Uprawniony z patentu: Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen (Republika Federalna Niemiec) Sposób wzbogacania roztworów polipeptydów, zwlaszcza enzymów i inhibitorów enzymów Przedmiotem wynalazku jest sposób wzbogaca¬ nia roztworów polipeptydów, zwlaszcza enzymów i inhibitorów enzymów, oraz ich oczyszczania i wy¬ odrebniania.Znany jest sposób wzbogacania polipeptydów polegajacy na tym, ze polipeptyd wiaze sie kowa- lentnie z nierozpuszczalnym lub rozpuszczalnym nosnikiem, a na utworzony addukt dziala sie w srodowisku wodnym roztworem zawierajacym sub¬ stancje, zdolne do tworzenia z polipeptydem kom¬ pleksu, utworzony kompleks oczyszcza sie przez przemycie lub metoda chromatograficznej adsorpcji, dysocjuje sie go i wyodrebnia substancje tworza¬ ca kompleks.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze do adduktu utworzonego z polipeptydu i nierozpusz¬ czalnego albo rozpuszczalnego nosnika przed dal¬ sza przeróbka wprowadza sie grupy zasadowe. Ja¬ ko wzbogacone polipeptydy stosuje sie enzymy i jako substancje kompleksotwórcze stosuje sie od¬ powiednie inhibitory enzymów jako wzbogacone polipeptydy stosuje sie inhibitory enzymów i jako substancje kompleksotwórcze stosuje sie odpo¬ wiednie enzymy.Sposób ten dotyczy w szczególnosci wzbogacania inhibitorów enzymów i polega na tym, ze enzym, którego dzialanie ulega zahamowaniu pod wply¬ wem odpowiedniego inhibitora, wiaze sie kowalen- tnie z nosnikiem i na powstaly nierozpuszczalny zwiazek dziala sie w srodowisku wodnym roztwo¬ rem inhibitora enzymu, wytworzony kompleks oczyszcza sie przez przemycie, poddaje dysocjacji i wyodrebnia inhibitor enzymu.Jako nierozpuszczalne i rozpuszczalne nosniki 5 stosuje sie przede wszystkim substancje polime- ryczne. Substancje te musza zawierac grupy fun¬ kcyjne, reagujace zgodnie z metodami chemii pe- ptydów z odpowiednimi polipeptydami, enzymami i inhibitorami enzymów. Nalezy tu wymienic prze- io de wszystkim zywice, zawierajace grupy kwaso- bezwodnikowe, kwasochlorobezwodnikowe, izocyja- nianowe i azydowe, jak równiez zywice zawiera¬ jace aktywowane atomy fluoru [Makromol. Chem. 39 (1960), 137]. Moga tu równiez wchodzic w gre 15 znane w handlu zywice jonowymienne, zawieraja¬ ce grupy karboksylowe po wprowadzeniu do nich aktywowanych grup funkcyjnych. Wiekszosc tych zywic zwana jest dlatego w dalszym ciagu zywica¬ mi typu A. Jesli do zywic tych wprowadzi sie gru- 20 py zasadowe, to otrzyma sie tak zwane zywice po- liamfoteryczne, w których wylacznie ujemny la¬ dunek ulegl oslabieniu niemal do calkowitego „zobojetnienia". Zywice te w dalszym ciagu beda nazywane zywicami typu N. 25 Opisany sposób mozna znacznie ulepszyc, jesli jako nosników uzyje sie zywic typu N. Uzyskuje sie przy tym nastepujace korzysci: Zywice typu N wykazuja zazwyczaj wieksza zdolnosc wiazania, niz zywice typu A. Przy zastosowaniu zywic typu 3o N wyodrebniane substancje mozna oddzielac 82 62082 620 3 < 4 w znacznie lagodniejszych warunkach, np. przy wyzszym pH, czyli w mniej kwasnym srodowisku, niz przy uzyciu zywic typu A. Zywice typu N wia¬ za równiez enzymy i inhibitory