodesmina G Sirodesmina J monooctan Sirodesminy A dwuoctan Sirodesminy A Desacetylo¬ sirodesmina A Absorpcja /cm-1/. 65 I 3450 1765 1690 1112 1075 1045 3450 1765 1680 1118 1082 1045 3450 1760 1685 1080 1045 1008 3400 1750 1670 1153 1083 1045 3400 1750 1©70 1153 1083 1045 3450 1750 1675 1135 1083 1047 3450 1750 1683 1155 1083 1047 3450 1760 1680 1085 1047 722 3500 1745 1675 1035 937 725 1700 1095 1080 1055 940 3500 1748 1675 1375 1355 1305 1210 1130 1085 1050 800 727 1395 1225 1008 943 722 1375 1228 946 722 1375 1225 945 722 1375 1230 1015 721 1375 1230 1015 721 1375 1230 1012 722 1375 1230 1015 722 1380 1235 1360 1210 1235 1082 1412 1390 1265 1210 1008 939 857mm 11 12 Mieszanina, otrzymana droga ekstrakcji grzybni, wyodrebnione z niej nowe zwiazki Sirodesminy A, B, C, D, E, F i G, pochodne, otrzymane przez de- zacetylacje. Sirodesminy A i G, monooctan Sirodes¬ miny A oraz siarczek Sirodesminy — wszystkie wy¬ kazuja aktywnosc przeciwwirusowa w obecnosci komórek zywiciela, w szczególnosci przeciwko „rhi¬ nowirusom" w obecnosci tkanki plucnej embrio¬ nów ludzkich, przeciwko wirusom „Coxsackie" A i B i „Echo". Aktywnosc przeciwko rhinowirusom oznacza sie w sposób nastepujacy: PrepaAije sie tkanke plucna embrionów ludzkich z plynem tkankowym „Eagle'a", zawierajacym 1% surowicy cielecej i nastepnie umieszcza w probów¬ kach szklanych 7,6i2 cm X 1,27 cm. Próbki z zawar¬ toscia poddaje sie inkubacji w temperaturze 33°C.Do ©znaczenia wybiera sie 8 serii po 3 probówki.Po.kolejnych serii probówek wprowadza sie roztwór badanego zwiazku w tym samym rozpuszczalniku, zawierajacym odpowiednio 200, 50, 12,5, 3,1, 0,8, 0,2, 0*005 i 0,00 g substancji w 1 ml roztworu i kon¬ tynuuje inkubacje w temperaturze 33°C.Po uplywie 24 godzin do kazdej probówki wpro¬ wadza sie dawke rhinowirusa, np. rhinowirusa ty¬ pu 2, 50% dawki zakaznej w 100 czesciach kultury tkankowej. Po dalszych dwóch dniach wygrzewania w temperaturze 33°C kazda probówke ocenia sie wizualnie dla stwierdzenia efektu cytopatogennego, spowodowanego toksycznoscia zwiazku. Pojecie to zostalo uogólnione i obejmuje cala powierzchnie komórki — równiez efekt cytopatogenny wywola¬ ny .wzrostem wirusa i który jest.charakterystycz¬ nym efektam ogniskowym latwo odróznialnym od efektu, wywolanego toksycznoscia zwiazku.„Dawka aktywna" badanego zwiazku okresla sie takie jego stezenie, które zabezpiecza 50% komórek przeciwko degeneracyjnym zmianom, wywolanym rozwojem wirusa, zas jako „dawke toksyczna" zwiazku przyjmuje sie takje jego stezenie, które powoduje toksyczne zmiany w 50% komórek.Mieszanina' przeciwwirusowa oraz zwiazki, wcho¬ dzace w sklad mieszaniny, hamuja rozwój rhino¬ wirusa typu 2 przy stezeniu mniejszym lub rów¬ nym 0,25 mgAnl, ftie dajac jednoczesnie widocznych efektów toksycznych na komórkach tkanki przy dawkach co najmniej dziesieciokrotnie nizszych ód dawki aktywnej.Sirodeamina A byla podawana do nosa samcom i samicom szczura. Stosowano dawke dzienna 0,25 mg/kg w ciagu 14 dni. Wszystkie szczury dobrze zniosly okres doswiadczalny, a pózniejsza sekcja nie wykazala zmian histologicznych. Aby spowodo¬ wac dzialanie przeciwwiruisowe w komórkach zy¬ wiciela, mieszanine lub jeden z opisanych zwiaz¬ ków nalezy wprowadzic do tkanki w poblizu miej¬ sca rozwoju wirusa, stosujac stezenie 0,003—0,25 ipg/ml. Podanie do nosa lub gardla dawki 0,01— ^0,1 mg, trzy do szesciu razy dziennie jest wy¬ starczajace. TJ ludzi: stanowi 'to odpowiednio dzien¬ na dawke doustna dla osoby doroslej 2—2f0 mg.