PL69578B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 30.XI.1973 69578 KI. 12o,17/03 MKP C07c 127/16 UKD Wspóltwórcy wynalazku: Eddie Herman Masey, Arthur Philips Raun.Richard Martin Kline Wlasciciel patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zjedno¬ czone Ameryki) Sposób wytwarzania addycyjnych zwiazków antybiotyków makrolidowych, zawierajacych grupe aldehydowa z mocznikiem Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia addycyjnych zwiazków pochodnych mocznika z makrolidowymi antybiotykami zawierajacymi grupe aldehydowa.Znane sa pewne antybiotyki makrolidowe, za¬ wierajace grupe aldehydowa, na przyklad tylo¬ zyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 3178 341) oraz szereg zwiazków z grupy leukomycyny (Tetrahedron Letters, 1967, str. 609), spiramycyny A, B, C i D (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 000 785 i nr 3 105 794), karbomycyna (opis patentowy Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 2 796 379) i karbomycyna B (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 785104). Antybiotyki te zawieraja równiez i inne grupy zdolne dó reakcji, na przyklad tylo- zyna zawiera oprócz grupy aldehydowej takze grupe ketonowa, grupe laktonowa, grupy aminowe, eterowe i wodorotlenowe oraz wiazania glikozy- dowe i nienasycone wiazania podwójne. Ze wzgle¬ du na tak znaczna ilosc zdolnych do reakcji grup, te antybiotyki makrolidowe nie sa trwale, co ogra¬ nicza mozliwosc ich stosowania w lecznictwie.W szczególnosci antybiotyki te ulegaja reakcjom kwasnej hydrolizy oraz rozkladowi w atmosferze utleniajacej. Zabezpieczanie grup podatnych do reakcji w róznych antybiotykach makrolidowych bylo ostatnio przedmiotem wielu badan.Stwierdzono, ze podawanie droga doustna anty¬ biotyku zwierzetom przezuwajacym jest o tyle % niekorzystne, ze flora bakteryjna zwacza moze zmieniac nature czasteczki antybiotyku. Na przy¬ klad stwierdzono, ze organizmy przezuwaczy sa zdolne do redukcji grupy aldehydowej obecnej 5 w wielu makrolidach do pierwszorzedowej grupy alkoholowej. W przypadku tylozyny produkt takiej przemiany jest znany jako tylozyna D (równiez AM-684, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 321368). Tylozyna D jest duzo mniej !0 aktywna antybiotycznie niz tylozyna i posiada nie¬ co inne dzialanie antybiotyczne. Zabezpieczenie grupy aldehydowej przed przemiana spowodowana przez mikroorganizmy zwacza podczas leczenia przezuwaczy makrolidami, takimi, jak tylozyna, 15 mogloby w duzym stopniu zwiekszyc skutecznosc dzialania tych antybiotyków.Stwierdzono równiez, ze doustnemu podawaniu antybiotyków, takich jak makrolidy i tetracykliny, zwierzetom przezuwajacym w celach leczniczych, 20 lub dla polepszenia wykorzystania paszy, badz zwiekszenia przyrostu ciezaru ciala, towarzyszy zwykle szereg niepozadanych efektów ubocznych.Antybiotyki te, podawane w ilosciach potrzebnych do powyzszych celów, szkodliwie wplywaja na flo- 25 re bakteryjna zwacza. W konsekwencji mechanizm trawienia przezuwacza jest zaklócony i zwierzeta zwykle traca apetyt, ewentualnie atakowane sa przez biegunke itp. Na przyklad, Bell i wspólpra¬ cownicy (J. Anim. Sci., 9, 647 (1950); Proc. Soc. 30 Exptl. Biol. and Med., 76, 284 (1951)) stwierdzili, 69 578i *f , 3 ze podawanie chlorotetracykliny obnizylo zdolnosc trawienia surowych wlókien jak i suchej substancji u krów.Rola zwacza w procesie trawienia wlókien, skla¬ dajacych sie prawie calkowicie z dietetycznej ce¬ lulozy, jest bardzo istotna, a