PL82374B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: VEB Carl Zeiss Jena, Jena (Niemiecka Repu¬ blika Demokratyczna) Sposób wykonywania analiz zwlaszcza enzymatycznych oraz urzadzenie do wykonywania analiz Przedmiotem wynalazku jest sposób wykonywa¬ nia ch-em-iozLnych, a zwlaszcza enzymatycznych ana¬ liz .majacych na celu pomiar aktywnosci enzymów, stezen substratów lub kosubstratów w zakresie ultramikro, obejmujacy mieszanie substancji wzór- 5 cowej z substancja badana i nanoszenie przynaj¬ mniej czesci powstalej tym sposobem mieszaniny po okreslonym czasie reakcji na material substan¬ cji nosnej, jak równiez urzadzenie do stasowania sposobu. io Dzieki wysokiej specyficznosci i czulosci, analizy enzymatyczne odgrywaja wielka role w wielu dziedzinach biochemicznych badan podstawowych oraz w biochemii stosowanej np. w klinicznej dia- 15 gnastyce biochemicznej. Celem analiz enzymatycz¬ nych jest badz to pomiar aktywnosci enzymu, tzw. próba aktywnosci, badz tez oznaczenie stezenia partnera reakcji, to znaczy próba podloza. Bardzo rozpowszechniony i Wszechstronny w zastosowa- 20 niu jest optyczny pomiar reakcji utleniania — re¬ dukcji na drodze enzymatycznej, w toku których redukcji lub utlenianiu ulegaja stechiometryczne ilosci koenzymów nikotynoamidoadenoindynonu- kleotydu oznaczonego symbolem NAD lub nikoty- 25 noamidoadenoindynonukleotydofosforanu oznaczo¬ nego symbolem NADP, co znajduje wyraz w zmia¬ nie absorpcji swiatla w dlugofalowym zakresie widma nadfioletowego. Jest to tak zwana próba optyczna wedlug Warburga. 30 Równiez te reakcje enzymatyczne, które zacho¬ dza bez bezposredniego udzialu jednego z dwóch koenzymów moga przez sprzezenie z enzymatycz¬ na reakcja utleniania — redukcji zachodzaca w obecnosci NAD lub NADP, byc mierzone przy zastosowaniu tej samej metody. Jest to sprzezona próba optyczna. W ten sposób mozna stosowac ta sama zasade pomiaru do rozwiazywania bardzo wielu zagadnien analitycznych. Pomiaru mozna do¬ konywac nie tylko w oparciu o pomiary absorpcji fal swietlnych o dlugosci 340 lub 366 nm, lecz równiez fluorymetrycznie przy wzbudzaniu dlugo¬ falowym swiatlem nadfioletowym, dzieki czemu dodatkowemu zwiekszeniu ulega czulosc pomiaru.Imne znane zasady ujmowanlia reakcji enzyma¬ tycznych polegaja m.in. na: zastosowaniu jako sub¬ stratów barwników lub leukozasad, które w toku reakcji ulegaja stechiometrycznej przemianie w od¬ barwiony produkt lub zabarwiony produkt; prze¬ prowadzeniu reakcji barwnej z proldjukitem konco¬ wym w sprzezonej wtórnie reakcji pomocniczej; zuzywaniu lub wytwarzaniu gazów, np. 02, NH3; co2.Przewazajaca czesc sposród wielkiej liczby reak¬ cji enzymatycznych kontroluje sie na drodze fo- tometrycznej. Do tego celu znajduja zastosowanie fotometry, których jakosc wywiera wplyw na do¬ kladnosc pomiaru. Pomiar przeprowadza sie zwy¬ kle w jednej lub kilku kuwetach pomiarowych, które wprowadza sie kolejno w droge wiazki pro- 8237482374 3 4 mieniowania urzadzenia pomiarowego. Na skutek tego w zasadniczy sposób ograniczony jest stosu¬ nek czasowy próby w analizie enzymatycznej. Lep¬ sza efektywnosc badan enzymatycznych osiaga sie jedynie w przypadku stosowania tylko nielicznych, bardzo skomplikowanych pod wzgledem