Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A204 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku A204 lub jego soli o wlas¬ ciwosciach szkodnikobójczych.Sposobem wedlug wynalazku nowy antybiotyk A204 wytwarza sie przez hodowanie nowego szcze¬ pu Streptomyces albus w warunkach aerobowych w srodowisku, zawierajacym zródlo przyswajalne¬ go wegla, azotu i nieorganicznych soli.Antybiotyk A204 wykrystalizowany z eteru ety¬ lowego stanowi krystaliczna substancje o barwie bialej i o temperaturze topnienia 96—98°C roz¬ puszczalna w estrach, benzenie, chlorowcowanych weglowodorach, dwumetyloformamidzie, dwume- tylosulfotlenku, eterze i ketonach, slabo rozpuszczal¬ na w alkoholach i bardzo slabo w wodzie. Zwia¬ zek ten jest substancja kwasna o jednej dajacej sie zmiareczkowac grupie o pK 6,1. Pozorny cie¬ zar czasteczkowy tego zwiazku, oznaczony metoda miareczkowania, wynosi okolo 900. W sklad tego zwiazku wchodzi 61,74% wegla, 9,37% wodoru i 28,38% tlenku. Optyczna skrecalnosc wlasciwa 25° zwiazku (a) D oznaczona w roztworze metanolo¬ wym o stezeniu 1% wagowo/objetosciowym wyno¬ si +68,12°. Analiza podczerwonego widma absorp¬ cyjnego w zakresie 2,0—15,0 mikronów, dokonana na roztworze zwiazku w chloroformie, wykazuje pasma przy dlugosci fali 2,95; 3,43; 5,95; 6,87; 7,26; 7,80; 8,52; 8,95; 9,17; 9,34; 9,59; 9,82; 10,07; 10,24; 10,51; 10,77; 11,40; 11,80 mikronów. Charakterystycz- 10 15 20 25 nego nadfioletowego widma absorpcyjnego nie stwierdzono.Optyczna skrecalnosc wlasciwa wyznaczono dla zwiazku w postaci krystalicznego wolnego kwasu, suszonego w ciagu okolo 15 godzin w temperaturze pokojowej pod cisnieniem nizszym od atmosferycz¬ nego, nad bezwodnym chlorkiem wapniowym. Mia¬ reczkowanie przeprowadzono metoda elektrome- tryczna w 66% roztworze tego kwasu w mieszani¬ nie metyloformamidu z woda, a analize elementar¬ na przeprowadzono dla zwiazków wysuszonego nad pieciotlenkiem fosforu w temperaturze okolo 80°C pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego.Nowy szczep Streptomyces albus stosowany w procesie prowadzonym sposobem wedlug wynalaz¬ ku wyosobniono z próbek gleby w miejscowosci Perry w stanie Floryda w Stanach Zjednoczonych Ameryki. Próbki tej gleby mieszano w wyjalowio¬ nej wodzie destylowanej i otrzymane zawiesiny na¬ noszono na plytki pozywki agarowej, które nastep¬ nie poddawano hodowli w ciagu kilku dni w tem¬ peraturze okolo 30°C. Po zakonczeniu inkubacji, przeniesiono otrzymane kolonie na skosy agarowe za pomoca petli platynowej, po czym zaszczepione skosy agarowe poddano inkubacji, otrzymujac wiek¬ sze ilosci organizmów wytwarzajacych antybioty¬ ki A204.Otrzymany mikroorganizm, zdolny do wytwarza¬ nia zwiazku A204, zdeponowano w zbiorze Northern Utilization Research and Development DivisIon;?dd62 i Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (poprzednio Northern Regional Rese¬ arch Laboratories) w Peorii w stanie Illinois, gdzie jest oznaczony numerem NRRL 3384. 5 Ze wzgledu na brak jednolitych i pewnych usta¬ len taksonomicznych co do grupy Streptomyces, wystepuja zawsze watpliwosci zwiazane z klasyfi¬ kacja nowo odkrytych ustrojów. Mikroorganizm, z którego otrzymuje sie antybiotyk A204, wydaje 10 sie upodabniac swymi najwazniejszymi cechami do publikowanych opisów ustrojów Streptomyces al¬ bus, Streptomyces albidoflavus i Streptomyces fla- veolus. Uwaza sie jednak nowy ustrój za szczep Streptomyces albus (Rossia Doria) Waksman i Hen- 15 rici, w oparciu o opis szczepu S. albus ATCC 3004 przez Lyonsa i Pridhama w J. Bacteriol nr 83 (1962) str. 370—380, oraz szczepu S. albus IMRU 3005 przez Waksmana w The Actinomycetes, t. II pt. „Klasyfikacja, identyfikacja i opis rodzajów 20 i gatunków*', Williams and Wilkins Co., Baltimore (1961).Pomimo podobienstw, istnieja jednak dostatecz¬ ne róznice pozwalajace odróznic nowy mikroorga- 25 nizm od wszystkich znanych dotychczas szczepów Streptomyces albus. Szczep NRRL 3384 zostal zatem sklasyfikowany jako nowy szczep Streptomyces albus. 