(Mieszanina przeciwwirusowa lub którykolwiek z jej skladników, w szczególnosci Sirodesmina A mo¬ ze miec zastosowanie jako srodek farmaceutyczny w polaczeniu, z odpowiednimi rozpuszczalnikiem lub nosnikiem. Srodek moze miec postac konwencjo¬ nalnych lub romboidalnych tabletek, kapsulek, wodnych i olejowych roztworów lub zawiesin, e- mulsji, kropli do nosa, roztworów aerozolowych lub do inhalacji.Przygotowuje sie go metodami konwencjonalnymi.Srodek moze zawierac inne typowe dodatki. Naj¬ korzystniejsza postac srodka jest taka, która umoz¬ liwia uzyskanie odpowiedniego stezenia mieszaniny, lub zwiazku w tych czesciach tkanki, w których io rhinowirusy zwykle sie rozwijaja, op. w Wonie sluzowej nosa i gardla, badz przez bezposrednie wprowadzenie srodka do tych miejsc, badz tez po¬ srednio poprzez wytworzenie dostatecznego pozio¬ mu mieszaniny lub zwiazku we krwi po podaniu doustnym.Do bezposredniego stosowania dogodne sa np. pa¬ stylki romboidalne, które powinny rozpuszczac sia powoli w jamie ustnej, roztwory do przeplukiwa¬ nia jamy ustnej i polaczonych z nia przewodów, spray do gardla i nosa, tabletki do zazywania do¬ ustnego.Pastylki romboidalne lub tabletki zawieraja ko¬ rzystne od 0,05 mg do 5 mg zwiazku czynnego. Ty¬ powa dawka profilaktyczna lub lecznicza przy Jn- fekcji rhinowirusowej wynosi jedna tabletke 3 do 6-ciu razy dziennie.Zawartosc zwiazku czynnego w aerozolu powinna wynosic 0,01—1 mg. Dla celów profilaktycznych lub leczniczych wprowadza sie do nosa albo do gardla . okolo 0,1 ml takiego roztworu 3 do 6-ciu razy dzien¬ nie.Srodek moze równiez zawierac inne znane zwiaz¬ ki o dzialaniu farmakologicznym, np. substancje hamujace krwawienie z nosa, przeciwgoraczkowe i antyseptyczne.Mieszanina, wyodrebnione zwiazki lub odpowied¬ nie kompozycje, zawierajace zwiazki czynne moga byc stosowane profilaktycznie przez osoby, które maja kontakt z nosicielami infekcji rhinowiruso- 40 wej.Podawanie mieszaniny lub kompozycji chorym moze w wielu przypadkach nie przynosic zlagodze¬ nia towrzyszacych objawów, poniewaz do czasu 45 pojawienia sie objawów infekcja rhinowirusowa moze sie w pelni rozwinac, niemniej jednak lecze¬ nie takie moze byc uzyteczne, gdyz ogranicza: w znacznym stopniu rozprzestrzenienie sie infekcji.Przykladowy sklad preparatu do nosa: 50 SlirodesminaA 6 mg 1'himoresal 2 mg p-hydroksybenzoesan metylu 80 mg p-hydroksybenzoesan propylu 20 mg fosforansodu 500 mg 55 EDTA — sól sodowa 5 mg woda destylowana do objetosci — 100 ml Wynalazek ilustruja ponizsze przyklady, które nie ograniczaja jego zakresu.Przyklad I. Sporzadzono pozywke o naste- 60 pujacym skladzie: azotansodu 2,0 g ortofosforan jednopotasowy 1,0 g siarczan magnezu siedmiowodny 0,5 g chlorekpotasu 0,5 g 65 siarczan zelazawy siedmiowodny "•-«..