enzymów o niz¬ szym punkcie izoelektrycznym, które przez zywice A nie sa albo wcale, albo tylko bardzo slabo wia¬ zane. Tak np. zywica N-kallikreinoinhibitorowa wiaze kallikreine, której nie wiaze zupelnie zywi¬ ca A-kallikreinoinhibitorowa, zas zywica N-tryp- synowa wiaze inhibitory z ziaren soi, bialka jaj kurzych i z osocza, które przez zywice A-trypsy- nowa albo w ogóle nie ulegaja zwiazaniu lub tyl¬ ko w o wiele mniejszym stopniu.Zywice typu N wytwarza sie przez wprowadze¬ nie w odpowiednim momencie do ukladu, skladaja¬ cego sie z nosnika i enzymu albo z nosnika i inhi¬ bitora enzymu poliamin alifatycznych i/lub aro¬ matycznych, w których wolna jest tylko jedna grupa aminowa, zas pozostale grupy aminowe sa zabezpieczone przeciw zacylowaniu. Przykladem tego rodzaju amin sa N,N-dwumetyloetylenodwu- amina, agmatyna, N-metylo-N'-(3-aminopropylo)- -piperazyna, 4-aminopirydyna, 2-aminopirydyna, 3-amino-l-cykloheksylo-aminopropan i inne.W czasie procesu prowadzonego sposobem wedlug wynalazku powstaly kompleks zwiazany z zywica typu N poddaje sie starannemu przemyciu woda i roztworami buforowymi w celu usuniecia substancji towarzyszacych i zanieczyszczen, a nastepnie poddaje sie go dysocjacjL Dysocjacji tej mozna dokonac przez zmiane pH i/lub zmiane stezenia jonów i/lub wy¬ parcie przez konkurencyjnie dzialajace substancje hamujace lub podkladowe, np. tryptamine lub n- -butyloamine w przypadku trypsyny i/lub przez dodatek takich substancji, które, jak np. mocznik i sole guanidyny, sa w stanie spowodowac rozluz¬ nienie albo oslabienie wzajemnych oddzialywan miedzyczasteczkowych, co ewentualnie odbywa sie poprzez odwracalna denaturacje protein, bioracych udzial w procesie.Z posród enzymów, które sposobem wedlug wy¬ nalazku daja sie wzbogacic w ich mniej lub wie¬ cej zanieczyszczonych roztworach, a nastepnie oczy¬ scic i z tych roztworów wyodrebnic, nalezy wy¬ mienic w pierwszym rzedzie trypsyne, chymotryp- syne, kallikreine, plazmine, pepsyne, renine, rybo- nukleaze, trombine, amylaze, papaine, hialuroni- daze, karbopeptydaze A i B, pankreatopeptydaze E, penicylinaze i cholinoesteraze.Do inhibitorów, które mozna wzbogacic, oczyscic i wyodrebnic sposobem wedlug wynalazku, zalicza sie przede wszystkim znany inhibitor kallikreiny i trypsyny (inhibitor Kunitza, Trasylol ®), specy¬ ficzny inhibitor hamujacy dzialanie wylacznie tryp¬ syny, otrzymywany z trzustki swin i zwierzat ro¬ gatych, dalej inhibitor trypsyny otrzymywany z pecherzyków nasiennych oraz inhibitory trypsy¬ ny otrzymywane z nasion roslinnych i kartofli.Sposób wedlug wynalazku stwarza dalej mozli¬ wosc odkrywania nowych inhibitorów dla znanych enzymów i odwrotnie, odkrywania nowych enzy¬ mów, których dzialanie ulega przez dany inhibitor zahamowaniu. W pierwszym przypadku wiaze sie dany enzym kowalentnie na nosniku, a otrzymany W ten sposób addukt traktuje sie roztworami, mo¬ gacymi zawierac inhibitory tego enzymu, tak dlu¬ go az aktywnosc biologiczna enzymu calkowicie za¬ niknie. W drugim przypadku postepuje sie analo¬ gicznie, jednakze w odwrotnej kolejnosci. 