PL65156B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 20.VII.1972 65156 KI. 12 o, 25/04 MKP C 12 d 13/08 CZYTELNIA UKDn L Urzedu Patentowego Twórca wynalazku: Zdzislaw Zakrzewski Wlasciciel patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania zwiazków A*4-3-ketosteroidowych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia zwiazków ZlM-3-keitosteroidowych szeregu an- dirostanu przez uwodornienie na drodze enzyma¬ tycznej odpowiednich substratów. Zwiazki te sa cennymi srodkami leczniczymi lub stanowia pro¬ dukty posrednie do ich wytwarzania.Znany z opisu patentowego nr 56 331 sposób de- hydrogenacji sterydów w pozycji 1 polega na za¬ stosowaniu sp. C-9, zarówno w postaci rozwijaja¬ cej sie hodowli, w postaci zawiesiny odsaczonych i przemytych komórek jak i preparatów enzyma¬ tycznych otrzymanych z tych mikroorganizmów.Jako „preparaty enzymatyczne" nalezy rozumiec opisane w literaturze produkty 1,2-dehydrogenu- jaice steroidy 'uzyskane z innych mikroorganizmów, a mianowicie zliofolizowane komórki Nocardia co- rallina, wysuszone powietrznie komórki Corynebac- teriuim simpLex, zamrozone komórki Sepitomyxa affinis, zamrozone zarodniki Septomyxa affinis.Zgodnie z istniejacym stanem techniki w celu sporzadzenia tych preparatów we wszystkich tych przypadikach przeprowadza sie hodowle mikroorga¬ nizmu na stosownym podlozu wzrostowym, po czym oddziela sie od niego material zawierajacy A1-de¬ hydrogenaze 3-ketositeroidowa przez odwirowanie komórek wegetatywnych lub obmycie zarodni¬ ków woda a nastepnie utrwala sie produkt przez odwodnienie, za pomoca liofilizacji lub wysuszenia na powietrzu, badz tez zamrozenie.Produkty powyzsze cechuje wybitnie krótki 10 15 20 30 okres trwalosci. Otrzymanie trwalego preparatu enzymatycznego zawierajacego A1-dehydrogenaze 3-ketosteroidowa natrafia na podstawowa trudnosc wynikajaca z faktu szczególnej wrazliwosci tego ukladu enzymatycznego na czynniki dezorganizujace czy denaturujace, takie jak wplyw podoptymalnej temperatury lub pH, liza fizyczna, oddzialywanie mechaniczne ozy idluzszy ozas przechowywania. I tak komórki Corynebacteriuim simplex stosowane sa . bezposrednio po przygotowaniu, komórki Septomyxa. affinis utrzymuja aktywnosc przez trzy tygodnie a zaroidnilki przez osiem tygodni. Dla zliofolizowanyoh komórek z Nocardia corallina okres trwalosci nie jest znany, jednakze wysoki koszt produkcji w tym przypadku odbiera tej metodzie charakter przemy¬ slowy.Dotychczasowe niepowodzenia w uzyskiwaniu w sposób latwy i tani metoda przemyslowa trwa¬ lego produktu enzymatycznego A1 -dehydrogenazy 3-ketosteroidiowej o charakterze zarówno odczynni¬ kowym jak i surowca do zastosowan produkcyjnych sklaniaja do uzywania w badaniach naukowych i w praktyce przemyslowej jako zródla Zl1-dehydro¬ genazy 3-ketosteroidowej hodowli mikroorganizmu wzglednie wydzielonych z podloza i bezposrednio uzytych komórek. Zgodnie np. z opisem patentu 56 331 po okresie inkubacji dodaje sie do hodowli plesniaków 1,2-dwuhydirosteryd i poddaje sie go dzialaniu tej hodowli.Po zakonczeniu procesu mieszanine zazwyczaj 651563 ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym.Mozna równiez mieszanine przesaczyc lub odwiro¬ wac, przesacz poddac ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym, a wydzielona biomase ewentualnie za¬ wrócic do nastepnej szarzy produkcyjnej, przy czym biomasa moze byc wykorzystana w ten sposób nie wiecej niz pare razy.Sposób ten wymaga kazdorazowego przygotowania hodowli mikroorganizmu przed przeprowadzeniem procesu dehydrogenaicji, co jest klopotliwe, glównie z uwagi na koniecznosc zatrudnienia specjalnie przeszkolonego personelu mikrobiologicznego i po¬ trzebe