PL52617B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 26.Y.1964 Wielka Brytania Opublikowano: 5.1.1967 52617 KI. 6 a, 22/04 MKP C 12 d J&/IO UKD BIBLIOTEK Twórca wynalazku: Eunice Jean Napier Wlasciciel patentu: Glaxo Laboratories Limited, Greenford (Wielka Brytania) Urzedu Patentowego! Sposób otrzymywania kompleksu enzymów proteolitycznych Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania kom¬ pleksu enzymów proteolitycznych.Preparaty enzymatyczne znajduja coraz wszech¬ stronniejsze zastosowanie w przemysle. Na przy¬ klad enzymy; proteolityczne stosuje sie w prze¬ mysle piekarniczym, garbarskim i browarniczym.Stwierdzono, ze bakterie rodzaju Cytophaga, za¬ rejestrowane w Narodowym Zbiorze Bakterii Prze¬ myslowych (National Collection of Industrial Bac- teria) w Aberdeen w Szkocji, pod numerem NCIB 9497 wytwarzaja kompleks enzymów proteolitycz¬ nych o szerokim zakresie dzialania i duzej aktyw¬ nosci. Kompleks ten rozklada grzybnie grzybowa.Wykazuje on silna aktywnosc proteolityczna rów¬ niez wobec keratyny i zawiera, miedzy innymi, la- minarynaze i chitynaze, co poszerza zakres jego zastosowania.Nizej podane sa cechy charakterystyczne bakte¬ rii Cytophaga NCIB 9497.Morfologia. W wyniku badania bakterii za po¬ moca fazowego mikroskopu kontrastowego z obiek¬ tywem X20 po 24-godzinnej hodowli w temperatu¬ rze 20°C stwierdzono pojedyncze i podwójne nie¬ ruchliwe, krótkie, proste, dosc cienkie paleczki o równoleglych bokach i zaokraglonych koncach. Po¬ dobny wyglad mialy w wodzie peptonowej w tem¬ peraturze 30° C.Barwienie metoda Gramma, po 3-dniowej hodo¬ wli na pozywce agarowej w temperaturze 20° C: Gramm-ujemne, krótkie, proste paleczki o bokach 10 15 20 25 30 równoleglych i zaokraglonych koncach; barwienie o nierównych pasmach. Podobny wyglad mialy bakterie wyhodowane na pozywce zawierajacej agar, glukoze i pepton. Barwienie wystepuje na¬ wet na agarze z krwia.Wyglad kolonii. Po 4 dniach hodowli na pozywce agarowej w temperaturze 20° C, hodowla jest bla- dozólta, pólprzezroczysta o ksztalcie kolistym, wy¬ pukla, jednolita, gladka i blyszczaca, ma srednice 1—1,5 mm i wydziela gryzacy zapach.Po 4-dniowej hodowli na pozywce, zawieraja¬ cej agar, glukoze i pepton w temperaturze 20° C, kolonia jest bladozólta, przezroczysta o ksztalcie kolistym, wypukla, jednolita, gladka blyszczaca i sluzowata, ma srednice 1—2,5 mm i wydziela gry¬ zacy zapach.Po 4-dniowej hodowli na agarze z krwia w tem¬ peraturze 20° C, kolonia jest szarawo-zólta, pól¬ przezroczysta, o ksztalcie kolistym, wypukla, jed¬ nolita, gladka i blyszczaca, ma srednice 1—2 mm, wydziela gryzacy zapach i nie wykazuje zjawiska hemolizy.Wzrost w srodowisku plynnym. Po dwóch dniach hodowli na pozywce z bulionu w temperaturze 20° C obserwuje sie slaby wzrost kolonii, bardzo slabe równomierne zmetnienie i niewielki lepki osad. Wzrost jest równiez slaby w temperaturze 30° C.Po dwóch dniach hodowli na wodnej pozywce glukozo-peptonowej w temperaturze 20° i 30°C 526173 obserwuje sie umiarkowany wzrost i slabe rów¬ nomierne zmetnienie.Zaleznosc wzrostu kolonii od temperatury. W temperaturze 5°—10°C nie nastepuje wzrost ko¬ lonii. W temperaturze 37° C wystepuje slaby wzrost. Kolonia jest niewrazliwa na dzialanie pe¬ nicyliny i streptomycyny, lecz wrazliwa na dzia¬ lanie