«80829 13 Dekstroza o znaku handlowym „Cerelose" 50,0 g Ekstrakt drozdzowy o znaku handlowym „Oxoid" 1,0 g Koncentrat pierwiastków sladowych 1,0 ml woda destylowana do objetosci — 1,0 1 Koncentrat pierwiastków sladowych o skladzie: siarczan zelazawy siedmiowodny 1,0 g siarczan miedzi pieciowodny 0,15 g siarczan cynku siedmiowodny 1,0 g siarczan manganu czterowodny 0,1 g molibdenianpotasu 0,1 g przygotowano nastepujaco: wyzej wymienione zwiazki ^rozpuszczano w wodzie destylowanej, do¬ dano stezonego kwasu solnego do uzyskania kla¬ rownego roztworu i rozcienczono woda destylowana do objetosci 1 litra.Pozywke zalkalizowano lOn wodnym roztworem wodorotlenku potasu i trzymano przez 25 minut w autoklawie pod cisnieniem 0,70 kg/cm2.Sirodesmium diversum o symbolu katalogowym CMI 102519 hodowano w temperaturze 25°C w bu¬ telkach Thompson^, zawierajacych po 1 litrze po¬ zywki. Po 35 dniach produkt zebrano, przefiltro- wano, uzyskujac 70 litrów filtratu o pH=6,5, po czym ekstrahowano toluenem 2X14 litrów. Pola¬ czone ekstrakty toluenowe wysuszono nad bezwod¬ nym siarczanem sodowym, po czym rozpuszczalnik odparowano w temperaturze 60°C pod cisnieniem mm Hg. 7,1 g pozostalosci przemyto czterokrot¬ nie po 25 ml eteru naftowego o temperaturze wrze¬ nia 60—80°C, odrzucajac popluczyny. Osad stanowi¬ la mieszanina przeciwwirusowa.Przyklad II. Dwie serie miszaniny przeciw- wirusowej wynoszace okolo 6,52 g, otrzymane w przykladzie I, polaczono, nastepnie rozdzielono na 2 równe porcje i podano oddzielnie na chromato¬ graf z suchymi kolumnami, które przygotowano nastepujaco: 2 butelki, zawierajace 900 g zelu krzemionkowe¬ go (F-my Hopkins i Williams, Ltd. „Silica Gel M.F.C.") i 100 ml wody wirowano przez 2 godziny, po czym dodano 115 ml eteru dwuetylowego i octa¬ nu etylu w stosunku 3 : 2 i wirowano przez nastep¬ ne 3 godziny. Otrzymany zel krzemionkowy upako¬ wano do nylonowych oslon, uzyskujac suche ko¬ lumny 90 cm X 4 cm.Do górnej czesci kolumny wprowadzono miesza¬ nine w niewielkiej ilosci ukladu rozpuszczalników eter — octan etylu w stosunku 3:2, po czym ko¬ lumne zasilano ta sama mieszanina rozpuszczalni¬ ków dopóki nie dotarly one do dolu kolumny. Kaz¬ da kolumne podzielono na 6 sekcji i te same sekcje z dwóch kolumn laczono razem, po czym eluowano 3X500 ml octanu etylu i metanolu, uzytych w sto¬ sunku 97:3. Odparowano rozpuszczalniki.Z otrzymanych 6 frakcji pierwsza byla najmniej polarna, szósta zas najbardziej polarna. Frakcja 1— —3 odrzucono. Frakcja 4 zawierala Sirodesminy A i C lacznie z mniej polarnym produktem, frakcja 5 zawierala Sirodesminy A, B i C razem z niepo¬ zadanym materialem, frakcja 6 zawierala Sirodes- mine B lacznie z pokrewnym materialem podsta¬ wowym. Frakcje 4—6 rozdzielano metoda chroma¬ tografii cienkowarstwowej *ia zely krzemionkowym 14 G.F., stosujac plytki o rozmiarach 20X40X0,1 cm.Do wywolywania zastosowano dwa rodzaje roz¬ puszczalników: 1) -octan etylu i toluen w stosun¬ ku 2:1 i 2) kwas mrówkowy, metanol* i chloroform w stosunku 1: 4 : 95. ."Rozdzielony material odzyska¬ no, eluujac odpowiednie paski octanem etylu i me¬ tanolem, uzytych