PL81044B1 - Hypotensive agent, oudenone, its salts and processes for production and preparation thereof[us3835170a] - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania oudenonu oraz jego soli, obnizajacych cisnienie krwi Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego srodka hipotensyjnego' (obnizajacego cisnienie krwi) — oudenonu o wzorze 1. W szcze¬ gólnosci, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania oudenonu na drodze fermentacyjnej oraz sposobu jego wyodrebniania i oczyszczania. Sposobem we¬ dlug wynalazku otrzymuje sie wspomniany srodek hipotensyjny oraz jego sole w rozcienczonych roz¬ tworach, pod postacia zageszczonych surowych roz¬ tworów, surowych preparatów stalych, oczyszczo¬ nych preparatów stalych oraz czystych form kry¬ stalicznych. Substancja ta hamuje wzrost hydro- ksylazy tyrozynowej oraz obniza cisnienie krwi.Znajduje ona zastosowanie przy leczeniu schorzen wywolanych nadcisnieniem.Zwiazek otrzymany sposobem wedlug wynalazku, rozpuszcza sie w wodzie, metanolu, etanolu, propa- nolu, butanolu, acetonie, metyloizobutyloketonie, octanie etylu, octanie butylu, chloroformie i w benzenie, nie rozpuszcza sie w eterze, heksanie i w eterze naftowym, wykazuje maksimum przy 246 m w buforze fosforanowym (pH = 7.0) oraz dwa maksima przy 221 m^i i 285 m^i w 0,1 n HC1, daje dodatnia próbe z 2,4-dwunitrofenylohydrazy- na i z odczynnikiem tetrazoliowym, natomiast ujemna z odczynnikami Fehlinga i Tollensa, two¬ rzy krysztaly o temperaturze topnienia 77—79°C, jest czynna optycznie (a^° =—10,6° w 0,5% eta¬ nolu), przy miareczkowaniu jej wodnego roztworu wykazuje pK' = 4,1, posiada wzór czasteczkowy 10 20 25 30 z Ci2Hi603, a jej. widmo w podczerwieni, wykonane w bromku potasowym, wykazuje maksima przy nastepujacych wartosciach liczb falowych w cm-1: 3400, 2900, 1710, 16G0, 1560, 1455, 1420, 1380, 1300, 1270, 1255, 1195, 1170, 1130, 1100, 1050* 1015, 990, 980, 955, 935, 895, 885, 860, 840, 820, 810, 780; krystali¬ zuje dobrze z heksanu.Na fig. 1 przedstawiono widmo absorpcyjne ou¬ denonu w ultrafiolecie, wykonane w buforze fosfor ranowym o pH = 7,0 oraz w 0,1 n HO.Na fig. 2 przedstawiono widmo absorpcyjne ou¬ denonu w podczerwieni, wykonane w bromku po¬ tasowym.Na fig. 3 przedstawiono widmo absorpcyjne w podczerwieni soli potasowej oudenonu, wykonane w bromku potasowym.Zgodnie z wynalazkiem, sposób produkcji oude-. nonu, obejmuje hodowle wytwarzajacych oudenon mikroorganizmów w srodowisku wodnym, zawiera¬ jacym zródla wegla i azotu, przy napowietrzaniu, do momentu nagromadzenia sie w tym roztworze znacznej. ilosci oudenonu. Ilosc oudenonu w pozyw¬ ce okreslic mozna spekrofotometrycznie lub na podstawie wlasnosci hamowania hydroksylazy ty¬ rozynowej.Organizm, wytwarzajacy oudenon, stanowiacy rodzaj grzyba, odkryto i zebrano pod drzewami iglastymi w Kirizumiyama w prefekturze Gumma, 8104481044 3 Hodowano go i oznaczono jako szczep 10F w In- stitute of Microbial Chemistry, Shinagawa-ku, To- kyo. Powierzono go Kogoyo Gijutsuin Hakko Ken- kyujo w prefekturze Chiba, gdzie wlaczono go do stalej kolekcji jako No. 503. Owocniki tego grzyba wyhodowano na podlozu z trocin (10 g trocin zmie¬ szano z 60 ml pozywki, zawierajacej 2,0% gluko¬ zy i 0,5% suchych drozdzy, umieszczono w kolbie o pojemnosci 500 ml i poddano sterylizacji w tem¬ peraturze 120°C przez 20 minut) w temperaturze 27°C; sa to owocniki typu Collybia. Kapelusz grzyba ma 4—11 cm srednicy. Poczatkowo kapelusz jest wypukly, z czasem otwiera sie i splaszcza, a jego srodkowa czesc nieco sie unosi. Gdy jest mo¬ kro, jego powierzchnia jest pokryta sluzem i ja- snobrazowa lub jasno szarobrazowa. Daja sie na niej zauwazyc zylki (zmarszczki), ulozone promie¬ niscie lub tworzace siatke.Oddzielne blaszki, biale lub zóltobiale lacza sie bezposrednio z lodyzka. Wewnetrzna czesc lodyz¬ ki jest pusta, a zarodnia jest koloru bialego. Jesli chodzi o podobienstwo do znanych grzybów, to szczep 10F posiada wspólne wlasnosci z Oudeman- siella, a sposród trzech znanych gatunków Oude- mensiella najbardziej przypomina Oudemansiella radicata.Grzyby klasyfikuje sie na podstawie morfologii ich owocnika, nie jest jednak zupelnie pewne, czy owocnik wyhodowany na sztucznym podlozu jest identyczny z uksztaltowanym w warunkach natu¬ ralnych. Szczep 10F, który we wczesnych stadiach wzrasta na opisanym wczesniej podlozu z trocin, przypomina Pseudohiatula ohshimae, Hongo et Matsuda. Jednakze w okresie dojrzalosci sklasyfi¬ kowano go jako Oudemansiella radicata, który zde¬ ponowano w Amerykanskim Banku Szczepów pod nr ATCC 20 295. Jest rzecza znana, ze ten sam zwiazek znajduje sie czesto w materiale z hodowli róznych rodzajów