instalowania specjalnej aparatury (trzesa- wek) w osobnych pomieszczeniach termostatowych oraz koniecznosc utrzymania warunków jalowych, a poza tym czasochlonne ze wzgledu na dlugi okres inkubacji. Warunki jalowe musza byc równiez za¬ chowane w czasie samej dehydrogenacji, gdzie za¬ chodzi mozliwosc zakazenia hodowli np. w chwiLi pobierania próbek kontrolnych lub przy silnym pie¬ nieniu sie mieszaniny.W sposobie tym w czasie dtehyidmogenacji maste- puje zazwyczaj silne pienienie sie, co uniemozliwia pelne wykorzystanie pojemnosci fermentora, a po¬ nadto zmusza do uzywania srodków przeciwpien- nych, utrudniajacych wyodrebnienie produktu.W czasie wyodrebniania produktu za pomoca eks¬ trakcji rozpuszczalnikiem organicznym wystepuje w silnym stopniu niekorzystne zjawisko tzw. inter¬ fazy, czyli tworzenia sie emulsji. Wreszcie mie¬ szanina, w której zachodzi dehydrogenacja, wyka¬ zuje zazwyczaj silne zabarwienie, w izwiazku z czym otrzymanie produktu bezbarwnego napotyka na trudnosci.Poza tym podczas transformacji prowadzonej w warunkach hodowli z reguly wystepuje wielo¬ kierunkowa przemiana substratu a to przez zacho¬ dzenie reakcji równoleglych czy nastepczych w wy¬ niku sukcesywnego indukowania przez rozwijajacy sie w warunkach hodowli mikroorganizm nowych ukladów enzymatycznych.Ze wzgledu na to, ze kazda hodowla mikroorga¬ nizmu w kazdej pojedynczej kolbie czy tanku fer¬ mentacyjnym stanowi oddzielna, niezaleznie sie roz¬ wijajaca jednostke biologiczna i ulega wplywom wszystkich zmiennych warunków zewnetrznych, w zasadzie niemozliwe jest osiagniecie przy jej uzy¬ ciu calkowitej powtarzalnosci wyników i ich po¬ równywalnosci, dostepnej dopiero po nadaniu enzy¬ mowi charakteru odczynnikowego.Poza tym niemozliwe jest bezposrednie przeno¬ szenie wyników ze skali mniejszej (kolb) do wiek¬ szej (tanków) m. in. z uwagi na niewykonalnosc po¬ miaru efektu napowietrzania czy mieszania w kol¬ bach, sluzacych do prowadzenia hodowli mikroorga- nrzmu.Niemozliwe jest takze w tym przypadku zmniej¬ szenie skali badawczej ponizej pewnego poziomu, warunkujacego prawidlowy rozwój hodowli pod- powierzchniowej, a tym samym poprawienie bilansu zuzycia bardzo na ogól kosztownych wyjsciowych produktów sterydowych.Okazalo sie, ze wszystkich wymienionych ujem¬ nych skutków znanych metod mozna uniknac, je¬ zeli zamiast hodowli mikroorganizmu w procesie »7' . "-: ¦¦¦' ;¦ ¦ :r ;:^ 4 '. .; ^ ¦¦ ' dehydrogenacji sterydów w pozycji 1 zastosuje sie preparat enzymatyczny otrzymany z plesniaków w rodzaju Cephalosporium sp. C-9. Wprowadzony wedlug wynalazku sposób utrwalania komórek mi- 5 kroorgainizmu droga lagodnego i stopniowego od¬ wodnienia wpierw poprzez wyprasowanie nadmiaru wilgoci z biomasy,'a nastepnie wysuszenie korzyst¬ nie w warunkach zmniejszonego cisnienia nad sub¬ stancja pochlaniajaca wode, taka jak P205 iw obni- 10 zonej temperaturze — zapewnia zachowanie przez komórki pierwotnej aktywnosci Z^-dehydrogenazy 3-keitositeroidowej bez jej ubytku w ciagu wieiu, co najmniej szesciu, miesiecy.Istotnym czynnikiem korzystnym dla zachowania 15 wysokiej aktywnosci przez preparat jest uzycie do jego wyprodukowania specjalnie dobranego srodka konserwujacego w postaci soli sodowej kwasu 2-etylortecktiobenzenokarboksylowego-l. Substan¬ cja ta dzialajac wybiórczo z jednej strony nie prze- 20 jawia wplywu inhibujacego na czynnosc ^-dehy¬ drogenazy 3-keitosteroidowej, a z drugiej wykazuje silny wplyw iohibujacy na rozwój mikroorganiz¬ mów. Chroni ona w ten sposób preparat przed skutkami zakazen mozliwych w czasie manipulacji 25 zwiazanych z jego produkcja i pózniejszym stoso¬ waniem, a w tym przed dzialaniem proteaz rozkla¬ dajacych A1-dehydrogenaze 