PL63305B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 26. V.1966 Niemiecka Republika Federalna Opublikowano: 25.IX.1971 63305 KI. 6 a, 22/07 MKP A 61 k, 19/02 UKD Wlasciciel patentu: Farbenfabriken Bayer A. G., Leverkusen (Niemiecka Republika Federalna) Sposób wyodrebniania inaktywatora kalikreiny z zanieczyszczonych roztworów wodnych i Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodreb¬ niania zanieczyszczonych roztworów wodnych ina¬ ktywatora kalikreiny, polipeptydu zwanego równiez inhibitorem Kunftza i inhibitorem trypsyny z trzu¬ stki bydla.Wiadomo, ze enzymy jak i zwiazki bialkowe lacza sie z substancjami spolimeryzowanymi. Tak np. trypsyna laczy sie z kopolimerem bezwodnika maleinowego i etylenu (E. Katchalski i in. Bio- chem 3(1964)1905). W powstajacych przy tym zwiaz¬ kach addycyjnych enzymy zachowuja w mniej¬ szym lub wiekszym stopniu swoja aktywnosc.Wiadomo równiez, ze mozna dezaktywowac enzym zwiazany w taki sposób z polimerem za pomoca inhibitora (E. Katchalski i in. patrz wy¬ zej).Inaktywator kalikreiny inaktywuje rózne enzy¬ my np. kalikreine, trypsyne, chymotrypsyne i fi- brynoine (plazmine) i trombine.Dane literaturowe nie wskazywaly dotychczas 20 na mozliwosc wykorzystania powyzszych danych w celu prostego i taniego wyodrebnienia inaktywa¬ tora kalikreiny z zanieczyszczonych roztworów otrzymywanych w toku produkcji.Stwierdzono, ze istnieje mozliwosc wyodreb- 25 nienia i tym samym wzbogacenia inaktywatora kalikreiny na drodze polaczenia kowalencyjnego w postaci zwiazku addycyjnego jednego z enzy¬ mów dezaktywowanych przez inaktywator kali¬ kreiny z nierozpuszczalnym lub rozpuszczalnym 30 10 15 polimerem. Otrzymuje sie wtedy nierozpuszczalny zwiazek albo zwiazek rozpuszczalny, który nastep¬ nie przeprowadza sie w postac nierozpuszczalna przez usieciowanie.Jako polimer stosuje sie kopolimer, bezwodnika kwasu maleinowego i etylenu korzystnie tak zwa¬ ne zywice EMA-31 do EMA-91 firmy Monsanto.Sa to zywice o ciezarze czasteczkowym 20 000— 90 000 i czasteczkach liniowych nieusieciowanych, których jedyna grupa funkcyjna jest grupa bez- wodnikowa, o ogólnym wzorze 1, które reaguja w roztworze wodnym z wolnymi grupami amino¬ wymi enzymów, tworzac zwiazki o wzorze 2, za¬ wierajace grupy amidowe i wolne grupy karbo¬ ksylowe. Przy tym nastepuje czesciowe osiecio- wanie lancuchów kopolimeru, poniewaz enzymy zawieraja wiecej niz jedna wolna grupe aminowa.Jezeli jest pozadane dalsze usieciowanie, to uzy¬ skuje sie je korzystnie przez dodatek dwuaminy, np. szesciometylenodwuaminy. Dwuamine dodaje sie kilka minut po dodaniu enzymu, co powoduje usieciowanie pozostalych wolnych grup bezwodni- kowych i zwiekszenie nierozpuszczalnosci otrzy¬ manej zywicy enzymowej.Wyzej wymienione nierozpuszczalne pochodne enzymów sa czynne enzymatycznie. Wiaza one inaktywator podobnie jak wolne enzymy, wytwa¬ rzajac nierozpuszczalne zwiazki kompleksowe. Za¬ leta tych nierozpuszczalnych kompleksów jest latwosc wydzielenia ich z roztworów, zawieraja- 6330563305 cych zanieczyszczenia, przez zwykle odsaczenie na kolumnie lub na nuczy. Przez wymycie woda lub roztworem buforowym usuwa sie resztki to¬ warzyszacych inaktywatorowi zanieczyszczen. Ten prosty sposób oczyszczania i tym samym wzboga- 5 cania nie byl dostepny dopóki dysponowalo sie tylko