Opublikowano: 15.IV.1970 59365 KI. 12 o, 25/04 MKP C 07 c UKD a\u Wspóltwórcy wynalazku: mgr inz. Zdzislaw Zakrzewski, mgr Anna Groszkiewicz, mgr Sabina Raczkowska, inz.Maria Malinowska Wlasciciel patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (Polska) Sposób wyodrebniania metyloandrostadienolonu z brzeczki pofermentacyjnej Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrebnia¬ nia metyloandrostadienolonu z brzeczki pofermen¬ tacyjnej. Metyloandrostadienolon, cenny lek o dzia¬ laniu anabolicznym, powstaje z metyloandrosteno- lonu w wyniku biotransformacji wywolanej drob¬ noustrojami odwodorniajacymi. Ze wzgledów eko¬ nomicznych przemiany nie prowadzi sie do konca, w zwiazku z czym w brzeczce pofermentacyjnej zawarty jest zarówno produkt (w roztworze) jak i substrat (w postaci zawieszonego osadu).Znany sposób wyodrebniania metyloandrostadie¬ nolonu z brzeczki [pofermentacyjnej czy tez jej frak¬ cji polega na wyczerpujacej ekstrakcji tych mie¬ szanin rozpuszczalnikami organicznymi i nastepnej przeróbce otrzymanych ekstraktów na drodze fizy¬ kochemicznej lub fizycznej, na przyklad metoda chromatografii kolumnowej lub przez wielokrotna krystalizacje pozostalosci po odparowaniu rozpusz¬ czalnika. Sposób ten zwiazany jest ze znacznym nakladem ipracy, czasu i kosztów. Tak wiec na przyklad przy wielokrotnej krystalizacji pozostalos¬ ci powstaja straty siegajace 10% zawartej w suro¬ wym produkcie ilosci steroidów, a poza tym znacz¬ ne zuzycie rozpuszczalnika, przy czym laczna wy¬ dajnosc procesu wyodrebniania z brzeczki wynosi okolo 85%.Stwierdzono, ze w przypadku metyloandrostadie¬ nolonu i metyloandrostenolonu mozna zastosowac metode chemiczna wyodrebniania, oparta na pow¬ stawaniu nowych i nie opisanych dotad w litera- 2 turze trudno rozpuszczalnych polaczen addycyj¬ nych z /^-naftolem. Otrzymane polaczenia addycyj¬ ne w srodowisku alkalicznym ulegaja latwo roz¬ kladowi, uwalniajac odpowiedni zwiazek steroido- 5 wy z niemal ilosciowa wydajnoscia i w stanie wy¬ sokiej czystosci. Sposób ten wplywa na uzyskanie równie wysokiej ogólnej wydajnosci procesu oraz znacznie upraszcza przerób produktów biotransfor¬ macji w porównaniu ze sposobami znanymi. 10 Wedlug wynalazku z brzeczki pofermentacyjnej, zawierajacej metyloandrostadienolon oraz nieprze- reagowany metyloandrostenolon, sedymentuje sie i/lub odwirowuje albo tez odsacza czesci stale, czesc ciekla brzeczki jpoddaje sie ekstrakcji rozpuszczal- 15 nikami organicznymi, ekstrakt zageszcza sie, za¬ geszczony roztwór zadaje sie ^-naftolem i ewentu¬ alnie czesciowo odparowuje sie rozpuszczalnik, wy¬ tracony zwiazek addycyjny z ^-naftolem oddziela sie, rozpuszcza w organicznym rozpuszczalniku, roz- 20 twór zadaje sie wodnym roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, warstwe wodna zawierajaca /?-naftolan metalu alkalicznego oddziela sie, a z warstwy organicznej po przemyciu woda wydziela sie metyloandrostadienolon przez czesciowe odparo- 25 wanie rozpuszczalnika i oziebienie roztworu.W analogiczny sposób z oddzielonej czesci stalej brzeczki ewentualnie odzyskuje sie nieprzereagowa- ny metyloandrostenolon poprzez jego zwiazek ad¬ dycyjny z ^-naftolem. Mozna równiez odzyskac nie- 30 przereagowany metyloandrostenolon z czesci stalej 593653 brzeczki w aposób znany, na przyklad przez eks¬ trakcje rozpuszczalnikiem organicznym, odparowa¬ nie ekstraktu i oczyszczenie surowego produktu przez krystalizacje lub metoda chromatograficzna.Jako rozpuszczalnik ograniczny stosuje sie roz- 5 puszczalnik z grupy pochodnych