3-ketosteroidowa.Sposób wytwarzania preparatu moze byc aktualny i dla innych mikroorganizmów zawierajacych z^-de- 30 hydroigenaze 3-ketosteroidowa.Sposobem wedlug wynalazku otrzymana w znany sposób biomase plesniaka z rodzaju Cephalosporium sp. C-9, wykazujacego aktywnosc enzymatyczna w kierunku dehydrogenacji steroidów w pozycji 1, 35 wydziela sie z podloza wzrostowego przez odsaczenie lub odwirowanie w momencie, gdy hodowla osiaga najwyzszy poziom aktywnosci.Istotnym czynnikiem wydzielania jest mozliwie dokladne usuniecie resztek podloza wzrostowego. 40 Nastepnie biomase zwilza sie rozcienczonym roz¬ tworem wodnym srodka konserwujacego, takiego jak sól sodowa kwasu 2-etylorteciotiobenzenokarbo- ksylowego-1, po czym odciaga sie reszte roztworu, np. na saczku bakteriologicznym, wyprasowuje nad- 45 miar wilgoci i suszy w temperaturze okolo 0° do + 10°C, korzystnie pod zmniejszonym cisnieniem i przy uzyciu substancji odciagajacej wode, np. pie¬ ciotlenku fosforu, az do uzyskania 10—20°/o suchej masy w preparacie. 50 Otrzymany preparat enzymatyczny przechowuje sie w szczelnych naczyniach, w chlodni, w opako¬ waniu zabezpieczonym przed dzialaniem swiatla.Preparat moze byc przechowywany w okresie co najmniej 6 miesiecy bez wyraznej straty aktyw- 55 nosci.Preparat enzymatyczny otrzymany z plesniaków z rodzaju Cephalosporium sp. C-9, zawiesza sie nastepnie w wodzie o temperaturze 24—32°C, do zawiesiny wprowadza sie przy mieszaniu roztwór 60 lub zawiesine zwiazku z14-3-ketositeroidowego szere¬ gu androistanu w mozliwie malej ilosci rozpuszczal¬ nika organicznego, takiego jak dwumetyloformamid, aceton, metanol, po czym doprowadza sie przy mie¬ szaniu tlen, np. w postaci powietrza i utrzymuje 65 zawartosc reaktora w tych warunkach az do stwier- -*%.65156 6 dzenia, ze ilosc produktu dehydrogenacji nie zwiek¬ sza sie. Nastepnie proces przerywa sie przez zanie¬ chanie napowietrzania i mieszania oraz dodanie rozpuszczalnika organicznego, takiego jak chlorow- coalkan, np. chloroform. Produkt i nieprzereagowa- 5 ny suibstrat wyodrebnia sie w znany sposób.Proces dehydrogenacji mozna przyspieszyc doda¬ jac odpowiednio wieksza ilosc preparatu enzyma¬ tycznego. Tak wiec np. przy dehydirogenacji 50 mg 17a-metyloandrosten-4-ol-17/?-onu-3 czas przereago- 10 wania przy uzyciu 1 g preparatu enzymatycznego wynosi 16 godzin, a przy uzyciu 5 g preparatu en¬ zymatycznego czas przereagowania do tego samego poziomu przereagowania wynosi tylko 3 goidziny. 15 Przyklad. W tanku fermentacyjnym przepro¬ wadzono hodowle plesniaka Cephalosporium sp. C-9 w znany sposób. Po okolo 12 godzinach od chwili zaszczepienia tanku, tj. w momencie, gdy hodowla osiagnela najwyzszy poziom aktywnosci /U-dehy- 20 drogenazy 3-ketosteroidowej, przerwano inkubacje i zawartosc tanku przesaczono przez filtr bakteryjny Seiitza. Po przemyciu woda pozostala na saczku bio¬ mase plesniaka zwilzono wodnym 0,01% roztworem soli sodowej kwasu 2-etylorteciati'obenzenokarbo- 25 ksylowego-1 w ilosci 70 ml roztworu na 100 g wil¬ gotnej biomasy i odciagnieto nadmiar roztworu pod zmniejszonym cisnieniem. Biomase zdjeto z saczka, zawinieto w trzy warstwy bibuly filtracyjnej twar¬ dej, umieszczono pod prasa i wycisnieto czesc po- 30 zostalego roztworu.Operacje te powtórzono jeszcze dwukrotnie, przy czym biomasa stracila lacznie okolo Vs swojej pier¬ wotnej wagi, jaka posiadala po odsaczeniu i prze-' myciu srodkiem konserwujacym. Nastepnie pólsu- 35 cha biomase umieszczono w eksykatorze próznio¬ wym nad pieciotlenkiem fosforu i odciagano po¬ wietrze w ciagu 1/b godziny. Potem eksykator umieszczono w chlodni w temperaturze + 4° na okres 48 godzin, a otrzymany preparat enzymatycz- 40 ny w postaci