30 W taksonomicznych badaniach szczepu Strepto¬ myces albus wytwarzajacego antybiotyk A204 za¬ stosowano metody zalecone dla International Strep¬ tomyces Project, opisanego przez Shirlinga i Gottlie- ba w International Bulletin Systematic Bacteriol 35 nr 16 (1966), str.^313—340 i w innych dokumentach.Badania zuzycia wegla prowadzono metoda opisana przez Pridhama i Gottlieba w J. Bac. nr 56 (1948), str. 107. Uzyskane w wyniku badan taksonomicz¬ nych wyniki podano w tablicy I. Jako nazwy barw 40 zastosowano terminy wedlug Kelly'ego i Judda „The ISCC-NBS Method of Designating Colours and a Dictionary of Colour Names" U.S. Dept. of Com- merce Circ. 553, Washington D.C. Dane w nawia¬ sach odnosza sie do szeregu kolorów Tresnerai Bac- 45 kusa — „System of Colour Wheels for Streptomy¬ ces Taxonomy" w Applied Microbiology nr 11 (1966) str. 335—338. W nawiasach kwadratowych podaje sie bloki barw wedlug Maerza i Paula Dic¬ tionary of Colour, McGraw-Hill, New York (1950). 50 Tablica I Opis szczepu NRRL 3384 Morfologia Spiralne sporofory o 3—50, zwykle 10—50 sporach w lancuchu, spory o ksztal¬ tach od owoidalnego do wydluzonego o wielkosci 1,9 u X 1,3 u: powierzch¬ nia widoczna na fotomikro- grafii elektronowej — gladka.Hodowla na pozyw¬ kach: Jablczan wapniowy 55 60 65 Owsianka z pasta po¬ midorowa ICP nr 2 (Agar drozdzowo slodowy) ICP nr 3 (Agar ow¬ siany) ICP nr 4 (Agar z soli nieorganicznych i skrobi) ICP nr 5 (Agar gli- cerynowo-asparagi- nowy) Agar Czapka Agar tyrozynowy Agar glikozowo-as- paraginowy Agar Emersona Agar Bennetta Rozrost obfity o barwie odwróconej bladozóltej zie¬ leni 10B1; sporowanie i grzybnia powietrzna — obfite, (7) blada zólcien, 2ba 11Cl brak rozpuszczal¬ nego pigmentu, srodowisko odzywcze lekko sklarowa¬ ne.Rozrost obfity o barwie odwróconej szarawej zól¬ cieni 11B2, sporowanie i grzybnia powietrzna — obfite (W) biel a; brak roz¬ puszczalnego pigmentu.Rozrost obfity o barwie odwróconej szarawej zól¬ cieni 11B2, sporowanie i grzybnia powietrzna — obfite (Y) blada zólcien, 2ba 11Cl, brak rozpuszczal¬ nego pigmentu.Rozrost spory o barwie od¬ wróconej bieli; sporowanie i grzybnia powietrzna — spore (W) biel a, brak roz¬ puszczalnego pigmentu.Rozrost obfity o barwie odwróconej szarawej zól¬ cieni 11B2, obfite sporowa¬ nie i grzybnia powietrzna (Y) blada zólcien 2ba 11C1, brak rozpuszczalnego pi¬ gmentu.Rozrost obfity o barwie odwróconej bladozóltej zie¬ leni 10B1, obfite sporowa¬ nie i grzybnia powietrzna (W) biel a; brak rozpusz¬ czalnego pigmentu.Duzy rozrost o barwie od¬ wróconej bieli, duze sporo¬ wanie i grzybnia powietrz¬ na (W) biel a; brak roz¬ puszczalnego pigmentu.Bardzo slaby rozrost, nie ustalone barwy.Spory rozrost o barwie od¬ wróconej zólcieni 11Cl, srednie sporowanie i grzyb¬ nia powietrzna (Y) blada zólcien 2ba 11C1, brak roz¬ puszczalnego barwnika.Rozrost obfity o barwie odwróconej szarawej zól¬ cieni 12B3, obfite sporowa¬ nie i grzybnia powietrzna (GY) zóltawa szarzen, 2dc 10A2, brak rozpuszczalne¬ go pigmentu.Bardzo slaby rozrost, nie ustalone barwy.7**82 5 9 Agar odzywczy Dzialanie na mleko Redukcja azotanu Wytwarzanie mela- miny Agar peptonowo-ze- lazowy Ekstrakt tryptonowo- drozdzowy Uplynnianie zelatyny Wymagana tempera¬ tura Wplyw zmiany war¬ tosci pH na grzyb¬ nie Wplyw zmiany war¬ tosci pH na rozpusz¬ czalny pigment Zuzycie wegla: L — arabinoza ' Sacharoza D — ksyloza D — fruktoza Glukoza Ramnoza Rafinoza I — inozyt D — mannit próba kontrolna Sredni rozrost o barwie odwróconej szarawej zól¬ cieni 11B2, srednie sporo- wanie i grzybnia powietrz¬ na (W) biel a, brak roz¬ puszczalnego pigmentu.Bez zmian po uplywie 14 dni.Dodatnia Dodatnie Ujemne Ujemne Nie wystepuje w ciagu 14 dni.Rozrost i sporowanie — srednie w temperaturze 26°C, dobre w temperatu¬ rze 30°C. Rozwój wegeta¬ cyjny w temperaturze 37°C, slady rozwoju wege¬ tacyjnego w temperaturze 43—49°C. W temperaturze 55°C — brak rozrostu.Brak wplywu na wszystkie srodowiska z wyjatkiem ICP nr 4, które pod wply¬ wem 0,05 n HC1 lub 0,05 n NaOH zmienia barwe z brunatnej na biala lub staje sie bezbarwne.Brak rozpuszczalnego pi¬ gmentu.