w stosunku 97 : 3.Poddajac rozdzialowi metoda chromatografii cien¬ kowarstwowej 780 mg frakcji 4, uzyskanej z chffo- io matografu o suchych kolumnach i stosujac roz¬ puszczalnik /l/ oraz 8 plytek, otrzymano frakcje flj w ilosci 9,2 mg, zawierajaca glównie Sirodesmine A i frakcje /II/ w ilosci 165 mg, zawierajaca glów¬ nie Sirodesminy A i C.W wyniku dalszego rozdzialu metoda chromato¬ grafii cienkowarstwowej frakcji /I/, stosujac dwu¬ krotne wywolywanie rozpuszczalnikiem /2/, otrzy¬ mano frakcje /III/ w ilosci 43 mg, zawierajaca Si¬ rodesmine A. Dalsze chromatografowanie na 2 plyt- kach, przy uzyciu rozpuszczalnika /2/ dalo frakcje /IV/ w ilosci 36,4 'g, zawierajaca Sirodesmine A i slady Sirodesminy C, zanieczyszczonej w niewiel¬ kim stopniu Sirodesmina A i B.IW wyniku rozdzialu metoda cienkowarstwowej chromatografii 716 mg frakcji, otrzymanej z chro¬ matografu o suchych kolumnach, przy zastosowa¬ niu 8 plytek i rozupszczalnika /l/, otrzymano 296 mg frakcji /VI/, zawierajacej glównie Sirodesminy A i C, które z kolei poddano dalszemu rozdzialo- wi, przy uzyciu 6 plytek i rozpuszczalnika 72/, da¬ ly 63,4 mg frakcji /VII/, zawierajacej glównie Siro¬ desmine A i 146 mg frakcji /VTHI/ z Sirodesmina C jako skladnikiem glównym. Frakcje /IV/ i /VTI/ polaczono i poddano dalszemu rozdzialowi, stosujac do wywolania 2 plytki i rozpuszczalnik /2A Uzyska¬ no 37 mg frakcji /IX/, zawierajacej Sirodesmine A.Frakcje /III/i /IX/ polaczono, rozpuszczono w 2 ml benzenu i skraplano eter o temperaturze wrzenia 60—80°C, celem wytracenia osadu Sirodesminy A. 40 Otrzymano 68 mg Sirodesminy A.Frakcje /VIII/ rozdzielano dalej, stosujac dwu¬ krotne wywolywanie rozpuszczalnikiem /2/ i plytki.Otrzymano 68 mg frakcji /X/ Sirodesminy C, za¬ nieczyszczonej sladowymi ilosciami Sirodesminy A 45 i B. Polaczone frakcje /V/ i /X/ rozpuszczono w 2 ml octanu etylu, po czym wytracono 60 mg stalej Sirodesminy C, stosujac jako substancje stracaja-, ca eter naftowy.Frakcje 6 uzyskana z chromatografu o suchych 50 kolumnach rozdzielano dalej metoda chromatogra¬ fii cienkowarstwowej, stosujac do wywolania 6 ply¬ tek rozpuszczalnika /2/. Otrzymano 193 mg oleistej/ Sirodesminy B, z której, po rozpuszczeniu w benze¬ nie i wytraceniu eterem naftowym, uzyskano 113 55 mg Sirodesminy B.Przyklad III. 2,5 g mieszaniny przeciwwisru- sowej, uzyskanej z 90 litrów brzeczki fermentacyj-, nej, przeniesiono do 50 ml suchej pirydyny, po czym zadano 5,0 *ml chlorku tionylu, w tempera- 60 turze 0°C. Po 15 minutach dodano 500 ml wody z lodu, odstawiono na dalsze 15 minut, zakwaszono 2n kwasem siarkowym do pH=2 i wyekstrahowa¬ no chloroformem 3X500 ml. Ekstrakty wysuszono nad siarczanem sodu i zatezono do konsystencji 05 oleju, 1,43 uzyskanego oleju podano na chromato-86 829 1S graf o suchych kolumnach, sporzadzonych z 430 g zelu krzemionkowego przygotowanego nastepujaco: Pwulitrowa butelke, zawierajaca 1* kg zelu krze¬ mionkowego MFC (F-my Hopkin i Williams, Ltd.) i 120 ml wody poddano wirowaniu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Nastepnie dodano 112,5 ml mieszaniny rozpuszczalników: octan etylu i to¬ luenu W