chloramfenikolu i hydroksytetracykliny. W temperaturze 20°C lub 30°C nie powstaje zaden kwas ani gaz z glukozy, sacharozy, maltozy, man¬ nitu lub skrobii. W glukozowej pozywce Hugh i Leifsona nie wystepuje zmiana zabarwienia. W temperaturze 20° C nastepuje peptonizacja mleka lakmusowego i redukcja odczynnika, a w tempe¬ raturze 30° C tylko peptonizacja. W temperaturze 20° C zelatyna uplynnia sie. W temperaturze 20° i 30° hodowli — w oksydaza Kovaca dodatnia. Po¬ za tym w temperaturze 20° i 30° nie wytwarza sie indol, a zabarwienie czerwieni metylowej nie ule¬ ga zmianie. W warunkach tych nie wytwarza sie acetylometylokarbinolu a azotan nie ulega reduk¬ cji. Z peptonu wytwarza sie amoniak. Katalaza i ureaza jest ujemna. Cytrynian wykorzystuje sie jako jedyne zródlo wegla. Lipazy i lecytynazy nie obserwuje sie na agarze zóltkowym.Badania te przeprowadzone wedlug Bergeya Ma¬ nual of Determinative Bacteriology, wyd. 7-me 1957 (Bailiere Tindall Cox, London), okreslaja ba¬ dany mikroorganizm jako Flavobacteria (str. 309— —322) lub Cytophaga (str. 858—863). Flavobacteria i Cytophaga okresla sie dalej wspólnie jako Cyto¬ phaga.Sposób otrzymywania kompleksu enzymów we¬ dlug wynalazku polega na hodowaniu drobnou¬ stroju Cotyphaga NCIB 9497 na odpowiedniej po¬ zywce w warunkach aerobowych, na przyklad me¬ toda fermentacji aerobowej glebinowej.Jako srodowisko fermentacyjne nadaja sie pod¬ loza, stosowane powszechnie przy hodowli drob¬ noustrojów. Podloza te stanowia podstawowe zród¬ la azotu, które w razie potrzeby uzupelnia sie we¬ glowodanem i (lub) solami odzywczymi. Jako zród¬ la azotu stosuje sie ekstrakt slodowy, ekstrakt miesny, pepton i wyciag namokowy kukurydzy, oddzielnie lub w kombinacji ze soba. Szczególnie korzystnym zródlem azotu jest grzybnia grzybowa na przyklad rodzajów Cephalosporium i Penicil- lium. Umozliwia to stosowanie jako zródla azotu pozostalosci grzybniowych po produkcji antybioty¬ ków.Surowiec bedacy zródlem azotu zaspokaja czesto zapotrzebowanie bakterii Cytophaga NCIB 9497 na wegiel i (lub) sole odzywcze tak, ze na przyklad wystarczajace jest stosowanie jako srodowiska fer¬ mentacyjnego srodowiska zlozonego wylacznie z ekstraktu miesnego i peptonu, zawierajacego równiez chlorek sodowy. W niektórych przypad¬ kach pozadane jest uzupelnienie srodowiska weglo¬ wodanem, przy czym odpowiednimi weglowodana¬ mi sa sacharoza, maltoza, glukoza i inne. Poza tym pozadany jest niekiedy dodatek substancji mine¬ ralnych takich jak magnez, zelazo i cynk. Przed sterylizacja pH srodowiska ustala sie na 5—8 ko¬ rzystnie 5,5—6,0.Proces fermentacji prowadzi sie w temperaturze 4 20—35°C, korzystnie 22—33^, a najkorzystniej w temperaturze okolo 26°C w ciagu 20—50 godzin.Wytworzona ciekla kulture stosuje sie lako taka lub wyodrebnia sie z niej kompleks enzymów, na 5 przyklad przez osuszenie calego bulionu lub jego sklarowanie przez odwirowanie a nastepnie wysu¬ szenie sklarowanej cieczy np. przez odparowanie ze stanu zamrozenia. Wyodrebniony kompleks enzymów ewentualnie oczyszcza sie, na przyklad 10 przez stracenie z roztworu wodnego za pomoca czynników stracajacych proteiny, takich jak aceton lub siarczan amonowy, droga dializy itp. Kompleks enzymów mozna na przyklad stracic na kaolinie przez dodanie do bulionu okolo 20^/o-owego siar- 15 czanu amonowego.Surowy kompleks enzymów otrzymany sposo¬ bem wedlug wynalazku wystepuje w postaci su¬ chego, bladokremowego proszku, który w tempe¬ raturze 4°C jest trwaly przez szereg miesiecy. 