pogorszenie procesu trawienia celulozy zmniejsza szybkosc wzrostu zwierzat, produkcje mleka itp. Podobne wyniki otrzymal Luther ze wspólpracownikami („European Symposium on Antibiotics and New Crowth Fac- tors in Animal Nutrition", Rzym 10—12 maj, 1955) dla nastepujacych antybiotyków: polimiksyny B, chloramfenikolu, bacitracyny, dwuwodorostrepto- mycyny, oksytetracykliny, penicyliny G i karbo- mycyny.Wreszcie, w wyniku pewnych testów in vitro, Hungate i wspólpracownicy (J. Anim. Sci., 14, 997 (1955)) stwierdzili, ze obecnosc duzej ilosci chkn- rotetracykliny zmniejsza ilosc produktów calkowi¬ tej fermentacji typowej flory bakteryjnej zwacza.Ponadto stwierdzono, ze czesto, w poczatkowych etapach doustnego podawania antybiotyków do¬ roslym przezuwaczom, wystepuje okres braku lak¬ nienia i ewentualnie biegunka. Te niepozadane efekty uboczne wystepuja równiez przy podawaniu przezuwaczom makrolidów, a wsród nich i tylo¬ zyny.Z powyzszych rozwazan widac wyraznie, ze bar¬ dzo pozadane byloby opracowanie ulepszonego spo¬ sobu doustnego podawania antybiotyków zwierze¬ tom przezuwajacym.Stwierdzono, ze addycyjne zwiazki antybiotyk- -mocznik, zawierajace 2 czasteczki mocznika na 1 czasteczke makrolidu zawierajacego grupe alde¬ hydowa, umozliwiaja doustne podawanie antybio¬ tyków przezuwaczom.Sposobem wedlug wynalazku, addycyjne zwiazki makrolidów z pochodnymi mocznika o ogólnym wzorze 1, w którym Am oznacza grupe o wzorze -NHR, w którym R oznacza rodnik fenylowy, toli- lowy, np. o-tolilowy, m-tolilowy lub p-tolilowy, rodnik chlorowcofenylowy, np. o-chlorofenylowy, m-bromofenylowy, p-fluorofenylowy itp. lub rod¬ nik trójfluorometylofenylowy, albo Am oznacza grupe o wzorze 2, w którym R i R" sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru, rodnik alki¬ lowy o 1—4 atomach wegla lub rodnik alkenyIo¬ wy o 3—4 atomach wegla, taki jak rodnik mety¬ lowy, etylowy, allilowy, n-propylowy, izopropylo¬ wy, n-butylowy itp., przy czym suma atomów we¬ gla rodników R' i R" wynosi najwyzej 4, wytwa¬ rza sie przez nasycanie pochodna mocznika wod¬ nego lub alkoholowego roztworu zawierajacego makrolid, korzystnie w postaci soli. Otrzymany gesty syrop pozostawia sie w temperaturze otocze¬ nia do czasu, gdy przeprowadzona analiza, zwlasz¬ cza na drodze chromatografii cienkowarstwowej, wykaze, ze praktycznie wszystek antybiotyk utwo¬ rzyl addukt mocznikowy zawierajacy co najmniej 2 mole mocznika na 1 mol antybiotyku. Wówczas wyosabnia sie produkt przez rozcienczenie miesza¬ niny reakcyjnej 1—2 objetosciami wody, doprowa¬ dzenie wartosci pH wodnej mieszaniny do okolo 9,0 i nasycenie mieszaniny chlorkiem Sodowym.Wytracony osad odsacza sie lub oddziela innym 19 578 4 znanym sposobem i oczyszcza przez rozpuszczenie w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w chlo^ roformie, przemycie warstwy organicznej woda, oddzielenie warstwy organicznej i usuniecie roz- 5 puszczalników pod zmniejszonym cisnieniem. Bez¬ postaciowa pozostalosc ewentualnie przekrystali- zowuje sie z bezwodnego rozpuszczalnika organicz¬ nego, otrzymujac produkt w postaci krystalicznej.Jako zwiazki o wzorze 1, korzystnie stosuje sie 10 np. N-metylomocznik, N,N-dwuetylomocznik, N-n- -butylomocznik, N-allilomocznik, N-krotylomocz- nik, N-metylo-N-allilomocznik, N-fenylomocznik, N-(p-chlorofenylojnmocznik, N-(o-tólilo) ^mocznik, N-(p-trójfluorometylofenylo)-mocznik itp. Jako maikrolidy zawierajace grupe aldehydowa stosuje sie np. tylozyne, imakrocyne, desmyikozyne, lakte- nocyne, katfbomycyne, karbomycyne