PL66611B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 15.111.1973 66611 KI. 30h,2/20 Ur.MKP C12d 5/04 UKD *LNJa -°*erri Wspóltwórcy wynalazku: Tadeusz Szczesniak, Leonard Karabin, ^<*JA*.-.Krystyna Wituch Wlasciciel patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania ryboflawiny metoda biosyntezy Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia ryboflawiny (witaminy B2) metoda biosyntezy w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gos- sypii.Znane jest z opisu patentowego nr 59792 wytwa¬ rzanie ryboflawiny w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii na pozywkach zawieraja¬ cych tluszcz pozelatynowy jako zródlo wegla. Uzy¬ skiwane ta metoda wydajnosci ryboflawiny wyno¬ sily 3781 ^g/ml.Postepem w tej dziedzinie byl sposób ujawnio¬ ny w opisie patentowym nr 64983. Polegal on na wytwarzaniu ryboflawiny metoda biosyntezy w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gos¬ sypii na pozywkach zawierajacych tluszcz pozela¬ tynowy jako zródlo wegla, przez wstepne pasazo- wanie grzyba Ashbya gossypii przez odpowiednio dobrane pozywki stale i plynne, a nastepnie ho¬ dowli w plynnej pozywce produkcyjnej zawiera¬ jacej jako zródlo azotu klej skórny i/lub kostny.Uzyskiwane ta metoda wydajnosci ryboflawiny wy¬ nosily 5910 wg/ml.Stwierdzono, ze wydajnosc ryboflawiny mozna jeszcze znacznie podwyzszyc do 6420 ^g/ml jezeli jako zródlo wegla w pozywkach zastosuje sie tluszcz kostny lub tluszcz skórny, albo w mieszaninie z in¬ nymi tluszczami roslinnymi i zwierzecymi, które wprowadza sie bezposrednio do pozywki posiewo- wej w ilosci 0,1—6,0% wagowych, a podczas hodowli grzyba Ashbya gossypii w ilosci 0,1—5,0% wago- 10 15 25 30 wych. Tluszcz kostny lub tluszcz skórny wprowadza sie do pozywki podczas hodowli Ashbya gossypii pomiedzy 0—120 godzina hodowli.Ilosciowy i jakosciowy sklad kwasów tluszczo¬ wych w tluszczu pozelatynowym, kostnym i skór¬ nym obrazuje tablica 1.Tablica 1 Ilosciowy i jakosciowy sklad kwasów tluszczowych Wzór su¬ maryczny kwasu tluszczo¬ wego C14H26O2 C14H28O2 C15H30O2 C16H32O2 C16H30O2 C16H28O2 C1GH26O2 C17H34O2 C18H36O2 C18H34O2 C18H32O2 C20H38O2 C20H10O2 w róznych Zawartosc tluszcz pozela¬ tynowy . 1,4 — 23,5 4,0 0,5 0,5 — 10,3 55,0 3,3 1,5 — tluszczach kwasów tluszczowych w procentach tluszcz kostny 0,4 1,5 0,4 24,3 3,1 — — 1,1 15,9- 47,4 3,2 1,3 0,4 tluszcz skórny 0,2 1,2 0,3 25,2 2,8 — — 0,9 16,4 48,2 3,2 1,1 0,3 66 61166 611 3 10 15 Sposób prowadzenia hodowli Ashbya gossypii i wydajnosci ryboflawiny w plynnej pozywce pro¬ dukcyjnej zawierajacej tluszcz kostny lub tluszcz skórny przedstawia szczególowo przyklad, w któ¬ rym procenty oznaczaja procenty wagowe o ile nie 5 zaznaczono inaczej.Przyklad. Przygotowano plynna pozywke do otrzymywania askospor grzyba Ashbya gossypii o skladzie: Glukoza czysta 1,0% Tiamina HC1 0,1% Woda drozdzowa (0,5% suchej masy) do 100,0% objetosciowych Wartosc pH pozywki nastawiano na 6,9 za po¬ moca wodorotlenku potasu. Tak przygotowana po¬ zywke rozlewano po 10 ml do probówek i wyjala¬ wiano w temperaturze 110°C w ciagu 30 minut.Probówki z pozywka szczepiono 5 dniowa kolo¬ nia grzyba wyhodowana na pozywce stalej.Przygotowano pozywke stala o nastepujacym skladzie: Glukoza czysta (100% suchej masy) 2,0% Agar 2,0% Woda drozdzowa (0,5% suchej masy) do 100,0% objetosciowych.Wartosc pH pozywki nastawiano za pomoca wo¬ dorotlenku potasu do 7,2 i wyjalawiano w tempera¬ turze 110°C w ciagu 30 minut.Pozywke rozlewano do plytek Petri'ego po 20 ml.Pozywke stala szczepiono zawiesina askospor wy¬ hodowana na pozywce plynnej. Inkubacje przepro¬ wadzano w temperaturze 28°C w ciagu 5 dni.Otrzymane w ten sposób kolonie grzyba stoso¬ wano do szczepienia plynnej pozywki posiewowej I.Przygotowano plynna pozywke posiewowa I o skladzie: Glukoza czysta (100% suchej masy) 1,0% Laktoza czysta (100% suchej masy) 0,3% Pepton 0,5% Ekstrakt drozdzowy 0,3% Woda wodociagowa do 100,0% objetosciowych Wartosc pH pozywki nastawiano na 6,5 za po¬ moca wodorotlenku potasu, rozlewano po 50 ml do kolb Erlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml i wyjala¬ wiano, w temperaturze 110°C w ciagu 30 minut.Kazda kolbe z plynna pozywka posiewowa I sta¬ dium szczepiono 5 dniowa kolonia grzyba wyhodo¬ wana na pozywce stalej.Hodowle prowadzono