Opublikowano: 30.VI.1973 68232 KI. 12q,6/01 MKP CÓ7c 103/52 CZYTELNA Urzedu Palentowege Miro«»*r,,|i lUJ0';fc| Wspóltwórcy wynalazku: Gotfryd Kupryszewski, Feliks Muzalewski Wlasciciel patentu: Jeleniogórskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa" Przedsiebiorstwo Panstwowe, Jelenia Góra (Polska) Sposób otrzymywania pochodnych peptydów Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania po¬ chodnych peptydów o wzorze, jak ;na rysunku, gdzie R oznacza acyl, R' oznacza wodór lub acyl, R" oznacza wodór, alkil, aryl, lub benzyl, X ozna¬ cza alkoksyl, n oznacza 1,2,3... itd.Peptydy oraz ich pochodne znajduja coraz szer¬ sze zastosowanie w lecznictwie, gdyz caly szereg hormonów oraz antybiotyków nalezy do tej grupy zwiazków. Poza tym polaczenie aminokwasów lub peptydów z róznego typu lekami czesto polepsza wlasnosci terapeutyczne tych ostatnich.Jedna z czesciej stosowanych dróg syntezy pep¬ tydów polega na aminolizie „aktywnych" estrów fenylowych N-acylowanych aminokwasów lub pep¬ tydów, zawierajacych elelktronoakceptorowe pod¬ stawniki w ugrupowaniu fenoksylowym; stosuje sie przy tym takie estry, jak p-nitrofenylowe (Bo- danszky M., Nature, 175, 685 (1955), 2,4,6-trój- chlorofenylowe (Kupryszewski G., Kaczmarek M., Roczniki Chem., 35, 931 ft-961); ibid., 35, 595 (1961), 2,4,5-trójchlorofenylowe (Pless J., Boissonnas R. A., Helv. Chim. Acta, 46, 1609 (1963)), pieciochlorofe- nylowe (Kupryszewski G., Formela M., Roczniki Chem., 35, 1533 (1961); Zesz. Nauk. WSP Gdansk, 1, 99 (1961)), p-metylosulfonylofenylowe (Schwyzer R., Sieber P., Helv. Chini. Acta, 41, 2190 (1958) oraz p-sulfonamidofenylowe (Kupryszewski G., Muzalewski F., Zesz. Nauk. WSP Gdansk, 7, 159 (1967)). Wada wymienianych wyzej metod jest trudnosc w oczyszczeniu uzyskanych peptydów od 10 15 20 25 30 powstajacych w procesie aminolizy fenoli oraz nie¬ wielkich ilosci wyjsciowych estrów fenylowych.Sposobem wedlug wynalazku do otrzymywania pochodnych peptydów (wzór) na drodze aminolizy aktywnych estrów N-acylowanych aminokwasów zastosowano aktywne estry p-[acetyiosulfonamido] - fenylowe N-acylowanych aminokwasów. Aktywne estry p-[acetylosulfonamido]-fenylowe szczególnie nadaja sie do syntezy wiazania peptydowego ze wzgledu na zwiekszenie efektu elektrono-akcepto- rowego grupy sulfonamidowej przez podstawienie atomu wodoru w tej grupie reszta acetylowa. Po¬ nadto reszta ta zwieksza kwasowosc pozostalego wodoru grupy sulfonamidowej do tego stopnia, iz estry p-[acetylosulfonamido]-fenylowe podobnie, jak i wolny p-[acetylosulfonamido]-fenol tworza w roztworze weglanu sodowego latwo rozpuszczal¬ ne w wodzie sole sodowe. Ta bardzo cenna wlas¬ ciwosc ulatwia oddzielenie uzyskanych w procesie aminolizy estrów N-acylowanych peptydów od lat¬ wo rozpuszczalnych w wodzie soli sodowych p-[acetylosulfonamido]-fenolu i niewielkich ilosci wyjsciowyeh estrów p- [acetylosulfonamido] -fenylo¬ wych.Sposobem wedlug wynalazku aminolize aktyw¬ nych estrów p-[acetylosulfonamido]-fenylowych prowadzi sie w rozpuszczalniku organicznym, np. w octanie etylu, dioksanie lub tetrahydrofuranie, za pomoca alkilowych estrów aminokwasów lub alkilowych