+ (-) (+) (+) + + + + + — | Oznaczenia stosowane w tablicy I: + = dodatnie (+) s= prawdopodobne (—) = watpliwe — = brak zuzycia wegla Dzieki temu, ze, jak wskazuja powyzsze dane, szczep moze wykorzystywac rózne zródla energii, jako srodowisko do hodowli tego szczepu w celu wytworzenia antybiotyku A204 stosuje sie rózne pozywki przy czym ze wzgledu na kryteria ekono¬ miczne, wydajnosc antybiotyku oraz latwosc jego wyosabniania, pewne pozywki maja korzystniejsze zastosowanie od innych. Takimi korzystnymi sro¬ dowiskami, zródlami przyswajalnego wegla, sa na przyklad glikoza, fruktoza, skrobia, gliceryna, me¬ lasa, dekstryna, cukier nieoczyszczony i tym po¬ dobne, przy czym najkorzystniejsza pozywka-zró- dlem wegla — jest glikoza. Innymi odpowiednimi pozywkami sa zródla przyswajalnego azotu, takie 5 jak maczka sojowa, substancje stale z wyciagu na- mokowego kukurydzy, drozdze, maczka z nasion bawelny, ekstrakt wolowy, peptony (miesne lub sojowe), kazeina, mieszaniny aminokwasów itp. Ko¬ rzystnie jako zródla azotu stosuje sie peptony, maczke sojowa, mieszaniny aminokwasów i tym podobne. Do srodowiska pozywkowego mozna rów¬ niez wprowadzac sole nieorganiczne, wytwarzajace jony sodowe, potasowe, amonowe, wapniowe, fosfo¬ ranowe, siarczanowe, chlorkowe, weglanowe i tym podobne.Pierwiastki drugorzedne, potrzebne do optymal¬ nego wzrostu i rozwoju mikroorganizmu, z którego wytwarza sie antybiotyk A204, wprowadza sie tak¬ ze do pozywki. Pierwiastki takie wystepuja zwykle jako domieszki z innymi skladnikami srodowiska odzywczego w ilosciach odpowiednich do zapotrze¬ bowania przez antynomycety stosowane w proce¬ sie prowadzonym sposobem wedlug wynalazku.Poczatkowa wartosc pH srodowiska pozywkowe¬ go moze sie wahac w pewnych granicach, przy czym stwierdzono, ze winna ona korzystnie wyno¬ sic 6,5—7,5. Jak zaobserwowano w przypadku in¬ nych aktynomycetów, wartosc pH pozywki wzra¬ sta stopniowo podczas wzrostu szczepu i wytwa¬ rzania antybiotyku, przy czym moze ona osiagac wartosc 7,0—7,6 lub nawet wyzsza, z. tym, ze kon.- cowa wartosc pH zalezy co najmniej czesciowo od wyjsciowej wartosci pH pozywki* substancji bufo¬ rowych w tej pozywce oraz. od czasu wzrostu mi¬ kroorganizmu.Antybiotyk A204 wytwarza sie korzystnie w za¬ nurzeniowej hodowli aerobowej. W przypadku wy¬ twarzania stosunkowo niewielkich ilosci antybio¬ tyku A204 mozna stosowac kolne wstrzasana i pro¬ wadzic hodowle powierzchniowa, w balonach, na¬ tomiast do wytwarzania wiekszych ilosci antybio¬ tyku korzystniej stosuje sie zanurzona kulture aerobowa w sterylizowanych zbiornikach. Pozyw¬ ka umieszczona w sterylnym zbiorniku moze byc zaszczepiona sporowana zawiesina. Ze wzgledu jed¬ nak na to, iz metoda ta pociaga za soba opóznie¬ nie wzrostu, korzystniej jest stosowac hodowle w postaci wegetatywnej, która nie powoduje opóz¬ nienia i wplywa tym samym na wydajniejsze wy¬ korzystanie sprzetu do fermentacji. Zaleca sie za¬ tem najpierw wytworzyc szczepionke wegetatyw¬ na przez zaszczepienie stosunkowo niewielkiej ilos¬ ci pozywki mikroorganizmem w opstaci sporów, a nastepnie zachowujac warunki aseptyczne, prze¬ niesc mloda, aktywna szczepionke do duzego zbior¬ nika. Pozywka, w której wytwarza sie wegetatyw¬ na szczepionke, moze byc ta sama pozywka lub rózna od pozywki, stosowanej do produkcji anty¬ biotyku A204 na duza skale.Poniewaz szczep, z którego otrzymuje sie anty¬ biotyk A204, rozwija sie w temperaturze 