technicz¬ nym urzadzen.Dalsze istotne, zasadnicze ograniczenie znanych metod dotyczy objetosci próbek. Najmniejsze na¬ dajace sie jeszcze do stosowania w badaniach ru¬ tynowych kuwety musza zawierac nie mniej niz okolo 0,3 ml objetosci mierzonego roztworu.Celem wynalazku jest zasadnicze zmniejszenie ilosci badanych roztworów i ilosci próbek, znacz¬ ne zwiekszenie stopnia efektywnosci, to znaczy czasowego stosunku próby, przy zastosowaniu zna¬ nych fotometrycznych i fluorometrycznych reakcji testowych stosowanych do pomiaru aktywnosci enzymów, reakcji podlozowych i koenzymatycznych odpowiednimi, nieskomplikowanymi srodkami tech¬ nicznymi, w odpowiednich warunkach reakcyjnych, a tym samym zdecydowane obnizenie kosztów ana¬ liz enzymatycznych. To samo dotyczy nieenzyma- tycznych metod analitycznych.Cel ten osiagnieto przez opracowanie sposobu polegajacego na tym, ze dla wytworzenia miesza¬ niny substancji wzorcowej i badanej substancji stosuje sie mikrolitrowe ich objetosci oraz, ze zmieszania dokonuje sie przez równoczesna wibra¬ cje obu polozonych bezposrednio obok siebie obje¬ tosci. Sposobem wedlug wynalazku mozna prze¬ prowadzac dokladne analizy jakosciowe i iloscio¬ we przy uzyciu objetosci mniejszych od 5/J. Przy¬ najmniej jedna z obu substancji musi wystepowac przy tym w postaci roztworu. Jest oczywistym, ze substancja wzorcowa zawiera z reguly kilka sklad¬ ników.Wyniki dowolnie ustalonej wartosci progowej moga przez dobór warunków reakcji byc uznane za pozytywne lub negatywne. Dla kazdej próby ustala sie dwie wartosci progowe. Testy naniesio¬ ne na bibule filtracyjna ocenia sie ilosciowo przy pomocy fotometru lub fluorymetru w swietle prze¬ chodzacym lub padajacym. Przestrzenie reakcyjne mozna tworzyc z komór o postaci otworów nie¬ przelotowych, wywierconych w dwóch, nalozonych na siebie plytkach z twardego materialu, korzyst¬ nie tworzywa sztucznego. Wokól tych komór sa w plytkach wyzlobione pierscieniowe wyzlobienia.Nalozone na siebie plyty sciskane sa mocno przy pomocy sruby naprezajacej i dwóch szczek mo¬ cujacych i zamocowane na wibratorze. W dwóch dalszych plytach, zlozonych z optycznie nieprzepu¬ szczalnego materialu wykonane sa dwa przelotowe otwory rozmieszczone w takim samym odstepie jak komory w omówionych powyzej plytach.Praktyczne znaczenie i przydatnosc sposobu we¬ dlug wynalazku wynika stad, ze wielka ilosc se¬ ryjnych analiz enzymatycznych musi sie prowadzic we, wszystkich dziedzinach analityki biochemicznej.Dotyczy to np. prac preparatywnych w dziedzinie wytwarzania, oczyszczania oraz oznaczania ciezaru czasteczkowego enzymów, w badaniach diagnosty¬ cznych i epidemiologicznych, w ramach klinicznej biochemii i profilaktyki lekarskiej, a takze w in¬ nych dziedzinach. Sposób wedlug wynalazku umo¬ zliwia prowadzenie badan wielkich ilosci próbek przy minimalnej czasochlonnosci i ze zmniejsze¬ niem zuzycia odczynników o przeszlo dwa rzedy wielkosci. Poniewaz ©tasowanymi odczyininikami sa przewaznie drogie substancje biochemiczne, to osiagane oszczednosci przyczyniaja sie do bardzo istotnego potanienia kosztów poszczególnych badan.To samo dotyczy oszczednosci na czasie pracy i niskich kosztach na podstawowe wyposazenie aparaturowe. Dzieki