PL52425B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 30.XI.1966 52425 KI. 12 q, 6/01 MKP C 07 c XJKD jos/^ f£2s ¦'°^'kAi Wspóltwórcy wynalazku: dr Roger Boissonnas, dr Rene Huguenin Wlasciciel patentu: Sandoz AG Bazyleja (Szwajcaria) ifSt^S^ Sposób wytwarzania nowego polipeptydu Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wego polipeptydu o wzorze 1.Polipeptyd o wzorze 1 moze byc otrzymany me¬ todami ogólnie znanymi dla syntezy tego rodzaju zwiazków, przy czym aminokwasy laczy sie ze soba w podanej we wzorze kolejnosci, pojedynczo lub po uprzednim utworzeniu peptydów o mniej¬ szej czasteczce.Wedlug wynalazku polipeptyd o wzorze 1 mozna otrzymac przez utlenienie nonapeptydu o wzorze 2. Produkty wyjsciowe do otrzymania pochodnej nonapeptydu o wzorze 2, o ile dotychczas nie sa znane, otrzymuje sie metodami znanymi w chemii polipeptydów, przy czym aminokwasy laczy sie ze soba pojedynczo lub po uprzednim utworzeniu peptydów o mniejszych czasteczkach.Utlenienie nonapeptydu o wzorze 2 do zada¬ nego produktu koncowego o wzorze 1 moze byc prowadzone w roztworze wodnym lub alkoholo- wo-wodnym przy wartosci pH 4—9. Utlenienie prowadzi sie korzystnie za pomoca powietrza, tle¬ nu, nadtlenku wodoru lub zelazicyjanku potaso¬ wego.Otrzymany polipetyd o wzorze 1 mozna w zna¬ ny sposób przeprowadzic w sole addycyjne przez reakcje z nieorganicznymi lub organicznymi kwa¬ sami. Jako kwasy stosuje sie na przyklad: kwas solny, bromowodorowy, siarkowy, fumarowy, jabl¬ kowy, maleinowy, octowy i winowy. Zwiazek o wzorze 1 wykazuje równie silne dzialanie zwe- 10 15 so 25 zajace naczynia krwionosne jak naturalne wazo- presyny o ogólnym wzorze 3, od których nowy zwiazek rózni sie tym, ze zamiast lizyny (wazo- presyna swini o wzorze 3a), wzglednie argininy (wazopresyna bydla o wzorze 3b) — zawiera or- nityne, a zamiast tyrozyny — fenyloalanine. Zwia¬ zek o wzorze 1 nie wykazuje tak silnego dziala¬ nia zmniejszajacego wydzielanie moczu, jak natu¬ ralne wazopresyny tak, ze zwiazek o wzorze 1 moze byc wprowadzony do terapii jako substan¬ cja o selektywnym dzialaniu zwezajacym naczy¬ nia krwionosne. Specyficzne dzialanie zwezajace naczynia krwionosne wystepuje na skutek bezpo¬ sredniego wplywu na miesnie naczyn, dlatego tez zwiazek o wzorze 1 w przeciwienstwie do adrena¬ liny i noradrenaliny, nie wywoluje objawów ubocznych ze strony wegetatywnego ukladu ner¬ wowego.Selektywnego, zwezajacego naczynia krwionos¬ ne dzialania zwiazku o wzorze 1 nie mozna bylo przewidziec, poniewaz struktura reszty ornityno- wej podobna jest do struktury lizyny i argininy i dlatego mozna bylo oczekiwac, ze równiez wlas¬ ciwosci nowego zwiazku o wzorze 1 beda odpo¬ wiadac wlasciwosciom obydwóch naturalnych hor¬ monów. Glównym zakresem zastosowania nowego zwiazku o wzorze 1 jest profilaktyka i terapia krwotoków tkankowych, przy czym infiltracja tkanki zwiazkiem o wzorze 1 powoduje silna jej anemizacje. 5242552425 3 Zwiazek o wzorze 1 znajduje zastosowanie szcze¬ gólnie przy chirurgicznych zabiegach w laryngo¬ logii i poloznictwie, urologii i stomatologii. Doda¬ je sie go przy tym do srodków miejscowo znieczu¬ lajacych albo przy operacjach z narkoza ogólna, rozciencza fizjologicznym roztworem soli kuchen¬ nej i stosuje do infiltracji. Zwiazek o wzorze 1 moze byc tez stosowany doustnie przy leczeniu pewnych przypadków hypotonii lub stanach za¬ pasci i szoku.Otrzymany sposobem wedlug wynalazku, dotych¬ czas nieznany