estrów peptydów. Reakcja aminolizy 68 23268 232 4 przebiega w temperaturze pokojowej z wydajno- sciami od 32 do 89%. Uzyskiwane w ten sposób estry N-acylowanych peptydów charakteryzuja sie wysokim stopniem czystosci. Synteze pochodnych peptydów wedlug wynalazku wyjasniaja przykla¬ dy IX — XVI.Zastosowane w procesie aminolizy estry p-[ace¬ tylosulfonamido]-fenylowe N-acylowanych amino¬ kwasów sa zwiazkami nowymi. Otrzymuje sie je metoda mieszanych bezwodników w ten sposób, iz na roztwór N-acylowanego aminokwasu i p-[ace¬ tylosulfonamido]-fenolu w aminie trzeciorzedowej, taiKiej, jak np. pirydyna, dziala sie chlorkiem kwa¬ sowym np. tlenochlorkiem fosforu, chlorkiem tio- nylu lub benzensoulfochlorkiem, albo roztworem chlorku kwasowego w rozpuszczalniku organicz¬ nym.Estry p-[acetylosulfonamido]-fenylowe N-acylo - wanych aminokwasów otrzymuje sie takze dzia¬ laniem dwucykloheksylokarbodwuimidu na rozt¬ wór N-acylowanego aminokwasu i p-[acetylosul- fonamido]-fenolu w rozpuszczalniku organicznym.Omawiane estry p-[acetylosulfonamido]-fenylowe mozna otrzymac równiez poprzez acetylowanie bezwodnikiem octowym lub innym czynnikiem acetylujacym w bezwodnej pirydynie odpowied¬ nich estrów p-sulfortamidofenylowych N-acylowa¬ nych aminokwasów.Aktywne estry p-[acetylosulfonamido]-fenylowe N-acylowanych aminokwasów otrzymuje sie wyzej wymienionymi metodami w postaci krystalicznej z duzymi wydajnosciami od 72 do 90%. Poszczegól¬ ne metody otrzymywania aktywnych estrów p-[ace¬ tylosulfonamido]-fenylowych wyjasnione sa za po¬ moca przykladów I — VIII. W przykladach tem¬ peratury podano w stopniach Celsjusza.Przyklad I. 20,5 g (0,1 mola) N-ftaliloglicyny i 21,5 g (0,1 mola) p- [acetylosulfonamido] -fenolu rozpuszcza sie w 250 cms bezwodnej pirydyny. Do chlodzonego w temperaturze 0°C roztworu wkra- pla sie w ciagu 1 godziny roztwór 15,3 g (0,1 mo¬ la) tlenochlorku fosforu w 30 cm3 chlorku me¬ tylenu. Mieszanine reagujaca pozostawia sie na 1 godzine w temperaturze pokojowej, po czym wy¬ lewa do 3000 cma wody z lodem i pozostawia do nastepnego dnia. Wytracony krystaliczny osad od¬ sacza sie, przemywa woda do zaniku zapachu pi¬ rydyny i suszy. Otrzymuje sie 36 g (90% wydaj¬ nosci) estru p*[acetylosulfonamido]-fenylowego N-ftaliloglicyny, który £o krystalizacji z octanu etylu wykazuje temperature topnienia 183 — 184°C.Analiza: dla wzoru C18H1407N2S — obliczono: 6,96% N; otrzymano: 7,04% N.Przyklad II. 20,9 g (0,1 mola) N^karboben- zoksyglicyny i 21,5 g (0,1 mola) p-[acetylosulfo- namido]-fenolu rozpuszcza sie w 220 cm3 bezwod- nej pirydyny. Do chlodzonego w temperaturze 0°C roztworu wkrapla sie w ciagu 1 godziny 17,7 g (0,1 mola) benzenosulfochlorku, a nastepnie mie¬ szanine reagujaca pozostawia na dalsza godzine w temperaturze pokojowej, po czym wylewa do 3000 om8 wody z lodem. Nastepnego dnia odsacza sie krystaliczny osad, przemywa woda i suszy.Otrzymuje sie 34 g (84% wydajnosci) estru p-[ace- tylosulfonamido] -fenylowego N-karbobenzoksygli- cyny, który po krystalizacji z mieszaniny octan etylu — eter naftowy wykazuje temperature top¬ nienia 176 — 178°C. Analiza: dla wzoru C18H1807N2S — obliczono: 