Pierwszenstwo: Zgloszenie ogloszono: 30.05.1973 Opis patentowy opublikowano: 30.05.1975 77983 KI, 421,3/01 MKP G01n 31/00 ^ZY IfcLWlA Ur-edu P-nW^*-0" Twórcawynalazku: Elzbieta Kocwa Uprawniony z patentu tymczasowego: Politechnika Krakowska, Kraków (Polska) Sposób ilosciowego oznaczania fenolu w wodzie Przedmiotem wynalazku jest sposób dyfuzyjnego przeprowadzania ilosciowego oznaczania fenolu w wodzie z zastosowaniem zelu agarowego, jako srodowiska reakcji oznaczania.Do oznaczania ilosciowego fenoli w wodzie stosuje sie dotychczas metode bromometryczna, jodometrycz- na i wagowa, róznego rodzaju metody kolorymetryczne, chromatograficzne i spektrofotometryczne.Metody bromometryczna, jodometryczna i wagowa wymagaja za\ysze destylacji badanych prób wody, a w metodach kolorymetrycznych mozna tylko wyjatkowo opuscic destylaqe. Destylacja jest czasochlonna i uciazliwa zwlaszcza, gdy laboratorium musi zbadac kilkanascie próbek dziennie.Metody kolorymetryczne pociagaja za soba zmudne przygotowywanie wzorców, a ponadto nie zawsze daja moznosc bardzo dokladnego odczytu wyników, poniewaz w pewnym stopniu badana woda rózni sie od nich.Metody chromatograficzne sluza raczej do rozdzielania fenoli z mieszaniny i do ich identyfikacji, gdy zas wykorzystuje sie je do celów ilosciowych, sa one skomplikowane i pracochlonne, dajac blad wyniku okolo kilku procent.Metody spektrofotometryczne wymagaja drogiej aparatury, próby wody musza byc w wiekszosci destylo¬ wane, wymagaja tez fachowej obslugi.Powszechnie zostalo stwierdzone, iz wyniki analizy tej samej próbki wody, uzyskane róznymi metodami, sa przewaznie malo zgodne lub tez niezgodne. Dlatego tez istnieje zasada podawania przy kazdej ekspertyzie metody jaka zastosowano.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu ilosciowego oznaczania fenolu w wodzie, taniego i prostego oraz szybkiego i dokladnego, w którym mozna by pominac destylacje i który nie bedzie wymagal stosowania drogiej aparatury ani wysokokwalifikowanej obslugi.Cecha charakterystyczna sposobu wedlug wynalazku jest to, ze osrodkiem reakcji jest ok. 1,5% zel aga* rowy, zwiazujacy mieszanie 1 :1 dwóch odczyników, 1% roztworu wodnego FeCl3 i 1% roztworu wodnego K3Fe/CN/6, a badany roztwór fenolu wprowadza sie w ilosci 0,25 ml do stalowych cylindrów tak, jak sie to stosuje w biologicznej metodzie oznaczania mocy antybiotyków; fenol z roztworu wodnego dyfunduje do zelu agarowego, dajac reakcje barwna w postaci okraglych, granatowych stref, których srednice mozna mierzyc2 77 983 i wyniki odczytac z uprzednio sporzadzonej krzywej wzorcowej lub z nomogramu.Przyklad I. W zaleznosci od ilosci próbek wody zawierajacych fenole, dostosowuje sie objetosc po¬ trzebnego roztworu agaru sproszkowanego.Gdy bada sie jedna próbke wody przygotowuje sie w erlenmajerce o pojemnosci okolo 50 ml, 1,5 ml agaru w roztworze, zawierajacego 0,45 g agaru sproszkowanego w 15 ml wody destylowanej. Po wsypaniu agaru do wody rozpuszcza sie go wstawiajac erlenmajerke do wrzacej lazni wodnej, przetrzymujac tam roztwór nadal aby nie zastygl.Oddzielnie przygotowuje sie w probówce 