PL67681B1 - - Google Patents

Description

Przyklad VII. Przygotowano hodowle szcze¬ pu Cephalosporium sp. X-l w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I. Do kazdej kolby dodano po 250 mg 21-acetoksypregnen-4-ol-17a- -trionu-3,11,20 rozpuszczonego w 2,5 ml metanolu.Kolby inkubowano na trzesawce przez 20 godz., a nastepnie ekstrahowano ich zawartosc chlorofor¬ mem czterokrotnie po 50 ml. Ekstrakty polaczono, wysuszono nad siarczanem sodowym bezwodnym, przesaczono i odparowano do sucha. W suchym ekstrakcie stwierdzono przy pomocy chromatogra¬ fii cienkowarstwowej [silikazel/chloroform: meta¬ nol 95 : 5] obecnosc octanu prednizonu, prednizonu i sladowa plame substratu.Przyklad VIII. Przygotowano hodowle szcze¬ pu Cephalosporium sp. X-l sposobem opisanym w przykladzie I. Do kazdej kolby dodano 100 mg progesteronu rozpuszczonego w 1 ml metanolu.Mieszanine reakcyjna inkubowano jak w przykla¬ dzie I. Po 20 godzinach zawartosc kolb wyekstra¬ howano chloroformem 4 razy po 30 ml. Ekstrakty polaczono, osuszono, przesaczono i odparowano do sucha. Zawartosc suchego ekstraktu oznaczono przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej. Chro- matogram wykazal obecnosc pieciu plam odpowia¬ dajacych produktom ubocznym oraz plame pro¬ duktu glównego, która z uwagi na istnienie ukladu A1,4-3-keto (reakcja z hydrazydem kwasu izoni¬ kotynowego wedlug Smitha i Foela, reakcje barw¬ ne i rodzaj fluorescencji po wywolaniu kwasem siarkowym i kwasem fosforowym (oraz wartosc Rf) nieco nizsza niz substratu okreslono jako A J-po¬ chodna progesteronu.Przyklad IX. Przygotowano hodowle pod- powierzchniowa szczepu Cephalosporium sp. X-l w sposób opisany w przykladzie I. Grzybnie od¬ dzielono od brzeczki przez odwirowanie hodowli przy 3000 obrTmin. w ciagu 20 minut. Plyn znad grzybni zlano. Grzybnie z kazdej kolby zawieszono w 100 ml 0,03 molarnego buforu fosforanowego o wartosci pH=7,0 i do zawiesiny dodano 250 mg pregnen^-diol-Ha^l-trionu-^lMO rozpuszczonego w 2,5 ml metanolu. Zawartosc kolb inkubowano 10 15 20 na trzesawce w temperaturze 28°C przez 18 go¬ dzin, a nastepnie ekstrahowano, osuszono, przesa¬ czono i odparowano jak w przykladzie I. Zawar¬ tosc suchego ekstraktu badano za pomoca chro- 5 matografii cienkowarstwowej. Chromatogram wy¬ kazal tylko plame pregnadien-l,4-diol-17a,21-trio- nu-3,11,20.Przyklad X. Przygotowano hodowle szczepu Cephalosporium sp. X-l w sposób analogiczny do 10 opisanego w przykladzie I. Grzybnie oddzielono od brzeczki przez odwirowanie hodowli przy 3000 obr/min. przez 20 minut. Plyn znad grzybni zla¬ no. Grzybnie z kazdej kolby zawieszono w 500 ml wody i do zawiesiny dodano 250 mg pregnen-5- -triol-3p,17a,21-onu-20 rozpuszczonego w 2,5 ml me¬ tanolu. Mieszanine powtórnie umieszczono na trze¬ sawce. Po 20 godzinach zawartosc kolb ekstraho¬ wano czterokrotnie 50 ml chloroformu, ekstrakty polaczono-odwodniono siarczanem sodowym bez¬ wodnym i przesaczono. Przesacze odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Zawartosc ekstraktów oznaczono przy pomocy chromatografii cienkowar¬ stwowej [silikazel/chloroform : metanol 95 : 5] i na podstawie reakcji barwnych z hydrazydem kwasu izonikotynowego wedlug Smitha i Foela, reakcji barwnych i fluorescencji po wywolaniu kwasem siarkowym i kwasem fosforowym, stwierdzono istnienie