PL52448B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 20.1.1967 KI. 30 h, 6 l MKP C 12 d 3/yflj UKD Wspóltwórcy wynalazku: Wieslaw Drzewinski, Edward Zukowski, zLijrItdu ?^^'"^S,.. gniew I^assota, Danuta Ruczaj, Iwona Koro^J^|fc^^^-v : Wlasciciel patentu: Tarchominskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa" Przedsiebiorstwo Panstwowe, Warszawa (Polska) Sposób wydzielania erytromycyny lub jej pochodnych z plynów pofermentacyjnych Sposób wedlug wynalazku dotyczy wydziela¬ nia erytromycyny lub jej pochodnych z plynów pofermentacyjnych w formie kompleksu o ogól¬ nym wzorze: (AlkCOOK)x • [Erytromycyna • HCNS gdzie Alk — oznacza wodór lub jednowarto- sciowy rodnik szeregu parafin zawierajacy od 1 do 2 atomów wegla. x — oznacza liczbe przybierajaca wartosci 0,5 1 lub 2 w zaleznosci od warunków wytracania.Plyny pofermentacyjne uzyskuje sie znanymi sposobami przez hodowle odpowiednich mikro¬ organizmów na pozywkach plynnych w proce¬ sach tak zwanej fermentacji glebinowej. Pro¬ cesom wydzielania biologicznie czynnych sub¬ stancji z plynów pofermentacyjnych stawiane sa specjalne wymagania: substancja czynna be¬ daca w stanie duzego rozcienczenia rzedu kilku kilogramów w tonie przefermentowanego ma¬ terialu winna byc wydzielona z mozliwie duza wydajnoscia oraz wysoka czystoscia spelniaja¬ ca warunki stawiane preparatom leczniczym te¬ go typu.Spelnienie tych wymagan jest utrudnione przez koniecznosc oddzielenia w trakcie proce¬ su izolacji substancji o bardzo nieraz zblizonej budowie chemicznej, a nie wykazujacych czyn¬ nosci biologicznej, a zatem bezwartosciowych zanieczyszczen. Produkty tego typu powstaja niestety w procesach opartych na biosyntezie 10 15 20 25 30 prawie powszechnie. Nastepnym utrudnieniem jest labilnosc czynnych biologicznie zwiazków pod wplywem ostrzejszych warunków obróbki co w znacznym stopniu ogranicza swobode w wyborze techniki izolacji.Znane dotychczas sposoby wydzielenia ery¬ tromycyny z plynów pofermentacyjnych pole¬ galy na ekstrakcji czynnej substancji do roz¬ puszczalnika organicznego nie mieszajacego sie z woda, ponownej reekstrakcji do srodowiska wodnego, wydzieleniu antybiotyku w formie su¬ rowej zasady oraz ostatecznym oczyszczeniu przez krystalizacje z rozpuszczalników organicz¬ nych jak np. z chloroformu lub nitrometanu.Inny wariant izolacji przewiduje wysolenie antybiotyku z reekstraktu wodnego do acetonu w podwyzszonej temperaturze i nastepnie wy¬ dzielenie wolnej zasady przez rozcienczenie wo¬ da.Najnowsze opisy patentowe zalecaja wydzie¬ lanie z zageszczonych ekstraktów organicznych trudnorozpuszczalnych polaczen erytromycyny z oksykwasami wzglednie z bezwodnikami kwa¬ sów. Wymienione tu metody wykazuja nastepu¬ jace niedogodnosci: sposób opierajacy sie na wydzieleniu surowej zasady a nastepnie jej oczyszczeniu przez rekrystalizacje np. z chloro¬ formu pozwala wprawdzie otrzymac produkt o odpowiedniej jakosci, jednak z uwagi na wie- loetapowosc procesu nie gwarantuje uzyskania 52 44852 448 3 dobrej wydajnosci, a ponadto zmusza do poslu¬ giwania sie toksycznymi rozpuszczalnikami (chloroform). Metoda opierajaca sie na wysole- niu antybiotyku do acetonu upraszcza technolo¬ gie, eliminuje koniecznosc stosowania toksycz¬ nego chloroformu jednak nie gwarantuje odpo¬ wiedniej jakosci preparatu. / Najnowsze metody bazujace na wydzieleniu pólproduktu z oksykwasami lub bezwodnikami kwasów sa stosunkowo proste. Pozwalaja na wydzielenie antybiotyku w formie pólproduktu o czystosci pozwalajacej na bezposrednie otrzy¬ mywanie finalnych preparatów, jednak z uwa¬ gi na stosunkowa spora rozpuszczalnosc tych pólproduktów w rozpuszczalnikach organicznych konieczne jest, dla zmniejszenia strat w lugach pokrystalicznych, zageszczanie roztworów wyj¬ sciowych. Mozna to jedynie osiagnac stosujac wysokosprawne prózniowe aparaty wyparne.Takie postepowanie wymaga zainstalowania spe¬ cjalnych urzadzen, a jednoczesnie nie eliminuje calkowicie strat termolabilnej substancji czyn¬ nej, podczas zageszczania w podwyzszonej tem¬ peraturze.Udalo sie wyeliminowac podane wyzej nie¬ dogodnosci przez bezposrednie wytracenie z ek¬ straktu trudnorozpuszczalnego polaczenia kom¬ pleksowego o wzorze: (CHsCOOK)x • Erytromycyna • HCNS, które okazalo sie szczególnie przydatne dla izo¬ lacji erytromycyny.Polaczenie takie powstaje po wprowadzeniu nasyconego wodnego roztworu rodanku potasu (1 g w 0,5 ml wody) do ekstraktów erytromycy¬ ny w rozpuszczalnikach organicznych w srodo¬ wisku lekko kwasnym od kwasu octowego.W zaleznosci od warunków stracania moga powstac polaczenia zawierajace 1/2, 1 lub 2 mo¬ le octanu potasu na mol tiocjanianu erytromy¬ cyny.Ponizsza tabela podaje porównanie ilosci pota¬ su w procentach, znalezionych i wyliczonych dla poszczególnych zwiazków: L. ¦ 1 f 2 3 [ 4 i 5 . ' 6 i Zwiazek Erytromycyna 'HCNS (CHsCOOK) 0,5 erytromycyna • HCNS (CHsCOOK) 0,5 i erytromycyna • HCNS (CHsCOOK) • Ery¬ tromycyna •¦ HCNS (CHsCOOK) • Ery¬ tromycyna • HCNS (CHseOOK)2 Ery¬ tromycyna • HCNS Zawartosc potasu w procentach Obli¬ czona 0 2,32 2,32 .. 4,38 4,38 t 7,90 Znale- 1 ziona slady 2,6 2,3 4,4 4,6 7,8 | Z. zestawienia wynika, ze zawartosc procento¬ wa potasu obliczona i oznaczona przy pomocy fotometru plomieniowego Bunsena jest zgodna w granicach bledu analizy.Opisany w literaturze tiocjanian erytromycy¬ ny — (Erytromycyna • HCNS) jest bialym krysta¬ licznym proszkiem o temperaturze topnienia 165 — 167°C (z rozkladem), dobrze rozpuszczalnym w 5 metanolu, etanolu, dioksanie, a praktycznie nie¬ rozpuszczalnym w acetonie i wodzie. Wyizolowa¬ ne kompleksowe zwiazki o wzorze (CHsCOOK)x • • Erytromycyna • HCNS, w którym x moze przyjmowac wartosci 1/2, 1 lub 2 sa bia- 10 lymi krystalicznymi proszkami o temperatu¬ rze topnienia 131 — 136° (z rozkladem) rozpu¬ szczalnymi dobrze w acetonie, metanolu i eta¬ nolu.Porównanie widm w podczerwieni dla tiocja- 15 nianu erytromycyny i zwiazku (CHsCOOK)x- • Erytromycynafc HCNS uzyskanych na aparacie Perkin-Elmera wykazuje dla tiocjanianu cha¬ rakterystyczne pasma dla grupy CNS" w za¬ kresie 2050 cm-1.. Natomiast widmo zwiazku 20 kompleksowego wykazuje obok pasma charakte¬ rystycznego dla grupy CNS™ dodatkowe pasma w zakresie 1400 — 1560 cm—1 charakterystyczne dla grup karboksylowych.Rysunek 1 przedstawia widmo w podczerwie- 25 ni dla tiocjanianu erytromycyny. Rysunek 2 przedstawia widmo w podczerwieni