PL52447B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 20.1.1967 52447 KI. 30 h, 2/10 MKP A 61 k UKD Jtf* r£}d 'Wspóltwórcy wynalazku: inz. Felicjan Mozolowski, inz. Ryszard Kaflow- ski, Stanislaw Poludnikiewicz, Jadwiga Wazna, Barbara Mozolowska Wlasciciel patentu: Jeleniogórskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa" Przedsiebiorstwo Panstwowe:, Jelenia Góra (Polska) Sposób otrzymywania hormonu adrenokortikotropowego ha drodze oczyszczania pólproduktu ACTH I Metody oczyszczania ACTH przy uzyciu róz¬ nego typu adsorbentów, jak np. pochodnych ce¬ lulozy, wymieniaczy jonów itp. stanowia przed¬ miot licznych publikacji naukowych i opra¬ cowan patentowych. Sposród nich klasyczna metoda postepowania, opublikowana w amery¬ kanskich czasopismach naukowych w latach 1951 — 1952 przez Payne'a, Raben'a i Astwood'a jest adsorpcja ACTH z wodnego rozcienczone¬ go kwasu organicznego, najczesciej 0,1 n kwa¬ su octowego, eluacja substancji czynnej wod¬ nym, rozcienczonym mocnym kwasem mineral¬ nym, przewaznie 0,1 n kwasem solnym, i wy¬ tracanie preparatu z roztworu nadmiarem ace¬ tonu, alkoholu lub wydzielenie przez liofiliza¬ cje.Jako adsorbenty oprócz celulozy, która za¬ stosowal Payne (J. Biol. Chem. 187, 719 (1951)) stosuje sie równiez jej pochodne takie, jak kar- boksyceluloza, zwana takze oksyceluloza (Astwo- od i inni, J. Am. Chem. Soc. 73, 2969 (1951)) i karboksymetyloceluloze (J. D. H. Homan i L.P. Ederzeel, opis patentowy niemiecki nr 1053732).Wyniki znanych sposobów postepowania, za¬ leznie od uzytego materialu wyjsciowego (jego metody otrzymywania, rodzaju zwierzat, od których pochodizily gruczoly, sposobu konser¬ wacji przysadek itp.) oraz stosowanego adsor- benta róznia sie znacznie od siebie tak pod wzgledem skutecznosci dzialania preparatu, jak i wydajnosci procesu oczyszczania. Najwieksze wydajnosci procesu oraz najwieksza aktywnosc preparatu uzyskuje sie stosujac karboksycelulo- 5 ze. Wedlug Astwood'a (J. Am. Soc. 73, 2969, 2970 (1951)) wydajnosc ta wynosi 40 — 60% i chociaz niektóre opisy patentowe podaja nieco lepsze rezultaty, to jednak, jak stwierdzili J. D.H. Homan i L. P. Ederzeel (opis patentowy nie- io miecki nr 1053732) rzadko udaje sie je uzyskac.W przeprowadzonych próbach zastosowania metody Astwood'a oraz licznych drobnych jej modyfikacji, bedacych przedmiotem róznych pa¬ tentów, do oczyszczania ACTH I, uzyskanego 15 sposobem wedlug patentu nr 4Ó759 z przysadek swinskich, najbogatszych w czynnik adrenokbr- tikotropowy, ustalono, stosujac jako adsorbenty karboksyceluloze % karboksymetyloceluloze, ze wydajnosc tej metody waha sie w granicach 30 20 —55% oraz ze rozbieznosc wyników jest znaczna..Ustalono nastepnie, ze w trakcie procesu oczy¬ szczania ACTH I, uzyskanego wedlug opisu patentowego nr 40759 adsorpcja na karboksy- celulozie nie jest selektywna i z materialu wyj- 25 sciowego adsorbuje sie nie tylko frakcja najbo¬ gatsza w skladnik kortikotropowy, lecz takze substancje zblizone budowa chemiczna do ACTH, posiadajace bardzo nikle dzialanie hor¬ monu. W czasie procesu desorpcji substancje 30 te wraz z frakcja aktywna, zostaja wyeluowane 52 4473 i