stosowaniu sposobu wedlug wynalazku nawet male i niedostatecznie wyposa¬ zone laboratoria uzyskuja moznosc wykonywania analiz enzymatycznych.Korzysci plynace ze stosowania ispoisdbu wedlug wynalazku oraz jego zdecydowane zalety moga byc wykazane wyraznie na przykladzie klinicznej diagnostyki biochemicznej. Enzymatyczna metoda diagnostyczna odgrywa decydujaca role przy wczesnym rozpoznawaniu i kontroli przebiegu bar¬ dzo wielu chorób. Próby takie prowadzone sa kaz¬ dego dnia w wielkich ilosciach w kazdym klinicz¬ nym laboratorium chemicznym. Przy stosowaniu dotychczasowych metod nalezalo pobierac bada¬ nym pacjentom 5 do 10 ml krwii z zyl, w celu dokonania analizy enzymatycznej. Badania sa sto¬ sunkowo czasochlonne i kosztowne. Sposób we¬ dlug wynalazku pozwala na obnizenie kosztów kazdej próby do okolo 1% poprzednich kosztów.Czasochlonnosc prób ulega równiez znacznemu zmniejszeniu. Przy odpowiednich próbach wyniik moze byc przekazywany lekarzowi w ciagu nie¬ wielu minut, bez potrzeby uciekania sie do skom¬ plikowanych srodków pomocniczych. Przy maksy¬ malnym wykorzystaniu czasu pracy mozna równo¬ czesnie prowadzic wielka liczbe badan. Niedogod¬ nosci odczuwalne przez pacjentów sa minimalne poniewaz czulosc metody pozwala na ograniczenie sie do ilosci plazmy, która mozna uzyskac przy nakluciu czubka palca, nawet gdy nalezy dokonac pomiaru wiekszej liczby enzymów. Unikniecie na¬ kluc dozylnych ma wielkie znaczenie w przypad¬ ku badan dzieci, przy badaniach zapobiegawczych i masowych w ramach profilaktycznej ochrony zdrowia. Stwarza ono ponadto mozliwosci dalsze¬ go potanienia metody. Sposób wedlug wynalazku umozliwia prowadzenie szerokich epidemiologicz¬ nych akcji poszukiwawczych poza specjalistyczny¬ mi laboratoriami, które moga np. byc organizacyj¬ nie polaczone z rentgenowskimi badaniami malo¬ obrazkowymi.Substancje próbne i badane roztwory korzystnie jest wprowadzac do folii o ksztalcie odpowiada¬ jacym ksztaltowi plytek. Rozwiazanie takie umo¬ zliwia latwe podawanie substancji próbnych o do- dowolnym skladzie chemicznym i w dowolnej po¬ staci, umozliwia utrzymywanie substancji! próbnych i roztworów w odpowiedniej odleglosoi od plytek, a takze unikac przy badaniu w laboratorium czyn¬ nosci pipetowania substancji próbnych. Po uzyciu mozna folie usuwac do odpadów.Urzadzenie wedlug wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia umiesz¬ czone na wibratorze urzadzenie fig. 2 — rzut po¬ lo 15 20 25 30 35 40 45 50 55 605 82374 6 zlomy, a fig. 3 — czastkowy przekrój podluzny urzadzenia wedlug wynalazku, fig. 4 — bibule filtracyjna z plamkami próbnymi, zas fig. 5 — czastkowy przekrój podluzny innego przykladu urzadzenia wedlug wynalazku.Dwie plytki 1, 11 wykonane z twardego materia¬ lu, korzystanie z tworzywa sztucznego, sa wypo¬ sazone w komory 2, 12 w formie nieprzelotowych otworów odleglych od siebie o okolo 1 cm i po¬ siadajacych objetosc po okolo 10/J oraz w pier¬ scieniowe wyzlobienia 3, 13 otaczajace wokól te komory 2, 12. Plyty 1, 11 uklada sie jedna na drugiej i sprasowuje przy pomocy sruby napre¬ zajacej 4 i dwóch szczek mocujacych 5 w ten sposób, ze zarówno komory 2, 12 jak i wyzlobie¬ nia pierscieniowe 3, 13 kazdorazowo tworza ze soba przestrzenie