chlorowcowych zwiazków alifatycznych, takich jak chlorek etylenu, chloroform i inne.Wyodrebniony sposobem wedlug wynalazku me¬ tyloandrostadienolon, zarówno jak i odzyskany me- 10 tyloandrostenolon, charakteryzuja sie wysoka czy¬ stoscia.Przyklad, Z 2,5 1 brzeczki pofermentacyjnej zawierajacej produkt dehydrogenacji 2,5 g mety- loandrostenolonu w pozycji 1,2 przeprowadzonej w 15 sposób standardowy z udzialem odpowiedniego mi¬ kroorganizmu, wydzielono czesci stale przez odwi¬ rowanie. Uzyskany w ten sposób roztwór zawie¬ rajacy produkt reakcji poddano wyczerpujacej 7- krotnej ekstrakcji chlorkiem etylenu uzytym w por- ?o ejach po 350 ml. Polaczone ekstrakty przemyto trzy¬ krotnie 1% roztworem kwasnego weglanu sodowe¬ go po 250 ml, a nastepnie woda do odczynu obp- jetnego, po czym oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem do osiagniecia stezenia 25 okolo 1 g steroidu w 150 ml chlorku etylenu, czyli do okolo 300 ml. Nastepnie dodano 1,0 g ^-naftolu i oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem do momentu wydzielenia sie osadu. Po oziebieniu w ciagu kilku godzin w chlodni w tern- 30 peraturze okolo 2° C oddzielono utworzone krysztaly i przemyto na saczku kilkakrotnie malymi porcja¬ mi czterochlorku wegla. Po wysuszeniu otrzymano 2,7 g zwiazku addycyjnego metyloandrostadienolonu z ^-naftolem o temperaturze topnienia 109—110° C, 35 [a] ^°°= +6,8° (c = l°/o, etanol), E jc% = 1650 przy Amax = 226 m/u. Zawartosc C obliczona dla wzoru C20H28O2 • Ci0H7OH wynosi 81,04%, znaleziona — 81,37%, zawartosc H obliczona wynosi 8,16%, zna- 40 leziona - 7,96%.Wydajnosc 90%. Otrzymany zwiazek addycyjny rozpuszczono w 270 ml chlorku etylenu i zadano ta¬ ka sama objetoscia 1% wodnego roztworu wodoro¬ tlenku sodowego, po czym warstwy rozdzielono. 45 Roztwór w chlorku etylenu przemyto woda do od¬ czynu obojetnego, po czym oddestylowano czescio¬ wo rozpuszczalnik do momentu wydzielenia sie krysztalów steroidu i mieszanine pozostawiono w ciagu okolo 16 godzin w temperaturze okolo 2° C. 50 Po odsaczeniu i wysuszeniu otrzymano 1,8 g me¬ tyloandrostadienolonu, co odpowiada 98,7% wydaj¬ nosci teoretycznej. Laczna wydajnosc procesu wy¬ odrebniania steroidu z brzeczki wyniosla 84%.Otrzymany produkt byl chromatograficznie czysty 55 20° i wykazywal skrecalnosc wlasciwa [«] pv = + 9,7° (c = 1%, etanol),EJl^i=509 przy Amax = 244 mp.Osad z odwirowania brzeczki zawierajacy nie- przereagowany metyloandrostenolon zawieszono w 60 500 ml wody wodociagowej i poddano.wyczerpuja¬ cej 7-krotnej ekstrakcji chlorkiem etylenu uzytym w porcjach po 70 ml. Polaczone ekstrakty przemyto 4 trzykrotnie 1% roztworem kwasnego weglanu so¬ dowego, a nastepnie woda do odczynu obojetnego, po czym ekstrakt przerabiano dalej w sposób opi¬ sany powyzej otrzymujac 0,32 g zwiazku addycyj¬ nego metyloandrostenolonu z ^-naftolem o tempe¬ raturze topnienia 117-118° C, [a] ^°° = + 55,2° 10/ (c = 1%, etanol), E, /0 = 1,650 przy Xmax = 226 mu. lem Zawartosc C obliczona dla wzoru C2oHs002 • • C10H7OH wynosi 80,67%, znaleziona—79,67%, za¬ wartosc H obliczona wynosi 8,58%, znaleziona — 8,29%. Wydajnosc 92% w stosunku do zawartosci w ekstrakcie. Z otrzymanego zwiazku addycyjnego otrzymano w sposób powyzej opisany 0,21 g me¬ tyloandrostenolonu, co odpowiada 97,0% wydajnosci teoretycznej. Laczna wydajnosc procesu wyodreb¬ niania nieprzereagowanego substratu steroidowego wyniosla 84,7%. Otrzymany produkt byl chromato¬ graficznie czysty i wykazywal skrecalnosc wlasci¬ wa [a] ^°° = + 79°, E \°£m= 521 przy Amax = 242 m/u. PL