B, middamy- cyne (magnomycyna B pozbawiona grupy acety- lowej), spiramycyne A, B, C i D oraz zwiazki z grup leukomycyn, np. leukomycyny Ai_8.Nalezy nadmienic, ze chociaz w opisie stosuje sie pojecie „zwiazki addycyjne", to jednak produk¬ ty wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa okreslonymi zwiazkami, powstajacymi w wyniku reakcji pomiedzy grupa aldehydowa antybiotyku i dwiema czasteczkami mocznika, co mozna stwier¬ dzic na podstawie braku sygnalu charakterystycz¬ nego dla grupy aldehydowej w widmie magnetycz¬ nego rezonansu jadrowego produktu addycji. 30 Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku stanowia produkty posrednie do otrzymywania pochodnych róznych makrolidów, wyzej wymienio¬ nych. Na przyklad, przez reakcje aldehydowej gru¬ py tylozyny z mocznikiem otrzymuje sie addukt 35 odporny na dzialanie alkalii, dzieki czemu w pro¬ dukcie tym mozna grupe ketonowa tylozyny redu¬ kowac za pomoca borowodorku sodowego. Po kwasnej hydrolizie z czasteczek mocznika otrzy¬ muje sie nowa dwuwodorodesmykozyne lub nowa dwuwodorotylozyne, zaleznie od wartosci pH i czasu trwania kwasnej hydrolizy. Oczywiscie re¬ dukcji takiej nie mozna przeprowadzac bez zabez¬ pieczenia aldehydowej grupy tylozyny i desmyko- zyny, gdyz uleglyby one redukcji jeszcze przed MB uwodornieniem grupy ketonowej. 45 Dwuwodorotylozyna ze zredukowana grupa ke¬ tonowa i dwuwodorodesmykozyna, równiez ze zredukowana grupa ketonowa, wytworzone w spo¬ sób wyzej opisany, maja dzialanie antybiotyczne 50 podobne do antybiotycznego dzialania tylozyny i desmykozyny. Badania przeprowadzone z tymi zwiazkami wykazuja, ze zwiazki te hamuja np. roz¬ wój takich organizmów, jak S.aureus, Sarcina lu- tea i B.subtilis, totez zwiazki te mozna stosowac 55 np. do dezynfekcji urzadzen i pomieszczen szpi¬ talnych, laboratoryjnych itp.Zwiazki addycyjne antybiotyk-mocznik otrzymy¬ wane sposobem wedlug wynalazku umozliwiaja doustne podawanie antybiotyków przezuwaczom. 60 Antybiotyk podaje sie w postaci pochodnej, odpor¬ nej zasadniczo na rozklad chemiczny w zwaczu i nieaktywnej antybiotycznie. Po przejsciu anty¬ biotyku do trawienca przemienia sie on w sub¬ stancje czynna antybiotycznie, w wyniku czego 65 antybiotyk jest zdolny do dzialania leczniczego6$578 i stymulujacego wzrost bez naruszenia mikroflory zwacza.Korzysci plynace z wynalazku wykazano na przykladzie zastosowania zwiazku addycyjnego mocznika z makrolidem (addukt tylozyna-mocz- nik), w leczeniu przezuwaczy zainfekowanych bak¬ teriami gram-dodatnimi, chorobami CRD itp. lub do zwiekszenia przyrostu wagi i/lub lepszego wy¬ korzystania paszy. Te addukty mocznikowe ma- krolidów sa wlasciwie nieaktywne antybiotycznie oraz nie wplywaja na wzrost i metabolizm waznej mikroflory 'zwacza. W dodatku sa one trwale i od¬ porne na hydrolize w srodowisku obojetnym wy¬ stepujacym w zwaczu. Addukty te staja sie nie¬ trwale chemicznie po przejsciu do kwasnego tra¬ wienia, przy wartosci pH tam panujacej i ulegaja gwaltownej hydrolizie, dajac wyjsciowy antybio¬ tyk, lub w pewnych przypadkach, mieszanine wyj¬ sciowego antybiotyku i aktywnego antybiotycznie produktu rozkladu tego antybiotyku. Tak wiec ad¬ dukt otrzymany sposobem wedlug wynalazku umozliwia doustne podawanie antybiotyków prze¬ zuwaczom w sposób podobny do podawania do¬ ustnego antybiotyków zwierzetom nieprzezuwaja- cym, w przypadku których aktywny antybiotyk przechodzi natychmiast do zoladka, gdzie znajduje