25—37aC, przy czym optymalna wydajnosc uzyskuje sie w temperaturze 26—30°C, przez to hodowle prowadzi sie korzystnie w tej temperaturze. Ogólnie biorac, maksymalna produkcje antybiotyku osiaga sie po 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6079 962 uplywie okolo 24—72 godzin po zaszczepieniu po¬ zywki.Jak zwykle w przypadku zanurzonych kultur ae- robowych, przez pozywke przepuszcza sie sterylne powietrze. W celu uzyskania wydajnego wzrostu mikroorganizmu i wydajnej produkcji antybiotyku A204, przepuszcza sie 0,2—0,4, a korzystnie 0,35 objetosci powietrza na minute w stosunku do ob¬ jetosci pozywki.Aktywnosc antybiotykowa w pozywce podczas fermentacji ustala sie latwo badajac próbki tej po¬ zywki na aktywnosc hamujaca wzrost szczepów, których rozwój powstrzymuje obecnosc antybioty¬ ku A204. Stwierdzono, ze odpowiednimi do takiego badania szczepami sa Staphylococcus aureus, Sar- cina lutea, Bacillus subtilis i Mycobacterium avium.Badanie prowadzi sie znana metoda turbidome- tryczna lub metoda kubkowo-plytkowa.Maksymalna wydajnosc antybiotyku A204 uzy¬ skuje sie na ogól w ciagu 2—3 dni po zaszczepie¬ niu pozywki, zarówno w przypadku zanurzonej kultury aerobowej, jak i w przypadku stosowania wstrzasanego balonu.Aktywnosc antybiotykowa podczas fermentacji wystepuje w roztworze, w grzybni lub w obu tych miejscach. Technike wyosabniania produktu do¬ biera sie tak, aby otrzymac najwyzsza wydajnosc antybiotyku z kazdego z tych zródel lub z obu zródel jednoczesnie. Na przyklad, wytworzony roz¬ twór fermentacyjny przesacza sie, a przesacz eks¬ trahuje odpowiednim rozpuszczalnikiem w celu wyosobnienia calego aktywnego antybiotyku, nie zatrzymanejgo przez grzybnie. Poza tym, antybio¬ tyk zawarty w grzybni wyosabnia sie równiez przez dokladne ekstrahowanie odpowiednim rozpuszczal¬ nikiem. W obu przypadkach antybiotyk wyosabnia sie z rozpuszczalnika ekstrakcyjnego metodami sto¬ sowanymi zwykle do tego celu.Chemiczna i fizyczna analiza krystalicznego A204 wykazuje obecnosc 4—5 grup metoksylowych.Chromatografia bibulowa antybiotyku A204 z za¬ stosowaniem papierka Whatmana nr 1 daje naste¬ pujace wartosci Rf: 0,14 — w wodzie, metanolu, acetonie i benzenie w stosunku objetosciowym 72 :24*5 :3 :0,5; 0,87 — w 10% wodnym roztworze n-propanolu, 0,33 — w rozpuszczalniku zawieraja¬ cym wode, metanol i kwas octowy w stosunku 12 :3 :1 (wartosc pH roztworu ustalono na 10,5 przez dodanie NH4OH, a nastepnie na 7,3 przez do¬ danie H3PO4). Powyzsze dane uzyskano z zastoso¬ waniem roztworu antybiotyku w metanolu. Bioau- tografy otrzymano umieszczajac chromatogram bi¬ bulowy na plytkach agarowych zaszczepionych tes¬ towym szczepem Bacillus subtilis. Przy poddaniu antybiotyku A204 chromatografii cienkowarstwowej na plytkach zelu krzemionkowego z zastosowaniem octanu etylu jako rozpuszczalnika oraz natrysku wanilinowego lub natrysku kwasu siarkowego jako detektora, otrzymuje sie wartosc Rf okolo 0,8. Wid¬ mo absorpcyjne antybiotyku A204 w podczerwieni podano na fig. 1 rysunku.Sodowa sól antybiotyku A204 jest krystaliczna substancja o barwie bialej i o temperaturze top¬ nienia 144—145°C i ciezarze czasteczkowym, wy- 8 znaczonym droga analizy rentgenograficznej, wy¬ noszacym okolo 960. Sól ta rozpuszcza sie w estrach, benzenie, chlorowcowanych weglowodorach, dwu- metyloformamidzie, dwumetylosulfotlenku, eterze 5 i ketonach i jest slabo rozpuszczalna w alkoholach. nrO Optyczna skrecalnosc wlasciwa (a) krystalicznej soli sodowej antybiotyku A204, suszonej w ciagu okolo 15 godzin nad bezwodnym chlorkiem wapnia 10 w temperaturze pokojowej i pod cisnieniem niz¬ szym od atmosferycznego, wynosi +54,95° (C = 2% wag./obj. w metanolu).Widmo absorpcyjne soli sodowej antybiotyku A204 w podczerwieni w chloroformie pokazano na 15 fig. 2 rysunku. Wyrazne pasma tego widma przy dlugosci fali 2,0—15,0 mikronów sa nastepujace: 3,1—3,2 (szerokie), 3,44, 6,26, 6,87, 7,29, 7,67, 7,79, 8,45, 8,96, 9,11, 9,18, 9,36, 9,56, 9,82, 10,05, 10,26, 10,54, 10,95, 11,77 mikronów. 