stosunku 2:1 i kontynuowano wirowanie przez dalsze 3 godziny. Kolumne rozwinieto octa¬ nem etylu i toluenem w stosunku 2:1, po czym podzielono ja na 9 czesci, eluujac kazda 3X500 ml octan etylu i metanolu, uzytych w stosunku 97:3.Frakcje, zawierajace Sirodc^mine A polaczono, po czym rozdzielono metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej, stosujac zel krzemionkowy G.F., oraz oc¬ tan etylu i toluen 2:1, Uzyskano 218 mg oleistej Sirodesminy A, Druga porcje, uzyskana fcrzez wyekstrahowanie toluenem &0 litrów brzeczki fermentacyjnej i póz¬ niejsze przemycie nafta, poddano wyzej opisanym czynnosciom. Dwie próbki, zawierajace Sirodesmi- ne A, polaczono ze soba, uzyskujac w sumie 505 mg produktu, który rozpuszczono w 5 ml benzenu.Wkraplajac do roztworu eter naftowy o tempera¬ turze wrzenia 60—80°C, otrzymano 385 mg stalej Sirodesminy A.Przyklad IV. 50 mg Sirodesminy B w 1,0 ml suchej pirydyny potraktowano 0,1 ml chlorku tio- nylu w temperaturze 0°C. Po 12 minutach dodano ml wody z lodu, odstawiono na dalsze 15 minut, zalcwaszono 2n kwasem siarkowym do pH=2 i wy¬ ekstrahowano 3X20 ml chloroformu. Ekstrakty wy¬ suszono nad siarczanem sodu i zatezono do uzys¬ kania konsystencji oleju. Otrzymano 29,4 mg Siro¬ desminy A ze sladami Sirodesminy B i C-Suro¬ wy produkt oczyszczono metoda chromatografii cienkowarstwowej, przy uzyciu zelu krzemionko¬ wego G.F. i mieszaniny rozpuszczalników: kwas mrówkowy, metanol i chloroform 1: 4 : 95. Otrzy¬ mano 12,5 mg oleistej Sirodesminy A.Przyklad V. 5,0 mg Sirodesminy C w 0,1 ml suchej pirydyny zadano chlorkiem tionylu w temperaturze 0°C. Po 10 minutach dodano 5 ml wo¬ dy z lodem i pozostawiono na 15 minut. Roztwór zakwaszono 2n kwasem siarkowym do pH^2, ek¬ strahowano chloroformem, 3X5 ml, ekstrakty wy- "* suszono nad siarczanem sodu 1 zatezono do uzyska¬ nia 4,3 mg oleistej Sirodesminy A, Przyklad- VI. 250 mg Sirodesminy A w 9,5 ml suchej pirydyny poddano reakcji z 6,25 ml bez¬ wodnika octowego w temperaturze pokojowej, bez dostepu swiatla, przez okres 1 tygodnia, po czym potraktowano 1,25 ml wody w czasie 1 godziny, w temperaturze 5°C. Roztwór zakwaszono kwasem siarkowym do pH=2, rozcienczono 25 ml wody i wyekstrahowano octanem etylu* 4X50 ml. Ekstrak¬ ty wysuszono nad siarczanem sodu, zatezono do u- 16 zyskania 280 mg oleju i oczyszczono metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej, stosujac jako roz¬ puszczalnik: kwas mrówkowy, metanol i chloroform, w stosunku 1 : 4 : 95.Skladnik, wystepujacy w przewazajacej ilosci, krystalizowano dwukrotnie z octanu etylu. Otrzy¬ mano 127 mg dwuoctanu Sirodesminy A w postaci lekko zóltych igiel —189°C.Przyklad VII. Roztwór 50 mg Sirodesminy A i 15 mg siarki w 2 ml pirydyny trzymano w ciemnosci, ,w temperaturze pokojowej, przez 24 go¬ dziny, po czym odparowano do sucha w tempera¬ turze 35°C. Sucha pozostalosc rozdzielono na Siro- desmine A, B i C metoda chromatografii cienko- warstewkowej, stosujac 1 plytke zelu krzemionko¬ wego G.F. o rozmiarach 40X20X0,1 cm oraz octan etylu i toluen w atosunku 2:1.Przyklad VIII. Kulture, hodowana w sposób, opisany w przykladzie I, zebrano