grzybów. Spektrofotometryczna metoda, pozwala na wykrycie oudenonu w mate¬ riale z hodowli mikroorganizmów.Sposobem wedlug wynalazku mozna takze wy- /Kirebniac i oczyszczac oudenon. Spektrofotome¬ tryczna metoda oznaczania oudenonu znajduje rów¬ niez zastosowanie do ustalania wydajnych sposo¬ bów jego ekstrakcji i oczyszczania. Wyrazenie „szczep wytwarzajacy oudenon" stosowane w opisie wynalazku, obejmuje szczep 10F.Zgodnie z wynalazkiem oudenon wytwarza sie w napowietrzanej hodowli szczepu wytwarzajacego oudenon. Hodowle mozna prowadzic na podlozu stalym, jednakze dla wytwarzania wiekszych ilosci oudenonu korzystna jest hodowla w osrodku cie¬ klym. Szczep 10F hoduje sie np. na skosie agaro¬ wym o zawartosci 2,0% glukozy, 0,5% suszonych drozdzy, 1,5% agaru (sterylizacje prowadzono przez 20 minut w temperaturze 120°C, nie regulowano pH, przy czym po sterylizacji wartosc pH wynosila 5,6), z wyhodowana grzybnia zaszczepiono na po¬ zywce, na której wytwarzano oudenon. ^ Dobre wyniki daje takze inna metoda szczepie¬ nia: szczep produkujacy oudenon hoduje sie na opisanej juz pozywce z trocin w temperaturze 27°C przez 10—20 dni, podloze to wraz z grzybnia zawiesza sie w swiezej pozywce (zawierajacej np. 4 2,0% glukozy i 0,5% suchych drozdzy), a zawiesin^ zaszczepia sie na pozywce, w której wytwarzany jest oudenon.Mozna tez zaszczepiac brzeczke z hodowli na wy¬ trzasarce lub z napowietrzanej wewnetrznie fer¬ mentacji na pozywce do wytwarzania oudenonu.Szczep, wytwarzajacy oudenon, moze wzrastac w temperaturze 20—35°C, jednakze przy produkcji oudenonu dobrze jest utrzymywac go w temperatu- 10 rze 25—30°C. Do hodowli tego szczepu nadaja sie substancje znane jako pozywki dla mikroorganiz¬ mów. Jako zródlo wegla stosowac mozna np. glu¬ koze, dekstryne, skrobie, laktoze, sacharoze, glice¬ ryne lub kwas octowy. Dodajac wymienione zródla wegla do zasadniczej pozywki zawierajacej 0,5% peptonu, 0,3% suszonych drozdzy, 0,3% KH2PO4, 0,1% MgS04. 7H20 i 0,1% NaCl, badano tworzenie sie oudenonu w pozywkach z róznymi zródlami wegla w hodowli na wytrzasarce, w temperaturze 2 27°C przez okres 14 dni. Szczep, wytwarzajacy ou¬ denon, hodowany na opisanej pozywce z trocin przez 14 dni w temperaturze 27 °C, zawieszono w pozywce zawierajacej 2,0% glukozy i 0,5% suchych, drozdzy, a nastepnie po 10 ml zawiesiny zaszczepio- 15 no na 120 ml pozywki w 500 ml kolbach.Wytwarzanie oudenonu w plynie z hodowla (|ig/ml) oraz wzrost tej hodowli (obfity wzrost+++, sredni wzrost ++, slaby wzrost +), ksztaltowaly 30 sie w nastepujacy sposób: glukoza 59 ng/ml 7 dnia, 300 fig/ml i +.++ 10 dnia, maltoza: 7 ng/ml 7 dnia, mniej niz 5 jig/ml i ++ 10 dnia, dekstryna: 12,5 fig/ml 7 dnia, mniej niz 5 \ig/ml i +;+ 10 dnia, skrobia: 5 [Ag/ml 7 dnia, mniej niz 5 jig/ml i ++ 35 10 dnia, laktoza: 25 jig/ml 7 dnia, 100 ^ml i + 10 dnia, sacharoza: 14 jjig/ml 7 dnia, 15 ng/ml i +.+ 10 dnia, octan sodowy: mniej niz 5 iig/ml 7 i 10 dnia, 18 ng/ml i + 15 dnia.Jako zródlo wegla i srodków przeciw pienieniu 40 uzywac mozna olejów roslinnych takich, jak sojo¬ wy, sezamowy itp. oraz tluszczów zwierzecych w rodzaju oleju smakowego itp. Oudenon sklada sie z wegla, wodoru i tlenu, a nie zawsze zawiera azot. Jednakze, w hodowli szczepu, wytwarzajace- 45 go ten zwiazek, mozna stosowac substancje znane jako dostarczyciele azotu w innych hodowlach. Na¬ leza do nich: pepton, ekstrakt z miesa, drozdze, ekstrat z drozdzy, maczka sojowa, maczka z nasion bawelny, maczka z orzeszków ziemnych, namok z 50 kukurydzy, otreby ryzowe oraz nieorganiczne zwiaz¬ ki, dostarczajace azot Jako przyklady pozywek, stosowanych do hodo¬ wli szczepu wytwarzajacego oudonen, wymienic 55 mozna: pozywka A, zawierajaca 2,0% glukozy, 0,5% peptonu, 0,3% KH2P04, 0,1% MgS04. 7HaO (pH nie bylo regulowane), pozywka B, zawierajaca 2,0% glukozy, 1,0% namoku z kukurydzy (pH = 5,6), po¬ zywka C, zawierajaca 2,0% glukozy, 1,0% maczki ^ sojowej, 0,5% suchych drozdzy (pH = 5,6).Kazda pozywke o objetosci 125 ml umieszczano w 500 ml kolbie i zaszczepiano wyhodowanym w opisany juz sposób szczepem, wytwarzajacym oude¬ non. Wytwarzanie oudenonu oraz zmiany pH prze* 65 biegaly w nastepujacy sposób:81044 Tablica 1 1 Dni 5 7 8 11 12 15 pH 4.4 4.4 4.4 4.4 4.8 5.2 Pozywka A 11 5 11 62 158 180 pH 4.8 4.4 4.8 4.6 5.0 5.2 Pozywka B jLg/ml 5 12 29 100 215 255 PH 4.4 4.4 4.4 5.0 2.2 5.6 Pozywka C Kg/ml 15 64 88 95 229 475 Jak widac z powyzszego opisu, pepton, namok z kukurydzy, maczka sojowa i suche drozdze sta¬ nowia przyklady odpowiednich dla produkcji oude- nonu zródel azotu. W tym samym celu mozna tez, jak stwierdzono, stosowac maczke z orzeszków ziemnych, maczke z nasion bawelny, kazeine i hy¬ drolizat kazeiny. Mozna tez dodawac soli nieorga¬ nicznych i, jesli to potrzebne, minimalnych ilosci soli metali ciezkich.Do produkcji oudenonu na drodze fermentacji zastosowac mozna fermentacyjne metody produk¬ cji antybiotyków: np. zwiazek ten wytwarza sie w hodowli na trzesawce lub przez napowietrzana fermentacje wglebna, dodajac srodków zapobiega¬ jacych pienieniu takich, jak oleje roslinne, tluszcze zwierzece lub zywice silnikowe.W celu oznaczenia ilosci oudenonu mierzy sie jego zdolnosc do hamowania hydroksylazy tyrozy¬ nowej. Sposób ten opisano w Journal of Antibio- tics 21, 350—352 (1968). Oudenon moze byc ozna¬ czony nastepujaca spektrofotometryczna metoda: badany roztwór tego zwiazku rozciencza sie Vis M buforem fosforanowym o pH^7,0 (krotnosc roz¬ cienczenia oznaczono jako n) i odczytuje sie war¬ tosc gestosci optycznej (a) rozcienczonego roztworu przy 246 jim w kiuwecie o dlugosci 1 cm, wspom¬ niany roztwór rozciencza sie 0,1 N HC1 (krotnosc rozcienczenia oznaczono jako n) i przy 246 nm od¬ czytuje sie wartosc gestosci optycznej rozcienczo¬ nego roztworu w kiuwecie o dlugosci 1 cm, ilosc oudenonu w badanym roztworze oblicza sie w na¬ stepujacy sposób: X 104 = ug/ml oudenonu w roztworze 1000—60 ^ W przypadku, gdy szczep wytwarzajacy oudenon hodowano w pozywce cieklej, zwiazek ten znajdo¬ wal sie zarówno w czesci cieklej, jak i w czesci stalej brzeczki hodowlanej. Np. w hodowli tego szczepu na trzesawce w pozywce, zawierajacej 2,0% glukozy i 0,5% peptonu (125 ml pozywki w kolbie o pojemnosci 500 ml) 10 ml brzeczki zawieralo na¬ stepujace ilosci oudenonu w czesci stalej i w cze¬ sci cieklej) oudenon znajdujacy sie w czesci sta¬ lej ekstrahowano metanolem i oznaczano spektro- fotometrycznie): Tablica 2 Dni " ' 5 ' 7 * 11 fig oudenonu w czesci cieklej 372 845 1300 2180 lig oudenonu w czesci stalej 185 365 410 342 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Oudenon rozpuszcza sie w wodzie, metanolu, eta¬ nolu, butanolu, octanie etylu, octanie butylu, chlo-? roformie oraz w benzenie i daje sie wyekstraho¬ wac z wody za pomoca takich rozpuszczalników, jak butanol, octan etylu, octan butylu, chloroform i benzen. Oznaczone wspólczynniki podzialu sa na¬ stepujace: butanol — woda: 8 przy pH = 2,0, 7,5 przy pH = 3, przy pH = 4, 2,5 przy pH = 5, 2,5 przy pH = 6, 3 przy pH = 8, 0,6 przy pH = 9, 0,8 przy pH = 10, octan etylu —woda: 5 przy pH = 2,0, 4 przy pH = 3, 1,5 przy pH = 4, 0,2 przy pH = 5, mniej niz 0,1 przy pH = 6, octan butylu — woda: 3 przy pH = A 2,5 przy pH = 3, 1 przy pH = 4, 0,1 przy pH = 5, mniej niz 0,1 przy pH = 6, chlo¬ roform — woda: 19 przy pH = 4, 1 przy pH = 5 i 0,1 przy pH = 6. Wspólczynnik podzialu pomiedzy ketonem metylowoizobutylowym a woda, oznaczo¬ ny za pomoca pomiarów stopnia hamowania hydro¬ ksylazy tyrozynowej byl nastepujacy: 1 przy pH = = 2, 1 przy pH = 3, 0,3 przy pH = 4, 0,1 przy pH =i 5, 0,1 przy pH = 6.Oudenon jest zwiazkiem trwalym przy pH = 2,0, 7,0 i 9,0: aktywnosc jego nie zmniejsza sie po 30 minutach w temperaturze 60°C i po 5 minutach w temperaturze 100°C. Mozna go wyekstrahowac z roztworu kwasnego za pomoca rozpuszczalnika, niemieszajacego sie z woda. Jego roztwory mozna zatezac przez odparowanie rozpuszczalnika. Jak widac z wartosci wspólczynników podzialu, oude¬ non rozpuszczony w niemieszajacym sie z woda rozpuszczalniku przechodzi do warstwy wodnej o odczynie obojetnym badz alkalicznym. Np. mozna wyekstrahowac oudenon z brzeczki fermentacyjnej za pomoca butanolu, octanu etylu, octanu butylu, chloroformu itp. przy pH = 2—3. Do ekstrakcji tej nadaje sie wielostopniowy ekstraktor, zwiekszajacy znacznie wydajnosc procesu, który mozna zastoso¬ wac do calej brzeczki lacznie z grzybnia. Odde¬ stylowanie rozpuszczalnika pod normalnym lub zmniejszonym cisnieniem daje syrop lub suchy, surowy proszek, z którego mozna wykrystalizowac oudenon, w postaci bialych krysztalów.W pewnych przypadkach zachodzi koniecznosc przesaczenia brzeczki; oudenon wyodrebnia sie z przesaczu w sposób wyzej podany, a z czesci sta¬ lej ekstrahuje sie go metanolem, etanolem, aceto¬ nem, octanem etylu, octanem butylu, chlorofor¬ mem itp. Do krystalizacji malych ilosci oudenonu uzywac mozna heksanu lub mieszaniny heksanu z benzenem, przy wiekszych jednak ilosciach mozna zastosowac rozpuszczalniki, w których oudenon jest lepiej rozpuszczalny, a wiec wode, metanol, etanol, butanol, octan etylu, aceton, benzen i chlo¬ roform. Przy krystalizacji oudenonu stosuje sie* 81044 s takze dodawanie do Jego roztworu, rozpuszczalnika, w którym jest on ile rozpuszczalny.Jezeli surowy materia! zawiera zanieczyszczenia, uniemozliwiajace krystalizacje, to przeprowadza sie