PL54657B1 - - Google Patents

Description

Mozna go wiec na przyklad stosowac przy le¬ czeniu nastepujacych schorzen: ostry i chronicz¬ ny reumatyzm stawowy, wrzodziejace zapalenie jelita grubego, nerczyca, kolagenozy, jak na przy¬ klad toczen rumieniowaty, sklerodermia itd. scho¬ rzenia alergiczne róznych organów jak astma oskrzelowa, egzemy, pokrzywki, zluszczajace za¬ palenie skóry, wstrzas analilaktyczny itd. zatru¬ cia róznego pochodzenia jak na przyklad przy chronicznym alkoholizmie, guzy (nowotwory) jak np. bialaczka rak gruczolów limfatycznych, rak ukladu siateczkowosródblonkowego itd., dla zapo¬ biegania zanikowi kory nadnerczy przy terapii kortikosterydami, przy objawach niedoczynnosci przypadki mózgowej.Duza zaleta w porównaniu z naturalnym, ze zwierzecego materialu wyekstrahowanym hormo¬ nem jest fakt, ze syntetyczny pentakozapeptyd nie posiada wlasciwosci antygenowych. Mozna go przy wyzej wymienionych schorzeniach stosowac bez zastrzezen równiez wtedy, jezeli u pacjenta wystapily objawy alergiczne przy poprzednim le¬ czeniu naturalnym ACTH.Nowy pentakozapeptyd wykazuje bardzo wyso¬ ka aktywnosc w porównaniu z naturalna kortiko¬ tropina.Podczas gdy naturalna kortikotropine mozna oczyscic tylko klopotliwymi i drogimi metodami i praktycznie zawsze jeszcze zawiera wysokocza- steczkowe, bialkowe zanieczyszczenia, które moga wywolac grozne reakcje anafilaktyczne, to nowy syntetyczny zwiazek mozna otrzymac bezposrednio w stanie bardzo czystym i bez jakichkolwiek za¬ nieczyszczen substancjami o charakterze bialko¬ wym. Poza tym wytwarzanie nowego syntetycz¬ nego zwiazku jest niezalezne od dysponowania gruczolami przysadki mózgowej, które sa bardzo drogie i dostepne w ograniczonej ilosci. Szczegól¬ na zaleta jest to, ze nowy zwiazek w pozycji 4 nie zawiera, jak naturalne ACTH, reszty metio- ninowej, która jak wiadomo latwo sie utlenia i przez to hormon przechodzi latwo w forme nie¬ czynna lecz reszte norleucynowa, która posiada te same steryczne wlasciwosci jak reszta metio- ninowa, natomiast jest odporna na utlenienie.Poza tym nowe polaczenie posiada w pozycjach 17 i 18 dwie reszty lizynowe zamiast reszt arginino- wych, obecnych w tych pozycjach w naturalnym ACTH.Syntetyczne otrzymywanie nowego pentakoza- peptydu jest wskutek tego bardzo ulatwione poza tym w nowym zwiazku nie stwierdza sie zmniej¬ szania biologicznej aktywnosci. Nowy zwiazek po¬ siada ponadto w pozycji 25 reszte waliny, która w naturalnym ACTH w tym miejscu nie wyste¬ puje. Ta reszta waliny chroni lancuch peptydowy przed rozkladajacymi enzymami, co jest szczegól¬ nie korzystne przy stosowaniu podskórnym. Nowy zwiazek, tak jak naturalne ACTH, mozna rów¬ niez podawac w postaci preparatu o przedluzonym dzialaniu.Nowy pentakozapeptyd moze znalezc zastosowa¬ nie jako lek na przyklad w postaci preparatów farmaceutycznych. Preparaty te zawieraja wymie¬ niony zwiazek w mieszaninie z nieorganicznym lub organicznym nosnikiem, odpowiednim do sto¬ sowania pozajelitowego. Jako nosniki w rachube wchodza takie zwiazki, które nie reaguja z no¬ wym zwiazkiem, jak np. zelatyna, cukier mle¬ kowy, skrobia, stearynian magnezowy, talk, oleje roslinne, alkohol benzylowy, guma arabska, ,gli- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6054657 5 kole polialkilenowe, wazelina, cholesteryna lub inne znane nosniki. Farmaceutyczne preparaty moga byc przygotowane np. w postaci plynnej jak roztwory, zawiesiny lub emulsje. W razie potrzeby sa one sterylizowane i/albó zawieraja materialy 5 pomocnicze jak srodki konserwujace, stabilizuja¬ ce, zwilzajace lub emulgujace. Moga one równiez zawierac jeszcze inne terapeutycznie wartosciowe skladniki.Otrzymany sposobem wedlug wynalazku penta- w kozapeptyd i jego sole moga równiez znalezc za¬ stosowanie jako produkt przejsciowy do otrzymy¬ wania preparatów farmaceutycznych.W opisie stosowano nastepujace skróty: 15 kbo tri ktb kat ocp otb orne oet arg glu gli his liz nie fe pro ser try tyr wal — karbobenzoiloksy — trity1-trójfenylometyl — karbo-III rzed. butyloks — karbo-III rzed. amyloks — 2,4,5-trójchlorofenoksy — III rzed. butyloksy — metoksy — etoksy r — 1-arginil — 1-glutamyl — glicyl — 1-histydyl — 1-lizyl — 1-norleucyl — 1-fenyloalanil — 1-prolil — 1-seryl — 1-tryptofanyl — 1-tyrozyl — walil W przykladach, które objasniaja wykonanie wy¬ nalazku, jednak nie ograniczaja jego zakresu, po¬ dano wszystkie temperatury w stopniach Celsju¬ sza. Synteze polipeptydu objasniono na rysun- 4( kach.Przyklad I. Otrzymywanie estru 2,4,5-trój- chlorofenylowego a-N-karbobenzóiloksy-s-N-karbo- -III rzed. butoksy - l-lizyny/kbo-/ktb/liz - ocp/ (Fig.1). 4I 104 g a-N-karbobenzoilokisy-e-N-karbo-III rzed. butoksy-1-lizyny i 70 g 2,4,5-trójchlorofenolu roz¬ puszcza sie 900 ml chloroformu i 90 ml acetoni- trylu i zadaje w temperaturze —10° 56 g dwu- cykloheksylokarbodwuimidu. Wytrzasa sie podczas 50 dwóch godzin i odsacza od mocznika. Po odparo¬ waniu rozpuszczalnika rozpuszcza sie pozostalosc w etanolu i wytraca eterem naftowym. Po prze- krystalizowaniu z mieszaniny etanol-woda otrzy¬ muje sie 140 g estru 2,4,5-trójchlorofenylowego a- 55 -N-karbobenzoiloksy-f-N-karbo-III rzed. butoksy- 22° -1-lizyny. Temperatura topnienia 99°. [a] D =11° w dwumetyloformamidzie.Przyklad II. Otrzymywanie amidu 1-walilo- 60 -£-N-karbo-III rzed.butoksy-1-lizylo - 1-walilo-l-ty- rozylo-1-prolilo-l-waliny.(H-wal-/ktb/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2) (Fig. 1). 50 g amidu 1-prolilo-l-waliny (H-pro-wal-NH2) i 100 g kbo/kbo-tyr-ocp rozpuszcza sie w 100 ml 65 * dwumetyloformamidu, pozostawia przez 48 godzin w temperaturze 20° i saczy. Roztwór zadaje sie 500 ml 1 n kwasu solnego i oleista pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu. Po przemyciu roz¬ cienczonym kwasem solnym i roztworem kwasnego weglanu sodowego odparowuje sie do sucha. Po przekrystalizowaniu z mieszaniny octan etylu — eter dwuetylowy otrzymuje sie 100 g kbo (kbo/tyr- -pro-wal-NH2) (temperatura topnienia 133°). Zwia¬ zek ten zadaje sie 90 ml 2 n lugu sodowego i 200 ml etanolu. Pozostawia sie przez godzine w tempera¬ turze pokojowej i dodaje 1000 ml 1 n kwasu sol¬ nego. Pozostalosc przemywa sie najpierw woda, a po osuszeniu octanem etylu. Otrzymuje $ie 60 g kbo-tyr-pro-wal-NH2. Temperatura topnienia 220°. 21 [a] D = — 23° w dwumetyloformamidzie.Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 200 ml 4 n roztworu kwasu bromowodorowego w lodowatym kwasie octowym i pozostawia przez godzine w tem¬ peraturze 20°. Po dodaniu mieszaniny eter dwu- etylowy-octan etylu wypada H-tyr-pro-wal-NH2 jako bromowodorek. Temperatura topnienia 220°. 