po 28 dniach, prze- filtrowano i 70 1 filtratu ekstrahowano chlorofor¬ mem, 2X14 1, wysuszono nad bezwodnym siarcza¬ nem sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Przygotowano dwuwarstwowy uklad rozpusz- czalników, dolny i górny, wytrzasajac toluen, me¬ tanol, chloroform i wode w stosunku objetoscio¬ wym 9:9:4:4. g mieszaniny przeciwwirusowej rozpuszczono w 300 ml dolnej warstwy rozpuszczalnika, po czym roztwór ten, jak i dwie dalsze porcje po 300 ml mieszaniny, rozpuszczonej w dolnej warstwie roz¬ puszczalnika, wytrzasano z 2X100 ml górnej war¬ stwy rozpuszczalnika. 900 ml polaczonych dolnych warstw odparowano do sucha i pozostalosc rozpu- szczono w 100 ml dolnej warstwy drugiego dwu¬ warstwowego ukladu rozpuszczalników, przygoto¬ wanego przez wstrzasanie lekkiej frakcji nafty, wrzacej w temperaturze 60—80°C, toluenu, metano¬ lu i wody, w stosunku objetosciowym 2:3:4:1. 40 Roztwór ten oraz 100 ml drugiej porcji, rozpuszczo¬ nej w dolnej warstwie drugiego dwuwarstwowego ukladu rozpuszczalników, wytrzasano kolejno z 2X100 ml górnej warstwy. 200 ml polaczonych dol¬ nych warstw odparowano do sucha. 10 g suchej po- 45 zostalosci podano na chromatograf z 850 g dezakty- wowanego zelu krzemionkowego, przygotowanego przez potraktowanie 250 g zelu krzemionkowego 30 ml wody i staranne wymieszanie w butelce z za¬ kretka w mlynie kulowym. 50 Frakcje mieszaniny przeciwwirusowej najpierw eluowano rozpuszczalnikiem, a nastepnie kilkakrot¬ nie oczyszczano metoda chromatografii cienkowar- stewkowej, na zelu krzemionkowym G.F., przy czym za kazdym razem substancje oczyszczona wy- 55 odrebniano z plytki w znany sposób i ponownie przenoszono na nastepna plytke, przed jej wywo¬ laniem. Wyniki przedstawione w tablicy 11.86 829 17 18 Tablica 11 Kolumna chromatograficzna Frakcja Nr 1 1 2 3 4 6 7 8 1 9 1 io Rozpuszczalnik wywolujacy octan etylu 40 40 50 50 50 100 100 objetosc (1) 4,5 2,0 1,7 3,6 1,0 1,4 ,0 1,4 1,8 ,6 Chromatografia cienkowarstew- kowa Rozpuszczalnik wywolujacy *) a,b, » b,b,b,c *) b,b,b,b,c,c,b, b,a,b, 't?,a, b, b,b, d,b») 3) Zwiazek wyodrebniony Sirodesmina G Sirodesmina F Sirodesmina E Sirodesmina D Sirodesmina H Sirodesmina A Sirodesmina A Sirodesmina C Sirodesmina B 1) a) toluen : octan etylu 1:2 ta) chloroform : metanol : kwas mrówkowy, 95:4:1 c) chloroform : octan etylu : 1:1 d) chloroform : metanol, 95:5 2) Koncowe oczyszczanie przy uzyciu rozpuszczalnika b jako inhibitora reakcji dysproporcjonowania, w czasie chromatografowania Sirodesminy C do Siro¬ desminy A i B. 3) Oczyszczanie na kolumnie, zawierajacej 225 g dezaktywowanego zelu krzemion¬ kowego, przy uzyciu chloroformu jako rozpuszczalnika rozwijajacego.Przyklad IX. Do 11 g roztworu oczyszczone¬ go mieszaniny przeciwwirusowej, przygotowanego sposobem, opisanym w przykladzie VIII, w 30 ml pirydyny dodano zimny roztwór S02 w pirydynie, przygotowany przez barbotowanie S02 w 51 ml pirydyny do uzyskania objetosci 62 ml. Po pólgo¬ dzinnym odstaniu roztworu w temperaturze poko¬ jowej mieszanine reakcyjna wylano na lód i za¬ kwaszono 410 ml 2n HC1.Mieszanine ekstrahowano chloroformem) przemy¬ to równiez chloroformem, wysuszono i odparowa¬ no. Otrzymane 8,0 g pozostalosci podano na chro¬ matograf z zelem krzemionkowym. Wyniki chro¬ matografowania podano w tablicy 12. 