20 Proszek ten rozpuszcza sie w wodzie w ilosci 0,1% tworzac opalizujacy roztwór.Jak wspomniano wyzej, wytworzony sposobem wedlug wynalazku, kompleks enzymów wykazuje miedzy innymi dzialanie podobne do proteazy, la- 25 minarynazy i chitynazy. Poza tym, kompleks ten wykazuje aktywnosc keratynazy, elastazy i lipazy oraz zdolnosc rozkladania grzybni róznych ustro¬ jów grzybowych.Dzialanie kompleksu enzymów ujawnia na przy- 30 klad jego zdolnosc do rozkladania zelatyny i ka¬ zeiny, keratyny oraz róznych grzybni grzybowych, na przyklad plesni rodzaju Penicillium i Cephalos¬ porium.Szczególnie godna podkreslenia jest duza szyb- 35 kosc dzialania kompleksu enzymów, wytworzonego sposobem wedlug wynalazku.Kompleks ten stosuje sie na przyklad przy pro¬ dukcji pokarmów zbozowych i karmy dla zwierzat, do udelikatniania miesa, do produkcji hydroliza- 40 tów proteinowych, do wytrawiania skór, do usu¬ wania plam przy czyszczeniu na sucho, a takze dla celów medycznych do przyspieszania zabliznia¬ nia ran, lagodzenia stanów zapalnych, usuwania skrzepów krwi i siniaków. 45 Poza tym stwierdzono, ze kompleks enzymów wykazuje rozkladajace dzialanie wobec róznych grzybów patogenicznych na przyklad M. canis, Trichophyton rubrum i T. sulphureum.Dzieki temu, ze kompleks enzymów, otrzymany so sposobem wedlug wynalazku wykazuje zdolnosc rozkladania grzybni grzybowej mozna za jego po¬ srednictwem wykorzystac zuzyta grzybnie z pro¬ dukcji antybiotyków, zwlaszcza produktów cefalo- sporynowych. Taka zuzyta grzybnie rozklada sie 55 za pomoca enzymu, a wytworzona rozpuszczalna substancje stosuje sie jako pozywke w czasie fer¬ mentacji. Stopien aktywnosci kompleksu enzymów wobec grzybni grzybowej zalezy od rodzaju danej grzybni, na przyklad w przypadku rodzaju Cep- oo halosporium i trzech rodzajów dermatofitowych podanych wyzej, zachodzi calkowity rozpad ko¬ mórki. W przypadku Penicillium chrysogenum, Adpergillus fumigatus i Rhizopus nigricans, mlode strzepki grzyba staja sie szybko pólprzezroczyste, 65 a zawartosc komórek zanika lub plazmolizuje sie.Pomimo uwolnienia niewielkiej ilosci N-acetylo- glukozaminy, scianki komórek pozostaja zasadni¬ czo niezmienione.Jesli chodzi o dzialanie keratynazowe, kompleks enzymów dziala na wlosy i warstwe rogowa.Kompleks ten stosuje sie w sposób uzywany zwykle w technologii enzymów. Przy rozkladaniu grzybni grzybowej najkorzystniejsza wartosc pH wynosi 7, a temperatura procesu 37°C. Przy dzia¬ laniu proteolitycznym wartosci te wynosza ko¬ rzystnie odpowiednio pH = 8 i temperatura 37°C.Dzialanie rozkladajace kompleksu enzymów wobec grzybni grzybów ustaje szybko w temperaturze 50°C i wyzszej; dzialanie proteolityczne ustaje w temperaturze 60°C.Ponizsze przyklady objasniaja sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. Pozywki w ilosci 40 ml umiesz¬ czone w stozkowych kolbach o pojemnosci 250 ml, skladajace sie z 4°/o maltozy, 2,4% ekstraktu slo¬ dowego, 1% peptonu i wody destylowanej do 100°/o, o pH = 7, ustalonym przez dodanie wodorotlenku sodowego, zaszczepiono oczkami kultury drobno¬ ustroju Cytophaga NCIB 9497 i prowadzono