go z roztworu w rozpuszczalniku, nie mieszaja¬ cym sie z woda, do roztworu wodnego o odczynie obojetnym lub alkalicznym i ekstrahuje sie go z tego roztworu, ale juz o odczynie kwasnym, roz¬ puszczalnikiem niemieszajacym sie z woda. W nie¬ których przypadkach, oudenon mozna oczyscic chromatograficznie. Przykladem odpowiedniego spo¬ sobu jest chromatografia na silikazelu za pomoca mieszaniny benzen-octan etylu (1:2).Jak podano w opisie wynalazku, oudenon ma wlasnosci kwasowe, a zatem do jego ekstrakcji i wyodrebniania mozna zastosowac zywice aniono- wymienne i tak np. 130 ml brzeczki fermentacyj¬ nej, zawierajacej 310 pg/ml oudenonu, przepuszczo¬ no przez kolumne wypelniona 20 mililitrami zywi¬ cy Dowe* 1X2 (dostawca: Dow Chemical, U.S.A.) w postaci Cl*-, przemyto kolumne woda- destylo¬ wana i eluowano ja 0,2 N HC1. Eluat dzielono na 20 gramowe frakcje i we frakcjach 2—9 znajdo- walo sie 16 mg oudenonu. Do wyodrebniania oude¬ nonu sluzyc moze takze zywica anionowymienna 1RA-400 (dostawca: Rhom and Haas, U.S.A.). Za¬ stosowanie zywic anionowymiennych w opisanych procesach pozwala na wyodrebnienie oudenonu z brzeczki fermentacyjnej z co najmniej 75% wydaj¬ noscia. Wykorzystujac wlasnosci kwasowe oudeno¬ nu, mozna go wytracic z jego roztworów, np. z wodnego roztworu zwiazek ten daje sie wytracic w postaci osadu przez dodanie jonu miedziowego.Poddanie tego osadu dzialaniu kwasu, ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym i odparowanie da¬ je oudenon w postaci oczyszczonej.Jak wynika z opisu, stosujac sposób wedlug wy¬ nalazku, mozna wyodrebnic oudenon przez eks¬ trakcje rozpuszczalnikiem, absorpcje i eluowanie, wytracanie w postaci osadu z roztworów lub de¬ stylacje.Oudenon, otrzymany sposobem wedlug wynalaz¬ ku, posiada nastepujace wlasnosci i aktywnosc, biologiczna; krystaliczny oudenon (biale platki), otrzymany przez krystalizacje z heksanu lub z mieszaniny benzen-heksan, topi sie w temperatu¬ rze 77—79°C, posiada wzór sumaryczny C^HnA) (analiza elementarna: obliczono C 69,21, H 7,74, O 23,05, znaleziono: C 69,5, H 7,86, O 23,01, CiJPafh wedlug spektroskopii masowej o duzej rozdzielnosci), rozpuszcza sie w wodzie, metanolu, etanolu, propanolu, butanolu, acetonie, ketonie me- tylowoizobutylowym, octanie etylu, octanie butylu, benzenie, chloroformie, a nie rozpuszcza sie w ete¬ rze, eterze naftowym i heksanie, jfcrt czynny op¬ tycznie ([a]^ =—10,6°, 0,5% etanol). Jego roztwór (KL~lAg/ml) w buforze fosforanowym (V15 M) o pH = 7,0 wykazuje maksimum przy 246 my, 'El*m =1000), w jego roztworze (10 |ig/ml) w 0,1 N HC1 wykazuje dwa maksima przy 221 m^ tEl« =625) i 285 mu (E^ =963, Wykonane w KBr widmo w podczerwieni tego zwiazku wykazuje pasma absorpcji przy 3400, 2900, 1710, 1660, 1560, 1455, 1420, 1380, 1300, 1270, l»5f 1195, 1170, 1130, 1100, J050, 1015, 990, 980, 956, 935, 895, 885, 860, 840, 820, 810 i 780 cm-1. Ma wlasno¬ sci kwasowe i przechodzi do rozpuszczalnika, nie* 5 mieszajacego sie z woda, w srodowisku kwasnym, a z rozpuszczalnika tego przechodzi do wody przy wartosciach pH wyzszych od 5—6. Jest adsorbowa- ny przez zywice anionowymienna, a miareczkowa* nie wykazuje pK' okolo 4,1. Daje dodatnie reakcje io z 2,4-dwunitrofenylohydrazyna i takimi odczynni¬ kami, jak kwas hydroksamowy — chlorek zelazo* wy, czy odczynnik tetrazoliawy, a ujemne reakcje z odczynnikami Fehlinga i Tollensa.Wobec palladu na weglu pochlania dwa mole w wodom, dajac C^H^A. cairomatografowany na cienkiej warstwie silikazelu wykazuje Rf okolo 0,7 w ukladzie butanol: kwas octowy: woda (4:1:1) a Rf okolo 0,1 w ukladzie benzen-octan etylu (2 :1).W stezeniu 100 pg/ml oudenon nie hamuje wzro- tt stu nastepujacych bakterii na pozywce agarowej: S aureus, E. coli (K12), S. typhosa, S. dysenteriae^ K. pneumoniae, B. anthracis, B. subtilis, Mycobft- cterium 607, nie hamuje równiez Pyricularia ory- zae, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, *5 Penicillium chrysogenum na pozywce agarowej z glukoza. W stezeniu 12,5 ng/ml hamowal wzrost Pyricularia oryzae na pozywce ryzowej o pH=»5,0.Zwiazek o wzorze C^Hk^, topiacy sie w tempe¬ raturze 75—80°C, nie byl dotad znany, oudenon 9o jest zatem zwiazkiem nowym, co zostalo równiez potwierdzone przez jego wzór strukturalny. Jest slabo toksyczny dla zwierzat. Kiedy oudenon roz¬ puszczono/ w wodzie destylowanej (pH—2,3) i po¬ dano myszom, to LD% wynosila 138 mg/kg przy m wstrzyknieciu dozylnym, 163 mg/kg przy wstrzy¬ knieciu dootrzewnowym, 1000 mg/kg przy wstrzy¬ knieciu podskórnym i 1100 mg/kg przy podaniu doustnym. Kiedy oudenon rozpuszczono w wodzie destylowanej i zobojetniono, to LDTO wynosila, od- *9 powiednio, 1270 mg/kg, 1310 mg/kg, 1400 