sie srodowisko kwasne, z którego moze byc absor¬ bowany w postaci pierwotnej lub jako produkt kwasnej degradacji.Produkty wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku umozliwiaja podawanie antybiotyków przezuwa¬ czom droga doustna nie naruszajac mikroflory zwa¬ cza, a wiec bez wywolywania rozstroju jelit, braku laknienia i biegunki, powodowanych prawdopodo¬ bnie zachwianiem bilansu mikroflory w zwaczu i wystepujacych przy podawaniu znanych antybio¬ tyków. Stosujac zwiazki wytwarzane sposobem we¬ dlug wynalazku, mozna osiagnac calkowity efekt leczniczy, ewentualnie powodowac zwiekszenie wzrostu lub w lepsze wykorzystanie paszy bez nie¬ pozadanych efektów ubocznych wystepujacych przy stosowaniu produktów wytwarzanych znanymi spo¬ sobami. Jesli na przyklad addukt tylozyno-moczni- kowy podaje sie krowom w ilosci 250 mg/krowe/ /dzien, wówczas poczatkowo wystepuje niewielkie zmniejszenie apetytu, takie, jak wystepuje przy po¬ dawaniu samej tylozyny, natomiast nie stwierdzono znacznego wplywu ani na trawienie celulozy, ani na wykorzystanie azotu nie pochodzacego z protein.Ponadto nie wystepuje biegunka ani utrata apetytu.Adduktem mocznikowo-tylozynowym, bedacym przykladem zastosowania korzystnego antybiotyku, karmiono krowy, owce i kozy w ilosci 1 do 1000 mg/zwierze/dzien, w zaleznosci od tego, czy chciano uzyskac szybki efekt leczniczy, czy tez antybiotyk podawano w celu zwiekszenia przyrostu ciezaru i poprawienia ogólnego stanu zdrowia, polepszenia wykorzystania paszy, w ramach ogólnego programu zywienia.Podawanie adduktu mocznifeowo-tylózynowego w powyzszych ilosciach zwierzetom przezuwaja* cyim doprowadzilo do spodziewanych, dobrych re¬ zultatów bez zadnych efektów ubocznych, wyste¬ pujacych zwyMe przy podawaniu samej tylozyny.Addukt tylozyno-mocznikowy, inne addukty ma- krolidomocznikowe lub inne pochodne antybioty- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ków trwale w srodowisku alkalicznym, podaje sie zwierzetom w mieszaninie z pozywieniem. Mozna je równiez pokrywac zelatyna lub podobnym materia¬ lem i dopiero potem mieszac z pozywieniem. Po¬ nadto mozna je podawac w postaci duzych pigulek, jak to zwykle w celach leczniczych podaje sie anty¬ biotyki takim zwierzetom, jak bydlo. iDane zamieszczone w tablicy 1 wskazuja na brak wplywu adduktu tylozyno-mocznikowego stanowia¬ cego typowa, trwala w srodowisku alkalicznym, nieczynna antybiotycznie forme antybiotyku, na or¬ ganizmy trawiace celuloze w zwaczu. Przygotowano zaszczep zwacza z plynu zwacza pobranego przez przetoke wolu, któremu podawano duza ilosc paszy objetosciowej. Zawartosc zwacza przepuszczono przez 4 warstwy gazy, a pozostalosc na gazie zniie* szano z równa objetoscia buforu fosforanowo-we^ glanowego w temperaturze 37X! i ponownie prze¬ saczono przez gaze. Otrzymana ciecz odstawiono na 30 minut, w którym to Czasie na dno opadly pier¬ wotniaki, a male ilosci substancji uniosly sie w kie^ runku powierzchni.Oddzielono pierwotniaki oraz faze ciekla i uzyto jako zaszczep zwacza. Przed uzyciem zaszczep roz¬ cienczono równa objetoscia buforu fosforanowo- -weglanowego, nasyconego poprzednio dwutlen¬ kiem wegla, posiadajacego nastepujacy sklad: Skladnik NaH2P04 KH2P04 NaHCO, KC1 NaCl MgS04 CuClg FeSQ4 MnS04 ZnS04 CuS04 CuClj g/litr 0,316 0,152 2,260 0,375 0,375 0,112 0,038 0,008 0,004 0,004 0,002 0,001 Do rozcienczonego szczepu dodawano celuloze w ilosci 5 g/litr i mocznik w ilosci 1 g/litr. Mieszanine inkubowano w atmosferze dwutlenku Wegla w cia¬ gu 30 minut. 