rozpuszczalnymi enzymami i rozpuszczal¬ nymi kompleksami enzym-inaktywator. v W celu wydzielenia inaktywatora dysocjuje sie jego zwiazek kompleksowy przez zmiane wartosci !P pH i/albo zmiane stezenia jonów. Mozna tez wy¬ przec go za pomoca odpowiednich substratów, które po zetknieciu z enzymem ulegaja przemia¬ nie i natychmiast dysocjuja, lub substancji hamu¬ jacych, jak w przypadku trypsyny, za pomoca 15 tryptaminy, kwasu a-aminokapronowego lub n-bu- tyloaminy, tworzacych z enzymem kompleks, blo¬ kujacy aktywne grupy enzymu, ewentualnie przez dodatek substancji, które jak np. mccznik, sa w sta¬ nie rozluznic miedzyczasteczkowe sily wzajemnego 20 oddzialywania, co nastepuje przez odwracalna de- naturacje bioracej udzial proteiny.Sposób wedlug wynalazku umozliwia otrzymanie czystych inaktywatorów nawet z najbardziej zanie¬ czyszczonych roztworów. 25 Nizej podane przyklady ilustruja wynalazek, nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. 5 g trypsyny rozpuszczonej w 500 ml 0,2 m — roztworu buforowego fosforanu potasu o wartosci pH = 7,5 oraz 1 g kopolimeru 30 bezwodnika kwasu maleinowego i etylenu (DX 840—21, EMA-M) zawieszono w 1 1 wymienionego buforu. Nastepnie dodano 100 ml 0,1% wodnego roz¬ tworu szesciometylenodwuaminy. Po zakonczeniu re¬ akcji produkt zmieszano z podwójna objetoscia od- 35 szlamowanego proszku celulozowego i wlano do ko¬ lumny. Kolumne przemyto 0,1 m buforem trójeta- noloaminowym o wartosci pH = 7,8, zawierajacym ponadto 0,1 m-NaCl i 0,01 m CaCl2, do stwierdzenia braku w eluacie aktywnej trypsyny. Wszystkie 40 operacje przeprowadzono przy chlodzeniu (4°C).Znomogemizowana tkanke trzustki bydlecej od- bialczono za pomoca kwasu nadchlorowego lub eta¬ nolu, zatezono pod próznia i doprowadzono do war¬ tosci pH =7,8 za pomoca podanego wyzej buforu. 45 Roztwór podano bezposrednio na kolumne. Po przepuszczeniu przez kolumne roztworu inhibitora z kolumny wymyto calkowicie proteiny za pomoca buforu i wody, nastepnie eluowano inhibitor bu¬ forem HCl(KCl/0,2 n-KCl) o wartosci pH = 2. Po 50 doprowadzeniu do wartosci pH = 7,8 kolumne mozna stosowac do dalszych operacji. Przy stosowaniu chlodzenia (4°C, woda) kolumne mozna uzywac do wydzielania inaktywatora kalikreiny w ciagu miesiecy bez wyraznego zmniejszenia sprawnosci. 55 Przy oczyszczaniu w temperaturze 4—8°C wydaj¬ nosc preparatu o czystosci okolo 80% wynosi 90— 100%. Po zatezeniu kwasny roztwór inhibitora od- solono za pomoca wymieniaczy jonowych i zliofili- zowano. 60 Przyklad II. 200 mg kopolimeru bezwodnika kwasu maleinowego z etylenem zhomogenizowano krótko w temperaturze 0°C.z 200 ml 0,2 m— roz¬ tworu buforowego fosforanu potasu o wartosci pH = 7,5, po czym zmieszano w ciagu 3 minut 65 z 20 ml 0,1% roztworu szesciometylenodwuaminy, ; dodano do tego 1 g alfa-chymotrypsyny, rozpusz¬ czonej w 100 ml 0,2-m-buforu fosforowego o war¬ tosci pH = 7,5 i otrzymana mieszanine mieszano w ciagu nocy w temperaturze 0—4°C, przy utrzy¬ mywaniu wartosci pH = 7,5 przez dodanie buforu.Osad przemyto (wirowanie) kilkakrotnie trójeta- noloaminowym roztworem buforowym o wartosci pH = 8,7 (0,1 m trójetanoloaminy, 0,1 m-NaCl, 0,01 m-CaCl2) po czym zmieszano z okolo trzykrotna objetoscia proszku celulozowego (Schleicher u. Schull) i wlano do kolumny chlodzonej woda.Po okolo 6 godzinach kolumne przemyto tym sa¬ mym buforem. 