fer¬ mentacje w temperaturze 26°C na trzesawce (pod¬ rzut 5 cm) pracujacej z predkoscia 200 obrotów na minute. Po 2-dniowej inkubacji, kultura ta wy¬ kazywala silne rozkladowe dzialanie wobec Cep- halosporium acremonium (Brotzu) IMI 49137.Przyklad II. Pozywki w ilosci 100 ml, umieszczone w stozkowatych kolbach o pojem¬ nosci 250 ml zawierajace l10/© ekstraktu miesnego, 1% peptonu, O^/o chlorku sodowego i wody desty¬ lowanej do 100°/o o pH = 8 ustalonym przez do¬ danie wodorotlenku sodowego, po 1-godzinnym go¬ towaniu, odsaczeniu i ustaleniu pH na 7,2 przez dodanie kwasu chlorowodorowego, zaszczepiono oczkami kultury drobnoustroju Cytophaga NCIB 9497 i prowadzono fermentacje w temperaturze 26°C na trzesawce (podrzut 5 cm), pracujacej z predkoscia 200 obrotów/min. Po jednodniowej in¬ kubacji, kultura wykazywala silne dzialanie roz¬ kladajace wobec C. acremonium.Przyklad III. W warunkach okreslonych w przykladzie II lecz z zastosowaniem pozywki, skla¬ dajacej sie z 2,5Vo namokowego roztworu kukury¬ dzy, 0,55% octanu amonowego, 2,5°/o sacharozy i wody destylowanej do lOO^/o o pH = 6,5 ustalo¬ nym przez dodanie wodorotlenku sodowego, po jednodniowej inkubacji otrzymano kulture, która wykazywala dzialanie rozkladowe wobec C. acre¬ monium.Przyklad IV. Trzy litry, sterylizowanej przez 30 minut w temperaturze 120°C pozywki, skladaja¬ cej sie z 6°/o sprasowanej na mokro grzybni C. acremonium, 0,0TD/o wodorofosforanu dwupotaso- wego, 0,03 dwuwodorofosforanu potasowego, 0,05 MgSO, • 7H20, 0,001 FeS04*7H20, 0,0001 ZnS04 • • 7H20 0,25 oddzielnie sterylizowanej glukozy i uzu¬ pelnionej woda destylowana do lOO^/o, zaszczepiono 60 ml wyrosnietej kultury drobnoustroju Cyto¬ phaga NCIB 9497 i calosc utrzymywano w tem¬ peraturze 26°C mieszajac z predkoscia 550 obro¬ tów/min. oraz napowietrzajac najpierw przez 20 6 godzin z predkoscia 3 litrów powietrza na minute, nastepnie przez 4 godziny z predkoscia 1 litr/min. a przez dalsze 2 godziny z predkoscia 0,5 Kira/min.Nastepnie odwirowano srodowisko fermentacyjne 5 i po liofilizacji górnej warstwy plynu, otrzymano G,6 g kremowej stalej substancji, która wykazy¬ wala rozkladowe dzialanie wobec C. acremonium i dzialanie proteolityczne wobec kazeiny.Przyklad V. Póltora litra kultury z przykla- le du IV uwolniono przez odwirowanie od substancji stalej, ustalono pH na 6,1 przez dodanie kwasu octowego i odparowano mieszanine w prózni w temperaturze ponizej 40°C do objetosci 250 ml.Otrzymany koncentrat wprowadzano powoli do 15 2 litrów acetonu po czym ochlodzono mieszanine do 5°C mieszajac ja szybko. Po wyplukaniu aceto¬ nem i wysuszeniu nad pieciotlenkiem fosforu, otrzymano 7,4 g jasnobrunatnego produktu, który wykazywal te sama aktywnosc co wyjsciowy 29 bulion.Przyklad VI. Jeden litr kultury z przykladu IV uwolniono przez odwirowanie ze stalej sub¬ stancji, po czym rozpuszczono w nim 472 g siar¬ czanu amonowego. Po odsaczeniu straconego pro- 25 duktu i wysuszeniu go, otrzymano 19 g substancji wykazujacej okolo 50°/o aktywnosci wyjsciowej bulionu.Przyklad VII. Dwa litry kultury z przykla¬ du IV uwolniono ze stalej substancji przez odwiro- 30 wanie, po czym wlano je do 20 litrów lodowatego acetonu. Po odsaczeniu produktu, wyplukaniu go acetonem i wysuszeniu nad pieciotlenkiem fosforu, otrzymano 10 g substancji wykazujacej aktywnosc równa aktywnosci wyjsciowego bulionu. 