mg/kg i 2200 mg/kg. Podawanie oudenonu w ilosciach 160 mg/kg 40 mg/kg lub 10 mg/kg dziennie, do¬ ustnie lub dootrzewnowo, przez 30 dni, nie wywo¬ lalo zadnych objawów zatrucia, natomiast spowo- 45 dowalo spadek cisnienia krwi.Wplyw oudenonu na hydroksylaze tyrozjmowa badano w nastepujacych sposób: mieszanina re¬ akcyjna zawierala 0,1 jimol L-tyrozyny-14C (1,1 X 105 sygnalów na minute), 1 ^mol 2-amino-4-hydro- m -ksy-6,7-dwumetyloterahydropterydyny, 0,1 ml Roz¬ tworu hydroksylazy tyrozynowej (1 mg protei¬ ny/ml), 200 iimoli buforu octanowego o pH = 6,0, 100 iimoli merkaptoetanolu, 100 ng, 50 lig, 25 pg, 12,5 ^ig lub O pg oudenonu w 1 ml; po 15 minutach 55 w temperaturze 30°C wyodrebniano 3,4-dwuhydro- ksyfenyloalanine-14C za pomoca chromatografii na tlenku glinowym i. oznaczono jej ilosc na podsta¬ wie radioaktywnosci. Próba ta wykazala nastepu-. jace % hamowania przy klejonych stezeniach oude- w nonu: 74,1% przy 100 ug/ml, 57,6% przy 50 |igtol, 39,0% przy 25 Mg/ml 30,6% przy 12,5 ug/ml. Ha¬ mowanie nie cofalo sie po dodaniu Fe++ (1 X 1 Po przedstawieniu wyników na wykresie zgod- 19 nie z równaniem Lineweavor-Burk, daje sie zau*81044 ft 10 wazyc niekonkurencyjny charakter oudeonu w sto¬ sunku do tyrozyny, a konkurencyjny w stosunku do 2-amino-4-hydroksy-6,7-dwumetylotetrahydrop- terydyny.Struktura oudenonu, krystalizowanego z heksa¬ nu, zostala ustalona i obrazuje ja wzór 1.Jak widac ze wzoru strukturalnego, oudenon nie posiada grupy karboksylowej, ma jednak, jak to Juz wczesniej opisano, wlasnosci kwasowe. Jego Sole z metalami maja wzór (^UnOJriNL/M two¬ rzy jon Bfn+). Ustalono z pewnoscia,: ze budowe Oudenonu mozna opisac wzorami strukturalnymi 1,2,5,4, przedstawionymi na schemacie 1.' Na schemacie tym M»+ oznacza jony metali, np.Ca+* odpowiada M*+.W czasie biosyntezy, w plynie hodowlanym, ou¬ denon wystepuje glównie w formie zwiazków o wzorach 2, 3 i 4, natomiast ekstrahowany nie- mieszBjacym sie z woda rozpuszczalnikiem przybie¬ ra postac wzoru 1.* Zgodnie z wynalazkiem do roztworu oudenonu dodaje sie nieorganiczne lub organiczne zwiazki metali, dajace latwo jony tych metali, dodaje sie, jesli trzeba, wode i wyodrebnia sie sole oudenonu o wzorze 4 przez usuniecie rozpuszczalnikiem lub przez krystalizacje. Np. do oudenonu, rozpuszczo¬ nego w octanie etylu, dodaje sie sól sodowa 2- -etyloheksanolu i krystalizuje sie wytracajaca sie sól sodowa oudenonu; do oudenonu, który w wo¬ dzie przechodzi w zwiazki o wzorach 2 i 3 dodaje sie KHCO3 az do uzyskania pH o wartosci 6,0, a sól potasowa oudenonu wyodrebnia s\a przez od¬ parowanie roztworu, przy czym w celu ulatwienia odparowania dodaje sie n-butanol; do oudenonu, którjr w wodzie przechodzi w zwiazki o wzorach 2 i 3 dodaje sie wodorotlenek barowy do uzyska¬ nia pH o wartosci 6,0 a zageszczanie z jednocze¬ snym dodawaniem n-butanolu daje krystaliczna sól barowa oudenonu. Jak widac z polozenia ma¬ ksimów w widmie oudenonu w ultrafiolecie, wy¬ konanym w wodzie 1*15 M buforze fosforanowym o pH—7,0, oraz, jak wynika ze wzorów czastecz¬ kowych opisanych ponizej soli; oudenon reaguje z woda i tworzy zwiazki o wzorach 2 i 3. Zwiazki te oraz ich formy racemiczne mozna otrzymac rów¬ niez na drodze syntezy chemicznej. Wynalazek obejmuje sposoby otrzymywania soli oudenonu i jego formy racemicznej ze zwiazków o wzorach 2 i 3, otrzymanych' na drodze syntezy chemicznej.Sole oudenonu posiadaja nastepujace wlasnosci: sól sodowa: bialy, krystaliczny proszek, tempera¬ tura topnienia 145—148°C, dla C^H^ Na obli¬ czono: C 58,05, H 6,90, O 25,77, Na 9,26, otrzymano: C 57,79, H 7,32, O 24£6, Na 8,77; sól potasowa: biale krysztaly, temperatura topnienia 116—117°C, dla C12H17O4K obliczono: C 54,51, H 6,48, O 24,20, K 14,78, znaleziono: C 55,73, H 6,77, O 23,6, K 13,37; sól wapniowa: biale krysztaly, temperatura topnie¬ nia 167—169°C, dla (CuHiTO^sCa obliczono: C 58,76, H 6,96, O 26,09, Ca 8,15, otrzymano: C 58,40, H 7,15, Ca 8,19; sól magnezowa: biale krysztaly, tempera¬ tura topnienia 252—255°C, obliczono dla (C12H17O4) 2Mg: C 60,70, H 7,21, Mg 5,01 znaleziono: C 60,53, H 7,62, Mg 5,15; sól barowa: biale krysztaly, tem¬ peratura topnienia 135—138°C, dla (CuHfTOjhBa obliczono: C 49,03, H 5,82, O 21,77, Ba 23,36, zna¬ leziono: C 49,24, H 6,01, O 20,00, Ba 22,91. Sól gli¬ nowa oudenonu otrzymano w postaci bialego pro¬ szku. Sól sodowa, potasowa, wapniowa lub mag- 5 nezowa oudenonu, dajaca roztwór wodny o pH = 6—7 mozna stosowac doustnie lub w postaci za¬ strzyków.Dzieki wlasnosciom kwasowym oraz znajomosci budowy róznych form oudenonu w roztworach, oraz, znajac sposoby otrzymywania jego soli z za¬ sadami, mozna z latwoscia otrzymac szereg mody¬ fikacji opisanych sposobów.Hydroksylowanie tyrozyny jest etapem biosyn¬ tezy norepinefryny, decydujacym o szybkosci tego procesu. Dlatego tez, hamowanie hydroksylazy ty- rozynowej prowadzi do zahamowania syntezy no¬ repinefryny in vivo, co powoduje obnizenie cisnie¬ nia krwi.Zmniejszenie szybkosci syntezy norepinefryny w komórkach mózgowych ma dzialanie sedatywne.Wstrzykniecie duzej dawki oudenonu myszom lub szczurom nie powoduje zasypiania i nie zauwazor no przy tym zadnych objawów dzialania sedatyw- nego. Uwaza sie zatem, ze bariera krew-mózg ha¬ muje przenikanie oudenonu do komórek mózgu.Jak juz wspomniano, codzienne wstrzykiwanie lub podawanie doustne oudenonu szczurom obnizalo cisnienie krwi. Dzialanie hipotensyjne da sie za¬ uwazyc jeszcze wyrazniej, gdy.podaje sie oudenon szczurom o wrodzonym nadcisnieniu. Szczury takie udalo sie wyhodowac prof. Okamoto, Medical School, University of Kyoto.Kiedy dawke 6,25 mg/kg zastrzyknieto dootrzew- nowo szczurowi o cisnieniu krwi 183 mm, oraz in¬ nemu szczurowi o cisnieniu 193 mm, to cisnienie krwi obnizylo sie, odpowiednio, do 115—145 mm i 150—170 mm w czasie 1—22 godzin po zastrzy- knieciu. Gdy dawke 3,13 mg/kg zastrzyknieto szczu¬ rowi o cisnieniu 173 mm, to cisnienie to obnizylo sie do<«44C—148 mm w czasie 1—22 godzin po wstrzyknieciu. Gdy dawke 25 mg/kg wstrzyknieto dootrzewnowo szczurowi o cisnieniu 190 mm, to cisnienieito obnizylo sie do 140—163 mm w czasie 1—22 goflz. po wstrzyknieciu.. Doustne podawanie oudenonu (dzienne dawki: 3^1 mg/kg 6,25 mg/kg, 12,5 mg/kg, 25 mg/kg) przez trzy dni wywolalo znaczne obnizenie cisnienia krwi. Obnizenie to wy¬ nosilo 20—30% i utrzymywalo sie przez okolo 5 dni po podaniu ostatniej dawki.Oudenon hamuje hydroksylaze tyrozynowa i ob¬ niza cisnienie krwi. Laczenie go z innymi srodka¬ mi hipotensyjnymi powoduje zatem wzmocnienie dzialania. Zwlaszcza w polaczeniu z rezerpina wzmocnienie dzialania jest bardzo duze.Ponizej opisano przyklady sposobów produkcji i otrzymywania oudenonu i Jego soli. Latwo za¬ tem znalezc sposoby, bedace modyfikacjami opisa¬ nych tu metod. Wynalazek obejmuje wszystkie spo¬ soby powstale przez modyfikacje sposobów, opisa¬ nych w wynalazku.Przyklad I. Szczep 10F wyhodowany na sko¬ sie agarowym zawierajacym 2%' glukozy, 0,5% su¬ chych drozdzy i 1,5% agaru zaszczepiono na po-, zywce z trocin w 4 kolbach. Pozywke te przygo¬ towano w nastepujacy sposób:. 10 g trocin (z Mag¬ io 15 35 39 40 50 5581044 / U nolia hypolenoa) dodano 60 ml pozywki zawiera¬ jacej 2,0% glukozy i 0,5% suchych drozdzy, calosc umieszczono w kolbie o pojemnosci 500 ml i ste¬ rylizowano w temperaturze 120°C przez okres 20 minut.Okres inkubacji trwal 14 dni w temperaturze 27°C. Do kazdej z kolb dodano 250 ml pozywki zawierajacej 2,0% glukozy i 0,5% suchych drozdzy, wytrzasano przez pewien czas i tak otrzymana za¬ wiesine z 4 kolb zaszczepiono na 150 litrach po¬ zywki zawierajacej 2,0% glukozy, 0,5% peptonu, 0,3% suchych drozdzy, 0,3% KH2P04, 0,1% MgS04. 7 H2Q, w tanku fermentacyjnym ze stali i nie¬ rdzewnej o pojemnosci 400 1, wyjalowionego w tem¬ peraturze 120°C przez okres 20 minut. Fermenta¬ cje prowadzono mieszajac z szybkoscia 200 obr/min i napowietrzajac zawartosc tanku 150 litrami wy¬ jalowionego powietrza na minute w temperaturze 27°C.Poczatkowo pH wynosilo 5,68, po 45 godzinach 5,1, po 55 godz. 4,6, po 65 godz. 4,35, po 83 godz. 4,8 i 4,7 po 96 godzinach fermentacji. Poziom cukru zmniejszal sie stopniowo i po 96 godzinach wy¬ nosil i 0,53%. Zawartosci oudenonu w przesaczu Z brzeczki byly nastepujace: 19,5 g/ml po 40 godz., 91 |Ag/ml po 65 godz., 94 ng/ml PO 71 godz., 605 jig/ml po 80 godz. Proces przerwano po 97 godzi¬ nach, pH brzeczki doprowadzono do wartosci 3,0 za pomoca kwasu solnego i przesaczono ja otrzy¬ mujac 110 1 przesaczu, który zawieral 607 jig/ml oudenonu. Odsaczona, wilgotna grzybnia o wadze 4,1 kg zawierala 2?,0 g oudenonu. Do przesaczu dodano 100 litrów n-butanolu, wymieszano, roz¬ dzielono warstwy i dodano znów 50 listrów n-bu¬ tanolu.Ekstrakty butanolowe polaczono (objetosc calko¬ wita 166 litrów) — zawieraly one 49,8 oudenonu.Otrzymany po zatezeniu pod zmniejszonym cisnie¬ niem syrop rozpuszczono w 800 ml mieszaniny benzen-octan etylu (2:1 w stosunku objetoscio¬ wym) i roztwór przepuszczono przez kolumne z si- likazelem (1,75 kg silikazelu zawieszono w miesza¬ ninie benzen-octan etylu). Srednica kolumny wy¬ nosila 4 cm. Przez kolumne przepuszczano kolej¬ no: 6 1 mieszaniny benzen-octan etylu (2 :1), 6 1 mie¬ szaniny benzen-octan etylu (1:1) i 30 1 miesza¬ niny benzen: octan etylu (1:2). Otrzymano eluat, zawierajacy 28,6 g (1100 fig/ml) oudenonu. Po za- tezeniu tego roztworu