20 Ciezar czasteczkowy uwodnionej krystalicznej soli srebrowej antybiotyku A204, wyznaczony droga analizy rentgenograficznej, wynosi okolo 1099. Kry¬ sztaly soli srebrowej sa bezbarwne, lecz wrazliwe na dzialanie swiatla i promienie X, przy czym po 25 2 dniach napromieniowania na powietrzu staja sie ciemnobrunatne. Ciezar wlasciwy soli srebrowej, mierzony droga flotacji w wodnym roztworze ZnCl2 wynosi 1,293 g/cm3. Jedyna zasada ekstrakcji jest hkl : h + k = Zn, co wskazuje na niecentryczna, 30 jednoskosna grupe przestrzenna C2. W komórce ele¬ mentarnej o wymiarach: a«=25,977A, b = 14,517A, C = 14,418A, B«=91,94A znajduja sie 4 asymetrycz¬ ne komórki jednoskosne i jedna czasteczka na ko¬ mórke asymetryczna. 35 Podobnie, jak wiele innych antybiotyków, anty¬ biotyk A204 zawiera niekiedy kilka scisle pokrew¬ nych skladników. Obecnosc drugiego skladnika stwierdzono tylko w niektórych procesach fermen¬ tacyjnych, w ilosci do 5% calosci produktu. Ten 40 drugi wystepujacy niekiedy skladnik nazwano A204II. Dotychczas A204II otrzymano tylko w po¬ staci mieszanej soli sodowo-potasowej, której ak¬ tywnosc jest podobna do aktywnosci antybiotyku A204. 45 Przecietna z kilku analiz elementarnych krysta¬ licznej mieszanej soli sodowo-potasowej A204II, wysuszonej nad pieciotlenkiem fosforu w tempera¬ turze okolo 80°C pod cisnieniem nizszym od atmo¬ sferycznego, wykazuje obecnosc 60,66% wegla, 50 8,76% wodoru i 27,09% tlenu. Kilka atomowych analiz absorpcyjnych wykazalo, ze zwiazek jest mieszana sola sodowo-potasowa o róznych propor¬ cjach skladników, zawierajaca jeden mol kationu mieszanego na 1 mol A204. Mieszana sól sodowo- 55 potasowa A204II nie wykazuje zadnego charakte¬ rystycznego ukladu w nadfioletowym widmie ab¬ sorpcyjnym. Chromatografia cienkowarstwowa mie¬ szanej soli sodowo-potasowej antybiotyku A204II na plytkach zelu krzemionkowego, z zastosowaniem 60 octanu etylu jako rozpuszczalnika i kwasu siarko¬ wego jako detektora, wykazala wartosc Rf=0,75.Antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wy¬ nalazku, ma zastosowanie przemyslowe i farmaceu¬ tyczne, medyczne i weterynaryjne. W celu otrzy- 65 mania odpowiedniego preparatu szkodnikobójczego79 962 10 miesza sie zwykle aktywne zwiazki z odpowiedni¬ mi znanymi nosnikami.Antybiotyk A204 i jego sole wykazuja wysoka aktywnosc wobec zakazenia kokcydiozowego w przypadku wprowadzenia ich do pokarmu kurczat.Stwierdzono, ze zawartosc 9—45 g antybiotyku A204 lub jego soli na 1 tone pokarmu skutecznie zwalcza oddzielne zakazenia E. tenella, E. acervu- lina i E. maxima. Ta sama ilosc zwalcza mieszane zakazenie E. brunetti i E. tenella oraz mieszane za¬ kazenie 8 gatunkami kokcydów (Coccivac D).Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja równiez aktywnosc owado- i roztoczo- bójcza oraz hamuja rozwój mikroustrojów wywolu¬ jacych choroby u zwierzat i roslin, w tym takze rozwój bakterii Gra-dodatnich i grzybów. Antybio¬ tyki wprowadzone do roztworów dezynfekujacych maja zastosowanie do dezynfekowania powierzchni wokól basenów kapielowych, budynków gospodar¬ czych, pomieszczen dla inwentarza zywego i tym podobnych i do utrzymywania tych miejsc w sta¬ nie wolnym od bakterii i grzybów.