ukladu All4-3-ketonowego. Z wartosci Rf nieco nizszej niz dla substancji S Reichsteina oraz zgodnosci Rf z produktem wlasnym (otrzymanym wedlug przykladu I) stwierdzono, ze produkt jest pregnadien-l,4-diol-17a,21-dionem-3,20.Przyklad XI. Zawiesine zarodników szczepu 35 Cephalosporium sp. X-l uzyskana ze zmycia 10- -dniowej hodowli agarowej posiano 10 flaszek Roux z podlozem Waksmana. Hodowle inkubowano w 28°C przez 10 dni, a nastepnie zarodniki zmywa¬ no 50 ml jalowej wody. Zawiesine zarodników 40 umieszczono w jednolitrowych kolbach plaskoden¬ nych, do kazdej kolby dodano 50 mg pregnen-4- -diol-17a,21-trionu-3,ll,20 rozpuszczonego w 1,5 ml metanolu. Mieszanine inkubowano 18 godzin, po czym ekstrahowano czterokrotnie po 30 ml chloro- 45 formu. Ekstrakty polaczono, osuszono bezwodnym siarczanem sodowym, przesaczono i odparowano do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Suche ekstrakty analizowano stosujac chromatografie cienkowarstwowa [silikazel/chloroform: metanol 50 95: 5] i bibulowa [formamid/benzen: chloroform 1:1]. Chromatogram wykazal plame produktu glównego identyczna z wzorcem pregnadien-1,4- -diol-17a,21-trionem-3,ll,20 (wartosc Rf, reakcja z hydrazydem kwasu izonikotynowego wg Smitha 55 i Foela, oraz rodzaj fluorescencji po wywolaniu kwasem siarkowym i kwasem fosforowym) oraz sladowa plame substratu.Przyklad XII. Przygotowano hodowle szcze¬ pu Cephalosporium sp. X-l w sposób analogiczny 60 jak podano w przykladzie I. Grzybnie oddzielono od brzeczki przez odwirowanie hodowli przy 3000 obr/min przez 20 minut. Plyn usunieto, a biomase po dokladnym przemyciu woda poddano wirowa¬ niu w tych samych warunkach. Otrzymany prp- 65 parat enzymatyczny zliofilizowano, przechowy^a-67 681 11 no w temperaturze +4°C. Po okolo 7 dniach za¬ wieszono w 100 ml wody o temperaturze 24—32°C.Do zawiesiny dodano 250 mg pregnen-4-diol- 17a,21-trionu-3,ll,20 rozpuszczonego w 2 ml metano¬ lu. Zawartosc kolb inkubowano na trzesawce w temperaturze 28°C przez 12 godzin, po czym ekstra¬ howano, osuszono, przesaczono i odparowano jak w przykladzie I. Zawartosc suchego ekstraktu ba¬ dano za pomoca chromatografii cienkowarstwowej.Chromatogram wykazal tylko plame pregnadien- l,4-diol-17a,21-trionu-3,ll,20. PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania All4-3-ketonów sterydo¬ wych metoda mikrobiologiczna, znamienny tym, ze A5-3-ol sterydowy lub A4-3-keton sterydowy pod¬ daje sie dzialaniu hodowli szczepu Cephalosporium 12 10 sp. X-l, zawiesinie grzybni tego mikroorganizmu w wodzie z ewentualnym dodatkiem substancji bu¬ forowych, lub otrzymanymi z tego mikroorganizmu preparatami enzymatycznymi w obecnosci tlenu powietrza sposobem konwencjonalnym, po czym otrzymany produkt wyodrebnia sie i oczyszcza w znany sposób.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako preparat enzymatyczny stosuje sie preparat otrzymany przez namnozenie hodowli Cephalo¬ sporium sp. X-l na odpowiednim podlozu wzro¬ stowym, oddzieleniu od niej materialu zawieraja¬ cego A1,4-dehydrogenaze 3-ketosterydowa, odmy¬ ciu woda pozostalosci pozywki, a nastepnie usu¬ nieciu wody z produktu droga liofilizacji, przy czym preparat ten stosuje sie bezposrednio, albo po do¬ daniu srodków konserwujacych i przechowaniu w niskiej temperaturze. Cena zl 10,— RZG — 230/73 105 egz. A4 PL PL