40 Frakcje o wysokiej wartosci Rf oczyszczano me¬ toda chromatografii cienkowarstewkowej, stosujac najpierw jako rozpuszczalnik CHC13: CH8OH: : NCOOH w stosunku 95 : 4 :1, a nastepnie toluen : : octan etylu w stosunku 1 : 2. Otrzymano Sirodes- mine G.Sirodesmine A otrzymano przez polaczenie frakcji i 6 i podanie ich na chromatograf z 288 g de¬ zaktywowanego zelu krzemionkowego, przy czym jako rozpuszczalnik stosowano chloroform.Przyklad X. 4,46 g pozostalosci z ekstraktu chloroformowego, otrzymanej sposobem, opisanym w przykladzie IX, rozpuszczono w 400 ml metano¬ lu, zawierajacego 4 ml stezonego HC1, po czym roz- T abli ca 12 Frakcja Nr 1 2 3 4 6 Rozwiniecie Octan etylu w toluenie °/o 40 40 40 40 40 70 Objetosc (1) 1,1 1,6 0,5. t,9 1,1 1,6 » Waga frakcji 1.2 0,88 2,5 Frakcje 2 oczyszczono metoda chromatografii cienkowarstewkowej, stosujac jako rozpuszczalnik CHC13: CH3OH : HCOOH w stosunku 95:4:1. W ten sposób wydzielono frakcje o niskim wspólczyn¬ niku rozdzialu Rf. Nastepnie frakcje o niskiej war¬ tosci Rf oczyszczano dalej, przy uzyciu jako roz¬ puszczalnika octanu etylu i CHC1S w stosunku 7: 3.Otrzymano Sirodesmine J. twór odstawiono na 40 godzin w temperaturze po¬ kojowej. Nastepnie roztwór odparowano do obje- go tosci 35 ml i dodano 35 ml wody. (Mieszanine ek»- strahowano 2X20 ml mieszanina lekkiej frakcji nafty, o temperaturze wrzenia 60—80°C i toluenu, uzytych w proporcji 2 :3. Warstwe organiczna, jak równiez nierozpuszczona substancje, odrzucono, $5 warstwe wodna ekstrahowano chloroformem, chlo-8tft2d M roform odparowano, a pozostalosc podzielono na 2 równe czesci. Jedna czesc w ilosci 1,15 g podano na chromatograf z dezaktywowanym zelem krzemion¬ kowym.Wyniki chromatografowania przedstawiono w tablicy 13.Po 15 dniach pH bulionu wynosilo 6,7. Po dopro¬ wadzeniu pH do wartosci 5,0 filtrat ekstrahowano chloroformem, po czym chloroform odparowano, uzyskujac mieszanine przeciwwirusowa.Przyklad XIII. 0,083 g Sirodesminy A w 100 ml metanolu, zawierajacego 1 ml stezonego HC1, Tablica 13 Frakcja JNt 2 3 Rozpuszczalnik toluen : octan etyul, 1 :1 CHC13 CHC13 O/bjetosc rozpuszczalnika ((ml) 370 480 '870 Pozostalosc z frakcji 3 krystalizowano z acetonu, otrzymujac iDezacetylosirodomine A o temperaturze topnienia 199—201°C.Inna porcja surowego produktu Dezacetylosiro- desminy A, krystalizowana z acetonu, wykazy¬ wala temperature topnienia 198—201°C.Przyklad Xl. Pozywke przygotowano w spo¬ sób, opisany w przykladzie I, zalkalizowano lOn wodnym roztworem wodorotlenku potasu do pH= =5,6 i wstawiono na 25 minut do autoklawu pod cisnieniem 0,7 kg/cm2.Sirodesmfum diversum C.MJ. o numerze katalo¬ gowym 102519 hodowano w temperaturze 25°C w 5tM ml kolbach stozkowych zawierajacych po 150 ml pozywki i wytrzasanych na obrotowej wytrza¬ sarce. Po 4 dniach, dalsze kolby zaszczepiono 12 ml bulionu; Po 12 dniach hodowli, w identycznych warun¬ kach, produkt zebrano i przesaczono. 