w zaciemnionym pomiesz¬ czeniu, na trzesawce obrotowej o 220 obrotach/min. i mimosrodzie 25 mm w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin.Otrzymana w ten sposób zawiesine grzybni sto¬ sowano do szczepienia plynnej pozywki posiewo¬ wej II.Przygotowano plynna pozywke posiewowa II o skladzie: Drozdzepaszowe 2,0% Tluszcz kostny lub skórny 1,5% Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) 3,0% Wodawodociagowa do 100,0% objetosciowych 25 30 35 40 45 50 55 Wartosc pH pozywki nastawiano na 7,2, rozle¬ wano po 50 ml do kolb Erlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml i wyjalawiano w temperaturze 110°C w ciagu 30 minut.Kazda kolbe z plynna pozywka posiewowa II szczepiono 1 ml zawiesiny grzybni z plynnej po¬ zywki posiewowej I.Hodowle prowadzono w ciagu 24 godzin w takich samych warunkach jak na plynnej pozywce posie¬ wowej I.Otrzymana w ten sposób zawiesina grzybni szcze¬ piono plynna pozywke produkcyjna.Przygotowano plynna pozywke produkcyjna o skladzie: Klej skórny 3,0% Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) 6,0% Glicyna 0,15% KH2P04 0,15% Mg++ 1 ^g/ml Co++ 2 /Lig/ml Mn++ 5 jug/ml Zn++ 10 fig/ml Wodawodociagowa do 100,0% objetosciowych Wartosc pH pozywki nastawiano na 6,8 za po¬ moca wodorotlenku potasu. Pozywke rozlewano po 30 ml do kolb Erlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml i do kazdej kolby dodawano tluszcz kostny lub skórny w ilosci 4,0% objetosciowych. Pozywki wy¬ jalawiano w temperaturze 110°C w ciagu 3 godzin.Kazda kolbe z pozywka szczepiono 1 ml zawiesiny grzybni z plynnej pozywki posiewowej II.Hodowle prowadzono w zaciemnionym pomiesz¬ czeniu, na trzesawce obrotowej o 220 obrotach/min. i mimosrodzie 25 mm, w temperaturze 28°C, w cia¬ gu 192 godzin.Do kazdej kolby z okreslonej partii pozywki pro¬ dukcyjnej zawierajacej tluszcz kostny lub skórny w ilosci 4,0% objetosciowych dodawano taki sam tluszcz w ilosci 2,5% objetosciowych w 72, 96, 120 oraz 72 i 120 godzinie hodowli Ashbya gossypii.Zawartosci ryboflawiny (witaminy B2) po 192 go¬ dzinach hodowli Ashbya gossypii w pozywkach, do których dodawano tluszcz kostny w róznych godzi¬ nach hodowli przedstawione sa w tablicy 2.Tablica 2 Czas dodawania tluszczu kostnego 72 godzina /^g/ml 3560 96 godzina A*g/ml 3510 120 godzina /ug/ml 2850 72 i 120 godzina 6420 65 Jak wykazano powyzej najwieksza wydajnosc ry¬ boflawiny otrzymano w pozywce, do której dodano tluszcz kostny dwukrotnie w 72 i 120 godzinie ho¬ dowli.Zawartosci ryboflawiny (witaminy B2) po 192 go¬ dzinach hodowli Ashbya gossypii w pozywkach, do których dodawano tluszcz skórny w róznych go¬ dzinach hodowli, przedstawione sa w tablicy 3.66 5 Tablica 3 1 Czas dodawania tluszczu skórnego l j 72 godzina jMg/ml 3440 96 godzina jug/ml 3280 120 godzina jug/ml 2670 72 i 120 godzina jug/ml 6320 Jak wykazano wyzej najwieksza wydajnosc ry¬ boflawiny otrzymano w pozywce, do której doda¬ wano tluszcz skórny dwukrotnie w 72 i 120 go¬ dzinie hodowli.W przykladzie I wykazano, ze sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac wysokie wydajnosci ryboflawiny stosujac plynne pozywki zawierajace tluszcz kostny lub tluszcz skórny.Wytworzona ryboflawine znajdujaca sie w ply¬ nach hodowlanych izoluje sie jedna ze znanych metod chemicznych. 611 6 PL PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania ryboflawiny metoda bio¬ syntezy w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii przez wstepne pasazowanie grzy- 5 ba Ashbya gossypii przez odpowiednio dobrane po¬ zywki stale i plynne, a nastepnie hodowli w plyn¬ nej pozywce produkcyjnej zawierajacej jako zródlo azotu klej skórny i/lub klej kostny, wedlug pa¬ tentu nr 64983 znamienny tym, ze hodowle prowa- 10 dzi sie w plynnej pozywce posiewowej, a nastep¬ nie w plynnej pozywce produkcyjnej, które zawie¬ raja jako zródlo wegla tluszcz kostny lub skórny.

2. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze tluszcz kostny lub skórny wprowadza sie bezpo¬ srednio do pozywki w ilosci od 0,1% do 6,0% wa¬ gowych a podczas hodowli Ashbya gossypii w ilosci od 0,1% do 5,0% wagowych.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, 2 znamienny tym, ze tluszcz kostny lub skórny wprowadza sie do po¬ zywki podczas hodowli Ashbya gossypii pomiedzy 0—120 godzina hodowli. PL PL