5 Sposób wedlug wynalazku ma te zalete, ze stwa¬ rza mozliwosc latwego wzbagacania, oczyszczania i wyodrebniania z dobra wydajnoscia i w stanie wysokiej czystosci równiez takich polipeptydów, enzymów i inhibitorów enzymów, których wzboga- 10 canie w zanieczyszczonych roztworach stwarzalo dotychczas trudnosci i wymagalo duzych nakla¬ dów.Przyklad I. Wytwarzanie nierozpuszczalnej w wodzie zywicy trypsynowej typu N przedstawia 15 zalaczony schemat. 200 mg zywicy EMA-31 firmy Monsanto dodano, mieszajac, do ochlodzonej do temperatury 0° — 4°C mieszaniny 20 ml 0,l°/o roz¬ tworu szesciometylenodwuaminy i 75 ml 0,2 molo¬ wego roztworu buforowego soli (0,1 mola/litr trój- 20 etanoloaminy i 0,1 mola/litr NaCl) o pH 7,8. Za¬ wiesine homogenizowano krótko przy jednoczes¬ nym chlodzeniu, mieszano i po 2 minutach od mo¬ mentu dodania zywicy zadano ochlodzonym do temperatury 0° — 4°C roztworem 1 g trypsyny 25 w 75 ml roztworu buforowego soli. Po 4 minutach mieszania do tej mieszaniny reakcyjnej dodano wodnego roztworu 4 g N,N-dwumetyloetylenodwu- aminy, rozcienczonej woda w stosunku objetoscio¬ wym 1:1 i nastawionej na pH 7,8 2 N roztworem 30 HC1. Mieszanine reakcyjna mieszano nastepnie w ciagu 2 godzin, a nastepnie odwirowano.W roztworze nad osadem znajdowalo sie jeszcze 320 mg trypsyny, to znaczy, ze 68% uzytej trypsyny uleglo zwiazaniu z zywica. Nieroz- 35 puszczalna zywice trypsynowa typu N zmieszano z dwukrotna objetoscia sproszkowanej celulozy Cellex XF 1 (Biorad Laboratories), zaladowano do kolumny ochlodzonej do temperatury 0° — 4°C i przemywano tak dlugo w ciagu nocy roztworem 40 buforowym soli (0,1 mola/l trójetanoloaminy, 0,1 mola/l NaCl i 0,01 mola/l CaCl2) o pH 7,8, póki w odcieku nie stwierdzono calkowitego zaniku od¬ czynu trypsynowego. Podobne wydajnosci zywic trypsynowych typu N uzyskano, stosujac zamiast 45 N,N-dwumetyloetylenodwuaminy inne podane wy¬ zej w opisie aminy.W zalaczonym schemacie wytwarzania zywic proteinowych typu N z lewej strony przedstawio¬ no sieciowanie (szesciometylenodwuamina), w srod- 50 kowej czesci przylaczanie inhibitora lub enzymu (poprzez reszty e-amino-Lys), z prawej strony two¬ rzenie sie par jonów (dwumetyloetylenodwuamina), R = —CH3.Przyklad II. Wyodrebnianie inhibitorów za 55 pomoca zywicy trypsynowej typu N. a. Specyficzny inhibitor trypsyny z trzustki swin.Uwolniony za pomoca 3% kwasu nadchlorowego od wyzejczasteczkowych bialek wyciag z trzustki swin (p. Fritz H., Hartwich G., Werle E., Z. phy- 60 siol. Chem. 348 (1966), 150) zawiera inhibitor o ak¬ tywnosci wlasciwej 0,014 ImU/^g proteiny biureto- wej. Definicja jednostki ImU jest podana w po¬ wyzszej pozycji literatury; 1 ImU dla trypsyny ha¬ muje okolo 1 \ig preparatu Trypure Novo R. 65 Zywice trypsynowa typu N, otrzymana z 10 25 82 620 6 bitor trypsyny i chymotrypsyny o ciezarze czastecz¬ kowym okolo 23 000. Jako surowiec wyjsciowy slu¬ zyl techniczny inhibitor z nasion soi produkowany i liofilizowany przez firme Serva, Heidelberg, RFN, 5 o aktywnosci wlasciwej 0,36 ImU dla trypsyny na 1 \ig proteiny biuretowej. Inhibitor w ilosci 149400 ImU dla trypsyny zostal zwiazany calkowicie z obojetna