polipeptyd o wzorze Iw postaci wolnej zasady lub jako sól organicznego lub nie¬ organicznego kwasu moze byc stosowany jako lek sam lub wraz z innymi substancjami doustnie, do- jelitowo, pozajelitowo lub donosowo. Do sporza¬ dzenia odpowiednich form leku uzywa sie nieor¬ ganicznych lub organicznych, farmakologicznie obojetnych srodków pomocniczych. Jako srodki pomocnicze stosuje sie na przyklad do tabletek i drazetek cukier mlekowy, skrobie, talk, kwas stearynowy i podobne; do syropów: roztwory cu¬ kru trzcinowego inwertowanego, glukozy i inne; do preparatów iniekcyjnych wode, alkohole, glice¬ ryne, oleje roslinne i podobne; do czopków natu¬ ralne lub utwardzone oleje, woski i inne. Prepa¬ raty moga równiez zawierac odpowiednie srodki konserwujace, stabilizujace, zwilzajace, ulatwia¬ jace rozpuszczanie, slodzace i barwiace, aromaty¬ zujace i inne.W ponizszych przykladach podano sposób otrzymania nonapeptydu o wzorze 2 i nastepnie jego utlenianie do polipeptydu o wzorze 1.W przykladach temperatury podano w stopniach Celsjusza.Przyklad I. a) Ester etylowy N-a-karbobenzoksy-N-S-p-to- luenosulfonylo-L-ornityloglicyny. 104 g N-a-kar- bobenzoksy-N-8-p-toluenosulfonylo-L.-ornityny i 27 g estru etylowego gliceryny rozpuszcza sie w 450 ml acetonitrylu, chlodzi do tempe¬ ratury 0°, dodaje 51 g dwucykloheksylokar- bodwuimidu i wytrzasa w ciagu 4 godzin w temperaturze pokojowej. Wytracony dwu- cykloheksylomocznik odsacza sie i przemywa ace- tonitrylem. Przesacz odparowuje sie w prózni. Po¬ zostalosc krystalizuje po dodaniu eteru naftowego.Po przekrystalizowaniu z n-propanolu otrzymu¬ je sie 93 g estru etylowego N-a-karbobenzoksy-N- -8-p-toluenosulfonylo-L-ornityloglicyny: tempera¬ tura topnienia 135° [a]22 d = — 7° (96»/o etanol). b) Amid N-karbobenzoksy-L-prolilo-N-8-p-to- luenosulfonylo L-ornityloglicyny. 90 g estru etylowego N-a-karbobenzoksy-N-8-p- -toluenosulfonylo-L-ornityloglicyny rozpuszcza sie w 800 ml bezwodnego kwasu octowego, nasyco¬ nego bromowodorem. Calosc pozostawia sie w ciagu godziny w temperaturze 20°, odparowuje w prózni w temperaturze 40°C i przemywa pozo¬ stalosc starannie eterem dwuetylowym. Pozosta¬ losc rozpuszcza sie w 500 ml acetonitrylu, dodaje 25 ml trójetyloaminy i 43 g N-karbobenzoksy-L- -proliny, chlodzi do temperatury 0°, dodaje je¬ szcze 35,5 g dwucykloheksylokarbodwuimidu i wy¬ trzasa przez noc w temperaturze 20°. Po odsacze¬ niu dwucykloheksylomocznika odparowuje sie przesacz w prózni w temperaturze 30°, pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu i przemywa ten roz¬ twór rozcienczonym kwasem siarkowym i wod- 5 nym roztworem amoniaku. Po osuszeniu nad siar¬ czanem sodowym odparowuje sie octan etylu w prózni i pozostalosc rozpuszcza w 1 litrze absolut¬ nego etanolu. Roztwór chlodzi sie do temperatury 0°, nasyca amoniakiem i pozostawia przez noc 10 w temperaturze 20°. Po odparowaniu w prózni w temperaturze 30° przekrystalizowuje sie pozo¬ stalosc z acetonitrylu. Otrzymuje sie 58 g amidu N-karbobenzoksy-L-prolilo-N-p-toluenosulfonylo- -L-ornityloglicyny, temperatura topnienia 122° 15 (z rozkladem) [a]22 D = — 46° (95w/o kwas octowy). c) Amid-N-karbobenzoksy-L.rglutaminylo-L.-as- paraginylo - S - benzylo - L - cysteinylo - L - -prolilo-N-8-p-toluenosulfonylo-L-ornityloglicyny. 