42 g H-tyr-pro-wal-NH2. HBr rozpuszcza sie w 200 ml dwumetyloformamidu i dodaje 36 g estru 2,4,5-trójchlorofenylowego N-karbobenzoilo- ksy-1-waliny/kbo-wal-ocp/ i 12 ml trójetyloaminy.Wytrzasa sie 48 godzin w temperaturze pokojowej i zadaje 500 ml 1 n kwasu solnego. Wydzielony produkt rozpuszcza sie w octanie etylu i przemy¬ wa rozcienczonym kwasem solnym i roztworem Jcwasnego weglanu sodowego. Roztwór octanu ety¬ lu ekstrahuje sie eterem. Otrzymuje sie 39 g kbo-wal-tyr-pro-wal-NH2. Temperatura topnienia 21 127° [a] D =—26° w dwumetyloformamidzie.Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 200 ml 4 n roztworu bromowodoru w Cwasie octowym. lodo¬ watym i pozostawia przez godzine w temperatu¬ rze 20°. Po dodaniu mieszaniny eter dwuetylowy- -octan etylu wypada 32 g H-wal-tyr-pro-wal-NH2.HB 29 g H-wal-tyr-pro-wal-NH2. HBr i 33 g kbo- -/ktb/liz-ocp (przyklad I) rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloformamidu i zadaje 7,5 ml trójetyloami- ny. Wytrzasa sie 48 godzin w temperaturze 20°, zadaje 500 ml 1 n kwasu octowego i przemywa wytracony produkt woda, a nastepnie octanem etylu. Otrzymuje sie 35 g kbo-/ktb/liz-wal-tyr-pro- -wal-NH2. Temperatura topnienia 125° (z rozkla- 21 dem), [a] D = — 25° w dwumetyloformamidzie. 39 g kbo/ktb/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2 rozpuszcza sie w 500 ml. metanolu i uwodornia przy normal¬ nym cisnieniu w obecnosci palladu jako kataliza¬ tora. Saczy sie, odparowuje w prózni i zadaje pozostalosc eterem. W ten sposób otrzymuje sie 28 g H-/ktb/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2. Temperatura to- 21 pnienia 145° (z rozkladem) [a] D = —30° w dwu¬ metyloformamidzie. 33g H-/ktb/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2 i 23 g kbo- -wal-ocp rozpuszcza sie w 150 ml dwumetylofor¬ mamidu i pozostawia przez 48 godzin w tempera¬ turze 20°. Roztwór odparowuje sie w prózni i rozpuszcza pozostalosc w malej ilosci n-butanolu i octanu etylu. Po przemyciu rozcienczonym kwa-54657 Ssem siarkowym i roztworem kwasnego weglanu sodowego odparowuje sie do sucha. Po zadaniu eterem dwuetylowym otrzymuje sie 33 g N-kbo- -waWktb/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2. Temperatura to¬ pnienia 171° [o] ^ = —27° w dwumetyloforma¬ midzie. Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 500 ml metanolu i uwodarnia przy normalnym cisnieniu w obecnosci palladu jako katalizatora. Odsacza sie, odparowuje w prózni i suszy w temperatu¬ rze 40°. Otrzymuje sie 22 g H-wal-/ktb/liz^wal-tyr- 21 -pro-wal-NH2 [a] D = —26° w dwumetyloformami¬ dzie.Przyklad III. Amid 1-walilo-glicylo-s-N-kar- bo-III rzed. btitoksy-1-lizylo-e-N-karbo-III rzed. butoksy-i-lizylo-e-N-karbo-III rzed. butoksy-1-lizy- lo-^N^karbo-III rzed. butoksy-l-prolilo-1-walilo- -e-N-karbo-III rzed. butoksy-1-lizylo-l-walilo-l-ty- rozylo-1-prolilo-l-waliny.(H-wal-gli-/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/Uz - pro- -wal/ktb/liz-wal- tyr-pro-wal-NH2) (Fig. 2). 470 g kbo-/ktb/-liz-OH i 182 ml trójetyloaminy rozpuszcza sie w 5 litrach octanu etylu, wkrapla w temperaturze —5° 125 ml estru etylowego kwa¬ su chloromrówkowego, miesza 30 minut w tempe¬ raturze —5°, dodaje 190 g H-pro-ome, pozostawia 4 godziny w temperaturze 20°, przemywa rozcien¬ czonym kwasem siarkowym i amoniakiem, suszy i odparowuje. Otrzymuje sie 550 g oleistego dwu- peptydu, który rozpuszcza sie w 3 litrach diok¬ sanu, chlodzi do temperatury 0°, dodaje 3 litry lugu sodowego (1 n), wytrzasa 1 godzine w tem¬ peraturze 20°, zageszcza do 3 litrów, dodaje 3 litry wody, przemywa eterem dwuetylowym, chlodzi do temperatury 0°, zakwasza 10% kwasem fosforowym do pH 2, ekstrahuje wydzielony olej octanem etylu, suszy, odparowuje, przemywa pozostalosc eterem naftowym i suszy. Otrzymuje sie 470 g kbo-/ktb/ 20 liz-pro-OH/ [a] ^ = —43° w dwumetyloformamidzie który, rozpuszcza sie w 3 litrach metanolu i 300 ml wody i uwodornia w obecnosci 30 g wegla z do¬ datkiem 10% palladu. Odsacza sie, odparowuje i przemywa pozostalosc eterem dwuetylowym.Otrzymuje sie 323 g H-/ktb/liz-pro-OH. Tempera- 20 tura topnienia 114° [a] D = —52° w dwumetylo¬ formamidzie.Dwupeptyd otrzymany w wyzej wymieniony spo¬ sób rozpuszcza sie w 1000 ml dwumetyloformamidu, dodaje 480 kbo-/ktb/liz-ocp, pozostawia 12 godzin w temperaturze 20°, odparowuje, rozpuszcza po¬ zostalosc w 1000 ml kwasnego weglanu sodowego, przemywa eterem dwumetylowym, zakwasza wodna faze 10% roztworem kwasu cytrynowego, ekstrahu¬ je octanem etylu, suszy, odparowuje i przerabia pozostalosc z eterem naftowym. Otrzymuje sie 308 g kbo-/ktb/liz-/ktb/liz-pro-OH (temperatura to¬ pnienia 125°) które rozpuszcza sie w 3 litrach me¬ tanolu i 300 ml wody. Uwodornia sie w obecnosci 45 g palladu osadzonego na weglu, saczy, odpa¬ rowuje i przekrystalizowuje pozostalosc z miesza¬ niny dioksan-eter dwuetylowy. Otrzymuje sie 205 g H-/ktb/liz-/ktb/liz-pro-OH. Temperatura topnienia 20 160° [a] D = — 24° w dwumetyloformamidzie. 8 380 g kbo-/ktb/liz-OH i 260 g HT/ktb/liz-ome,roz¬ puszcza sie w mieszaninie 1500 ml acetonitrylu i 300 ml dwumetyloformamidu, chlodzi do tempe^ ratury ^20°, dodaje 206 g dwucykloheksylokarbo- 5 dwuimidu, wytrzasa w temperaturze ;—5° przez 12 godzin, odsacza, odparowuje, rozpuszcza pozo¬ stalosc w octanie etylu, przemywa rozcienczonym roztworem kwasu siarkowego i amoniaku, suszy, odparowuje i krystalizuje pozostalosc z mieszaniny w eter dwuetylowy-eter naftowy. Otrzymuje sie 410 g kbo-/ktb/liz-/ktb/liz-ome. Temperatura to- 20 pnienia 105° [a] D =—10° w metanolu.Ester dwupeptydu otrzymany w wyzej opisany 15 sposób rozpuszcza sie w 3 litrach metanolu, uwo¬ dornia w obecnosci 50 g katalizatora palladowego i po przesaczeniu odparowuje. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w 1000 ml dwumetyloformamidu, do¬ daje 310 g kbo-wal-gli-ocp, pozostawia 12 godzin 20 w temperaturze 20°, odparowuje, zadaje eterem etylowym, przekrystalizowuje z mieszaniny meta¬ nol woda (1:1) i suszy. Otrzymuje sie 448 g kbo- -wal-gli-/ktb/liz-/ktb/liz-ome. Temperatura topnie- 20 nia 191° [a] D =—16° w metanolu. 25 Tak otrzymany ester tetrapeptydu rozpuszcza sie w 600 ml metanolu, dodaje 200 ml wódziami hydrazyny, pozostawia przez 16 godzin w tem¬ peraturze 20°, wlewa do 2 litrów wody, saczy, przemywa woda, suszy nad kwasem siarkowym, 30 rozpuszcza w metanolu, wlewa do eteru, saczy i suszy. Otrzymuje sie 366 g kbo-wal-gli-/ktb/liz- -/ktb/liz-NHNH2. Temperatura topnienia 204—206° 20 [a]D =—11° w dwumetyloformamidzie. 