6,90% N; otrzymano: 6,94% N.Przyklad III. 26,1 g (0,1 mola) N-ftalilo-DL- 5 leucyny i 21,5 g (0,1 mola) p-[acetylosulfonamid o] - fenolu rozpuszcza sie w 160 cm3 bezwodnej piry¬ dyny. Do chlodzonego w temperaturze 0°C roztwo¬ ru wkrapla sie w ciagu 1 godziny roztwór 15,3 g (0,1 mola) tlenochlorku fosforu w 30 cm8 chlorku io metylenu, pozostawia mieszanine reagujaca na dal¬ sza godzine w temperaturze pokojowej, po czym wylewa do 3000 cm3 wody z lodem. Nastepnego dnia odsacza sie krystaliczny osad, przemywa woda i suszy. Uzyskuje sie 38 g (83% wydajnosci) estru 15 p-[acetylosulfonamido]-fenylowego N-ftalilo-DL- leucyny, który po krystalizacji z mieszaniny octa¬ nu etylu i eteru naftowego wykazuje temperature topnienia 176 — 177°C. Analiza dla wzoru: C22H2207N2S — obliczono: 6,12% N: otrzymano: 20 5,85% N.Przyklad IV. 26,5 g (0,1 mola) N-karboben- zoksy-DL-leucyny i 21,5 g (0,1 mola) p-[acetylosul- fonamido] -fenolu rozpuszcza sie w 220 cm3 bez¬ wodnej pirydyny. Do chlodzonego w temperaturze 25 0°C roztworu wkrapla sie w ciagu 1 godziny 17,7 g (0,1 mola) benzenosulfochlorku, pozostawia mie¬ szanine reagujaca na dalsza godzine w temperatu¬ rze pokojowej, po czym wylewa do 3000 cm3 wo¬ dy z lodem. Nastepnego dnia odsacza sie krysta- 30 liczny osad, przemywa woda i suszy. Otrzymuje sie 37 g (80% wydajnosci) estru p-[acetylosulfona¬ mido]-fenylowego N-karbobenzoksy-DL-leucyny, który po krystalizacji z octanu etylu wykazuje tem¬ perature topnienia 145 — 146°C. Analiza: dla wzo- 35 ru C22H2607N2S — obliczono: 6,05% N; otrzymano: 6,30% N.Przyklad V. 26,5 g (0,1 mola) N^karbobenzo- ksy-L-leucyny i 21,5 g (0,1 mola) p-[acetylosulfo- namido]-fenolu rozpuszcza sie w 200 cm3 bezwod- 40 nej pirydyny. Do chlodzonego w temperaturze 0°C roztworu wkrapla sie w ciagu 1 godziny roztwór 15,3 g (0,1 mola) tlenochlorku fosforu w 30 cm3 chlorku metylenu, pozostawia mieszanine reagujaca na dalsza godzine w temperaturze pokojowej, po 45 czym wylewa do 3000 cm8 wody z lodem. Nastep¬ nego dnia odsacza sie krystaliczny osad, przemy¬ wa woda i suszy. Uzyskuje sie 33 g (72% wydaj¬ nosci) estru p-[acetylosulfonamido]-fenylowego N- karbobenzoksy-L-leucyny, który po {krystalizacji z 50 octanu etylu wykazuje temperature topnienia 145,5 — 146°C oraz skrecalnosc wlasciwa [a] ^ = —21° (c=2, octan etylu). Analiza: dla wzoru C22H20O7N2S — obliczono: 6,05% N; otrzymano: 5,94% N.Przyklad VI. Do roztworu 36 g (0,1 mola) 55 estru p-sulfonamidofenylowego N-ftaliloglicyny w 180 cm3 bezwodnej pirydyny wkrapla sie 20,4 g (0,2 mdla) bezwodnika octowego. Nastepnie ogrze¬ wa sie mieszanine w temperaturze 70 — 80°C w ciagu 3 godzin, po czym chlodzi ja, odsacza osad 60 i przemywa go woda. Otrzymuje sie 29 g (72% t wydajnosci) estru p-[acetylosulfonamido]-fenylowe¬ go N-ftaliloglicyny, który po krystalizacji z octanu etylu wykazuje temperature topnienia 183 — 184°C.Przyklad VII. Do roztworu 42 g (0,1 mola) 65 estru p-sulfonamidofenylowego N-karbobenzoksy-68 232 DL-leucyny w 200 cm3 bezwodnej pirydyny wkrap- la sie 20,4 g (0,2 mola) bezwodnika octowego. Na¬ stepnie ogrzewa sie mieszanine w temperaturze 65 — 85°C w ciagu 3 godzin, po czym