25 ml cieczy przeniesiono nastepnie do malych butelek inkubacyjnych, Wyposazonych w jednodirozne zawory do gazu, w celu umozliwienia wyplywu nadmiaru gazu i utrzymania warunków anaerobowych. Do butelki tej dodawano rózne an¬ tybiotyki w róznych ilosciach i inkubowano w cia¬ gu 24 godzin. Pod koniec inkubacji notowano war¬ tosc pH. Do kazdej butelki dodano 5 ml 20M kwasu metafosforowego i zawartosc butelki zamrazano, a nastepnie odmrazano i wirowano. Pobrano próbke cieczy znad osadu w celu oznaczenia krótkolancu* chowych, lotnych kwasów tluszczowych metoda chromatografii gazowej. Pozostalosc z butelki zmie¬ szano z 20 ml 80% kwasu octowego oraz 2 ml kwa-* su azotowego i mieszanine ogrzewano w temperatu¬ rze 130X! w ciagu 30 minut w celu strawienia wszy¬ stkich produktów z wyjatkiem celulozy. Po okresie ogrzewania, do kazdej butelki dodano 20 ml alko¬ holu etylowego i nierozpuszczony osad, glównie ce¬ luloze, odwirowano.Do butelek dodawano tylozyne, chlórotetracjrkline66578 8 i oksytetracykline w takich ilosciach, aby stezenie wynosilo 1 ^g/nil. Addukt tylozyno-mocznikowy do¬ dano do butelki w takiej ilosci, aby stezenie tylo- zyny po hydrolizie wynosilo 1 ^g/ml. Jedna butelka stanowila próbke kontrolna.Wyniki doswiadczen podano w tablicy 1; w ko¬ lumnie 1 podano nazwe antybiotyku, w kolumnie 2 srednia zawartosc (w procentach) strawionej ce¬ lulozy po 3 inkubacjach.Tablica 1 Addukt tylozyno-mocznikowy Tylozyna Chlorotetracyklina Oksytetracyklina Próbka kontrolna 69,6 30,3 12,9 16,8 76,3 W tablicy 2 podano wyniki badan nad wplywem tych samych antybiotyków na ilosc wytwarzanych lotnych kwasów tluszczowych. W kolumnie 1 poda¬ no nazwe antybiotyku, a w kolumnie 2 podano srednia zawartosc lotnych kwasów tluszczowych w milimolach/ml.Tablica 2 Addukt tylozyno-mocznikowy Tylozyna Chlorotetracyklina Oksytetracyklina Próbka kontrolna 27,0 8,6 3,4 2,0 20,2 Z wyników wyzej opisanych doswiadczen widac, ze stosowanie adduktu tylozyno-mocznikowego wplywa bardzo malo lub wcale na ilosc strawionej celulozy oraz na ilosc wytwarzanych przez flore zwacza lotnych kwasów tluszczowych, podczas gdy inne antybiotyki, w tym równiez i sama tylozyna, wywieraja szkodliwy wplyw na czynnosci zwacza.W tablicy 3 zamieszczono dane dotyczace przy¬ rostu ciezaru po 28 dniach karmienia jednorocz¬ nych wolów przy duzej ilosci niestrawnego pokar¬ mu. W kolumnie 1 podano liczbe wolów nalezacych do danej grupy doswiadczalnej, w kolumnie 2 po¬ dano ilosc antybiotyku podawana dziennie jedne¬ mu wolu, w kolumnie 3 podano przyrost ciezaru (w kg) jednego wolu w ciagu 1 dnia, w kolumnie 4 podano ilosc paszy (w kg) podawanej jednemu wolu w ciagu 1 dnia, a w kolumnie 5 podano sto¬ sunek ilosci paszy do przyrostu ciezaru. 1 1 11 u 11 Tablica 1 2 nic tylozyna, 250 mg addukt tylozyno-moczni¬ kowy zawierajacy 250 mg aktywnej tylozyny 5 3 0,60 0,63 0,68 4 9,4 9,6 9,6 5 15,5 15,3 14,1 Jak widac z danych zamieszczonych w tablicy 3, ciezar wolów karmionych pasza z dodatkiem addu¬ ktu tylozyno-mocznikowego zwiekszal sie dziennie wiecej niz ciezar wolów karmionych pasza z rów¬ nowaznymi ilosciami tylozyny lub ciezar wolów z 10 15 20 30 35 40 45 50 55 60 65 grupy kontrolnej, jak równiez wzrastal stopien wy¬ korzystania paszy (stosunek ilosci paszy do przy¬ rostu ciezaru). Ponadto- u wolów karmionych ad¬ duktsm tylozyno-mocznikowym nie wystapily nie¬ pozadane, opisane powyzej efekty uboczne.Addukt tylozyno-mocznikowy mozna stosowac w lecznictwie zwierzat