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja równiez aktywnosc wobec plesni ro¬ slin straczkowych i pewnych szkodników kukury¬ dzy, w stezeniu 16—400 czesci/milion, a zatem maja one zastosowanie do zwalczania tych szkodników.Owadobójcze i roztoczobójcze wlasciwosci anty¬ biotyku A204 przedstawiono w tablicy II, w której zastosowano nastepujaca skale.Procentowa smiertelnosc Moc 0—10 0 11—20 1 21—30 2 31—40 3 41—50 4 51—60 5 61—70 6 71—80 7 81—90 8 91—100 9 15 20 30 35 40 Aktywnosc antybiotyku w stosunku do pewnych mikroorganizmów okresla sie przez badanie roz- cienczalnosci agaru, polegajace na tym, ze badany szczep naklada sie na szereg plytek agarowych za¬ wierajacych rózne stezenia antybiotyku A204, w celu ustalenia minimalnego stezenia w mcg/ml., hamujacego rozwój szczepu w ciagu 24 godzin.Tablica Szczep badany Staphylococcus aureus (3055) Bacillus subtilis (X12-l) Mycobacterium avium (X-85) Streptococcus faecalis Lactobacillus casei Leuconostoc citrovorum Trichophyton mantagro- phytes Xanthomonas phaseoli Botritis cinerea Colletotrichum pisi Helminthosporum sativum Fellularia sp.N. gruberi (HB-1) w tkan- | ce MRj III Minimalne stezenie w mcg/ml 24 godziny dzialania 6,25 6,25 1£6 1,56 1,56 <*,39 25,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Sól sodowa antybiotyku A204 w postaci wolnego kwasu wykazuje podobna aktywnosc in vitro.Przyklad I. Wytwarzanie antybiotyku A204 w kolbie wstrzasowej. Spory Streptomyces albus NRRL 3384 zaszczepia sie na skórach agarowych z 10 g dekstryny, 2 g kazeiny przefermentowanej przez enzymy, 1 g ekstraktu slodowego, 1 g eks¬ traktu drozdzowego, 20 g agaru i wody do objetosci calkowitej wynoszacej 1 litr, po czym inkubuje sie zaszczepione skosy w ciagu 4—5 dni w temperatu¬ rze 30°C. Nastepnie pokrywa sie skosy sterylna wo¬ da destylowana i delikatnie zeskrobuje z nich Tablica II Skutecznosc antybiotyku A204 jako srodka owadobójczego Owad Meksykanski szkodnik ro¬ slin straczkowych (Mexican Bean Beetle) Szkodnik roslin w Amery¬ ce i Azji (Southern Army Worm) Mszyca kruszynowo-ogór- kowa (Melon Aphid) Roztocz dwukropek (Two- spotted Spider Mite) Chrzaszcz trojesciowy (Milkweed Bug) Dzialanie zoladkowe zoladkowe kontaktowe systemowe kontaktowe kontaktowe Moc przy stezeniu w czesciach 1000 8 8 3,5 7 9 9 500 4 9 2 0 7 9 250 0 8 1 0 7 4 100 — 8,5 — — 8 3 na miiion 50 — 3,5 — — 7 1 25 — 3 — — 6 279 962 li i* ustroje w celu wytworzenia ich wodnej zawiesiny.Kazde 100 ml pozywki wegetatywnej zaszczepia sie 1 ml otrzymanej zawiesiny.Pozywke wegetatywna wytwarza sie przez zmie¬ szanie 15 g glikozy, 15 g maczki sojowej, 5 g sta¬ lych substancji z wyciagu kukurydzy, 5 g. chlorku sodowego, 2 g weglanu wapnia i wody biezacej w ilosci dopelniajacej calosc do objetosci 1 litra. Mie¬ szanine te wstrzasa sie w ciagu 48 godzin w tem¬ peraturze 30°C na wstrzasarce posuwisto-zwrotnej o skoku 5 cm przy 108 obr./min. Otrzymana pozyw¬ ke stosuje sie do wytwarzania antybiotyku A204 jak nastepuje. Najpierw wytwarza sie mieszanine zawierajaca-15 g maczki sojowej, 1 g kazeiny, 3 g NaN03, 20 g syropu glikozowego^ 2,5 g CaC03 i wo¬ de w ilosci dopelniajacej calosc do objetosci 1 li¬ tra. 100 ml porcje tej mieszaniny umieszcza sie w kolbach Erlenmeyera o pojemnosci po 500 ml i kol¬ by te sterylizuje nastepnie w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut. Po ochlodzeniu, kazda kolbe za¬ szczepia sie 5% wytworzonej uprzednio pozywki wegetatywnej. Przygotowane jak wyzej kolby wstrzasa sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 30°C na wstrzasarce obrotowej o 250 obrTmin., przy; czym wartosc pH niezaszczepionej pozywki wynosi 6,5—7,5. Po zakonczeniu cyklu fermentacyjnego, wartosc pH wynosi 7,0—7,6. Aktywnosc antybio- tyczna stwierdza sie zarówno w roztworze jak i w grzybni, badajac roztwór i grzybnie wobec Bacillus subtilis metoda talerzowa lub kubkowo-plytkowa. 