pod zmniejszonym cisnie¬ niem otrzymano 40 g roztworu o konsystencji sy¬ ropu. Do syropu tego dodano 3 1 goracego heksa¬ nu, roztwór oziebiono i odsaczono 17 g krystalicz¬ nego oudenonu. Z lugów pokrystalizacyjnych wy¬ krystalizowano jeszcze 8 g oudenonu.Oudenon, zawarty w odsaczonej grzybni, wyek¬ strahowano 8 litrami metanolu, a ekstrakt odparo¬ wano do objetosci 1,5 1 pod zmniejszonym cisnie¬ niem, pH roztworu doprowadzono do wartosci 3,0 za pomoca kwasu solnego i ekstrahowano go 1,5 litrami i 0,75 1 m-butanolu. Ekstrakty butanolowe polaczone, odparowano do konsystencji syropu, któ¬ ry rozpuszczono w 100 ml mieszaniny benzen- octan etylu (2:1) i poddano chromatografii na si¬ likazelu (120 g silikazelu w kolumnie). W sposób wyzej juz opisany otrzymano 1,0 g oudenonu.Przyklad II. Zawiesine grzybni szczepu, wy¬ twarzajacego oudenonu, przygotowano w sposób, jak w przykladzie I, tj. wyhodowana-szczep 10F na pozywce zawierajacej trociny. 10 ml zawiesiny 5 zaszczepiono na 125 ml pozywki zawierajacej 2,0% glukozy, 0,5% peptonu, 0,3% suchych drozdzy 0,3% KH2P04, 0,1% MgS04. 7H20, w kolbie o pojemnosci 500 ml. Hodowle prowadzono na trzesawce, przez 11 dni w temperaturze 27°C, otrzymujac 1000 ml io brzeczki (310 |ig/ml), która przepuszczono nastep¬ nie przez kolumne z IRA-400 (dostawca: Rhom and Haas, USA) 50 ml zywicy (Cl~) umieszczono w ko¬ lumnie o 2 cm srednicy. Przepuszczono 100 ml wo¬ dy destylowanej, a nastepnie 350 ml 0,1 N HCL 19 Eluat zawieral 250 mg oudenonu. Ekstrahowano go 350 i 100 mililitrami n-butanolu, ekstrakty za- tezono pod próznia do konsystencji syropu. Syrop rozpuszczono w benzenie, a oudenon wytracono heksanem. Otrzymano 150 mg krystalicznego ou- 20 denonu.Przyklad III. Szczep 10F wyhodowano w spo¬ sób, jak w przykladzie I. Fermentacje przerwano po 96 godzinach. Przesacz zawieral 500 jig/ml oude¬ nonu, a grzybnia odsaczona z 1 ml brzeczki za- 25 wierala 80 \kg oudenonu. 100 1 tej brzeczki zakwa¬ szono HC1 do pH = 2,5 i ekstrahowano kolejno 100 litrami i 50 litrami n-butanolu. Ekstrakty bu¬ tanolowe polaczono (zawieraly one 52 g oudenonu) i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem do 30 konsystencji syropu. Oudenon ekstrahowano z sy¬ ropu za pomoca kolejno 4 litrów i 1 litra octanu etylu. Ekstrakty polaczono i dodano do 1,5 1 wody.Mieszajac, warstwe wodna zobojetniono 10 N NaOH do pH = 7,0 i oddzielono. Zakwaszono ja HC1 do 89 pH = 3,0 i ekstrahowano oudenon, kolejno, 3 li¬ trami i 1 litrem octanu etylu.Warstwy octanu etylu polaczono i odparowano do konsystencji syropu. Syrop rozpuszczono w 3 1 goracego heksanu i oziebiono, co dalo 18 g krysta- 40 licznego oudenonu, a dalsze 11 g otrzymano przez stezenie lugów pokrystalizacyjnych.Przyklad IV. Do 5,0 ml 0,02 M roztworu oudenonu (4,17 mg/ml) dodano kroplami 0,02 M CuS04 w temperaturze 17°C. Wytracila sie nie- 45 bieska sól miedziowa oudenonu. Najwiecej osadu wytracilo sie po dodaniu 2,45—3,0 ml 0,02 M CuS04. Pozostalosc zawierala 2,08 mg/ml oudenonu.Osad odsaczono i wysuszono, otrzymujac 9,5 mg soli miedziowej oudenonu. 50 Przyklad V. 650 mg krystalicznego oudeno¬ nu (temperatura topnienia 77,5—78,5°C) rozpuszczo¬ no w 20 ml octanu etylu i dodano 4 ml roztworu 2-etyloheksanolanu sodowego w ketonie metylowo- izobutylowym (45,2% objetosciowych). Mieszano 55 jeszcze przez okres 65 minut w temperaturze po¬ kojowej, odsaczono wytracona sól sodowa oude¬ nonu, przemyto 5 mililitrami octanu etylu i wysu¬ szono, otrzymujac 670 mg produktu o tempera¬ turze topnienia 145—148°C. Roztwór wodny tej soU« 60 mial pH = 6, sól rozpuszcza sie w wodzie, meta¬ nolu, etanolu, nierozpuszcza sie w octanie etylu, benzenie i acetonie.Przyklad VI. Surowe krysztaly oudenonu (1,18 g, temperatura topnienia 74—76°C) rozpu- 65 szczono w 25 ml octanu etylu i dodano 25 ml wody13 destylowanej. Do tego roztworu dodano 2,65 ml roztworu 2-etyloheksanolanu sodowego w ketonie metylowoizobutylowym (45,2% objetosciowych).Mieszano jeszcze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i dalsza godzine w temperaturze 10°C.Wytracona sól sodowa oudenonu odsaczono, prze¬ myto 5 mililitrami octanu etylu i wysuszono, otrzy¬ mujac 1,35 g krystalicznego produktu. Dla Ej°£m przy 246 m\i w obojetnym roztworze otrzymano wartosc 853, a dla EJ°^m w roztworze kwasnym przy 285 mji wartosc 765.Przyklad VII. 30 g syropu otrzymanego przez ekstrakcje butanolem brzeczki fermentacyjnej ze szczepem, wytwarzajacym oudenon, i odparowa¬ nie rozpuszczalnika pod zmniejszonym cisnieniem, zawierajacego 12 g aktywnego zwiazku rozpuszczo¬ no w 400 ml octanu etylu i do tego roztworu do¬ dano 70 ml roztworu 2-etyloheksanolanu sodowe¬ go w ketonie metylowoizobutylowym (45,2% ob¬ jetosciowych).Po godzinie mieszania w temperaturze pokojo¬ wej, mieszanine pozostawiono na kilkanascie go¬ dzin w lodówce. Wykrystalizowana sól sodowa ou- deonu przemyto 40 mililitrami octanu etylu i su¬ szono, otrzymujac 10,7 g produktu. W obojetnym roztworze wodnym, przy 246 nip. EJ £m = 842, a w roztworze kwasnym, przy 285 m^i E} ^ = 760. 