dla zwiazku (CHsCOOK) 0,5 • Erytromycyna • HCNS.Porównujac otrzymane widma do widm czy- 30 stej erytromycyny znajdujemy potwierdzenie dla obecnosci grupy CNS"na rys. 1 oraz grup CNS" i COO~na rys. 2. Rekrystalizacja kompleksu (CHsCOOK)x • Erytromycyna • HCNS z acetonu w przypadku kiedy x jest wieksze od wartosci 35 0,5 prowadzi do ustalenia sie skladu komplek¬ su i wtedy x przybiera wartosc zblizona do 0,5 a temperatura topnienia waha sie w granicach 130 — 135°C (z rozkladem). Produkt skrysta¬ lizowany utrzymuje swa dobra rozpuszczalnosc 40 w acetonie.Kompleks rozklada sie przez zawieszenie w 5 cz. wody do tiocjanianu erytromycyny o tem¬ peraturze topnienia 165—167°C. Nierozpuszczal¬ ny w acetonie tiocjanian erytromycyny zawie- 45 szony w nim rozpuszcza sie po wprowadzeniu octanu potasu na skutek powstawania komplek¬ su z octanem potasowym. Wydzielenie erytromy¬ cyny za pomoca omawianego kompleksu jest selektywne i nie obejmuje erytromycynopodob- so nych zwiazków nie posiadajacych czynnosci bio¬ logicznej. Przykladem takiego zwiazku moze byc anhydroerytromycyna pozbawiona czynno¬ sci biologicznej, a rózniaca sie od erytromycy¬ ny jedynie brakiem jednego atomu tlenu i dwu atomów wodoru.Zwiazek ten powstaje zwykle w czasie pro¬ wadzenia biosyntezy w ilosci kilku do kilku¬ nastu procent w stosunku do wytworzonej ery¬ tromycyny i nie oddzielony w czasie procesu izolacji obniza wartosc lecznicza preparatu fi¬ nalnego. Obecnosc anhydroerytromycyny w ply¬ nach pofermentacyjnych okreslic mozna przez porównanie oznaczen zawartosci erytromycyny 65 metoda biologiczna i metoda kolorymetryczna 5552 448 6 Forda. Metoda biologiczna nie obejmuje nie¬ czynnej biologicznie anhydr oerytromycyny na¬ tomiast metoda Forda oznacza obie substancje.Z róznicy oznaczen tymi dwoma metodami mozna zatem wnioskowac o zawartosci anhy- droerytromycyny w badanym materiale.Dokonanie prawidlowej oceny komplikuje sie znacznie w przypadku obecnosci mieszaniny ery¬ tromycyny B, a szczególnie erytromycyny C. po wysuszeniu £68 g kompleksu o aktywnosci biologicznej 570 mcg/mg i temperaturze topnie¬ nia 115 — 12&°C. Wydajnosc = 87,0% wydaj¬ nosci teoretycznej.Przyklad III. 10,9 g kompleksu o aktyw¬ nosci biologicznej 617 mcg/mg rozpuszczono w 37 ml acetonu i dodano przy ciaglym mie¬ szaniu 2,2 g bezwodnika propionowego; po czym mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 go- W takich przypadkach mozna uzyskac potrzeb- 10 dziny, a nastepnie dodano 3,8 g laurylosiarczanu ne dane na drodze badania chromatograficzne- sodowego w 74 ml wody. Po uplywie 1 godzi- go. ny odsaczono krysztaly laurylosiarczanu propio- Badanial chromatograficzne wydzieloneg|o nianu erytromycyny i kilkakrotnie przemyto kompleksu jak równiez lugów pokrystalicznych woda. Wysuszony w temperaturze 50°C pro- wykazaly pelna selektywnosc rozdzialu tak, ze 15 dukt topnial w temperaturze 135 — 13 cala ilosc obecnej anhydroerytromycyny pozo- kazywal moc 627 mcg/mg. Wydajnosc przejscia stawala w lugach pokrystalicznych i stad byla wydzielana odpowiednimi metodami.Wydzielanie kompleksu erytromycyny z roz¬ tworów uzyskanych przez ekstrakcje plynów pofermentacyjnych nie mieszajacymi sie z woda