25 litrów brzeczki wytworzonej w powyzszy spo¬ sób przesacza sie pod cisnieniem nizszym od atmo¬ sferycznego przez ziemie okrzemkowa, po czym trzykrotnie ekstrahuje sie placek grzybniowy 0,5 objetosci 50% wodnego roztworu metanolu. Pola¬ czone ekstrakty steza sie pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego w celu usuniecia metanolu. Na¬ stepnie miesza sie przefiltrowany roztwór z wod¬ nym koncentratem ekstraktów grzybniowych, war¬ tosc pH otrzymanej mieszaniny ustala na 3 przez dodanie kwasu solnego i ekstrahuje roztwór dwu¬ krotnie 0,5 objetosci octanu etylu. Ekstrakty octa¬ nowe laczy sie i steza do sucha, po czym ponow¬ nie rozpuszcza w chloroformie (10 g chloroformu na 1 g substancji stalej) i przepuszcza sie otrzyma¬ ny roztwór przez 30X100 cm kolumne wegla pit- tsburgskiego o zawartosci 2 g wegla na 1 g substan¬ cji stalej, a nastepnie eluuje kolumne 5—10-krotna iloscia chloroformu w stosunku do ilosci wyjscio¬ wej.Polaczone eluaty steza sie do stanu suchego pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, pozosta¬ losc rozpuszcza w niewielkiej ilosci cieplego meta¬ nolu i ochladza, a nastepnie odsacza wytworzone krysztaly. Po rekrystalizacji otrzymuje sie 8,9 g krysztalów antybiotyku A204 o mocy 1200—1400 jednostek mikrobiologicznych na 1 mg. Krysztaly identyfikuje sie przez analize magnetycznego re¬ zonansu jadrowego, widma w podczerwieni, chro¬ matografii cienkowarstwowej i chromatografii bi¬ bulowej jako antybiotyk A204 o temperaturze top¬ nienia 96—98°C.Przyklad II. Wytwarzanie antybiotyku A204.Antybiotyk A204 wytwarza sie, jak w przykla¬ dzie I, z tym, ze stosuje sie mieszanine o skladzie: 15 g glikozy, 15 g maczki sojowej, 5 g substancji stalej z wyciagu kukurydzianego, 5 g NaCl, 2. g CaC03 i woda do objetosci calkowitej 1 litra. Wy¬ tworzony produkt identyfikuje sie jako antybiotyk 5 A204 o temperaturze topnienia 96—98°C.Przyklad III. Antybiotyk A204 wytwarza s^ jak w przykladzie I, z tym, ze stosuje sie miesza¬ nine o skladzie: 20 g glikozy, 5 g (NHJjSC^, 8 g CaC03, 4 & KCl, 0,4 g KH5PO4, 5 g maczki sojo¬ wej i woda da calkowitej objetosci 1 litra. Wy¬ tworzony produkt identyfikuje sie jako A204 o tem¬ peraturze topnienia 96—98°C Przyklad IV. Antybiotyk A204 wytwarza sie, jak w przykladzie I, z tym, ze stosuje sie miesza¬ nine o skladzie: 10 g glukozy, 20 g melasy jadal¬ nej, 5 g peptonu, 2 g CaC03 i woda do calkowitej objetosci 1 litra. Wytworzony produkt identyfikuje sie jako A204 o temperaturze topnienia 96—98°C.Przyklad V. Wytwarzanie antybiotyku A204 na skale pólprzemyslowa.Antybiotyk A204 wytwarza sie^ metoda fermen¬ tacji w zanurzeniu na skale pólprzemyslowa jak nastepuje. 250 ml kolbe zawierajaca 50 ml pozyw¬ ki wegetatywnej o zawartosci 10 g/litr dekstrozy, 25 g/litr rozpuszczalnej skrobi, 15 g/litr ziaren so¬ jowych, 10 g/litr wyciagu namokowego kukurydzy i 2 g/litr CaC03 w wodzie biezacej, po ustaleniu wartosci pH na 6,5 za pomoca NaOH, zaszczepia sie 5% zawiesina wytworzona, jak opisano w przy¬ kladzie I, z kultury na skosach agarowych, zawie¬ rajacej 10 g glikozy, 10 g ekstraktu drozdzowego, 5 g NaCl, 0,01 g FeS04 • 7H20, 0,25 g MgS04 • 7H20 i 20 g trzykrotnie wyplukanego agaru Meera w 1 litrze odjonizowanej wody. Zaszczepiona pozyw¬ ka inkubuje sie w ciagu 48 godzin w temperatu¬ rze 30°C na wstrzasarce obrotowej o srednicy luku 5 cm i 250. obr./min. 16 ml wytworzonej kultury za¬ szczepia sie 1-litrowa kolbe zawierajaca 200 ml pozywki wegetatywnej, po czym pozywke te in¬ kubuje sie w ciagu 30 godzin w temperaturze okolo 30°C na wstrzasarce obrotowej o srednicy luku 5 cm i 250 obr./min. 200 ml wytworzonej kultury zaszczepia sie 40-litrowa kadz zawierajaca 25 li¬ trów sterylizowanego wodnego roztworu fermenta¬ cyjnego, zawierajacego 0,2 g/litr srodka przeciw pienieniu, 25 g/litr dekstrozy, 15 g/litr ziaren sojo¬ wych, 3 g/litr koncowej czarnej melasy, 1 g/litr kazeiny i 2,5 g/litr CaC03 w wodzie biezacej. Po zaszczepieniu prowadzi sie fermentacje w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 30 godzin, przy czym w ciagu calego okresu fermentacyjnego miesza sie z pred¬ koscia 420 obr./min. i napowietrza z predkoscia 0,4 cm3 powietrza na 1 cm3 mieszaniny fermenta¬ cyjnej na minute. Wytworzony produkt wyosabnia sie, jak w przykladzie I, po czym identyfikuje