100 g amidu N-karbobenzoksy-L-prolilo-N-8-p- 20 -tolueonosulfonylo-L-ornityloglicyny rozpuszcza sie w 500 ml bezwodnego kwasu octowego nasyco¬ nego bromowodorem, pozostawia przez godzine w temperaturze 20° i odparowuje w prózni przy temperaturze ponizej 40°, Pozostalosc przemywa 25 sie starannie eterem dwuetylowym i dodaje do roztworu 100 g azydku N-karbobenzoksy-L-gluta- minylo-L-asparaginylo-S-benzylo-L-cysteinylu i 26 ml trójetyloaminy w 1000 ml dwumetyloformami- du. Pozostawia sie przez noc w temperaturze 20°, 30 dodaje 3000 ml octanu etylu, odsacza od osadu i przemywa octanem etylu. Otrzymuje sie 105 g amidu N-karbobenzoksy-L-glutaminylo-L-aspara- ginylo-S-benzylo-L-cysteinylo-L-prolilo-N-8-p-to- luenosulfonylo-L-ornityloglicyny, temperatura top- 35 nienia 193° [ d) Amid N-karbobenzoksy-S-benzylo-Li-cysteiny- lo-L-fenyloalanilo-L-fenyloalanilo-L-glutaminylo- -L-asparaginylo-S-benzylo-L-cysteinyló-L-prolilo- -N-8-p-toluenosulfonylo-L-ornityloglicyny. 40 50 g amidu N-karbobenzoksy-L-glutaminylo-L- -asparaginylo-S-benzylo-L-cysteinylo-L-prolilo-N- -8-p-toluenosulfonylo-L-ornityloglicyny rozpuszcza sie w 250 ml bezwodnego kwasu octowego nasy¬ conego bromowodorem i pozostawia w ciagu go- 45 dziny w temperaturze 20°. Po odparowaniu rozpu¬ szczalnika w prózni w temperaturze ponizej 40° przemywa sie pozostalosc starannie eterem dwu¬ etylowym i zadaje roztworem 31,5 g azydku N- -karbobenzoksy-S-benzylo-L-cysteinylo-L-fenylo- 50 alanilo-L-fenyloalanilu i 7,5 ml trójetyloaminy w 250 cm dwumetyloformamidu. Pozostawia sie przez 2 dni w temperaturze 20°, nastepnie zadaje 1000 ml octanu etylu i przemywa osad octanem etylu.Po wysuszeniu w prózni w temperaturze 30° prze- 55 mywa sie produkt cieplym metanolem. Otrzymuje sie 45 g amidu N-karbobenzoksy-S-benzylo-L-cy- steinylo-L-fenyloalanilo-L-fenyloalanilo-L-gluta- minylo-L-asparaginylo-S-benzylo-L-cysteinylo-L- -prolilo-N-8-p-toluenosulfonylo-L-ornityloglicyny, 60 temperatura topnienia 224° [a]2i D = — 40° (dwu¬ metyloformamid). e) Amid L-cysteinylo-L-fenyloalanilo-L-fenylo- alanilo-Li-glutaminylo-L-asparaginylo-L-cysteiny- lo-L-prolilo-L-ornityloglicyny. 65 Roztwór 5 g amidu N-karbobenzoksy-S-benzylo-52425 6 -L-cysteinylo-L-fenyloalanilo-L-fenyloalanilo-L- -glutaminylo-L-asparaginylo-S-benzylo-L-cystei- nylo-L-prolilo-N-8-p-toluenosulfonylo-L-ornitylo- glicyny w 1200 ml bezwodnego cieklego amoniaku zadaje sie podczas mieszania w temperaturze wrzenia roztworu taka iloscia metalicznego sodu lub potasu, az wystapi trwale niebieskie zabarwie¬ nie. Po dodaniu 3g chlorku amonowego odparowu¬ je sie roztwór do sucha. Pozostalosc zawiera amid L-cysteinylo-L-fenyloalanilo-L-fenyloalanilo-L- -glutaminylo-L-asparaginylo-L-cysteinylo-L-proli- lo-L-ornityloglicyny. f) Polipeptyd o wzorze 1.Pozostalosc otrzymana wedlug przykladu I e) rozpuszcza sie w 5 litrach 0,01 n kwasu octowego i utlenia przy wartosci pH 6,5 — 8,0 przez wpro¬ wadzenie powietrza lub tlenu w ciagu jednej go¬ dziny w temperaturze 20°. pH roztworu dopro¬ wadza sie przy pomocy rozcienczonego kwasu sol¬ nego do wartosci 4,0 — 5,0 i po dodaniu 50 g chlorku sodowego lub 0,64 g kwasu metanosulfo- nowego lub 0,76 g kwasu trójfluoro-octowego od¬ parowuje sie do sucha, przy czym otrzymuje sie suchy trwaly proszek w postaci mieszaniny poli- peptydu i soli. Moze on byc przechowywany i jest calkowicie rozpuszczalny w wodzie. Mozna jednak równiez bezposrednio stosowac otrzymany roz¬ twór, ewentualnie po rozcienczeniu woda lub roz¬ tworem soli. Celem usuniecia nieorganicznych so¬ li mozna wyzej wymieniony proszek otrzymany po dodaniu kwasu trójfluorooctowego