50 ml prze¬ saczu doprowadzono do pH=6,0 i dwukrotnie ek¬ strahowano chloroformem w ilosci polowy obje¬ tosci ekstrahowanej porcji.-Polaczone ekstrakty od¬ parowano, uzyskujac przeciwwirusowa mieszanine.Przyklad Xli. Sirodesmium diversum C.M.I. 1025il9 hodowano w temperaturze 25°C w dwulitro¬ wych kolbach stozkowych, umieszczonych w obro¬ towej wytrzasarce. Kazda kolba zawierala 1 litr pozywki, opisanej w przyKladzie XI. Po 3 dniach uzyskane 3 litry bulionu uzyto do zaszczepienia 30 litrów pozywki o skladzie: gliceryna 40,0 g azotansodu 2,21 g ortofosforan jedinopotasowy 5,0 g siarczan magnezu siedmiowodny 1,0 g woda destylowana do objetosci— 11 Pozywke wstawiono na 25 minut .do autoklawu pod cisnieniem 1,05 kg^cm2. pH sterylizowanej po¬ zywki wynosilo 4,9.Pozywke przeniesiono do dwóch fermentatorów: szklanego i z nierdzewnej stali, o pojemnosci 40 litrów. W czasie mieszania 4-smiglowym miesza¬ dlem obracajacym sie z szybkoscia 380 obrotów/min przepuszczano sterylne powietrze w ilosci 15 l/min.Gdy zachodzila potrzeba, dodawano srodka prze- ciwpieniacego — glikolu propylowego 750. 40 50 55 65 pozostawiono w ciemnosci, w temperaturze pokojo¬ wej, na 4 dni, po czym odparowano, do sucha w temperaturze ponizej 20°C. Nastepnie dodano do pozostalosci metanolu i roztwór odparowano, w ce¬ lu usuniecia sladów HC1..Pozostalosc oczyszczono chromatograficznie, sto¬ sujac zel krzemionkowy G.F. i jako rozpuszczalnik CHCl3:HCOOH w stosunku 95:4:1. Otrzymano Dezacetylosirodesmine A, która po przekrystalizo- waniu z ukladu octanu etylu — eter naftowy miala temperature topnienia 198—201°C.Przyklad XIV. 0,15 g roztworu Sirodesminy A i 0,078 g trójfenylofosfiny w chloroformie pozo¬ stawiono na 4 godziny, po'czym odparowano do su¬ cha. Pozostalosc oczyszczono chromatograficznie, stosujac zel krzemionkowy G.F. i rozpuszczalnik: CHC18: CH3OH : HCOOH w stosunku 95 :4 :1.Eterem naftowym wytracono z roztworu octanu etylu monosiarczek Sirodesminy A, w postaci zelu, który po wyschnieciu mial postac bezbarwnego proszku.Przyklad XV. 0,1 g Sirodesminy G rozpusz¬ czono w 100 ml metanolu, zawierajacego 1 ml ste¬ zonego HC1, i roztwór odstawiono na 3 dni w tem¬ peraturze pokojowej do ciemnego pomieszczenia, po czym rozpuszczalnik oddestylowano, a pozostalosc oczyszczono chromatograficznie, stosujac zel krze¬ mionkowy G.F. i jako rozpuszczalnik wywolujacy: % metanol/chloroform. Produkt przekrystalizowa- no z acetonu, otrzymujac Dezacetylosirodesmine d o temperaturze 'topnienia 195—196,5°C.Przyklad XVI. 0,044 g Sirodesminy G roz¬ puszczono w mieszaninie 2 mi pirydyny i 1 ml bez¬ wodnika octowego i roztwór odstawiono na 9 dni do ciemnego pomieszczenia o temperaturze pokojo¬ wej. Roztwór schlodzono lodem z sola, dodano 0,4 ml zimnej wody i odstawiono na 4 godziny. Na¬ stepnie dodano 60 ml 3n H?S04, mieszanine ekstra¬ howano 3X25 ml octanu etylu, polaczone ekstrakty przemyto najpierw 50 ml wody, nastepnie 2X50 ml 5% roztworem NaHC08 i ponownie 50 ml wo¬ dy. Warstwe organiczna odparowano, a pozostalosc przekrystalizowano z ukladu octan etylu — eter naf¬ towy. Otrzymano dwuoctan sirodesminy Go tem¬ peraturze topnienia 159^159,5°C.86 829 21 PL