sie go jako antybiotyk A204 o temperaturze topnienia 96—98°C.Przyklad VI. Wytwarzanie soli antybiotyku A204 z brzeczki i z grzybni.Sól metalu alkalicznego, sól amonowa, i amino¬ wa antybiotyku A204 wytwarza sie z roztworu i grzybni, jak w przykladzie VII, przez ustalenie wartosci pH mieszaniny przefiltrowanego roztworu i wodnego koncentratu ekstraktu grzybniowego za pomoca odpowiedniego wodorotlenku metalu alka- 15 20 25 3G 35 40 45 50 55 6013 licznego, wodorotlenku amonowego lub wodorotlen¬ ku aminy, dwukrotne ekstrahowanie 0,5 objetosci octanu etylu, a nastepnie postepowanie, jak wy¬ zej.Kwas i jego sole równiez mozna krystalizowac z wielu ketonów, estrów, alkoholi i mieszanin ben- zenowo-weglowodorowych lub oczyszczac innymi znanymi metodami, takimi, jak chromatografia ko¬ lumnowa i tym podobne.Przyklad VII. Wytwarzanie soli sodowej an¬ tybiotyku A204.Do 100 mg wytworzonego w przykladzie I anty¬ biotyku A204, rozpuszczonego w 1 ml acetonu, do¬ daje sie 1 krople 5 n roztworu NaOH i 1 ml wody.Mieszanine te klaruje sie przez lekkie ogrzewanie, po czym pozostawia ja w temperaturze —15°C do momentu rozpoczecia krystalizacji. Nastepnie od¬ sacza sie krysztaly i po przekrystalizowaniu z wod¬ nego roztworu alkoholu otrzymuje sie 72 mg sodo¬ wej soli antybiotyku A204 o temperaturze topnie¬ nia 144—145°C.Przyklad VIII. Wytwarzanie soli potasowej antybiotyku A204.Potasowa sól A204 wytwarza sie postepujac, jak w przykladzie VII, z tym, ze krople 5 n roztworu NaOH zastepuje sie kropla 5 n roztworu KOH.Przyklad IX. Wytwarzanie soli srebrowej antybiotyku A204. 670 mg soli sodowej antybiotyku A204 rozpusz¬ cza sie w 40 ml metanolu, miesza z roztworem 270 mg azotanu srebra w 2 ml wody i pozostawia w ciemnosci w temperaturze pokojowej na okres 3 dni. Nastepnie odparowuje sie mieszanine do su¬ cha i plucze woda w celu usuniecia nadmiaru azo¬ tanu srebra. Pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml cieplego metanolu, filtruje na goraco przez lejek z filtrem ze spiekanego szkla i pozostawia w tem¬ peraturze 50°C na okres 16 godzin. Otrzymane duze, biale, prostopadloscienne krysztaly soli srebrowej antybiotyku A204 przekrystalizowuje sie z wodne¬ go roztworu acetonu, otrzymujac 450 mg srebrowej soli A204. Analiza rentgenograficzna wykazuje ge¬ stosc soli okolo 1099.Przyklad X. Oddzielanie antybiotyku A204 od A204II. 100 g mieszanej sodowo-potasowej soli antybio¬ tyku A204, wytworzonej w przykladzie VI, roz- m 14 puszcza sie w 500 ml mieszaniny benzenu z octa¬ nem etylu o stosunku 7 :3, po czym roztwór pod¬ daje sie chromatografii kolumnowej w klumnie zawierajacej 2000 g zelu krzemionkowego. Do eluo- 5 wania stosuje sie mieszanine benzenu z octanem etylu w stosunku 7 :3, a po eluowaniu dokonuje sie cienkowarstwowej chromatografii na zelu krzemion¬ kowym, z zastosowaniem octanu etylu jako roz¬ puszczalnika i kwasu siarkowego jako detektora. 10 Jako pierwszy eluuje sie A204. Po zebraniu okolo 32 litrów rozpuszczalnika, rozpuszczalnik zmienia sie na mieszanine benzenu z octanem etylu w sto¬ sunku 1 :1 i kontynuuje eluowanie do momentu znikniecia plamek na plytkach zelu krzemionkowe- 15 gO.Frakcje zawierajace duze stezenia A204II mie¬ sza sie, steza do sucha i krystalizuje z mieszaniny acetonu z woda. Otrzymane 3 g krysztalów chro- matografuje sie ponownie na kolumnie, zawieraja- 20 cej 21 g zelu krzemionkowego, w mieszaninie ben¬ zenu z octanem etylu w stosunku 7 :3 i ponownie eluuje metoda chromatografii cienkowarstwowej.Frakcje, zawierajace wylacznie A204II, miesza sie, odparowuje do sucha i krystalizuje z mieszaniny 25 acetonu z woda, otrzymujac 788 mg krystalicznego antybiotyku A204II o temperaturze topnienia 177— 179°C i aktywnosci odpowiadajacej 1550 jednostkom A204 na 1 ml. Frakcje zawierajace antybiotyk A204 przerabia sie w sposób opisany w przykla- 30 dzie I. PL PL