chlodzi ja, od¬ sacza osad i przemywa go woda. Uzyskuje sie 35 g (75% wydajnosci) estru p-[acetylosulfonamido]-fe¬ nolowego N-karbobenzoksy-DL-leucyny, który po krystalizacji z ostan u etylu wykazuje temperature topnienia 145 — 146°C.Przyklad VIII. Do roztworu 20,9 g (0,1 mola) N-karbobenzoksyglicyny i 21,5 g (0,1 mola) p-[ace- tylosulfonamido]-fenolu w 200 cm3 bezwodnej piry¬ dyny dodaje sie 19,4 g (0,1 mola) dwucykloheksy- lokarbodwuimidu. Po uplywie 6 godzin odsacza sie wydzielony dwucykloheksylomocznik, a przesacz zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc po destylacji wylewa sie do 3000 cm3 wody, odsacza wydzielony osad, przemywa go woda i suszy. Otrzy¬ muje sie 30 g (74% wydajnosci) estru p-[acetylo- sulfonamido]-fenylowego N-ikarbobenzoksyglicyny, który po krystalizacji z octanu etylu wykazuje temperature topnienia 176 — 178°C.Przyklad IX. 40, 2 g (0,1 mola) estru p-[acety- losulfonamido]-fenylowego N-ftaliloglicyny i 9,8 g (0,1,1 mola) swiezo przygotowanego estru metylo¬ wego glicyny rozpuszcza sie w 250 cm3 dioksanu, zawierajacego dodatkowo 6 cm3 kwasu octowego i roztwór pozostawia w temperaturze pokojowej.Po uplywie 24 godzin odsacza sie wydzielony kry¬ staliczny osad. Otrzymuje sie 21 g (76% wydajno¬ sci) estru metylowego N-ftaliloglicyloglicyny otem^ peraturze topnienia 202 — 203°C.Przyklad X. 40,6 g (0,1 mola) estru p-[acety- losulfonamido]-fenylowego N-karbobenzoksyglicy¬ ny i 11,3 g (0,11 mola) swiezo przygotowanego estru etylowego glicyny rozpuszcza sie w 400 cm8 dioksanu, zawierajacego dodatkowo 6 cm3 kwasu octowego i pozostawia na 48 godzin w temperaturze pokojowej. Nastepnie oddestylowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem dioksan, a pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu. Uzyskany roztwór przemywa sie kolejno 5% roztworem weglanu sodowego, woda, 5% roztworem kwasu solnego i ponownie woda, po czym osusza bezwodnym siarczanem magnezowym.Po oddestylowaniu pod zmniejszonym cisnieniem octanu etylu pozostaje krystaliczny osad, który oczyszcza sie przez krystalizacje z mieszaniny oc¬ tanu etylu i eteru naftowego. Otrzymuje sie 24 g (31% wydajnosci) estru etylowego N-karbobemzok- syglicyloglicyny o temperaturze topnienia 80 — 81°C.Przyklad XI. 40,6 g (0,1 mola) estru p-[acety- ' losulfonamido]-fenylowego N-karbobenzoksyglicyny i 19 g (0,11 mola) swiezo przygotowanego estru metylowego L-leucyny rozpuszcza sie w 400 cm3 dioksanu, zawierajacego dodatkowo 6 cm3 kwasu octowego i pozostawia roztwór na 48 godzin w temperaturze pokojowej. Dalsze wydzielanie i oczyszczanie produktu przeprowadza sie podobnie, jak w przykladzie X. Uzyskuje sie 24 g (71% wy¬ dajnosci) estru metylowego N-karbobenzoksyglicylo- L-leucyny o temperaturze topnienia 64 — 65°C.Przyklad XII. 45,8 g (0,1 mola) estru p-[ace- tylosulfonamido] -fenylowego N-ftalilo-DL-leucyny i 9,8 g (0,11 mola) swiezo przygotowanego estru metylowego glicyny rozpuszcza sie w 400 cm3 diok¬ sanu, zawierajacego dodatkowo 6 cm3 ikwasu octo¬ wego i pozostawia roztwór na 48 godzin w tem¬ peraturze pokojowej. Dalsze wydzielanie produktu 5 przeprowadza sie podobnie, jak w przykladzie