35 48,2 g kbo-wal-gli-/ktb/liz-/ktb/liz-NHNH2 roz¬ puszcza sie w schlodzonej do temperatury —10° mieszaninie 400 ml dwumetyloformamidu, 100 ml izopropanolu i 60 ml 4 n kwasu solnego, wkrapla podczas silnego mieszania 14 ml 5 n roztworu azo- 40' tynu sodowego, miesza jeszcze 5 minut w tem¬ peraturze —5°, dodaje 35 ml trójetyloaminy i na¬ stepnie 1000 ml lodowatej wody, filtruje pod próz¬ nia, rozpuszcza osad w 200 ml dwumetyloformami¬ du, dodaje 28,5 H/ktb/liz-/ktb/-liz-pro-OH i 7 ml 45 trójetyloaminy, zageszcza w wysokiej prózni do 180 ml, pozostawia w ciagu 16 godzin w tempe¬ raturze 0°, dodaje 1500 ml octanu etylu, przemywa rozcienczonym kwasem octowym, odparowuje oc¬ tan etylu, wlewa pozostalosc do 2 litrów wody, so saczy i suszy nad wodorotlenkiem sodowym.Otrzymuje sie 42 g kbo-wal-gli-/ktb/liz-/ktb/liz- -/ktb/liz-/ktb/liz-pro-OH. Temperatura topnie¬ nia 156° z rozkladem. 55 ^D =—5° w dwumetyloformamidzie.Tak otrzymany heptapeptyd rozpuszcza sie w 160 ml absolutnej pirydyny, odparowuje, roz¬ puszcza pozostalosc w 160 ml absolutnej pirydyny, 60 dodaje 22 g trój-/2,4,5-trójchlorofenylo/-fosforynu, miesza w ciagu 16 godzin w temperaturze 20°, odparowuje, rozpuszcza pozostalosc w octanie ety¬ lu, przemywa rozcienczonym kwasem siarkowym i nastepnie 1 n roztworem kwasnego weglanu so- 65 dowego, suszy nad siarczanem sodowym, odparo-54657 9 wuje i krystalizuje pozostalosc z mieszaniny octan etylu-eter naftowy. Otrzymuje sie 44 g kbo-wal- -gH/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz - pro - ocp, które rozpuszcza sie natychmiast w 150 ml dwumety- loformamidu, dodaje 38 g H-wal-/ktbAiz-wal^tyr- -pro-wal-NH2, pozostawia 2 dni w temperaturze 20°, wytraca przez dodanie eteru dwuetylowego, saczy i suszy. Tak otrzymany produkt rozpuszcza sie w mieszaninie metanol-woda (8:2), przepuszcza przez kwasny wymieniacz jonowy, odparowuje i krystalizuje pozostalosc z mieszaniny etanol- -woda (8:2). Otrzymuje sie 45,5 g kbo-wal-gli- -/ktb/liz - /ktb/liz - /ktb/liz/-/ktb/liz - pro - wal- -/ktb/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2. Temperatura topnie- 20 nia 198° z rozkladem [a] D = + 5° w dwumetylofor- mamidzie. Tak otrzymany tridekapeptyd rozpusz¬ cza sie w 500 ml metanolu, uwodornia w obecnosci 5 g palladu osadzonego na weglu, saczy, odparo¬ wuje i przerabia pozostalosc z eterem dwuetylo- wym. Otrzymuje sie 26,3 g H-wal-gli-/ktb/liz- -/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz-pro - wal-/ktb/liz-wal-tyr- -pro-wal-NH2. Temperatura topnienia 198°.Przyklad IV. Ester 2,4,5-trójchlorofenyIowy tritylo-O-III rzed. butylo-glutamylo-Im-tritylo-1- -histydylo-1-fenyloalanilo - 1-arginilo-l-tryptofany- lo-glicylo-e-N - karbo-III rzed. butoksy - 1-lizylo-l- -proliny. (tri - glu/otb/-/tri/his-fe-arg-try - gli-/ktb/liz-pro- -ocp) (Fig. 3). 300 g kbo-/N02/arg-try-gli-orne rozpuszcza sie w 5 litrach mieszaniny dioksan-woda (8:2) dodaje 720 ml 1 n lugu sodowego, pozostawia 1 godzine w temperaturze 20° wlewa do 16 litrów 0,05 n kwasu siarkowego, odsacza osad pod próznia, prze¬ mywa woda, alkoholem, eterem dwuetylowym i eterem naftowym i suszy. Otrzymuje sie 285 g kbo-/N02/arg-try-gli-OH/. Temperatura topnienia 20 225° [a] D = —14° w dwumetyloformamidzie które rozpuszcza sie w 3,5 litrach absolutnej pirydyny.Dodaje sie 250 g trój-2,4,5-trójchlorofenylo-fosfory- nu, miesza sie 16 godzin w temperaturze 20°, od¬ parowuje, rozpuszcza w octanie etylu, przemywa rozcienczonym kwasem siarkowym, suszy i odpa¬ rowuje. Pozostalosc krystalizuje sie z mieszaniny octan etylu-eter dwuetylowy i otrzymuje 370 g kbo-/N02/arg - try - gli-ocp. Temperatura topnienia 20 124° [a] D = —9° w dwumetyloformamidzie. Tak otrzymany ester trójpeptydu rozpuszcza sie w 700 ml dwumetyloformamidu, dodaje 220 g H-/ktb/liz-pro- -OH/ przyklad III, miesza 16 godzin w tempera¬ turze 20°, wytraca eterem dwuetylowym, saczy, rozpuszcza osad w mieszaninie octan etylu-woda, przemywa 1 n kwasem cytrynowym, suszy i od¬ parowuje. Pozostalosc krystalizuje sie dwa razy z octanem etylu. Otrzymuje sie 370 g kbo-/N02/arg- -try - gli-/ktb/liz-pro - OH. Temperatura topnienia 20 12° [a] D = —20° w dwumetyloformamidzie. 245 g kbo-/N02/arg-try-gli-/ktb/liz-pro-OH roz¬ puszcza sie w 450 ml octanu etylu, dodaje 50 ml wody i 50 g 10% palladu osadzonego na weglu, uwodornia, saczy, odparowuje, rozpuszcza w wo¬ dzie, liofilizuje i suszy nad lugiem sodowym. 10 Otrzymuje sie 135 g H-arg-try-gli/ktb/liz-pro-OH 20 [a]D = —9° w mieszaninie kwas solny-woda (95:5). 457 g H-his-fe-ome. 2HBr i 226 ml trójetylo- 5 aminy rozpuszcza sie w 1000 ml dwumetyloforma¬ midu, miesza 10 minut w temperaturze 0°, saczy, dodaje do przesaczu 496 g kbo-glu/otb/-ocp i po¬ zostawia w temperaturze 20° w ciagu 16 godzin.Odparowuje sie dwumetyloformamid, rozpuszcza 10 pozostalosc w octanie etylu, przemywa rozcien¬ czonym wodnym roztworem kwasu octowego i 1 n roztworem kwasnego weglanu sodowego, suszy nad siarczanem sodowym, odparowuje i krystalizuje pozostalosc z octanem etylu. Otrzymuje sie 338 g 15 kbo-glu-/otb/-his-fe-ome. Temperatura topnienia 20 183° [a] D =—21° w dwumetyloformamidzie.Wyzej otrzymany trójpeptyd rozpuszcza sie w 3 litrach metanolu, uwodornia w obecnosci 50 g 10% palladu osadzonego na weglu, saczy, odparo¬ wuje, rozpuszcza pozostalosc w 1,5 litra chlorku metylenu, chlodzi do temperatury 0°, dodaje 140 ml trójetyloaminy i nastepnie 270 g trójfenylochloro- metanu, pozostawia w ciagu 16 godzin w tempera¬ turze 20°, przemywa rozcienczonym kwasem octo¬ wym, woda i 1 n roztworem kwasnego weglanu sodowego, suszy i odparowuje. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w eterze dwuetylowym i wytraca ete¬ rem naftowym. Otrzymuje sie 483 g tri-glu/otb/- -/tri/his-fe-ome (temperatura topnienia 80° z roz¬ kladem), które rozpuszcza sie w 1000 ml metanolu.Dodaje sie 50 ml hydrazyny, pozostawia w ciagu 24 godzin w temperaturze 20°, zageszcza do 500 ml, dodaje 5 litrów eteru dwuetylowego przemywa 0,1 n roztworem soli kuchennej, suszy, zageszcza do 500 ml i wytraca eterem naftowym. Otrzymuje sie 390 g tri-glu/otb/-/tri/his-fe-NHNH2. Tempera- 20 tura topnienia 80° z rozkladem[a] D = —14° w dwu¬ metyloformamidzie. 