przezuwajacych cierpiacych na rózne choroby, do których zalicza sie: wrzody wat¬ roby spowodowane spherophorus necrophorus; sze- lestnice spowodowane Clostridium chauvcei; zatru¬ cie jelitowe spowodowane Clostridium perpringens; zlosliwy obrzek spowodowany Clostridium septi- cum; tezec spowodowany Clostridium tetani i zapa¬ lenie pluc spowodowane prawdopodobnie przez wi¬ rus, mykoplazme i bakterie.Dawki adduktu tylozyno-mocznikowego w ilosci do 250 mg/dzien/zwierze sa dawkami profilaktycz¬ nymi w stosunku do wyzej wymienionych mikro¬ organizmów, a ponadto zabezpieczaja przed zapa¬ leniem pluc. Wieksze dawki, do 2000 mg/zwierze/ /dzien, moga byc niezbedne w leczeniu chorób pa¬ tologicznych.Addukt tylozyno-mocznikowy mozna stosowac do likwidowania coccidia u owiec i bydla. Te coccidia sa pasozytami, zajmujacymi komórki nablonkowe jelit, w których poczatkowo ilosc ich zwieksza sie sposobem bezplciowym, a nastepnie ulegaja one re¬ produkcji plciowej w obrebie komórek zywiciela.Dawki do 2000 mg/zwierze/dzien moga byc takze niezbedne w przypadku koniecznosci calkowitej lik¬ widacji wszelkich organizmów i ich oslabiajacego wplywu na zwierzeta. Coccidia najbardziej choro¬ botwórcza dla bydla to Eimeria boris i E. zurnii, chociaz i E. cylindrica, E. mipsoidalis, E. bukidno- nensis, E. auburnensis i E. allabamensis moga byc równiez chorobotwórcze aczkolwiek w mniejszym stopniu. Dla owiec najbardziej chorobotwórczymi organizmami sa Eimeria ninakohlyakimovae, E. artoingi i E. ahsata, a w mniejszym stopniu — E, faurei, E. intracata i E. parva.W analogiczny sposób mozna przygotowac adduk- ty mocznikowe innych makrolidów zawierajacych grupe aldehydowa* takich jak magnamycyny, spira- mycyny A, makrocymy, desmyfcozyny, laktenocyny, karbomycyny, karbomycyny B, niddamycyny, in¬ nych przedstawicieli serii spiiramycyn i przedsta¬ wicieli serii leukomycyn. Addukty te mozna poda¬ wac doustnie zwierzetom przezuwajacym w celach leczniczych luib w celu zwiekszenia przyrostu cie¬ zaru i/lub zwiekszenia stopnia wykorzystania paszy w ramach standardowego programu karmienia prze¬ zuwaczy w ten sam sposób, jak w przypadku ad¬ duktu tylozyno-mocznikowego. Te inne addukty sa równiez zasadniczo trwale i nieaktywne antybio- tycznie w srodowisku zwacza, a po przejsciu do trawienia hydrolizuja do wyjsciowego antybiotyku.Tak samo, jak w przypadku adduktu tylozyno- -mocznikowego, podczas stosowania innych adduk- tów wystepuja tylko minimalne efekty uboczne.Zakres wielkosci dawek jest taki sam, jak w przy¬ padku adduktu tylozyno-mocznikowego.Ponadto mozna otrzymac inne, odporne na dziala¬ nie srodowiska alkalicznego, antybiotycznie nie¬ czynne pochodne róznych antybiotyków, których uzytecznosc w karmieniu bydla i innych przezuwa-9 czy zostala juz sprawdzona. Pochodnymi takimi moga byc, na przyklad zywice jonowymienne, nie¬ rozpuszczalne sole kwasne i zasadowe itp.Sposób wytwarzania mocznikowych adduktów niektórych makrolidów zilustrowano ponizszymi przykladami.Przyklad I. 100 g winianu tylozyny rozpusz¬ cza sie w roztworze zawierajacym 100 g mocznika w 100 ml wody. Otrzymana mieszanine przecho¬ wuje sie do momentu calkowitego zakonczenia two¬ rzenia sie adduktu, co sprawdza sie metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej. Do analizy metoda chromatografii cienkowarstwowej jako podloze sto¬ suje sie zel krzemionkowy i uklad rozpuszczalni¬ ków dwuetyloamina-octan etylu w stosunku 1 :9. W takim ukladzie addukt tylozyno-mocznikowy pozo¬ staje