przechodza do roztworu. Wydzielenie z niego droga liofilizacji ACTH w postaci suchego pro¬ szku, prowadzi do uzyskania preparatu nisko- aktywnego i niezbyt czystego, poniewaz wszyst¬ kie frakcje bedace w eluacie przechodza do pre¬ paratu. Tak uzyskany produkt nie wykazuje równiez wymaganej rozpuszczalnosci w roztwo¬ rze soli fizjologicznej (40 jm/ml).Stosujac metode wydzielania ACTH w postaci suchego proszku, to jest wytracanie z eluatu i przy naturalnym pH roztworu 1 — 1,3 uzyskuje sie niska wydajnosc procesu 30 — 55%, przy czym aktywnosc preparatu jest równiez róz¬ na dla róznych serii i niezadowalajaca.Stwierdzono, ze stosujac, jako material wyj- i sciowy do oczyszczania, ACTH I otrzymany we¬ dlug opisu patentowego nr 40759 i postepujac z nim az do fazy desorpcji z karboksycelulozy zgodnie z przepisem Astwood'a (J. Am. Soc. 73 2969 — 2970), mozna z kazdej serii i z wysoka 2 wydajnoscia, uzyskac preparat doskonale roz¬ puszczalny nawet w duzych stezeniach w soli fizjologicznej oraz w wodzie i o jednakowej maksymalnej ilosci jednostek ACTH w 1 mg substancji, jezeli wedlug wynalazku przed wy- 2J traceniem hormonów z eluatu acetonem lub al¬ koholem doprowadzi sie w eluacie za pomoca 5% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego wartosc pH do 2,4.Zgodnie z powyzszym, pólprodukt ACTH I 30 uzyskany przez ekstrakcje przedniego plata przysadki mózgowej zakwaszona wodnoalko- holowa mieszanina w temperaturze wrzenia, poddaje sie wedlug wynalazku adsorpcji na karboksycelulozie, po czym eluuje rozcienczo- 35 nym kwasem solnym, a nastepnie wytraca z eluatu ACTH nadmiarem acetonu przy war¬ tosci pH = 2,4.W preparacie, otrzymanym sposobem wedlug wynalazku, ilosc jednostek miedzynarodowych 40 ACTH w 1 mg substancji zalezy jedynie od ro¬ dzaju zwierzat, z których pochodza gruczoly, i od sposobu konserwacji przysadek (mrozone lub acetonowane). Nie obserwuje sie natomiast wahan aktywnosci preparatu i wydajnosci pro- 45 cesu, co jest charakterystyczne dla innych metod.Znaczenie wlasciwej wartosci pH roztworu dla aktywnosci preparatu zilustrowano w tabeli.Tabela odnosi sie do pólproduktu ACTH otrzy¬ manego wedlug opisu patentowego nr 40759 z acetonowanych przysadek swinskich, oczy¬ szczonego zgodnie z wynalazkiem.Zaleznosc aktywnosci ACTH od wartosci pH roztworu przed wytraceniem pH 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 jm/mg 13,39 17,04 14,29 11,47 8,93 W tabeli podano wyniki srednie z 38 serii. 60 Aktywnosc preparatu oznaczona metoda inwo- lucji grasicy szczura (Methods in Hormone Re¬ search ACADEMIC PRESS New York and Lon¬ don 1962, Thymus Involution Assay — 661). 65 447 4 Przy stosowaniu roztworu o róznej wartosci pH uzyskuje sie wyniki dosc znacznie odbie¬ gajace od siebie w poszczególnych seriach, zaw¬ sze jednak nizsze niz przy stosowaniu roztworu 5 o wartosci pH = 2,4, przy której uzyskana aktywnosc preparatu prawie nie ulega waha¬ niu i wynosi od 16,82 jm/mg do 17,07 jm/mg.Aktywnosc te uzyskuje sie przy jednoczesnie wysokiej wydajnosci procesu 85 — 95% w sto¬ sunku do wyjsciowej ilosci jednostek.W przypadku stosowania ACTH I otrzymane¬ go ze swiezych przysadek uzyskuje