100 mg wstepnie oczyszczonego preparatu inakty¬ watora kalikreiny z pluc bydlecych o 50 000 KIE (jednostek miedzynarodowych) rozpuszczonego w 0,2 m roztworze buforowym fosforanu potasu o wartosci pH = 7,8 zaadsorbowano calkowicie na kolumnie. Inaktywator kalikreiny eluowano ilo¬ sciowo za pomoca buforu 0,25 m KC1/HC1 o war¬ tosci pH = 2, po czym czystosc jego wzrosla od 7% do 90%.Przyklad III. Wyciag trzustki bydlecej odbial- czony kwasem nadchlorowym i odsolony za po¬ moca Sephadex G-25 zawieral 200 000 I mU dla trypsyny z czego okolo 50% wynika z obecnosci inaktywatora ka.ikreiny. Wyciag po dodaniu NaCl (0,2 m) i buforu o wartosci pH 8 wprowadzono do kolumny EM-chymotrypsynowej otrzymanej we¬ dlug przykladu II. W przesaczu z kolumny stwier¬ dzono 100 000 I mU dla trypsyny, z których tylko mniej niz 1% tlumaczy sie obecnoscia inaktywa¬ tora kalikreiny. Po eluowaniu kolumny kwasnym roztworem wedlug przykladu II otrzymano inakty¬ wator kalikreiny w czystej postaci.Przyklad IV. 400 mg kopolimeru bezwodnika kwasu maleinowego i etylenu zhomogenizowano w 200 ml 0,2 m-buforu fosforowego o wartosci pH = 7,5 w temperaturze 0°C, mieszanine zadano w celu dalszego usieciowania 2 ml 1% roztworu szesciometylenodwuaminy, mieszano w ciagu 3 mi¬ nut w temperaturze 0°C, po czym dodano 100 000 IKE (2 u g proteiny (KE) rozpuszczonej w 20 ml 0,2 m-buforu fosforanowego o wartosci pH = 7,5 i otrzymana zawiesine mieszano w ciagu nocy w temperaturze 0—4°C.EM-kalikreine (kopolimer bezwodnika kwasu ma¬ leinowego z etylenem zwiazano z 99 500 JKE) zmie¬ szano z okolo 4-krotna objetoscia proszku celulo¬ zowego i wlano do kolumny wypelnionej warstwa Sephadex G-25 o wysokosci 1 cm i chlodzonej woda.Po przemyciu kolumny EM-kalikreinowej 1,0 rn-bu- forem trój etanol caminewym (+0,2 m NaCl) o war¬ tosci pH = 7,8 wprowadzono 80 000 KIE inaktywa¬ tora kalikreiny. Z tego adsorbowano na kolumnie 75 000 KIE. 40 000 KIE eluowano za pomoca roz¬ tworu buforowego octanu amonu o wartosci pH =- 2.Kolumne EM-kalikreinowa przy wartosci pH = 7;8} mozna ponownie zaladowac inaktyv,atorem kali¬ kreiny, poniewaz zwiazana kalikreina nie zostala uszkodzona przez bufor eluacyjny o wartosci pH = 2.Przyklad V. Z kolumny wedlug przykladu IV zaladowanej inaktywatorem kalikreiny eluowanoV 63305 go przy obojetnej wartosci pH roztworem 8 m- -mocznika ( + 0,1 m bufor trójetanoloaminowy o wartosci pH = 7,8). Wydajnosc inaktywatora ka- likreiny (po oddzieleniu mocznika za pomoca ko¬ lumny Sephadex G-25) wyniosla okolo 100°/o. PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wyodrebniania inaktywatora kalikreiny z zanieczyszczonych roztworów wodnych, znamienny tym, ze na ten roztwór dziala sie zwiazkiem kowa¬ lencyjnym o wzorze 2, otrzymywanym z kopolime¬ ru bezwodnika kwasu maleinowego i etylenu o wzo¬ rze 1 i ciezarze czasteczkowym 20 000 -90 000 z en¬ zymem ulegajacym inaktywujacemu dzialaniu inak¬ tywatora kalikreiny, ewentualnie dodatkowo usie- ciowanym za pomoca dwuaminy, po czym otrzy¬ many nierozpuszczalny w wodzie zwiazek kom¬ pleksowy polimer — enzym — inaktywator, odsacza sie i przemywa, a nastepnie poddaje sie go dy- socjacji i eluuje inaktywator kalikreiny. O / \ CO CO I I -CK,- CH«- CH — CH- WZOD 1 NH — Enzym I CO COOH I WZOD 2 PL PL PL PL PL PL PL PL