w miejscu wkroplenia, podczas gdy tylozyna wedruje tuz za czolem rozpuszczalnika. Addukt ty¬ lozyno-mocznikowy wyodrebnia sie z mieszaniny reakcyjnej dodajac do niej dwie objetosci wody, a nastepnie doprowadzajac wartosc pH roztworu do okolo 9 za pomoca 101% wodnego roztworu wodo¬ rotlenku sodowego. Do roztworu dodaje sie wresz¬ cie staly chlorek sodowy, az wytraci sie addukt tylozyno-mocznikowy w postaci zóltawego gumowa¬ tego osadu, który sie odsacza. Osad z filtru roz¬ puszcza sie w chloroformie. Roztwór chloroformowy przemywa sie woda i suszy. Chloroform usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostaly, jasno- zólty, bezpostaciowy addukt tylozyno-mocznikowy suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem tak dokla¬ dnie, jak to mozliwe. Wysuszony produkt rozpusz¬ cza sie w suchym acetonie w ilosci 5 ml acetonu/g produktu, a otrzymany roztwór oziebia sie. Addukt tylozyno-mocznikowy krystalizuje w postaci bialych igiel, które sie odsacza. Otrzymany produkt ma temperature topnienia równa 220—222°C.Dla wzoru C^H^NsOjs Obliczono: C 56,22 H 8,39 N 6,96 znaleziono: C 56,05 H 8,32 N 6,72 Widmo jadrowego rezonansu magnetycznego ad¬ duktu nie wykazalo protonu charakterystycznego dla grupy aldehydowej. Addukt jest mikrobiologicz¬ nie nieaktywny w stosunku do organizmów, które zwykle stosuje sie przy ocenie aktywnosci tylozyny.Z adduktu tylozyno-mocznikowego mozna otrzy¬ mac tylozyne droga rozpuszczenia adduktu w wod¬ nym roztworze o wartosci pH 4—7, utrzymywanej za pomoca standardowych roztworów buforowych.W wyniku kwasnej hydrolizy tylozyny otrzymuje sie równoczesnie pewne ilosci desmykozyny. Po¬ stepujac zasadniczo w sposób opisany powyzej lecz zastepujac mocznik N-metylo-mocznikiem otrzymu¬ je sie addukt tylozyny i N-metylo-mocznika.W sposobie opisanym w przykladzie I zamiast mocznika lub N-metylomocznika mozna równiez stosowac inne pochodne mocznikowe o ogólnym wzorze 1. Do pochodnych mocznika, które tworza addukty z makrolidami, zalicza sie allilomocznik, N,N-dwuetylomocznik, etylomocznik i N-metylo- -N-n-propylomocznik. Wszystkie te pochodne mocz¬ nika sa rozpuszczalne w wodzie i mozna je stoso¬ wac do otrzymywania adduktów w sposób opisany powyzej bez zadnych modyfikacji. W przypadku zastosowania innych pochodnych mocznikowych, »578 la takich jak N-(m^tolilo)^moczniik, N-fenylomocznik, N-(IH rzed.^buty11o)Hmocznik i N-(p-trójfiluorome- tylofenylo)Hmocznik zamiast roztworów wodnych stosuje sie alkoholowe roztwory pochodnej mocz- 5 hika i soli tylozyny.Przyklad II. 2 g magnamycyny rozpuszcza sie w 5 ml nasyconego, wodnego roztworu moczni¬ ka, którego wartosc pH utrzymuje sie w granicach 5;0—5,5 dodajac w razie potrzeby 10°/ 10 twór kwasu solnego. Po 12 dniach przechowywania w temperaturze pokojowej roztwór rozciencza sie 4 objetosciami wody. Wodny roatwór ekstrahuje sie 40 ml porcjami chloroformu przy wartosci pH: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 i 7,0. Wartosc pH roztworu Ustala sie 15 przed kazda kolejna ekstrakcja za pomoca 10*/o wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Addukt mocznikowy znajduje sie we wszystkich kolejnych ekstraktach, ale jedynie ekstrakt o wartosci pH 6,5 i 7 jest wlasciwie wolny od magnamycyny. Te dwa 20 ostatnie ekstrakty zbiera sie razem, a addukt ma- gnamycyno-mocznikowy wyodrejbnia i oczyszcza w sposób opisany w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,5 g bialego produktu stalego, posiadajacego typowe dla magnamycyny widmo w nadfiolecie, (e mam,^ = 25 = 13,00). Widmo magnetycznego rezonansu jadro¬ wego nie wykazuje obecnosci grupy aldehydowej.Ocena biologiczna adduktu wykazuje, ze jest on nieaktywny w stosunku do organizmów stosowa¬ nych w standardowych badaniach magnamycyny.Z adduktu magnamycyno-mocznikowego odzysku¬ je sie magnamycyne droga ogrzewania w autokla¬ wie w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut przy wartosci pH 5. 