rozpuszczalnikami organicznymi pozwala na se¬ lektywne wydzielenie z dobra wydajnoscia pól¬ produktu, który opisanymi w literaturze sposo- 82,5% wydajnosci teoretycznej. Porównanie wi¬ dma w podczerwieni otrzymanego preparatu ze standartem wykazuje calkowita zgodnosc.Przyklad IV. W 74 ml bezwodnego aceto¬ nu zawieszono 1/40 mola tiocjanianu erytromy¬ cyny i dodano 2,5 g czystego octanu potasowe¬ go. Podczas ogrzewania w temperaturze 40°C mieszano az do calkowitego rozpuszczenia osa- bami mozna przeprowadzic w zasade erytromy- 25 du tiocjanianu, po czym dodano 4,2 g bezwodni- 30 cyny, propionian lub laurylosiarczan propionia. nu erytromycyny.Przyklad I. 35 litrów przesaczu brzecz¬ ki o aktywnosci 1640 mcg/ml ekstrahowano octanem amylu. Uzyskano 5 I ekstraktu ery¬ tromycyny zawierajacego 10600 mcg/ml* do którego dodano nasycony wodny roztwór tiocja¬ nianu potasowego i nastawiono wartosc pH na 5,6 lodowatym kwasem octowym. Powstaly osad odfiltrowano i kilkakrotnie przemyto octanem 35 amylu. Otrzymano po wysuszeniu w temperatu¬ rze 50—60°C pod zmniejszonym cisnieniem 69,4 g kompleksu erytromycyny zawierajacego 680 mcg/mg antybiotyku. Zwiazek ten byl bialym krystalicznym proszkiem o temperaturze topnie¬ nia 131 — 136°C, nie rozpuszczal sie w wodzie natomiast dobrze rozpuszczal sie w metanolu, etanolu i acetonie. Wydajnosc izolacji komplek¬ su = 82,2% w stosunku do wydajnosci teore¬ tycznej.Przyklad II. Do 5 litrów ekstraktu ery¬ tromycyny w octanie butylu zawierajacego 48200 mcg/ml dodano nasycony roztwór tiocja¬ nianu potasowego w etanolu i wartosc pH na¬ stawiono na 5,7 kwasem propionowym. Wytra¬ cony osad odsaczono, przemyto kilkakrotnie oc¬ tanem butylu i suszono w temperaturze 55 — 60°C pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano ka propionowego. Roztwór pozostawiono w tem¬ peraturze pokojowej na 2 godziny. Nastepnie dodano 7,5 g laurylosiarczanu sodowego w 148 ml wody. Po uplywie 1 godziny odsaczono bia¬ le krysztaly, które po wysuszeniu" pód próznia w temperaturze 50 — 55°C topily sie w tempe¬ raturze 136 — 139°C. Laurylosiarczan propionia- nu erytromycyny o aktywnosci biologicznej 607 mcg/mg otrzymano z wydajnoscia 83%. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wyodrebniania erytromycyny lub jej pochodnych z plynów pofermentacyjnych na 40 drodze ekstrakcji rozpuszczalnikami organiczny¬ mi i wytracania, znamienny tym, ze roztwór erytromycyny w rozpuszczalniku organicznym traktuje sie rodankiem potasu i kwasem octo¬ wym lub propionowym w celu wytracenia kom- 45 pleksu o wzorze ogólnym (Alk.COOK)x • erytro¬ mycyna • HCNS, w którym Alk oznacza wodór lub jednowartosciowy rodnik szeregu parafin zawierajacy od 1 do 2 atomów wegla, zas x oznacza liczby 0,5, 1 lub 2, po czym otrzymany 50 kompleks wyodrebnia i w znany sposób prze¬ prowadza w laurylosiarczan propionianu* ery¬ tromycyny, propianian erytromycyny lub wolna zasade erytromycyny.KI. 30 h, 6 52 448 MKP C 12 d 400 60 $° ^o BO N N $ Oj N 40 20 ERVTROMVCVNA. HCNS 0 2200 2000 1800 KO0 DLUGOSC FALI 1400 1200 (<=«-*; 100 N ki N 5 60 60 40 10 RYS. Z [CH^COOKJ ERYTROMYCYNA. HCNS 0 2200 ZOOO 1800 -KOO OLUOOSC FALI (CM''1) 140o '200 Bltk 2902/66 r. 250 egz. A4 PL