zywica trypsynowa typu N otrzymana z 5 g trypsyny. Po 1 godzinnym wymieszaniu io kompleksu zywicy N-trypsynowej z inhibitorem z 0,3 molowym roztworem buforowym KC1+HC1 w cieczy pozostalej nad osadem o objetosci 150 ml znajdowalo sie 135 000 ImU, to jest 90% w sto¬ sunku do ilosci zwiazanego inhibitora. Aktywnosc 15 wlasciwa wyodrebnionego w ten sposób inhibitora z nasion soi wynosila po odsoleniu na kolumnie wypelnionej adsorbentem Sephadex-G-25 (120X X3 cm, 0,01 molowy roziwor buforowy octanu kol- lidyny o pH 8,0) 2,0 ImUAig proteiny buforowej, 20 co odpowiada prawie 6-krotnemu wzbogaceniu.Przyklad III. Wytwarzanie nierozpuszczalnych w wodzie zywic inhibitorowyeh z Trasylolem® Zy¬ wica anionowa typu A. Do mieszaniny 23 ml 0,2 molowego fosforanowego roztworu buforowego o 25 pH 8,0 i 2,0 ml 0,1% roztworu szesciometylenodwu- aminy (HMD) dodano 120 mg zywicy EMA-81 lub EMA-31 firmy Monsanto. Mieszanine przez chwile homogenizowano, mieszano i dokladnie po 5 minu¬ tach (przy zywicy EMA-31 po 3 minutach) od 30 chwili dodania zywicy zadano roztworem 200 mg (okolo 600 000 ImU trypsyny) inhibitora trypsyny i kallikreiny w 30 ml tego samego fosforanowego roztworu buforowego. Mieszanine reakcyjna mie¬ szano przez noc (16 godzin) w szafie chlodniczej, 35 nastepnie odwirowano, a w pozostalym roztworze oznaczano zawartosc niezwiazanego inhibitora.Osad zywicy inhibitorowej przemyto wielokrotnie 0,2 molowym trójetanoloaminowym roztworem bu¬ forowym o pH 7,8 az do calkowitego zaniku zawar- 40 tosci inhibitora w przesaczu. Wszystkie operacje wykonywano stosujac chlodzenie do temperatury 0°_4°C.Zywica obojetna typu N. Wsad jak w przypadku zywicy typu A. Dokladnie po 8 minutach od mo- 45 mentu dodania roztworu inhibitora do zawiesiny zywicy (EMA-81) dodano do mieszaniny reakcyj¬ nej (zywica+inhibitor) dodatkowo roztworu 1,6 £ N,N-dwumetyloetylenodwuaminy (NND) w nie¬ wielkiej ilosci wody nastawionego na pH 8 2 N 50 roztworem HC1. Otrzymana mieszanine mieszano trypsyny, rozmieszano w obojetnym roztworze za¬ wierajacym inhibitor (2,14 1 odpowiada 745 000 ImU trypsyny), chlodzac do temperatury 0°—4°C.Po 2,5 godzinach mieszania w tej temperaturze mieszanine odwirowano, a roztwór z nad osadu odrzucono. Nierozpuszczalny kompleks inhibitora trypsyny z zywica wymieszano nastepnie trzykrot¬ nie w 0,2 molowym roztworze buforowym soli (0,1 mola/l trójetanoloaminy, 0,1 mola/l NaCl, 0,01 mola/l CaCl2) o temperaturze 0°—4°C, po czym po- kazdorazowym odwirowaniu roztwór z nad osadu odrzucano.Przemyty kompleks wymieszano w 0,2 molowym roztworze KC1, a powstala zawiesine nastawiono na pH 2,0 przez dodanie 2 N HC1, po czym mieszano, chlodzac, przez 1,5 godziny. W koncu zawiesine odwirowano, a osad (zywica enzymowa plus kom¬ pleks zywicy) jeszcze raz przemywano, jak wyzej, 0,2 molowym roztworem KC1/HC1 o pH 2,0. Laczna ilosc inhibitora, znajdujaca sie w obu polaczonych roztworach z nad osadu, wynosila 458 600 ImU trypsyny, to znaczy 68,5% ilosci wzietej do próby wyodrebnienia. Aktywnosc wlasciwa otrzymanego preparatu inhibitora wynosila 0,32 ImU/ug proteiny biuretowej, a po odsoleniu