zamkiniejte. Na kazdej plytce 1 lub 11 moze byc wykonana dowolnie duza liczba komór 2, 12.W dotychczasowej praktyce szczególnie korzys¬ tnymi okazaly sie plytki o 20 do 120 komorach.Do komór 2, .12 (plytki ;1, II wprowadza sie badane próbki o pojemnosci 5^1 lub mniejszej, przy po¬ mocy mechanicznej mikropipety lub mikrobiuTety.Reakcja zaczyna zachodzic równoczesnie we wszy¬ stkich komorach 2, 12, po nalozeniu na siebie obu plyt 1, 11 i zmieszaniu zawartosci droga wibracji na wibratorze 6. Plytki 1, 11 utrzymywane sa w dokladnym polozenliu przy pomocy dwóch pre¬ tów prowadzacych i utrzymywane mocno jedna na drugiej przy pomocy sruby zaciskowej 4. Zlewaniu sie poszczególnych próbek przeciwdzialaja piers¬ cieniowe wyzlobienia 3, 13. Nastepnie komory 2, 12 przetrzymuje sie przez okreslony przeciag czasu w celu inkubacji. Nastepnie otwiera sie je, mie¬ dzy obydwie plytki 1, 11 wklada bibule filtracyjna 7, znowu umieszcza jedna plyte na drugiej i przez krótkotrwale wytrzasanie lub wibracje przenosi ciecz na bibule filtracyjna 7, gdzie tworzy ona okragle plamki.W przypadku reakcji katalizowanych dzialaniem NAD lub NADP oceny wyników dokonuje sie przy pomocy promiennika nadfioletu na podstawie fluo- rescencji zredukowanych zwiazków, powstajacych lub zanikajacych w wyniku reiakcji. W przypadku reakcji barwnych role wskaznika spelnia intensyw¬ nosc zabarwienia widocznych plamek 8. Stosuje sie papiery, które wstepnie traktowane byly roz¬ tworem wywolywacza zabarwienia, badz tez byly natryskane wskaznikiem. Warunki próbne dobiera sie w ten sposób, ze obecnosc enzymu lub sufo- stratu poczawszy od okreslonej wartosci progowej mozna rozpoznac po wystapieniu lub zaniku fluo- rescencji wzglednie barwnika. Ta zasada okresla¬ nia wartosci progowej pozwala sposobem wedlug wynalazku na uproszczenie i przyspieszenie po¬ miaru, jezeli moze polegac on na okresleniu zde¬ finiowanych wartosci krytycznych. Mozna np. do¬ bierac warunki próby w ten sposób, aby dla ba¬ dan diagnostycznych lub epidemiologicznych war¬ tosc programowa byla zblizona do. wielkosci dia¬ gnostycznej granicy ostrzegawczej, dzieki czemu wszystkie przypadki, które nalezy ocenic za pato¬ logiczne lub podejrzane moga byc latwo i nieza¬ wodnie rozpoznawane.Ponadto mozna realizowac nastepujaca pólilos- ciowa zasade pomiaru: zawartosc komór 2, 12 jed¬ nej z dwóch plyt 1, 11 • przenosi sie w okreslonym momencie na papier, natomiast zawartosc innych 5 poddaje dalszej inkubacji i wywoluje pózniej. Wy¬ sokie aktywnosci enzymów o wartosci poczynaja¬ cej sie od ustalonej wartosci progowej rozpozna¬ wane sa w pierwszym momencie, a nizsze aktyw¬ nosci o wartosciach dochodzacych do okreslonej 10 wartosci progowej — w drugim momencie. Tym samym uwzglednia sie w pelni ogólne kryteria diagnostyczne.Stosujac ta prosta zasade dwuokresowego pomia¬ ru wartosci ipro&owej mozna okreslic odbiegajace 15 od siebie aktywnosci enzymów oraz sitejzenia podloza przy minimalnych nakladach technicznych, w naj¬ prostszych warunkach roboczych. Istnieje jednak ponadto mozliwosc dokladnego pomiaru rezultatów przy pomocy wyposazenia dodatkowego do foto- 20 metru. W tym celu wlprowaidiza sie W droge wiazki swialrf pafpier fiflitracyftny 7 miedzy zródlo swiatla 9 i komórke tfótoelektryczna nie pokazanego na rysunku fotometoryoznego urzadzenia pomiarowego tak, ze kazdorazowo mierzona jest plamka 8 lub 25 jej czesc. Oceny dokonuje sie droga pomiaru ab¬ sorpcji lub fluorescencji. Miedzy wartosciami tych parametrów i iloscia wskaznika, a tym samym i aktywnoscia enzymu lub iloscia substratu wyste¬ puje liniowa zaleznosc. 