35 Przyklad III. 2g spiramycyny A rozpuszcza sie w 50 ml nasyconego, wodnego roztworu mocz¬ nika, którego wartosc pH utrzymuje sie w grani¬ cach 4,5—5,0 dodajac w razie potrzeby 10 wodny roztwór kwasu solnego. Po 12 dniach przechowy- 40 wania w temperaturze pokojowej roztwór rozcien¬ cza sie 4 objetosciami wody i poddaje kilkustop¬ niowej ekstrakcji przy róznej wartosci pH w spo¬ sób opisany w przykladzie II, z tym, ze wartosc pH roztworów wynosi kolejno 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 45 8,0; 8,5 i 9,0. Z polaczonych ekstraktów uzyskanych z roztworów o wartosci pH = 8,0; 8,5 i 9,0 uzysku¬ je sie 1,0 g bialego, stalego adduktu spiramycyno- nmocznikowego. Widmo tego adduSkltu w nadfiole¬ cie jesit wlasciwie takie samo, jak dla nieprzerea- 50 gowanej spiramycyny A (s ^^ =23,00). Widmo magnetyczne rezonansu jadrowego adduktu jest porównywalne z takim widmem dla spiramycyny A, przy czym brak jest sygnalów dla protonu z grupy aldehydowej. 55 Z adduktu spiramycyno-mocznikowego odzyskuje sie spiramycyne przez rozpuszczenie 20 mg adduktu w 1 ml etanolu, dodanie 4 ml roztworu buforowego o wartosci pH 5,5 i ogrzewanie w autoklawie w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut. 60 W opisany powyzej sposób mozna otrzymac ad¬ dukty mocznikowe innych makrolidów zawieraja¬ cych grupe aldehydowa, takich jak makrocyny, de¬ smykozyny, laktenocyny, karbomycyny, karbomycy- ny B, niddamycyny, zwiazki z serii spiramycyn 65 i serii leukomycyn.69 578 11 PL PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania addycyjnych zwiazków antybiotyków makrolidowych, zawierajacych grupe aldehydowa, z mocznikiem o ogólnym wzorze 1, w którym Am oznacza grupe o wzorze -NHR, w któ¬ rym R oznacza rodnik fenylowy, tolilowy, chloro- wcofenylowy lub trójfluorometylofenyIowy, albo Am oznacza grupe o wzorze 2, w którym R' i R" sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla lub rodnik alkenylowy o 3—4 atomach wegla, przy czym suma atomów wegla w rodnikach R' i R" wynosi najwy¬ zej 4, znamienny tym, ze wodny lub alkoholowy roztwór antybiotyku z grupy makrolidów nasyca sie mocznikiem o ogólnym wzorze 1, w którym Am ma wyzej podane znaczenie, w srodowisku obo- 12 10 15 jetnym lub alkalicznym w takich ilosciach, aby otrzymac addukt zawierajacy co najmniej 2 mole mocznika na 1 mol antybiotyku, po czym miesza¬ nine reakcyjna pozostawia sie w temperaturze po¬ kojowej do calkowitego zakonczenia reakcji i na¬ stepnie rozciencza woda, doprowadza wartosc pH mieszaniny do okolo 9, po czym wytracony produkt oddziela sie i oczyszcza w znany sposób,

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze antybiotyk z grupy makrolidów stosuje sie w po¬ staci soli.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ze jako antybiotyk z grupy makrolidów stasuje sie tylozyne, makrocyne, desmykozyne, laktenocyne, karbomycyne, karbomycyne B, middamycyne, spi- ramycyne A, B, C lub D albo leukomycyne Aj_8 H2N-C-Am 2 II 0 Wzórl ti N Nr Wzór 2 RSW Zakl. Graf. W-wa, zam, 918-73, nakl. 110+20 egz. Cena 10 zl PL PL