poddac roz¬ dzialowi przeciwpradowemu w ukladzie rozpu¬ szczalników — drugorzedowy butanol (woda) kwas trójfluorooctowy 120(160)1. Po 200 elementach rozdzielajacych substancja znajduje sie w elemen¬ tach 57 do 77, z maksimum w elemencie 67/K = = 0,50. Po odparowaniu otrzymuje sie z dobra wydajnoscia czynny polipeptyd w postaci higros- kopijnego trójfluorooctanu, który jest chromato¬ graficznie i elektroforetycznie jednorodny. Pred¬ kosc migracji przy elektroforezie bibulowej przy pH 5,8 i napieciu 40 v/cm wynosi 50 mm/godzine (uzyta jako wzorzec histydyna wedruje w ciagu godziny 65 mm).Migracja przy elektroforezie bibulowej, przy pH 1,9 i napieciu 40 v/cm wynosi 69 mm w ciagu jed¬ nej godziny (uzyty jako wzorzec tryptofan wedru¬ je w tym czasie 66 mm). Rf przy chromatografii bibulowej w systemie alkohol izoamylowy/pirydy- na/woda 35/35/30 wynosi 0,28. Hydroliza calkowi- 5 ta (16 godzin, temperatura 110°, 6 n HC1) daje nastepujace aminokwasy w ilosciach ekwimolar- nych: cystyne, kwas glutaminowy, kwas aspara¬ ginowy, proline, ornityne i glicyne, oraz w ilos¬ ciach podwójnie ekwimolarnych fenyloalanine. 10 Otrzymany produkt posiada nastepujace biologicz¬ ne dzialanie: 150 jednostek miedzynarodowych/mg na zahamowanie diurezy u szczura i mniej niz 3 jednostek miedzynarodowych/mg na macice u szczura. 15 Przyklad II. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie I. Na koncu utlenia sie jednak produkt w temperaturze 0—40° przez dodanie 7,5 ml 1 n roz¬ tworu nadtlenku wodoru w wodzie przy pH 7,5— 8,0. 20 Przyklad III. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie I. Na koncu utlenia sie jednak produkt w temperaturze 0—35° przez dodanie 6,7 ml 1 n roztworu zelazicyjanku potasowego w wodzie przy pH 5,5—7,5. 25 PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 30 1. Sposób wytwarzania nowego polipeptydu o wzorze 1 i jego soli addycyjnych z kwasami znamieny tym, ze nonapeptyd o wzorze 2 utle¬ nia sie w roztworze wodnym lub alkoholowo- -wodnym przy wartosci pH 4—9, po czym uzys- 35 kany produkt ewentualnie przeprowadza sie w sole addycyjne z kwasami.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako srodek utleniajacy stosuje sie powietrze.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze 40 jako srodek utleniajacy stosuje sie nadtlenek wodoru.

4. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze jako srodek utleniajacy stosuje sie tlen.

5. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze 45 jako srodek utleniajacy stosuje sie zelazicyJa¬ nek potasu.KI. 12 q, 6/01 52425 MKP C 07 c Ce"* CH2 C6H5 CH, CONH, 1 CH2 CH, CONH, I 2 CH, NH-CH-CO-MH-iH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-C^ 1 I CH. I ' S— C^js Fen Fen Gfu Asp -S CyS rjH2 CH2 CH2 I CM2 CHZ I N—CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CON^ GU CR-CH, Pto 0*n kfzóv4 SH I CH, CH, I CHZ CHL I CHt I CONH, l Z (JH2 SM t CH2 I I* I- i i ftH^CH-CO-M*CH~O&-W Cvjs Fen teft HM, I L CH* I Z CH—CH, CH2 I I ^ ^ L—N — CH-C0-NH-CH-C0-NH-CH2-C0NHZ PfO Otn Gli Wzó+ 2 Cys CH, CONH I 2 CH, I CH, CONH, CH, NH^CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CD-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CCH r ,—, S x rett G(u Asp Cys <*a f* f» R1" L-—N CH-OQ-NH-CH-CO-NH—CHj—CONHa flfrfo AfacWla MuhSh h/zóp$€ R"w •MCi^-0",qM •^-£V0H ~CM~0 lx fy fyn **n f. E"'* £_ ~cV*clV",ClV"CHfN^ Uz -CHj-CH^C^-NH-C-NMj A*8 -C^-O^-CH^N^ Om WDA - 1 Zam 17/66 Nakl. 270 PL