sie spo¬ sobem wedlug wynalazku znacznie lepsze wy¬ niki.Przy stosowaniu jako pólproduktu ACTH I otrzymanego z przysadek bydlecych uzyskuje sie aktywnosc 13 jm/mg oraz wydajnosc proce¬ su 60 — 85%, z ACTH I uzyskanego z przysa¬ dek cielecych uzyskuje sie aktywnosc 10 jm/mg, a wydajnosc procesu 50 — 70%.Preparat otrzymany sposobem wedlug wyna¬ lazku jest wolny calkowicie od innych hormo¬ nów przysadki, zwlaszcza oksytocyny i wazo- presyny, wykazuje doskonala rozpuszczalnosc w wodzie 250 jm/ml a takze w roztworze soli fizjologicznej 50 jm/ml.Przyklad. 1000 g ACTH I (otrzymanego wedlug opisu patentowego nr 40759) umieszcza sie w kubie szklanym, zalewa 32,200 1 0,1 n kwa¬ su octowego i miesza az do rozpuszczenia. Do roztworu dodaje sie 5%-ego roztworu wodo¬ rotlenku sodowego do wartosci pH = 3,5 — 3,6, po czym saczy do uzyskania klarownego prze¬ saczu. Do przesaczu dodaje sie 188 g odpowie¬ dnio przygotowanej karboksycelulozy (posiada¬ jacej okolo 10% grup karboksylowych) i miesza w temperaturze pokojowej w ciagu 20 — 24 go¬ dzin. Po tym czasie osad odsacza sie, umieszcza w lodówce, a do przesaczu dodaje dalszych 100 g karboksycelulozy i prowadzi adsorpcje analo¬ gicznie jak poprzednio. Odsaczony osad z II-giej adsorpcji laczy sie z osadem z I-szej adsorpcji i ciagle mieszajac (okolo 30 minut) zadaje 1750 ml 0,1 n kwasu octowego. Ciecz z przemycia stanowi odpad, natomiast osad przemywa sie jeszcze trzykrotnie kwasem octowym, uzywa¬ jac do kazdego przemycia 1750 ml tego odczyn¬ nika. Nastepnie osad przemywa sie dwukrotnie woda uzywajac za kazdym razem 2500 ml wody destylowanej. Ostatni przesacz powinien dac ne¬ gatywny wynik w reakcji z 20% kwasem sulfo- salicylowym (próba na nieobecnosc bialka). Tak przemyty osad poddaje sie w ciagu 20 — 24 godzin eluacji 15,600 1 rozcienczonego kwasu solnego. Osad odsacza sie natomiast z roztworu zawierajacego substancje o dzialaniu ACTH wy¬ traca sie najbardziej aktywna frakcje przez do¬ prowadzenie wartosci pH eluatu za pomoca 5% roztworu wodorotlenku sodowego do 2,4 i zada¬ niu nadmiarem acetonu. Roztwór umieszcza sie w chlodni (o temperaturze —15°C) i po pieciu dniach odsacza wytracony osad ACTH, który przemywa sie acetonem, eterem i suszy pod\ 52 447 5 próznia. Preparat zawiera okolo 17 jednostek miedzynarodowych w 1 mg (oznaczonych me¬ toda inwolucji grasicy) oraz dobra rozpuszczal¬ nosc w wodzie i soli fizjologicznej. Z 1000 g ACTH I (to jest okolo 900 000 jm) uzyskuje sie 765 000 — 855 000 jm wysokoaktywnego prepa¬ ratu ACTH. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania hormonu adrenokorti- kotropowego na drodze oczyszczania pólpro- Dokonano jednej poprawki \^<:^y 6 duktu ACTH I przez selektywna adsorpcje na pochodnych celulozy, eluowanie rozcienczonym kwasem solnym i wytracanie czystego ACTH acetonem, znamienny tym, ze pólprodukt ACTH I 5 uzyskany przez ekstrakcje przedniego plata przysadki mózgowej zakwaszona wodno-alkoho- lowa mieszanina w temperaturze wrzenia, pod¬ daje sie adsorpcji na karboksycelulozie, po czym eluuje rozcienczonym kwasem solnym, 10 a nastepnie wytraca z eluatu ACTH nadmiarem acetonu przy wartosci pH 2,4. PL