suchego proszku zawierajacego 12,9% suchej masy rozwazono . do sloików z ciemnego szkla, zaparafinciwano korki i przechowywano w chlodni w temperaturze + 4°C. Preparat prze¬ chowywany w tych warunkach w ciagu 6 miesiecy 45 nie stracil swej pierwotnej aktywnosci ^--dehydro¬ genazy 3-ketosteroidowej.Czesc preparatu enzymatycznego rozmieszano sta¬ rannie z woda w stosunku 5 czesci wagowych wody na 1 czesc wagowa preparatu. Otrzymana zawie- 50 sine przeniesiono do reaktora z woda o temperatu¬ rze 27—29°C w takiej ilosci, aby 1 g preparatu przypadal na 30 ml wody i rozpoczeto napowietrza¬ nie i .mieszanie zawartosci reaktora. Po 5 minutach dodano 20*Vo-wy roztwór metanolowy 17a-imetylo- 55 androi9ten-4-ol-17/7-onu-3 w ilosci odpowiadajacej 59 mg substancji' steroidowej na 1 g preparatu en¬ zymatycznego.Proces prowadzono przy stalym mieszaniu i na¬ powietrzaniu zawartosci reaktora w temperaturze 60 27—29°C w ciagu 16 godzin, przy czym obserwo¬ wano co najwyzej nieznaczne pienienie sie zawar¬ tosci. Proces przerwano przez zaniechanie mieszania i doprowadzania powietrza. Mieszanine poddano wyczerpujacej ekstrakcji ' chloroformem uzytym w trzech porcjach, kazda w ilosci równej polowie objetosci mieszaniny, przy czym nie zaobserwowano powstawania emulsji. Polaczone ekstrakty przemyto l°/o-wym roztworem kwasnego weglanu sodowego, uzytym w stosunku objetosciowym do ekstraktu jak 1 : 1, a nastepnie dwukrotnie woda. Z ekstraktu chloroformowego po osuszeniu go nad siarczanem sodowym oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniej¬ szonym cisnieniem.Pozostalosc bez odbarwiania rozpuszczono w eta¬ nolu z dodatkiem kwasu octowego, do roztworu do¬ dano odczynnik Girarda T, rozcienczono woda, po czym mieszanine ekstrahowano eterem etylowym.Z ekstraktu eterowego oddestylowano rozpuszczal¬ nik, uzyskujac po przekrystalizowaniu pozostalosci z etanu etylowego chromatograficznie czysty 17a-metyloandroiStadien-l,4-ol-17/?-on-3 z wydajno¬ scia 70°/o. Z warstwy wodnej pozostalej po wykry¬ stalizowaniu eterem odzyskano nieprzereagowany suibstrat przez rozlozenie kwasem solnym zawartego w niej hydrazonu i ekstrakcje eterem etylowym (wydajnosc okolo 80°/o). PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenie patentowe

2. Sposób wytwarzania zwiazków zlM-3-ketostero- idowych szeregu androstanu na drodze dehydroge¬ nacji ZH-3-ketoisteroidów szeregu androstanu przy uzyciu preparatu enzymatycznego z grzybni Cepha¬ losporium C-9, znamienny tym, ze z hodowli ple¬ sniaka z rodzaju Cephalosporium sp. C-9 wydziela sie biomase plesniaka, mozliwie dokladnie usuwa z niej podloze wzrostowe, nasyca ja roztworem srodka konserwujacego, takiego jak sól sodowa kwasu 2-etylorteciotiobenzenokarboksylowego-l, od¬ ciaga reszte roztworu, wyprasowuje nadmiar wil¬ goci, suszy w temperaturze 0—10 °C korzystnie pod zmniejszonym cisnieniem przy uzyciu substancji odciagajacej wode, takiej jak pieciotlenek fosforu, az do uzyskania .10—20 po czym otrzymany w ten sposób preparat enzyma¬ tyczny zawierajacy A1-dehydrogenaze

3. -ketos.tero- idowa zawiesza sie w wodzie o temperaturze 24—32°C i stosuje w znany sposób do dehydroge¬ nacji *zl

4. -3-ketosteroidów przez wprowadzenie do zawiesiny preparatu enzymatycznego roztworu lub zawiesiny zwiazku z14-3-ketosteroidowego szeregu androstanu w rozpuszczalniku organicznym, takim jak metanol, aceton, dwumetyloformamid, mieszanie i napowietrzanie, po czym mieszanine poreakcyjna ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym, ta¬ kim jak ^hlorowcoalkan, np. chloroform, a produkt i nieprzereagowany substrat wyodrebnia sie w zna¬ ny sposób. Errata strona 3, lam 5, wiersz 57 jest: 59 mg powinno byc: 50 mg PL PL