na kolumnie wypelnio¬ nej adsorbentem Sephadex G-25 (zel dekstranu firmy Pharmacia, Uppsala, Szwecja) 2,73 ImU/\ig proteiny biuretowej.Na zalaczonym rysunku przedstawiono przebieg krzywej dysocjacji inhibitora z trzustki swin two¬ rzacego kompleks z zywica typu N oraz z zywica typu A. Okazuje sie, ze wydzielanie sie inhibitorr% z kompleksu z zywica typu N zachodzi w zakre¬ sie mniej kwasnych odczynów niz z kompleksu 7 zywica typu A.Objasnienie rysunku. Zywice trypsynowe typu N otrzymano w sposób podany w opisie; zywice trypsynowe typu A otrzymano analogicznie, jednak bez dodatku N,N-dwumetyloetylenodwuaminy.Krzywe ciagle: Kompleks zywicy trypsynowej typu N lub A z inhibitorem kallikreiny.Krzywe przerywane: Kompleks zywicy trypsyno¬ wej typu N lub A ze specyficznym inhibitorem trypsyny z trzustki swin.Rzedna: Procentowa ilosc inhibitora uwolnione¬ go za kazdym razem z kompleksu przy danej war¬ tosci pH zawiesiny. b. Poliwalentny inhibitor kallikreiny z organów wolowych. W sposób analogiczny jak w wyzej opi¬ sanym przypadku inhibitora trypsyny z trzustki swin poddano wzbogacaniu na zywicy trypsynowej typu N inhibitor Kunitz'a Trasylo® Przebieg krzy¬ wej dysocjacji nierozpuszczalnego w wodzie kom¬ pleksu poliwalentnego inhibitora z zywica trypsy- nowa typu N i A przy róznych wartosciach pH wodnej zawiesiny podano równiez na rysunku. Ja¬ ko material wyjsciowy sluzyl techniczny inhibitor kallikreiny. Przy uzyciu zywicy trypsynowej typu N uzyskano z niego z 86% wydajnoscia czysty inhi¬ bitor kallikreiny o aktywnosci wlasciwej 3,75 ImU/[.ig proteiny. Szczególowy tok postepowania jak przy opisanym w p. II a) wyodrebnianiu inhi¬ bitora trypsyny z trzustki swin. c. Inhibitor z nasion soi. W analogiczny sposób jak w przykladzie Ha poddano wzbogaceniu inhi- Tablica 1 Typ zywicy EMA-31 EMA-81 EMA-81 Czas mie¬ szania po dodaniu HMD NND 3 - 5 8 5 5 Ilosc doda¬ nego do zywicy inhibitora % 92 81 32 Oznakowanie zywicy inhibitorowej zywica A zywica N8 zywica N5 jeszcze przez 2 godziny, nastepnie odwirowano, a nierozpuszczalna zywice inhibitorowa przerabiano jak wyzej. W tablicy 1 przytoczono równiez zywice typu N, przy otrzymywaniu której chlorowodorek 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6082 620 7 8 N-N-dwumetyloetylenodwuaminy dodano do mie¬ szaniny reakcyjnej (zywica+inhibitor) nie po 3, lecz po 5 minutach. a. Adsorpcja i dyisocjacja trypsyny i chymotry- psyny na anionowych typu A i obojetnych typu N zywicach inhibitorowych.Adsorpcja. Zywice inhibitorowa zmieszano z oko¬ lo 20 ml 0,1 molowego trójetanoloaminowego roz¬ tworu buforowego (plus 0,1 M NaCl plus 0,01 M CaCl2) i zadano nadmiarem enzymu rozpuszczonego w nie¬ wielkiej ilosci roztworu buforowego. Po dwugo¬ dzinnym mieszaniu, ewentualnie przez noc, osad odwirowano, a w pozostalym roztworze oznaczono zawartosc niezaadsorbowanego enzymu. Nierozpusz¬ czalny kompleks zywiczny przemyto roztworem buforowym o pH 7,8 az do calkowitego zaniku ak¬ tywnosci enzymatycznej w przesaczu. Wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 0°—4°C.Dysocjacja i wymywanie enzymu. Po ostatnim przemyciu sporzadzono