X.Otrzymuje sie 27 g (84% wydajnosci) estru metylo¬ wego N-ftalilo-DL-leucyloglicyny o temperaturze topnienia 104 — 105°C.Przyklad XIII. 46,2 g (0,1 mola) estru p-[ace- 10 tylosulfonamido]-fenylowego N-ikarbobenzoksy-L- leucyny i 9,8 g (0,11 mola) swiezo przygotowanego estru metylowego glicyny rozpuszcza sie w 400 cm3 dioksanu, zawierajacego dodatkowo 6 cm3 kwasu octowego i pozostawia roztwór na 48 godzin w 15 temperaturze pokojowej. Dalsze wydzielanie pro¬ duktu przeprowadza sie podobnie, jak w przykla¬ dzie X. Uzyskuje sie 30 g (89% wydajnosci) estru metylowego N-karbobenzoksy-L-leucyloglieyny o temperaturze topnienia 91 — 93°C i skrecalnosci 20 wlasciwej [a] ^ = — 26,6° (c=5, metanol).Przyklad XIV. 46,2 g (0,1 mola) estru p-[ace- tylosulfonamido] -fenylowego N-karbobenzoksy-L- leucyny i 19 g (0,11 mola) swiezo przygotowanego estru metylowego L-leucyny rozpuszcza sie w 200 25 cm3 dioksanu, zawierajacego dodatkowo 6 cm3 kwa¬ su octowego i pozostawia roztwór na 48 godzin w temperaturze pokojowej. Dalsze wydzielanie produktu przeprowadza sie podobnie, jak w przy¬ kladzie X. Otrzymuje sie 29 g (74% wydajnosci) 80 estru metylowego N-karbobenzoiksy-L-leucylo-L- leucyny o temperaturze topnienia 96 — 97°C i skre¬ calnosci wlasciwej [a] ^ = —33° (c=10, etanol).Przyklad XV. 45,9 g (0,1 mola) estru p-[ace- 35 tylosulfonamido]-fenylowego N-karbobenzoksy-L- metioniny i 29,4 g (0,1 mola) estru metylowego L- aspartylo-L-fenyloalaniny rozpuszcza sie w 1200 cm3 dwumetyloformamidu, zawierajacego 14 cm3 tróje- tyloaminy i pozostawia na 120 godzin w temperatu- 40 rze pokojowej. Nastepnie oziebia sie mieszanine rea¬ gujaca do temperatury —5°C i zakwasza 5% wod¬ nym roztworem kwasu cytrynowego. Wytracony bezbarwny osad odsacza sie, przemywa woda, wrza¬ cym metanolem i wrzacym cykloheksanem, po czym 45 oczyszcza sie przez krystalizacje z rozcienczonego etanolu. Otrzymuje sie 18,8 g (34% wydajnosci) est¬ ru metylowego N-karbobenzoksy-L-metionylo-E- aspartylo-L-fenyloalaniny o temperaturze topnienia 144 — 146°C i skrecalnosci wlasciwej [a] ^ — -n —25,9° (c=l, metanol).Przyklad XVI. 54,0 g (0,1 mola) estru p- [acetylosulfonamido]-fenylowego N-karbobenzo- ksy-L-tryptofanu i 42,6 g (0,1 mola) estru metylo¬ wego L-metionylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny roz- 55 puszcza sie w 5000 cm3 dwumetyloformamidu, za¬ wierajacego 14 cm3 trójetyloamiiny i pozostawia na 120 godzin w temperaturze pokojowej. Nastepnie zakwasza sie mieszanine reagujaca 5% wodnym roztworem kwasu cytrynowego. Wytracony olej go rozpuszcza sie w octanie etylu, a uzyskany roz¬ twór przemywa sie 5% wodnym roztworem kwa¬ su cytrynowego i woda, po czym osusza bezwod¬ nym siarczanem magnezowym. W dalszym ciagu oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem 65 octan etylu, a pozostalosc zadaje eterem etylowym.68 232 8 Wytracony osad przemywa sie wrzacym cyklo¬ heksanem. Otrzymuje sie 24 g (32% wydajnosci) estru metylowego N-karbobenzoksy-L-tryptofany- lo-L-metionylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny o tem¬ peraturze topnienia 158—160°C i skrecalnosci wla¬ sciwej [a]™= —31,2° (c = 0,5; metanol). PL