40 41,6 g tri-glu/otb/-/tri/his-fe-NHNH2 rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloformamidu i 100 ml izo- propanolu, chlodzi do temperatury —10°, dodaje 40 ml 4 n kwasu solnego i nastepnie podczas mie¬ szania 9 ml 5 n roztworu azotynu sodowego. Po 45 5 minutach dodaje sie28mltrójetyloaminyil000ml lodowatej wody, odsacza pod próznia, rozpuszcza osad w octanie etylu, przemywa nasyconym roz¬ tworem soli kuchennej, suszy, odparowuje w tem¬ peraturze 0°, rozpuszcza pozostalosc w 100 ml so dwumetyloformamidu, dodaje 26 g H-arg-try-gli- -/ktb/liz-pro-OH, 3 g AcOH i 4,5 ml trójetyloa- miny, pozostawia w ciagu 16 godzin w tempera¬ turze 0°, dodaje 1000 ml octanu etylu, przemywa 0,5 n kwasem octowym, woda i 0,5 n pirydyna, 55 odparowuje, rozpuszcza pozostalosc w 100 ml octa¬ nu etylu i wytraca eterem dwuetylowym. Otrzy¬ muje sie 46,4 g tri-glu/otb/-/tri/hL«-fe-arg-try-gli- 20 -/ktb/liz-pro-OH. Temperatura topnienia 180° [a] D M = —13° w dwumetyloformamidzie.Peptyd otrzymany wyzej opisanym sposobem rozpuszcza sie w 200 ml pirydyny, chlodzi do temperatury —20°, dodaje 30 ml 1 n roztworu kwasu solnego w dioksanie, miesza przez 5 minut 65 w temperaturze —20°, dodaje 7,8 ml trójetylo-54657 aminy, zageszcza do polowy objetosci, dodaje 30 g trójchlorofenylo-trójfosfbrynu, pozostawia w ciagu 16 godzin w temperaturze 20° odparowuje, zadaje pozostalosc eterem dwuetylowym, rozpuszcza w oc¬ tanie etylu, wytAca eterem dwuetylowym, saczy 5 i suszy, .przymuje sie 51,6 g tri-glu/otb/-/tri/his- -fe-arg-try-gli-/ktb/liz-pro-ocp. HCL Temperatura 20 topnienia 170° z rozkladem [a] ^ = —20° w dwu¬ metyloformamidzie. 10 Przyklad V. Amid 1-serylo-l-tyrozylo-l-sery- lo-1-norleucylo - 1-glutamylo-l - histydylo-1-fenylo- alanilo - 1-arginilo-l-tryptofanylo - glicylo-1-lizylo- -1-prolilo-l-walilo - gllcylo-1-lizylo-l-lizylo-l-lizylo- -1-lizylo-prolilo-l-walilo-l-lizylo-l-walilo-l-tyTOzylo- 15 -1-prolilo-l-waliny. * (H-ser-tyr-ser-nle-glu-his-fe-arg-try-gli-liz-pro - -wal-gli-liz-liz-liz-Hz-pro-wal-liz-wal-tyr-pro-wal - -NH2) (Fig. 4). 174 g tri-ser-OH i 117 g H-tyr-bme rozpuszcza so sie w mieszaninie 2 litrów acetonitrylu, 1 litra chloroformu i 50 ml dwumetyloformamidu, chlodzi do temperatury —10° zadaje 124 g dwucykloheksy- lokarbodwuimidu i miesza w ciagu 5 godzin w tem¬ peraturze 20°. Saczy sie, przemywa 1,5 litra pi- 25 rydyny, odparowuje polaczone przesacza do sucha i krystalizuje pozostalosc z goracego octanu etylu.Otrzymuje sie 221 g tri-ser-tyr-ome. Temperatura 21 topnienia 232° [a]n = —34° w dwumetyloformami- * 30 dzie. Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 500 ml dwumetyloformamidu i zadaje 100 ml hydrazyny, pozostawia 24 godziny w temperaturze 20°, wlewa roztwór do 5 litrów wody, odwirowuje, rozpuszcza oleista pozostalosc w 2 litrach octanu etylu i prze¬ mywa otrzymany roztwór woda az do zobojetnie¬ nia. Suszy sie siarczanem sodowym, odparowuje do sucha i przemywa pozostalosc eterem. Otrzy¬ muje sie 182 g tri-ser-tyr-NHNH2. Temperatura topnienia 120° (z rozkladem), [a] D =—30° w dwu- 40 metyloformamidzie. 131 g kbo-ser-OH i 95 g chlorowodorku H-nle- -ome rozpuszcza sie w 2 litrach chloroformu i 70 ml trójetyloaminy, chlodzi do temperatury —10°, zadaje 124 g dwucykloheksylokarbowuimidu tó i miesza przez 5 godzin w temperaturze 20°.Odsacza sie, odparowuje przesacz, przemywa po¬ zostalosc eterem naftowym i woda i suszy. Kry¬ stalizuje sie z mieszaniny octan etylu — eter na¬ ftowy i otrzymuje 151 g kbo-ser-nle-ome. Tern- 50 1 22 peratura topnienia 71°. [a] D = —19° w metanolu.Odszczepia sie grupe kbo przez katalityczne uwo¬ dornienie w metanolu w obecnosci katalizatora palladowego i równowaznej ilosci chlorowodoru. 55 Po oddzieleniu katalizatora, odparowaniu i zada¬ niu eterem etylowym otrzymuje sie chlorowodorek H-ser-nle-ome. 46 g tri-ser-tyr-NHNH2 rozpuszcza sie w mie¬ szaninie 120 ml dwumetyloformamidu, 120 ml izo- M propanolu i 120 ml wody, chlodzi do temperatury —10°, dodaje 44 ml 6 n kwasu solnego i zadaje podczas silnego mieszania 3,5 g azotynu* sodo¬ wego. Po 5 minutach dodaje sie 250 ml 1 n kwa¬ snego weglanu potasowego i 1500 ml wody. Od- w 12 sacza sie pod próznia, rozpuszcza sie staly pro¬ dukt w 200 ml dwumetyloformamidu, dodaje 24 g H-ser-nle-ome. HC1 i 23 ml trójetyloaminy i po¬ zostawia w ciagu 16 godzin w temperaturze 20*.Roztwór wlewa sie do 1000 ml wody, ekstrahuje octanem etylu, suszy nad siarczanem sodowym i odparowuje. Po przemyciu pozostalosci eterem otrzymuje sie 56,5 g tri-ser-tyr-ser-nle-ome. Tem- 20 peratura topnienia 130—140° (z rozkladem) [o] D _ = —7° w dwumetyloformamidzie. r Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 200 ml goracego etanolu, zadaje 3 ml hydrazyny, pozo¬ stawia przez 24 godziny w temperaturze 20°, do¬ daje 200 ml eteru, saczy, przemywa eterem i su¬ szy w prózni nad pieciotlenkiem fosforu i stezo¬ nym kwasem siarkowym. Otrzymuje sie 51 g tri- -.ser-tyr-ser - nie - NHNH2. Temperatura topnienia 205°. 6,1 g tri-glu/otb/-/tri/his-fe-arg-try - gli-/ktb/liz- -pro-ocp. nCl i 5,7 g H-wal-gli-/ktb/liz-/ktb/liz- -/ktb/liz/ktb/liz-pro-wal-/ktb/liz-wal-tyr-pro - wal- NH2 rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, dodaje 3,0 g imidazolu i pozostawia 3 dni w tem¬ peraturze 20°. Dodaje sie jeszcze 0,6 g tego sa¬ mego chlorowodorku oktapeptydu, pozostawia 16 godzin w temperaturze 20°, wytraca octanem ety¬ lu, saczy, rozpuszcza osad w etanolu, wytraca po¬ nownie octanem etylu, saczy, rozpuszcza osad w etanolu, wytraca raz jeszcze octanem etylu, sa¬ czy i suszy. Otrzymuje sie 8 g tri-glu/otb/-/tri/his- -fe-arg - try - gli-/ktb/liz - pro - wal/gli-/ktb/liz- -/ktb/liz-/lttb/liz-/ktb/liz - pro - wal - /ktb/liz-wal- -tyr-pro-wal-HN2/temperatura topnienia 195° z roz- 20 kladem [a]D =—27° w dwumetyloformamidzie, które rozpuszcza sie w 200 ml mieszaniny kwas octowy-woda (8:2) pozostawia przez 2 godziny w temperaturze 30°, odparowuje, przemywa octa¬ nem etylu, saczy i suszy. Otrzymuje sie 7 g octanu H-glu-/otb/-/tri/his-fe-arg-try-gli-/ktb/liz-pro-wal - -gli-/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz-pro-wal - /ktb/ liz-wal-tyr-pro-wal NH2. 165 g tri-ser-tyr-ser- -nle-NHNH2 rozuszcza sie w 6 ml dwume¬ tyloformamidu, dodaje 2 ml wody, chlodzi do temperatury —10°, dodaje 1 ml 6 n kwasu solnego, zadaje 140 mg azotynu sodu, miesza 5 minut w temperaturze —5° dodaje 300 ml 0,2 n roztworu kwasnego weglanu potasowego i odwiro¬ wuje. Otrzymany tri-ser-tyr-ser-nle-N3 rozpuszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu, zadaje 5,02 g octanu H-glu/otb/-/tri/his-fe-arg - try - gli-/ktb/liz- -pro - wal - gli-/ktb/liz-7ktb/liz-/ktb/liz-/ktb/liz- -pro - wal/ktb/liz-wal - tyr-pro-wal-NH2 pozosta¬ wia w ciagu 12 godzin w temperaturze 0°, dodaje dalsza ilosc otrzymanego azydku tetrapeptydu z 1,0 g tri-ser-tyr-ser-nle-NHNH2, pozostawia przez 6 go¬ dzin w temperaturze 0°, odparowuje, przerabia z octanem etylu, przemywa goracym acetonem i octanem etylu i suszy w prózni. Otrzymany pro¬ dukt rozpuszcza sie w 100 ml kwasu trójfluoroocto- wego, pozostawia w ciagu 1 godziny w tempera¬ turze 20° w atmosferze azotu, odparowuje, prze¬ rabia z octanem etylu, saczy i suszy. Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 500 ml 0,2 n kwasu44«57 13 octowego, przepuszcza roztwór przez Amberlit IRA-410 w postaci octanowej, saczy i liofilizuje.Po osuszeniu nad wodorotlenkiem sodowym otrzy¬ muje sie 3,5 g octanu H-ser-tyr-ser-nle-glu-his-fe- -arg - try - gli-liz-pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz * pro- wal - liz-wal-tyr-pro-wal-NH2, który zachowuje sie jednorodnie przy chromatografii i elektrofore¬ zie. (Calkowita hydroliza daje nastepujacy sklad aminokwasów: seri,8, tyri,9l nlei,o, glu0»9, hisi.i, fei,0, argi,i, gli2,0, lize,i, pro2,*, wal4,«; try rozklada sie w czasie calkowitej hydrolizy kwasowej). Pro¬ dukt moze byc stosowany jako taki lub po prze¬ prowadzeniu w inna sól. Moze byc skladowany w stanie stalym, w roztworze lub jako adsorbat.Przyklad VI. Otrzymywanie weglanu III rzed. amylotiofenylowego. 296 ml alkoholu III rzed. amylowego rozpuszcza sie w 212 . m)l pirydyny i 800 ml chloroformu i wkrapla w temperaturze 20° 410 g estru S-feny- lowego kwasu chlorotiomrowkowego. Po zakoncze¬ niu reakcji miesza sie jeszcze w ciagu 4 godzin w temperaturze 70°. Przemywa sie rozcienczonym kwasem solnym, kwasnym weglanem sodu i nasy¬ conym roztworem soli kuchennej. Odparowuje sie rozpuszczalnik i otrzymuje po frakcjonowanej de¬ stylacji 390 g weglanu III rzed. amylotiofenylo¬ wego. (Temperatura wrzenia 105—107° przy 4— —5 mm slupa rteci).Przyklad VII. Otrzymywanie karbazynianu III rzed. amylowego. 81 g wodzianu hydrazyny wkrapla sie do 170 g weglanu III rzed. amylotiofenylowego. Temperatura podnosi sie przy tym do 70—80°. Miesza sie jesz¬ cze przez 6 godzin i zadaje roztworem 47 g wodo¬ rotlenku sodowego w 40 ml wody. Tak otrzymana mieszanine ekstrahuje sie przez 24 godziny w spo¬ sób ciagly eterem. Faze eterowa oddziela sie, suszy nad siarczanem sodowym i odparowuje roz¬ puszczalnik. Po frakcjonowanej destylacji otrzy¬ muje sie 105 g karbazynianu III-rzed. amylowego.(Temperatura wrzenia 84° przy 3 mm slupa rteci).Przyklad VIII. Otrzymywanie a-N-karbb- benzoiloksy-e-N-karbo-III rzed. amyloksy-1-lizyny. (cbo-/kat/liz-OH). 35 g karbazynianu III rzed. amylowego roz¬ puszcza sie w 28 ml lodowatego kwasu octowego i 40 ml wody i wkrapla w temperaturze —10° roztwór 40 g azotynu sodowego w 50 ml wody.Miesza sie jeszcze przez dalsza godzine i zadaje 300 ml eteru. Faze eterowa przemywa sie woda i roztworem kwasnego weglanu sodowego i od¬ parowuje po osuszeniu nad siarczanem sodowym.Otrzymuje sie 35 g azydku III rzed. amyloksykar- bonylowego (kat-azydek), który jednak nie byl de¬ stylowany ze wzgledu na niebezpieczenstwo wy¬ buchu. Kat-azydek rozpuszcza sie w 200 ml dio¬ ksanu i dodaje do mieszaniny 62 g a-N-karbo- benzoiloksy-1-lizyny, 350 ml wody i 15 g tlenku magnezowego. Mieszanine reakcyjna miesza sie przez 16 godzin w temperaturze 40°, saczy i od¬ parowuje dioksan w temperaturze 40°. Po dodaniu 400 ml wody zakwasza sie rozcienczonym kwasem siarkowym i ekstrahuje octanem etylu. Po osu¬ szeniu nad siarczanem sodowym rozpuszczalnik odparowuje sie w prózni. Otrzymuje sie 57 g kbo- 14 ,22 -/kat/liz-OH. Ta]^ = —12° w dwumetyloforma- midzie. 20 g kbo/kat/liz-OH i 9 g dwucykloheksyloaminy B rozpuszcza sie w 50 ml eteru i pozostawia przez 2 godziny w temperaturze 20°. Wykrystalizowany produkt odsacza sie i przemywa eterem. Otrzymuje sie 22 g soli dwucykloheksyloaminowej kfoo-/kat/liz- -OH, temperatura topnienia 130°. u Przyklad IX. Otrzymywanie estru metylowe- 4go a-N-karbo-benzoiloksy-e-N-karbo-III rzed. amy- loksy-1-lizyny. (kbo-/kat/liz-ome). 24 g a-N-karbobenzoiloksy-e-N-III rzed. amylo- 1B ksy-1-lizyny rozpuszcza sie w 100 ml eteru i wkra¬ pla eterowy roztwór dwuazometanu az do trwa¬ lego zabarwienia zóltego. Rozpuszczalnik odparo¬ wuje sie w prózni i suszy pozostalosc w wysokiej prózni nad pieciotlenkiem fosforu. Otrzymuje sie 20 23 g estru metylowego a-N-karbobenzoiloksy-e-N- -karbo-III Tzed. amyloksy-1-lizyny w postaci ge¬ stego oleju, który krystalizuje w przeciagu kilku dni. (Temperatura topnienia 38—41°).Przyklad X. Otrzymywanie estru 2,4,5-trój- 25 chlorofenylowego a-N-karbobenzoiloksy-c-N-karbo- -III rzed. amyloksy-1-lizyny. 24 g kbo-/kat/liz-OH i 13 g 2,4,5-trójchlorofenolu rozpuszcza sie w 100 ml octanu etylu i zadaje w temperaturze 0° 14 g dwucykloheksylokarbo- 30 dwuamidu. Wytrzasa sie przez 16 godzin w tempe¬ raturze 20°, odsacza od dwucykloheksylomocznika, odparowuje rozpuszczalnik i krystalizuje z mie¬ szaniny etanol-woda. Otrzymuje sie 32 g estru 2,4,5-trójchlorofenylowego a-N-karbobenzoiloksy- S3 -£-N-karbo-III rzed. amyloksy-1-lizyny. Tempera- ?2 tura topnienia 78°. [a] ^ = —12° w dwumetylo- formamidzie.Przyklad XI. Otrzymywanie amidu-1-walilo- -e-N-karbo-III rzed. -amyloksy-1-lizylo-l-walilo - -1-tyryzylo-l-prolilo-l-waliny (H-wal-/kat/liz-wal- -tyr-pro-wal-NH2). 32 g H wal-tyr-pro-wal-NH2. HBr, 37 g kbo-/kat/ liz-ocp. 43 (Przyklad X) rozpuszcza sie w 150 ml dwumety- loformamidu i zadaje 8 ml trójetyloaminy. Wy¬ trzasa sie przez 48 godzin w temperaturze 20°, wytraca za pomoca 500 ml 1 n kwasu octowego i przemywa wydzielony produkt woda i octanem 50 etylu. Otrzymuje sie 39 g kbo-/kat/liz-wal-tyr- -pro-wal-NH2. [or]D = —26° w dwumetyloforma- midzie. 38 g kbo-/kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2 rozpuszcza sie w 500 ml metanolu i uwodornia w ciagu 6 godzin przy normalnym cisnieniu 55 w obecnosci katalizatora palladowego. Odsacza sie i odparowuje rozpuszczalnik w prózni. Otrzymuje 22 sie 32 g H-/kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2. [a]D = = —29° w dwumetyloformamidzie. 60 32 g H-/kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2 i 22 g kbo- wal-ocp rozpuszcza sie w 100 ml dwumetylofor- mamidu i pozostawia w ciagu 48 godzin w tem¬ peraturze 20°. Dwumetyloformamid odparowuje sie w prózni i rozpuszcza pozostalosc w niewiel- 65 kiej ilosci n-butanolu i octanem etylu. Przemywa54657 15 sie rozcienczonym kwasem siarkowym i roztwo¬ rem kwasnego weglanu sodowego. Po osuszeniu nad siarczanem sodowym odparowuje sie roz¬ puszczalnik w prózni. Otrzymuje sie 36 g kbo- 99 -waWkat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH^ MD = —25° w dwumetyloformamidzie. 36 g kbo-wal-/kat/liz- -wal-tyr-pro-wal-NH2 rozpuszcza sie w 500 ml metanolu i uwodarnia w obecnosci katalizatora palladowego przez 6 godzin przy normalnym cis¬ nieniu. Odsacza sie odparowuje metanol w prózni i zadaje oleista pozostalosc eterem dwuetylo- wym. Otrzymuje sie 26 g H-wal-/kat/liz-wal-tyr- 22 ^ pro-wal-NH2. [a]D = —27 w dwumetyloforma¬ midzie.Przyklad XII. Amid 1-walilo-glicylo-e-N- 7karbo-III rzed. amyloksy-1-lizylo-e-N-karbo-III rzed. amyloksy-1-lizylo-e-N-karbo-III rzed. amylo- ksy-l-lizylo-£-N-karbo-III rzed. amyloksy-lizylo- -1-prolilo-l-walilo-e-N-karbo-III rzed. amyloksy-1- -lizylo-1-walilo-l-tyrozylo-l-prolilo-l-waliny.