35 Przyklad VIII. Kawalki swiezej skóry cie¬ lecej zanurzono w P/o-owym roztworze, wytworzo¬ nego jak w przykladzie VII preparatu enzymowe- go, w buforze M/50 Tris o pH = 7. Po 18 godzinach w temperaturze 37°C wlosie wychodzilo latwo pod 40 wplywem lagodnego skrobania. Podobne dzialanie buforu Tris lecz bez zastosowania preparatu enzy- mowego nie umozliwilo usuniecia wlosia nawet przez silne wyciaganie.Przyklad IX. W ciagu 24 godzin w srodo¬ wisku zlozonym z peptonu i ekstraktu slodowego o temperaturze 26°C umieszczonym w kolbie wstrzasanej wytworzono grzybnie Trichophyton rubrum (jeden z grzybów wywolujacych grzybice stóp u sportowców). Nastepnie odsaczono grzybnie i zawieszono ja (0,2°/o) w 0,2%-owym roztworze, wytworzonego jak w przykladzie VII, preparatu enzymowego w buforze M/50 Tris o pH = 7. Po trzech godzinach w temperaturze 27°C grzybnia 55 rozpuscila sie calkowicie.Przyklad X. Do 600 ml bulionu fermenta¬ cyjnego, wytworzonego jak w przykladzie IV, do¬ dano 1,65 g kaolinu, a nastepnie porcjami 180 g siarczanu amonowego, mieszajac calosc mecha- 60 nicznie do rozpuszczenia. Nastepnie przez odsacze¬ nie wyosobniono mieszanine kaolinowo-proteino- wa, która wyplukano woda i wysuszono w piecu prózniowym w temperaturze pokojowej. Otrzyma¬ no 11,7 g produktu wykazujacego cala aktywnosc 65 wyjsciowego bulionu.52617 PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania kompleksu enzymów proteolitycznych na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze bakterie Cytophaga NCTB 9497 hoduje sie w warunkach aerobowych w temperaturze 20—35°C na pozywkach, zwy¬ kle stosowanych do hodowli drobnoustrojów, po czym otrzymany kompleks enzymów ewen¬ tualnie wyodrebnia sie z cieklej kultury.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze • stosuje sie pozywke, zawierajaca jako zródlo azotu grzybnie grzybów korzystnie rodzaju Cephalosporium lub Penicillium.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke, zawierajaca jako zródlo azotu ekstrakt slodowy, ekstrakt miesny, pe¬ pton i (lub) namokowy roztwór kukurydzy.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 i 3, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke, zawierajaca ekstrakt miesny, pepton i chlorek sodowy.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1—4, znamienny tym, 10 15 20 10. 8 ze stosuje sie pozywke z dodatkiem weglowo¬ danów, korzystnie sacharozy, maltozy i (lub) glukozy. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie korzystnie w tempe¬ raturze 22—32°C, najkorzystniej w tempera¬ turze okolo 26°C. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w ciagu 20—50 godzin. Sposób wedlug zastrz. 1—7, znamienny tym, ze kompleks enzymów wyosabnia sie z surowej kultury przez jej wysuszenie. Sposób wedlug zastrz. 1—8, znamienny tym, ze kompleks enzymów wyosabnia sie z surowej kultury przez odwirowanie z niej zanieczysz¬ czen i wysuszenie sklarowanej cieczy np. przez odparowanie ze stanu zamrozonego. Sposób wedlug zastrz. 1—9, znamienny tym, ze wyodrebniony kompleks enzymów oczyszcza sie przez stracenie go z roztworu wodnego za pomoca czynnika stracajacego proteiny np. acetonu lub siarczanu amonowego. BIBLIOTEK 'Urzedu Potenlov.-»cH WDA-1. Zam. 55/6 6. Nakl. 240. PL