10 ml jednoprocentowego roztworu wodnego FeCl3, oraz w dru¬ giej probówce 10 ml jednoprocentowego roztworu wodnego K3Fe/CN/6. Probówki oznacza sie napisami: od¬ czynnik 1 i odczynnik 2. Nastepnie do trzeciej probówki odmierza sie pipeta po 7,5 ml odczynnika 1 i odczyn¬ nika 2 ( = 15 ml), szybko miesza sie dokladnie i calosc wlewa do erlenmajerki z roztworem agaru okolo 3%.W ten sposób uzyskuje sie pózniej zel agarowy okolo 1,5%.Po wymieszaniu precikiem szklanym tej mieszaniny i poruszajac erlenmajerka, odpipetowuje sie po 10 ml roztworu agaru z odczynnikami i wylewa na 2 plytki Petriego. Do pipetowania uzywa sie pipety 10 ml z od¬ cietym koncem, co znacznie przyspiesza wyplyw roztworu agaru i zapobiega jego krzepnieciu. Nastepnie ocze¬ kuje sie az roztwór agaru, z odczynnikami calkowicie zastygnie.Przed wylewaniem mieszaniny agaru z odczynnikami, plytki Petriego umieszcza sie na wypoziomowanym blacie stolu celem uzyskania warstwy agaru o równomiernej wysokosci.Przed osadzeniem cylinderków na powierzchni agaru przygotowuje sie podkladke z papieru z rysunkiem.Rysunek, zawiera kolo odpowiadajace powierzchni dna plytki Petriego, która dzieli sie na równe trzy czesci pod katem 120°. W srodku trzech promieni kola rysuje sie trzy kólka odpowiadajace srednicy cylinderków. Uzy¬ wajac takiej podkladki osadza sie trzy cylinderki na powierzchni zelu agarowego.Do cylinderków wkrapla sie po 0,25 ml badanej wody z fenolem, za pomoca pipetki 1-milimetrowej, lub strzykawki tuberkulinowej. Na dwóch plytkach przeprowadza sie w ten sposób szesc równoleglych oznaczen, z których wyciaga sie srednia z 6 wyników.Sam zel agarowy z odczynnikami jest przejrzysty, barwy zielonej. Fenol obecny w cylinderkach reaguje (droga dyfuzji do zelu agarowego) z odczynnikami w ten sposób, ze naokolo cylinderków powstaja regularne, okragle strefy, koloru granatowego.Odczytywanie wyników odbywa sie nastepujaco: przy kazdym cylinderku mierzy sie srednice powstalej strefy wraz z cylinderkiem, podajac wyniki w milimetrach, a uzywajac do tego celu cyrkla i papieru milimetro¬ wego. Stosuje sie tez oswietlenie dna plytki tak, jak przy biologicznej metodzie oznaczania antybiotyków.Podobnie tez jak w tej metodzie wyznacza sie krzywa wzorcowa lub opracowuje nomogram. Na podstawie wielkosci srednicy granatowych stref okresla sie stezenie fenolu w wodzie. Kazde laboratorium powinno sobie opracowac krzywa wzorcowa lub nomogram, dostosowane do swoich warunków oraz uzywanych plytek jakie zastosuja. Plytki bowiem sa róznej srednicy.W opisanym przypadku stosowano plytki o srednicy 10 cm oraz znane roztwory fenolu w wodzie. Czas odczytywania wyników waha sie w granicach 1 godziny do 12 godzin. W zaleznosci od stezenia fenolu w cylin¬ drach. Barwa stref jest mniej intensywna przy nizszych stezeniach fenolu niz przy wyzszyeh..Przy wyzszych stezeniach fenolu reakcja wystepuje szybciej i szybciej osiaga ostra granice stref.Przyklad U. Gdy zachodzi potrzeba zbadania wiekszej ilosci próbek wody, mozna sie ograniczyc do jednej plytki Petriego na jedna próbke wody, uzyskujac w podany wyzej sposób trzy