(H-wal-gli/kat/liz-/katAiz-/kat/liz-/kat/liz - pro - -wal-/kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2 (Fig. 2). 186 g kbo-/kat/liz-OH i 73 ml trójetyloaminy rozpuszcza sie w 2 litrach octanu etylu, wkrapla w temperaturze —5° 50 ml estru etylowego kwasu chloromrówkowego, miesza 30 minut w tempera¬ turze —5°, dodaje 76 g H-pro-ome, pozostawia przez 4 godziny w temperaturze 20°, przemywa rozcienczonym kwasem siarkowym i amoniakiem, suszy i odparowuje. Otrzymuje sie 240 g oleistego dwupeptydu, który rozpuszcza sie w 1,3 litrach dioksanu, chlodzi do temperatury 0°, dodaje 1,3 li¬ tra 1 n lugu sodowego, wytrzasa w ciagu godziny w temperaturze 20°, zageszcza do 1,3 litra i doda¬ je 1,3 litra wody, przemywa eterem dwuetylowym, chlodzi do temperatury 0°, zakwasza 10% kwa¬ sem fosforowym do pH 2, ekstrahuje wydzielony olej octanem etylu, suszy, odparowuje, przemywa pozostalosc eterem naftowym i suszy. 20 Otrzymuje sie 195 g kbo-/kat/liz-pro-OH, [ = —45° w dwumetyloformamidzie, który rozpusz¬ cza sie w 3 litrach metanolu i 300 ml wody i uwo¬ dornia w obecnosci 10 g 10% palladu osadzonego na weglu. Odsacza sie, odparowuje i przemywa pozostalosc eterem dwuetylowym. Otrzymuje sie 130 g H-/kat/liz-pro-OH. Temperatura topnie- 20 nia 104° [a]D = —55° w dwumetyloformamidzie.Tak otrzymany dwupeptyd rozpuszcza sie w 400 ml dwumetyloformamidu, dodaje 195 g kbo-/kat/ liz-oop, pozostawia w ciagu 12 godzin w tempera¬ turze 20°, odparowuje, rozpuszcza pozostalosc w 400 ml 1 n roztworu kwasnego weglanu sodo¬ wego, przemywa eterem dwuetylowym, zakwasza wodna faze 10% roztworem kwasu cytrynowego, ekstrahuje octanem etylu, suszy, odparowuje i przerabia pozostalosc z eterem naftowym. Otrzy¬ muje sie 124 g kbo-/kat/liz-pro-OH (Temperatura topnienia 120°), który rozpuszcza sie w 1,3 litra metanolu i 100 ml wody. Uwodarnia sie w obec¬ nosci 10 g palladu osadzonego na weglu, saczy, odparowuje i krystalizuje pozostalosc z miesza¬ niny dioksan-eter dwuetylowy. Otrzymuje sie 16 84 g H-/kat/liz-/kat/liz-pro-OH. Temperatura to- pnienia 140° [a]D = —26° w dwumetyloforma¬ midzie. 5 Rozpuszcza sie 150 g kbo-/kat/liz-OH i 105 g H-/kat/liz-ome w mieszaninie 500 ml acetonitrylu i 100 ml dwumetyloformamidu, chlodzi do tempe¬ ratury —20°, dodaje 83 g dwucykloheksylokarbo- dwuimidu, wytrzasa w temperaturze —5° przez 10 12 godzin, odsacza, odparowuje, rozpuszcza po¬ zostalosc w octanie etylu, przemywa rozcienczo¬ nym roztworem kwasu siarkowego i amoniaku, saczy, odparowuje i krystalizuje pozostalosc ¦- z mieszaniny eter dwuetylowy, eter naftowy. 15 Otrzymuje sie 168 g kbo-/kat/liz-/kat/liz-ome. 20 Temperatura topnienia 103°. [a]D = —12° w me¬ tanolu.Wyzej otrzymany ester dwupeptydu rozpusz- 20 cza sie w 1 litrze metanolu, uwodornia w obec¬ nosci 15 g katalizatora palladowego i po przesa¬ czeniu odparowuje. Pozostalosc rozpuszcza sie w 400 ml dwumetyloformamidu, dodaje 125 g kbo-wal-gli-ocp, pozostawia w ciagu 12 godzin 25 w temperaturze 20°, odparowuje, przerabia z ete¬ rem etylowym, krystalizuje z mieszaniny meta- nol-woda (1:1) i suszy. Otrzymuje sie 180 g kbo- -wal-gli/kat/liz-/kat/liz-ome. Temperatura topnie- - 20 nia 175*. [a]^ = —18° w metanolu. 30 u Tak otrzymany ester tetrapeptydu rozpuszcza sie w 200 ml metanolu, dodaje 80 ml wodzianu hy¬ drazyny, pozostawia w ciagu 16 godzin w tempe¬ raturze 20°, wlewa do 1 litra wody, saczy, prze- 45 mywa woda,* suszy nad kwasem siarkowym, rozpuszcza w metanolu, wlewa do eteru, odsacza i suszy. Otrzymuje sie 147 g kbo-wal-gli-/kat/liz- /kat/liz-NHNH2. Temperatura topnienia 200° 20 [ 40 25 g kbo-wal-gli-/kat/liz-/kat/liz-NHNH2 roz¬ puszcza sie w ochlodzonej do temperatury —10° mieszaninie 200 ml dwumetyloformamidu, 50 ml izopropanolu i 30 ml 4 n kwasu solnego, wkra¬ pla podczas silnego mieszania 7 ml wodnego 5 n 45 roztworu azotynu sodowego, miesza jeszcze 5 mi¬ nut w temperaturze —5°, dodaje 18 ml trójetylo¬ aminy i nastepnie 500 ml lodowatej wody, odsacza pod próznia, rozpuszcza osad w 100 ml dwumety¬ loformamidu, dodaje 15 g H-/kat/liz-/kat/liz-pro- 50 -OH i 3,5 ml trójetyloaminy, zageszcza w wysokiej prózni do 90 ml, pozostawia w ciagu 16 godzin w temperaturze 0°, dodaje 800 ml octanu etylu, przemywa rozcienczonym kwasem octowym, od¬ parowuje octan etylu, wlewa pozostalosc do 1 li- 55 tra wody, saczy i suszy nad wodorotlenkiem so¬ dowym. Otrzymuje sie 25 g kbo-wal-gli-/kat/liz- /kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-pro-OH. Temperatura to- 20 pnienia 150° z rozkladem. [a]D = —6° w dwume- 60 tyloformamidzie.Tak otrzymany heptapeptyd rozpuszcza sie w 80 ml absolutnej pirydyny, odparowuje, roz¬ puszcza pozostalosc w 80 ml absolutnej pirydyny, dodaje 10 g trój-/2,4,5-trójchlorofenylo/-fosforynu, 65 miesza przez 16 godzin w temperaturze 20°, odpa-54657 *7 rowuje, rozpuszcza pozostalosc w octanie etylu, przemywa rozcienczonym kwasem siarkowym i na¬ stepnie 1 n roztworem kwasnego weglanu sodo¬ wego, suszy nad siarczanem sodowym, odparowuje i krystalizuje pozostalosc z mieszaniny octanu etylu-eter naftowy. Otrzymuje sie 26 g kbo-wal- -gli-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-pro-ocp, które natychmiast rozpuszcza sie w 75 ml dwumetylo¬ formamidu, dodaje 20 g H-wal-/kat/liz-wal-tyr- -pro-wal-NH2, pozostawia dwa dni w temperatu¬ rze 20p, wytraca przez dodanie eteru dwuetylowe- go, saczy i suszy. Tak otrzymany produkt roz¬ puszcza sie w mieszaninie metanol-woda (8:2), przepuszcza przez kwasny wymieniacz jonowy, odparowuje i krystalizuje pozostalosc z mieszaniny etanol-woda (8:1). Otrzymuje sie 15 g kbo-wal- -gli-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-pro-wal - /kat/ liz-wal-tyr-pro-wal-NH2. Temperatura topnie- 20 nia 190° z rozkladem, [a]^ = —6° w dwumetylo- formamidzie.Orzymany tridekapeptyd rozpuszcza sie w 500 ml metanolu, uwodornia w obecnosci 5 g palladu osadzonego na weglu, saczy, odparowuje i przera¬ bia pozostalosc z eterem dwuetylowym. Otrzy¬ muje sie 12 g H-wal-gli-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz- -/kat/liz-pro-wal-/kat/liz-wal-tyr- pro - wal - NH2.Temperatura topnienia 198°.Przyklad XIII. Ester 2,4,5-trójchlorofenylowy tritylo-O-III rzed. butylo-1-glutamylo-Im-tritylo- - 1 - histydylo-1-fenyloalanilo-l-arginilo-l-tryptofa- nylo-glicylo-N-e-karbo-III rzed. amyloksy-1-lizylo- -1-proliny. (tri-glu/otb/—/tri/his-fe-arg-try-gli-/kat/liz - pro- -ocp) (Fig. 3). 