30 Fig. 5 przedstawia znowu obie plytki 1, 11 z wy¬ zlobieniami 2, 12 i wpustami 3, 13. Miedzy plyt¬ kami 1, 11 umieszczone sa folie 14, 15; folia 14 dopasowana jest do ksztaltu powierzchni plyty 1, a folia 15 do ksztaltu powierzchni plyty 11. W od- 35 powiadajace wyzlobieniom 2 wglebienia folii 14 wprowadzana jest w danym przypadku substan- próbna 17 a w odpowiadajacych wyzlobieniom 12 wglebieniach folii 15 miesci sie badana substancja.Po wibrowaniu plyt 1, 11 na wibratorze 6, (fig. 1) 40 substancje uilegalja izmieszaniu.Ksztalt wyzlobien oraz sposób ich wykonywania jest dowolny. Równiez wielkosci wyzlobien w ply¬ tach moga byc dowolne. Dla zapewnienia malego zuzycia substancji i optymalnego wykorzystania 45 ilosci substancji stojacych do dyspozycji korzystnie jelst jednak, aby pojemnosc wyzlobien zawarta byla w zakresie mikrolitrowym. PL PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 80 1. Sposób wykonywania analiz, zwlaszcza enzy¬ matycznych w zakresie ultramikro, polegajacy na mieszaniu substancji próbnej z badana substancja i przynajmniej czesciowym nanoszeniu powstalej 55 tym sposobem mieszaniny po uplywie okreslonego czasu reakcji na material nosnikowy w celu oceny przebiegu reakcji, znamienny tym, ze do wytwa¬ rzania mieszaniny substancji próbnej i badanej substancji stosuje sie objetosci obu substancji rzedu 60 'milkrolitrów i ze anJieszamiie nastepuje droga rów¬ noczesnej wibracji lezacych bezposrednio obok sie¬ bie objetosci obu substancji.

2. Sposób wedlug zasitrz. 1, znamienny tym, ze przez dobór warunków reakcji wyniki dowolnie 05 wybranej wartosci progowej mozna uznac za po-82374 zytywne lufb negatywne, przy czym dla kazdej próby ustalic mozna dwie wartosci progowe.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze próbki naniesione na bibule filtracyjna ocenia sie przy pomocy fotometru lub fluorymetru, w swietle przechodzacym lub padajacym.

4. Urzadzenie do stosowania sposobu wedlug za- sitrz. 1—3, znamienne tym, ze zawiera dwie plytki, jedna na drugiefj, które ma pclwierzchniajch sltyka- jacych isie ze soiba imatja iwyikonaine wyzlobienia o takim samym rozmieszczeniu, 'dzieki czemu wy¬ zlobienia -'jednej plytki .tworza z wyzlobieniami 10 8 drugieij plytki po nalozeniu [na isiefbie tzamkniete kcmoiry reakcyjme.

5. Urzadzenie wedlug zastrz. 4, znamienne tym, ze plytki posiadaja pierscieniowe rowki, rozmiesz¬ czone wspólsrodkowo z wyzlobieniami.

6. Urzadzenie wedlug zasltrz. 4, znamienne tym, ze nalozone na siebie plytki scisniete sa mocno przy pomocy jednej sruby zaciskowej i dwóch szczek mocujacych i przymocowane do wibratora.

7. Urzadzenie wedlug zastrz. 4—6, znamienne tym, ze stykajace sie ze soba powierzichnie wypo¬ sazone sa w folie o ksztalcie dostosowanym do ksztaltu powierzchni stykowych. Fig. 3 3 w 15' /3 Fig. 5 DN-7 — Zam. 453/76 Cena 10 zl PL PL