2,0 g tak otrzymanej soli sodowej oudeonu (wzór 4, Mn+ = Na+) rozpuszczono w 40 ml wody destylowanej i ekstrahowano 40 mililitrami octanu butylu. Mieszanine wytrzasano przez 10 minut przy pH = 2,0 z 3 N HC1, a nastepnie oddzielono war¬ stwe octanu butylu.Operacje powtórzono, ekstrakty octanowe pola¬ czono i osuszono siarczanem .sodowym. Roztwór odparowano pod zmniejszonym cisnieniem do kon¬ systencji syropu, z którego wykrystalizowano ou¬ denon za pomoca 100 ml cykloheksanu. Otrzyma¬ no 1 g krystalicznego oudenonu (temperatura to¬ pnienia 76—78°C).Przyklad VIII. 2,08 g krystalicznego oudeno¬ nu rozpuszczono w 50 ml.wody destylowanej i do roztworu dodano 1,0 g KHCO3, doprowadzajac w ten sposób pH do wartosci 6,0. Do tego roztworu dodano 150 ml n-butanolu i mieszanine destylowa¬ no pod zmniejszonym cisnieniem. Po pojawieniu sie krysztalów dodano jeszcze 100 ml n-butanolu i kontynuowano destylacje.' Biale krysztaly odsaczono, przfemyto n-butanolem i odsaczono, otrzymujac 2,39 g krystalicznej soli potasowej oudenonu o temperaturze topnienia 11^-117°C. pH roztworu o stezeniu 10 mg/ml wy¬ nosilo 6,95. W 99% metanolo, przy 246 m^ E}°£m= = 592, w obojetnym roztworze wodnym, przy 246 mu Ei°^m =788, a w roztworze kwasnym, przy 285 m^ £{^=672, 044 14 Przyklad IX. W sposób, jak w przykladzie VIII, uzywajac 185 mg wodorotlenku wapniowego zamiast wodoroweglanu potasowego, z 1,04 g ou¬ denonu otrzymano 0,89 g jego soli wapniowej. 5 Przyklad' X, W sposób, jak w przykladzie VIII, uzywajac 787 mg Ba (OH)2. 8H20 zamiast wo¬ doroweglanu potasowego, z 1,04 g oudenonu otrzy¬ mano 1,28 g jego soli barowej. 10 Przyklad XI. W sposób, jak w przykladzie VIII, uzywajac 145 mg wodorotlenku magnezowe¬ go zamiast wodoroweglanu potasowego, z 1,04 g oudenonu otrzymano 0,64 g jego soli magnezowej.Przyklad XII. W sposób, jak w przykladzie 15 VIII, uzywajac 420 mg wodoroweglanu sodowego zamiast wodoroweglanu potasowego, z 1,04 g ou¬ denonu otrzymano 1,2 g jego soli sodowej. 20 PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania oudenonu o wzorze 1 i jego soli, obnizajacych cisnienie krwi, znamien¬ ny tym, ze szczep grzybów Oudemansiella radicata 26 ATCC nr 20 295 hoduje sie w wodnym roztworze weglowodanu,. zawierajacym substancje odzywcza, stanowiaca zródlo azotu, w temperaturze 20—35°, korzystnie 25—30°C, przez 10—20 dni w warunkach napowietrzanej hodowli wglebnej, po czym oude- 30 non wyodrebnia sie ze srodowiska hodowlanego w postaci wolnej lub ewentualnie przeprowadza w sole. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze oudenon wyodrebnia sie z jego wodnego roztworu 39 o odczynie kwasnym przez ekstrakcje niemiesza- jacym sie z woda rozpuszczalnikiem. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze oudenon wyodrebnia sie z roztworu w niemiesza- jacym sie z woda rozpuszczalniku, przez ekstrakcje 40 wodnym roztworem o odczynie obojetnym lub al¬ kalicznym. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze oudenon wyodrebnia sie przez absorpcje na zywi¬ cy anionowymiennej. *5 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze oudenon wyodrebnia sie z surowej masy stalej lub syropu przez rozpuszczenie jej w rozpuszczal¬ nikach organicznych, w których oudenon rozpu¬ szcza sie. 50 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku otrzymywania soli oudenonu z me¬ talami wyodrebniony oudenon poddaje sie dziala¬ niu nieorganicznych lub organicznych zwiazków metali tworzacych jony metali, a otrzymane sole 55 z metalami o wzorze 5, w którym M jest jonem' metalu, pochodzacego z zasady, wyodrebnia sie i krystalizuje.KI. 30h,6 81044 MKP C12d 13/02 FIG. 1 Widma UV oudenonu (5^/ml) w roztwórz* obojetnym (bufor fosforanowy, pH*7,0 ) i kwasnym (0,1 N Ha) w buforze fosforanowym, pH*7,0 w 0,1 n na FIG.2 Widmo IR oudenonu (KBr)KI. 30h,6 81044 MKP C12d 13/Ol FIG. 3
2. 2.5u 3 Widmo IR Soli potasowej oudenonu , C^H^O^KfKBr) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 100 ftr AA ou 40 or\ C.KJ 0 ~A l I I / / V \J ^ || I /. 1 ¦^ —**¦ ¦ I _l \ A M _\ i A A A / ft U r i l l\ pi i 1 1 U i / W 1 L \ 1 V \(\( VI V ' y"v f 1 i_. r\f H _| 1 ^ s —i A 4000 3000 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650 3500 2500 1900 1700 1500 1300 1100 900 700 WZÓR i. WZÓR 2 WZÓR 3 Schemat 1 WZÓR A \ CH^f""^ CHn— ^H» M / WZÓR 5 PL