zawiesine nierozpuszczalne¬ go kompleksu enzymu z zywica inhibitorowa w okolo 50 ml 0,3 molowego roztworu KC1 i nasta¬ lo 15 (3 do 4-krotnde po 50 ml), póki w pozostalym po odwirowaniu roztworze nie stwierdzono niemal zu¬ pelnej nieobecnosci enzymu. Wyniki podano w ta¬ blicy 2. b. Wzbogacanie roztworów kallikreiny przy po¬ mocy obojetnych zywic inhibitorowych: Do prób uzyto zywic inhibitorowych N5 i N8. W celu prze¬ prowadzenia adsorpcji kallikreine rozpuszczono w okolo 20 ml 0,1 molowego trójetanoloaminowego roztworu buforowego (+0,1 M NaCl) o pH 7—8, a do roztworu dodano, mieszajac, zywicy inhibitoro- wej. Po okolo czternastogodzinnym mieszaniu (przez noc, wystarczy jednak 2 godziny) osad od¬ wirowano, a w pozostalym roztworze oznaczono zawartosc niezwiazanej kallikreiny. Nierozpuszczal¬ ny kompleks kallikreiny z zywica inhibitorowa przemyto roztworem buforowym az do calkowitego zaniku zawartosci kallikreinyi proteiny w przesaczu.Uwolnienia kallikreiny z kompleksu z zywica in¬ hibitorowa dokonano 0,38—1,00 molowymi roztwo¬ rami soli guanidyny, które nastawiono na zadana wartosc pH za pomoca 0,1 molowego roztworu bu- Typ zy¬ wicy inhi¬ bito¬ rów j Ilosc in¬ hibitora zwiaza¬ nego z zywica (IU) Ta Ilosc zaadsor- bowanego enzymu mg %* blica 2 Ilosc uwolnionego enzymu w % (w stosunku do ilosci zaadsorbowa- nego enzymu) przy pH 3,5 3,0 2,5 2,0 1,7 Lacz- 1 nie Trypsyna 1 A N5 66,8 42,9 11,8 18 18,8°) 44 - 0 1 0 11 1 36 9 69 60 90 Chymotrypsyna A N5 66,8 42,9 3,7 3,5 15,7 37,0 0 31 1 45 6 37 17 - 17 1 80 a) w stosunku do ilosci enzymu ulegajacej w roztworze zahamowaniu przez taka sama ilosc inhibitora, b) przy pierwszym uzyciu zywicy 27,3 mg (64*/i a); po czterokrotnym uzyciu zy¬ wicy stale 13 mg (30V« a). wiono na zadana wartosc pH za pomoca 2 N roz¬ tworu HC1. Po dwugodzinnym mieszaniu zakwa¬ szonej zawiesiny osad ponownie odwirowano, a w pozostalym roztworze oznaczono stopien aktywnosci enzymatycznej. W celu calkowitego uwolnienia enzymu z zywicy operacje powtarzano tak dlugo forowego octanu sodowego. W celu calkowitego uwolnienia kallikreiny nalezy kompleks zywiczny 4—5 razy po 2 godziny wymieszac z 20 ml roztworu soli guanidyny, a nastepnie odwirowac zywice inhi¬ bitorowa. Temperatura pracy 0—4°C.Wyniki podano w tablicy 3.Tablica 3 Typ zywicy inhibito- rowej N8 N7 Ilosc zwiaza¬ ne? a z zywica inhibitora IUa) 110,9 221,9 Ilosc zaadsorbo- wanej kallikreiny KEb) %0 9 790 4,9 24 940 6,2 Ilosc uwolnionej kalli¬ kreiny (w stosunku do ilosci kallikreiny za- adsorbowanej) przy pH 7,0 15 6,0 53 64 5,0 59 Lacz¬ nie 72 64 a) ImU trypsyny: 1 ImU hamuje dzialanie okolo 1 pg trypsyny i odpowiada 0,27 fig czystego inhibitora i 0,33ug naszego preparatu inhibitora. b) 1 KE (jednostka biologiczna aktywnosci kallikreiny; patrz: Frey E.K., Kraut H., Werle E., Kallikrein-Padutin, F. Enke-Verlag, Stuttgart 1950) odpowiada okolo 0,7^g proteiny czystej kallikreiny (patrz: Fritz H., Eckert I., Werle E , Z. physiol. Chem. 348 (1967), 1120). c) w stosunku do ilosci enzymu, która ulega zahamowaniu przez taka sama ilosc inhibitora w roztworze.82 620 PL PL PL PL PL PL PL PL