równolegle oznaczenia, z których wyciaga sie srednia z trzech wyników.Badajac 20 próbek wody przygotowuje sie w duzej erlenmajerce 110 ml roztworu agaru sproszkowanego (3,3 g agaru) 110 ml wody destylowanej w lazni wodnej jak opisano poprzednio w przykladzie pierwszym.Odczynniki przygotowuje sie w odpowiednio wiekszej ilosci tak aby uzyskac 110 ml. Mieszanine odczynników w stosunku 1 :1 wlewa sie szybko do roztworu agaru. Nastepnie po wymieszaniu, odmierza sie za pomoca pipety z odcietym koncem po 10 ml i wlewa na dwadziescia plytek.Uwaga: lepiej jest przygotowac roztwór agaru z odczynnikami w nadmiarze, aby miec do dyspozycji plytki rezerwowe. Dalsze postepowanie jest takie samo jak w przykladzie pierwszym.Przyklad III. Celem uzyskania wiekszych stref i wiekszej róznicy w ich wielkosci mozna zasto¬ sowac dwie warstwy agaru, jak to stosuje sie w metodzie biologicznej oznaczenie antybiotyków z ta róznica, ze zamiast 21 ml podkladu agarowego oraz 4 ml górnej warstwy, stosuje sie 10 ml podkladu i 5 ml roztworu agaru z odczynnikami jako górna warstwe.Dolna warstwe zelu agarowego (podklad) przygotowuje sie stosujac roztwór agaru okolo 2% (2 g agaru na lOOml H20 dest.) Po jej zupelnym skrzepnieciu wWa sie górna warstwe zawierajaca, jak poprzednio opisano,77 983 3 mieszanine roztworu okolo 1,5% agaru wraz z odczynnikami. Dalsze postepowanie przebiega jak w przy¬ kladzie I.Sposób wedlug wynalazku zostal opracowany w oparciu o eksperymentalne stwierdzenie dyfuzji fenolu (roztworów wodnych) do zelu agarowego, w których reakcja przebiega równomiernie, w róznych kierunkach, tworzac z odczynnikami okragle, regularne i barwne strefy o ostro odgraniczonych od podloza brzegach. * Moze znalezc praktyczne zastosowanie do badania postepu rozkladu fenoli w poszczególnych etapach oczyszczalni biologicznej, okreslania sily aktywnosci nowo wyosobnionych szczepów drobnoustrojów rozklada¬ jacych fenole, laboratoryjnych badan na modelach doswiadczalnych, które wymagaja masowych oznaczen zawar¬ tosci fenolu (w komorach napowietrzania z osadem czynnym lub w zlozach biologicznych), ilosciowego oznacza¬ nia fenoli w wodach i sciekach fenolowych o niskiej ich zawartosci, ilosciowego oznaczania fenoli w sciekach o wysokich stezeniach po zastosowaniu rozcienczen, które sprzyjaja czulosci reakcji a równoczesnie pozwalaja niwelowac ewentualny wplyw innych niz fenole skladników chemicznych.Stosowanie sposobu wedlug wynalazku jest proste i tanie, nie wymaga destylacji, która jest konieczna przy wiekszosci stosowania dotychczasowych sposobów, na jednej plytce Petriego mozna przeprowadzic trzy równo¬ legle oznaczenia, z których otrzymuje sie srednia z trzech wyników. W ciagu jednego dnia mozna wykonac analizy kilkunastu do kilkudziesieciu próbek wody. Sposób jest czuly, która to czulosc polega na tym, ze niebieska strefa pojawia sie wyraznie przy zawartosci fenolu w próbce = 40 mgf. /I co w przeliczeniu na obje¬ tosc cylinderka wynosi 0,01 mg/0,25 ml.Mala objetosc próbki badanej wody fenolowej wynoszaca 0,25 ml w cylinderku, kwalifikuje sposób dyfu¬ zyjny do grupy mikrometod. PL