100 g kbo^(N02)arg-try-gli-ome rozpuszcza sie w 1,5 litra mieszaniny dioksan-woda (8 :2), dodaje 250 ml 1 n lugu sodowego, pozostawia w tempera¬ turze 20°, wlewa do 5 litrów 0,05 n kwasu siarko¬ wego, odsacza osad pod próznia, przemywa woda, alkoholem, eterem dwuetylowym, eterem naftowym i suszy. Otrzymuje sie 95 g kbo-(N02)arg-try-gli- 20 * -OH). Temperatura topnienia 225°[a] D =—14" w dwumetyloformamidzie, które rozpuszcza sie w 1,1 litra absolutnej pirydyny. Dodaje 85 g trój- -/2,4,5-trójchlorofenylo/ fosforynu, miesza w cia¬ gu 16 godzin w temperaturze 20°, odparowuje, rozpuszcza w octanie etylu, przemywa rozcienczo¬ nym kwasem siarkowym, suszy i odparowuje. Po¬ zostalosc krystalizuje sie z mieszaniny octan ety¬ lu-eter dwuetylowy i otrzymuje 125 g kbo-(N02) 20 arg-try-gli-ocp. Temperatura topnienia 124° [a]p = = —9° w dwumetyloformamidzie.Tak otrzymany ester trójpeptydu rozpuszcza sie w 240 ml dwumetyloformamidu, dodaje 750 g H-/kat/liz-pro-OH/ (przyklad XII) miesza w cia¬ gu 16 godzin w temperaturze 20° wytraca eterem dwuetylowym, saczy, rozpuszcza osad w mieszani¬ nie octan etylu-woda, przemywa 1 n kwasem cytrynowym, suszy i odparowuje. Pozostalosc prze- krystalizowuje sie 2 razy z octanem etylu. Otrzy¬ muje sie 125 g kbo-/NO,/arg-try-gli-/kat/liz-pro- 18 20 -OH. Temperatura topnienia 140°. [a]D = —20° w dwumetyloformamidzie. 85 g kbo-/N02/arg-try-gli-/kat/liz-pro-OH roz- '¦ puszcza sie w 450 ml kwasu octowego lodowatego, dodaje 50 ml wody i 50 g 10% palladu osadzonego na weglu, uwodornia, saczy, odparowuje, rozpusz¬ cza w wodzie, liofilizuje i suszy nad lugiem sodowym. Otrzymuje sie 46 g H-arg-tr$-gli-/ktb/ liz-pro-OH. [a]D =—9° w mieszaninie kwas octo- wy-woda (95:5). 61,5 g tri-glu/otb/—/tri/his-fe-NHNH2 (przy¬ klad IV) rozpuszcza sie w 150 ml dwumetylofor- ig mamidu i 150 ml izopropanolu, chlodzi do tempe¬ ratury ^-10° i dodaje 69 ml" 4 n kwasu solnego i nastepnie podczas mieszania 13,5 5 n roztworu azotynu sodowego. Po 5 minutach dodaje sie 42 ml trójetyloaminy i 1500 ml lodowatej wody, odsacza 20 sie pod próznia, rozpuszcza osad w octanie etylu, przemywa nasyconym roztworem soli kuchennej, suszy, odparowuje w temperaturze 0°, rozpuszcza pozostalosc w 150 ml dwumetyloformamidu, do¬ daje 40 g H-arg-try-gli-/kat/liz-pro-OH 3 g AcOH 25 i 6 ml trójetyloaminy, pozostawia w ciagu 16 go¬ dzin w temperaturze 0°, dodaje 1500 ml octanu etylu, przemywa 0,5 n kwasem octowym, woda i 0,5 n pirydyna, odparowuje, rozpuszcza i!ozo- stalosc w 150 ml octanu etylu i wytraca eterem 30 dwuetylowym. Otrzymuje sie 70 g tri-glu/otb/ -/tri/his-fe-arg-try-gli-/kat/liz-pro-OH. Tempera- 20 tura topnienia 150° [a]D = —15° w dwumetylo¬ formamidzie. 35 Tak otrzymany peptyd rozpuszcza sie w 300 ml pirydyny, chlodzi do temperatury —20°, dodaje 45 ml 1 n roztworu kwasu solnego w dioksanie, miesza 5 minut w temperaturze —20°, dodaje 12 ml trójetyloaminy, zageszcza do polowy ob- 40 jetosci, dodaje 45 g trój/trójchlorofenylo/-fosfory- nu, pozostawia w ciagu 16 godzin w temperatu¬ rze 20°, odparowuje, przerabia pozostalosc z ete¬ rem dwuetylowym, rozpuszcza w octanie etylu, wytraca eterem dwuetylowym, odsacza i suszy. 45 Otrzymuje sie 78 g tri-glu/otb/-/tri/his-fe-arg-try- -gli-/kat/liz-pro-ócp HC1. Temperatura topnienia 20 170° z rozkladem [a]D = —20° w dwumetylofor¬ mamidzie. / 60 Przyklad XIV. Amid 1-serylo-l-tyrozylo-l-se- rylo-1-norleucylo - 1-glutamylo - 1-histydylo-l- -fenylo - alanilo-l-arginilo-1 - tryptofan^lo - gli- cylo-l-lizylo-l-prolilo-l-waliIo--glicylo-l-lizylo-l-li - 55 zylo-l-lizylo-l-lizylo-l-prolilo-1-walilo- 1 -lizylo - 1 - -walilo-1-tyrozylo-l-prolilo-l-waliny.(H-ser - tyr-ser-nle - glu-his-fe-arg-try - gli- -liz-pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-pro-wal-liz-wal - tyr- -pro - wal-NH2). (Fig. 4). 60 18,5 g tri-glu/otb/-/tri/his-fe-arg - try - gli-/kat/ /liz-pro-ocp. HC1 i 18 g H-wal-gli-/kat/liz-/kat/ /liz-/kat/liz-/kat/liz - pro - wal-/kat/liz - wal^tyr- -pro - wal - NH2 (przyklad XII) rozpuszcza sie w 60 ml dwumetyloformamidu, dodaje 9 g imi- 65 dazolu i pozostawia przez 3 dni w temperaturze54657 19 20°. Dodaje sie jeszcze 1,8 g chlorowodorku tego samego aktapeptydu, pozostawia w ciagu dal¬ szych 16 godzin w temperaturze 20°, wytraca octanem etylu, saczy, rozpuszcza osad w etanolu, wytraca octanem etylu, saczy i suszy. Otrzymuje sie 26 g tri-glu/otb/-tri/his-fe-arg-try-gli-/kat/liz- -pro-wal-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz- pro - wal /kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2 (temp. top. 190° z roz¬ kladem [a] ^= —27° w dwumetyloformamidzie), któ¬ re rozpuszcza sie w 200 ml mieszaniny kwas octowy-woda (8:2), pozostawia przez 2 godziny w temperaturze 30°, odparowuje, przemywa octa¬ nem etylu, saczy i suszy. Otrzymuje sie 22 g octa¬ nu H-glu-/otb/-/tri/his-fe-arg-try-gli/kat/liz - pro - -wal - gM - /kat/liz-/kat/liz-/kat/liz-/kat/liz - pro - -wal-/kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2. 2,3 g tri-ser-tyr-ser-nle-NHNH2 (przyklad V) rozpuszcza sie w 12 ml dwumetyloformamidu, do¬ daje 4 ml wody, chlodzi do temperatury —10°, dodaje 2 ml 6 n kwasu solnego, zadaje 280 mg azotynu sodu, miesza przez 5 minut w tempera¬ turze —5°, dodaje 300 ml 0,2 n roztworu kwas¬ nego weglanu potasowego i odwirowuje. Otrzy¬ many tri-ser-tyr-ser-N3 rozpuszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu, zadaje 10,5 g octanu H- -glu/otb/-/tri/his - fe - arg - try - gli-/kat/liz-pro- wal - gli /kat/liz - /kat/liz - /kat/liz - /kal/liz-pro- -wal-/kat/liz-wal-tyr-pro-wal-NH2, pozostawiaj w ciagu 12 godzin w temperaturze 0°, dodaje jesz¬ cze dalsza otrzymana z dwóch gramów tri-ser- -tyr-ser-nle-NHNH2 ilosc azydku tetrapeptydu, pozostawia przez 6 godzin w temperaturze 0°, odparowuje, przerabia z octanem etylu, przemyj wa goracym acetonem i octanem etylu i suszy w prózni. Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 100 ml 90% kwasu trójfluoro-octowego, pozo¬ stawia w ciagu 1 godziny w temperaturze 20° w atmosferze azotu, odparowuje, zadaje octanem etylu, saczy i suszy. Otrzymany produkt roz¬ puszcza sie w 500 ml 0,2 n kwasu octowego, przepuszcza roztwór przez amberlit IRA-410 w postaci octanowej, saczy i liofilizuje. Po osusze¬ niu jiad wodorotlenkiem sodowym otrzymuje sie 7,5 g octanu H-ser-tyr-ser-nle-glu-his-fe-arg-try- -gli - liz - pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-pro-wal-liz- -wal-tyr-pro-wal-NH2, który zachowuje sie jed¬ norodnie przy chromatografowamu i elektrofo¬ rezie. (Calkowita hydroliza daje nastepujacy sklad aminokwasów: seri,8, tyri,9, nlei,0, gluo,9, hisi,i, fei,0, arg!,i, gli2,0, liz6,i, pro2,g, wal4,o, try ulega podczas hydrolizy rozkladowi).Produkt mozna ewentualnie przeprowadzic w inna sól. Moze byc skladowany w stanie stalym, w roztworze, lub jako adsorbat. PL

Claims (1)

Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego polipeptydu o wzorze amidu 1-serylo-l-tyrozylo-l-serylo-l- - norleucylo-1-glutamylo-l-histydylo - 1 - fenylo- alanilo-1-arginilo-l-tryptofanylo-glicylo - 1 - li- zylo-1-prolilo-l-walilo - glicylo-l-lizylo-l-lizylo-1- 20 lizylo-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo-l-lizylo-^l-walilo - -1-tyrozylo-l-prolilo-l-waliny, znamienny tym, ze od amidu N-R' -1-serylo-I-tyrozylo-1-serylo- -l-norleucylo-y-R"-l-glutamylo-Im - Rm-l-histy- ' dylo-1-fenylo - alanilo-l-argini|o-l-tryptofanylo - - glicylo-e-N-R-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo - glicy- lo-g-N-R-l-lizylo-e-N-R-l-lizylo-e-N-R-1 - lizylo - -e-N-R-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo-g-N-R-l-lizylo -- -1-walilo-l-tyrozyIo-l-prolilo-l-waliny, w któ- 10 rym R, R' R" i R'" oznaczaja atomy wodoru lub grupe ochronna/stosowana w chemii pepty- dów dla zabezpieczenia grup aminowych, przy czym co najmniej jedna z reszt R, R' R" i Rm nie moze oznaczac wodoru, a Im oznacza^ ze 19 grupa ochronna znajduje sie przy grupie imi- nowej, odszczepia sie grupy ochronne w jednym lub kilku stopniach, po czym otrzymany poli- peptyd przeprowadza sie ewentualnie w sole addycyjne z kwasami organicznymi lub nie- 20 organicznymi. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie od amidu N-R'-l- -serylo-1-tyrozylo-l-norleucylo-y-O-III rzed. bu- tylo-1-glutamylo -Im-trójfenylometylo-1-histydy- 25 lo-1-fenyloalanilo-l-arginilo-l-tryptofanylo - gli- cylo-e-N-R-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo - glicylo-e- -N-R-1-lizylo-e-N-R-l-lizylo-e-N-R-lizylo - e-N- -R-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo-e-N-R-l-lizylo-l-wa- lilo-1-tyrozylo-l-prolilo-l-waliny, w którym R 30 i R* oznaczaja grupy ochronne, stosowane w che- mi peptydów dla zabezpieczenia grup amino¬ wych. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepiaja sie w srodowisku 85 kwasnym od amidu N-R'-l-serylo-l-tyrozylo-l- -serylo-1-norleucylo-y-O-III rzed. butylo-1-glu- tamylo-Im-trójfenylometylo-l-histydylo-1 - feny- lo-alanilo-1-arginilo-l-tryptofanylo - glicylo-e-N- -R-l-lizylo-l-prolilo-1-walilo - glicylo-e-N-R- 1 - *• -lizylo-e-N-R-1-lizylo-e-N-R-l-lizylo-e-N - R -1 - -lizylo-l-prolilo-l-walilo-e-N-R-l-lizylo-1 - walilo- -1-tyrozylo-l-prolilo-l-waliny, w którym grupe ochronna R stanowi grupa karbo-III rzed. bu¬ toksylowa lub karbo-III rzed. amyloksylowa, 45 a grupe ochronna R* stanowi grupa trójfenylo- metylowa, karbo-III rzed. butoksylowa lub kar¬ bo-III rzed. amyloksylowa. 4. Sposób wedlug zastrz, 2 i 3, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie od amidu N-R'-l- 50 -serylo-l-tyrozylo-l-serylo-l-norleucylo-y-O - III rzed. butylo-l-glutamylo-Im-trójfenylometylo-1- histydylo-1-fenylo-alanilo-l-arginilo-l-tryptofany- lo-glicylo-f-N-R-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo - glicy- lo-e-N-R-1-lizylo-e-N-R-l-lizylo-f-N-R-l-lizylo-f- 55 -N-R-l-lizylo-l^prolilo-l-walilo-e-N-R-l-lizylo-1- -walilo-1-tyrozylo-l-prolilo-l-waliny, w którym R i TV posiadaja wyzej podane znaczenie, wytwo¬ rzonego na drodze kondensacji amidu 1-walilo-f- N-R-l-lizylo-l-walilo-l-tyrozylo-l-prolilo-1-wali- 60 ny, w którym R oznacza grupe karbo-III rzed. butoksylowa lub karbo-III rzed. amyloksylowa z estrem 2,4,5-trójchlorofenylowym N-karboben- zoi]oksy-l-walilo-glicylo-£-N-R-l-lizylo-e-N-R-l- -lizylo-f-N-R-1-lizylo-e-N-R-l-lizylo-l-proliny, w 65 którym R posiada wyzej podane znaczenie,54657 21 kondensacji otrzymanego amidu N-karbobenzo- iloksy-1-walilo-glicylo-e-N-R-l-lizylo-e-N-R-l-li- zylo-£-N-R-l-lizylo-£-N-R-l-lizylo-l-prblilo - 1 - -walilo-e-N-R-1-lizylo-l-walilo-l-tyrozylo- 1 -pro- lilo-1-waliny, w którym R posiada wyzej po¬ dane znaczenie, po odszczepieniu grupy karbo- fcenzoiloksylowej z estrem 2,4,5-trójchlorofeny- lowym N-trójfenylometylo-y-O-III rzed. buty- lo-l-glutamylo-Im-trójfenylometylo-l-histydylo-1- -fenylcalanilo-1-arginilo-l-tryptofanylo-glicylo-e- -N-R-1-lizylo-l-proliny, w którym R posiada wyzej podane znaczenie i kondensacji otrzyma¬ nego amidu N-trójfenylometylo-y-O-III rzed. 22 butylo-1 - glutamylo - Im - trójfenylometylo-1- -histydylo-1-fenyloalanilo - 1-arginilo-l - trypto- fanylo - glicylo-e-N-R-1-lizylo-l-prolilo-l-walilo- -glicylo-e-N-R - 1-lizylo-e-N - R-1-lizylo-e-N-R- 5. -1-lizylo-c-N-R-l-lizylo-l - prolilo - 1-walilo-f-N- - R -1 - lizylo -1 - walilo -1 - tyrozylo - 1-prolilo-l - -waliny, w którym R posiada wyzej podane znaczenie, po odszczepieniu grupy N-trójfenylo- metylowej z azydkiem N-R'-l-serylo-l-tyrozylo- 10 -1-serylo-l-norleucyny, w którym R' oznacza grupe trójfenylometylowa, karbo-III rzed. buto- ksylowa lub karbo-III rzed amyloksylowa.KI. 12 q,6/01 54657 MKP C 07 c **p. 1 kbo Kbo-| tyr [ocp H-\ pro wof |-NHt Kbo-| tyl' kbo -I- kbo-| wal [-ocp H-| tyr kbo-lwal R kbo-| liz [ocp H wal kb kbo -| wal [-ocp H -liz kbo-| wal H4 wal Hz tfz wal wal wal wal tyr Jy_ tyr T\jr tyr tyr pro pro pro pro pro pro pro pro wal NH wal hNH, wal hNH, wal NH. wal hNH wal HNH, wal hNH wal hNH *ifr 2 1 l kboH wal ftli hocp H-| liz iiz kbo- kbo- kbo- wat git wal Qii wal cli kbo-| Uz liz [ome i—l owe kbo-|_wal__2[i_ kbo-| wal q[j J—l Uz liz homc kfc*H liz kbo-| liz pro kme LOH kbo liz pro ocp H-\ liz pro OH 4—l iiz liz NHNHj kbo liz 4—t liz liz l-N, H- liz liz pro hOH OH liz pro l * {iZ {17 liz lir pro OH liz tiz liz liz PfO ocp H-|wai liz wal tyr pro wa^NH^ R -+- kbo-| wal git Uz liz liz liz pro wal liz wal tyr pro waLhNH H-|waL a[j liz liz Uz liz pro wal liz wal tyr pro wal* NKKI. 12 q, 6/01 54657 MKP C 07 c Fig. 3 otb kbo-| frtu, |-ocp h- otb kbo-| ^a otb -h HA <\i* tn- otb 4- otb tn-ljlu otb tri ¦ (jlti otb tri-ljlu otb t- tn-ljtu his |e kme NO. his fe ¦orne kbo-lar^ tri N02 his fe |-ome kboJ aro/ tri o^li omc OH tri -I- N0L _jtu his Je |-ome kbo^ orfr tyj 9U |-ocp H-| gz pr0 |_QH tri -h his fe tri -I- his {e NHINH2 kbo- N3 H- N02 ar<^ aro. tri tri 9« 9« R | liz R 1 liz pYO pro OH tri his Je rfr tri gli 4- Jtz__proU0H tri -I- his fe af(j, t^i <^ liz .pro kocpFigA R'-]ser|-OH ri-| tvjr |-ome Kbo-j ser |-QH H-[nte]-Ofne *-| R'- R1- ser ser ser tyr| ty iyr ser ser RM ser t^]-ome kbo-| ser nle \- ome N3 HHser _nle|-ome otb tri typ ser nfeLome trt- afit his Jfe arg- tmj a{| fiz pro|-oc p ? f T * wal gli liz lii th liz pro wal fiz n/af V pro *a/[-Nft t\jr ser rife t\jr ser nfeL-N NHNH N3 tri- H- otb tri i i H

1 .. CIU hiS fe arfl tr\j O/i otb tri i i 1 • ' •. JfU/ his {e aro- try (Jii ? ftz pro ? 1 fiz pro MM P i i i i i waf afi fiz fiz fiz Uz pro ml \\z waf ty pro wof MM i i i i i i wa[ a{\ Hi -fiz Hz liz pro wa( fiz wat ty pro mI otb tri R R R R NM 2 ¦NH 2 RM ser t\jr ser nte ftftt his je arfr tnj q,(t fiz. pro wat c£i fiz tiz liz (iz pro wal fiz kal ty pro W[-IMH Hj ser t\jr Ser nte frti* his je arfr twj gEi fiz pro woi att fiz fiz fiz fiz pro wof fiz wof ty pro \ital\-UH PL